CN102373168A - 一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其酶产品和生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种以枯草芽孢杆菌TQK为出发菌，采用UV+NTG+微波诱变3种方法重复使用2次的复合诱变技术，诱导培养能高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌TQBm菌株，其保藏号为CCTCCNo:M211147，用该TQBm菌株发酵生产高效能β-甘露聚糖酶及酶产品BM--Ⅰ、BM--Ⅱ。在优化产酶条件下可发酵得到平均酶活力为1000～2000μ/ml的高效能β-甘露聚糖酶，1ml酶液可转化10～20g甘露聚糖，底物浓度可达到10～20%。通过本发明培养出的TQBm菌株产酶量大，酶活力高，使用该酶产品能高效经济地水解魔芋、瓜尔豆、槐豆、田菁等植物中的甘露聚糖，生产甘露低聚糖。

Description

一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其酶产品和生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术，更确切说是一种高效表达β-甘露聚糖酶的芽孢杆菌及其酶产品和生产方法。

背景技术

β-甘露聚糖酶是一类能够水解含有β-葡萄糖苷键和β-甘露糖苷键的甘露聚糖的内切水解酶，甘露聚糖主要存在于魔芋胶、瓜尔豆胶、槐豆胶、田菁胶中，主要成分是葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等，它们构成了植物半纤维素的第二大组分，水解这些植物中甘露聚糖的酶产品就是β- 甘露聚糖酶。

[0003]  自上世纪80年代Akio.T等美国科学家首次发表甘露聚糖酶的研究成果以来（Akino T, Nakmura N, Horkoshi K.et al. Characterization of three β-mannanase of an alkalophilic Bacillus sp.[J].Agric Biol Chem. 1988. 52 (3)773-779），甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究就引起人们极大的关注。最近的报道是，李剑芳等（β-甘露聚糖酶高产菌株选育及产酶条件的研究,食品与发酵工业,第31卷第9 期.2005），张敏等（野皂荚多糖胶制备半乳甘露低聚糖的研究，食品工业斜技，Yo1.29,No.09,2008），王玲玲等（酶解法制备低相对分子质量胡芦巴半乳甘露聚糖及其产物的表征，林产化学与工业，第29卷第2期，Apr.2009），吴长菲等（魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究，生物技术通报 2010 年卷01期）。还有相关专利文献：CN 1766098 A,2006.5.3;CN 1739949 A,2006.6.28; CN 1OO516196 C，2007.7.22。

在上述的一些研究中，或是存在酶活力不高，底物浓度低，成本高，缺乏工业生产的基础（对半乳甘露聚糖而言尤其如此）；或是水解过程中加碱、加酸，给后处理工艺带来困难，还不利于环保。因此，水解魔芋胶和瓜尔豆胶中甘露聚糖的β- 甘露聚糖酶的制取方法仍然面临很多技术难题。而这也是本发明创新技术的起点。

发明内容

本发明的目的是利用 TQK 菌株，通过 UV（紫外线诱变）、NTG （亚硝基肌诱变）、微波诱变3种方法重复使用2次的复合诱变，诱导培养能高效表达β- 甘露聚糖酶的芽孢杆菌 TQBm 菌株，及其发酵生产高效能β-甘露聚糖酶产品的生产方法，从而能高效经济地转化生产甘露低聚糖。

使用的微生物：本发明涉及的芽孢杆菌 TQBm，它具有高效表达半纤维素酶的特性该菌株于2011 年 8 月 14 日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址.中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC No：M 211147（Bacillus subtilis TQBm）。

芽孢杆菌 TQBm菌株的菌学特性：

a、形态特征：单个细胞0.7～0. 8×2～3 微米、着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢 0. 6～0. 9×1. 0～1. 5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。 

b、生理生化特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色、在液体培养基中生长时，形成皱醚；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在半纤维素的诱导下产生半纤维素酶，在低聚甘露糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

本发明是这样实现的。从中国典型培养物保藏中心取得的 TQK 菌株（保藏号为 CCTCC No：M 207129）为出发菌，先采用UV（紫外线诱变），条件是：紫外灯功率15～3Ow，照射距离20～50cm，照射时间 l～8min；再采用NTG（亚硝基胍诱变），条件是：NTG 浓度 l～3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理 90～120min；最后采用微波诱变，条件是：家用微波炉，2450MHz，最小功率80w，最大功率800w，培养皿不加盖、快速冰上冷却，最佳处理时间为5Os。按上述3种复合诱变方法及顺序重复使用2次后，将菌种接种在含有0.1～0.5％的刚果红平板培养基中，30～35℃，诱导培养24～48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为：琼脂1.5～2.5％，魔芋胶酶解物<糖度10Bx>1.5～5.0%，（或者瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>1.5～5.0%，）以此对菌种进行适应性驯化和有效诱导，胰蛋白胨 0.5～2 %，酵母浸粉0.5～2%，NaCl 0.1～0.5%，刚果红0.1～0.5％。

选取水解圈直径H/C 菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过 DNS 法测定酶活。平均酶活力：培养基配方中碳源用魔芋胶酶解物的达到1600μ/ml，培养基配方中碳源用瓜尔豆胶酶解物的达到950μ/ml。

选取优良菌株进行稳定传代3代，最后得到高产半纤维素酶斜面菌株。将该菌株命名为TQBm，于4℃冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No：M 211147（简称 TQBm)。 

发酵产酶工艺包括如下步骤：

1、一级液体培养：即从斜面到 500ml三角瓶的放大培养，接种量为 TQBm 斜面菌一环，在 30～35℃，200～300r/min,  pH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～ 24小时。培养基配方按质量百分比计：魔芋胶酶解物<糖度10Bx>2.5～5.0%，(或者瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>1.5～5.0%)，胰蛋白胨0.5～2%，酵母浸粉0.5～2%，Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%，KH₂PO₄ 0.1～0.5%，NaCl 0.2～0. 5％，NH₄Cl 0.2～0.5，豆粕粉1～5%，玉米渣1～5%，其余为水，加水至500ml。 

2、7L小罐发酵产酶（专用于酶解魔芋胶）   

以2～5％的接种量接种，培养条件：35～37 ℃，300～500r/min，pH6.5～7.5，培养18～24小时，培养基配方为魔芋胶酶解物<糖度10Bx>5～15%，无机盐复合成份1.5～3.5 %，胰蛋白胨0.5～2%，酵母浸粉0.5～2%，豆粕粉1～5%，玉米渣1～5%。发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为30％～80%；培养结束后，DNS 法测定酶液的活力，平均酶活力达到2000μ/ml。

所述无机盐复合成份为Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%、KH₂PO₄ 0.1～0.5%、NaCl 0.2～0. 5％、NH₄Cl 0.2～0.5；

最佳配方:魔芋胶酶解物<糖度10Bx>10.0%，无机盐复合成份2.5%，酶母浸粉1.0%，胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%；最佳培养条件： 35士l℃，400r/min，pH7.0；最佳培养22小时；通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为65%。 

3、7L小罐发酵产酶（专用于酶解瓜尔豆胶）

除培养基配方中的碳源为瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>5～15%外，其它条件与第2步相同，培养结束后，DNS 法测定酶液的活力，平均酶活力达到1350μ/ml。

4、酶的纯化

发酵完成后，用大容量低温高速离心机以 6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用0.1μm的微滤膜对粗滤液进行纯化处理，进一步除去残存的微量菌体，再用 6000D超滤膜进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶收得率≥85％。

5、β --甘露聚糖酶于低温0～4℃下贮存。

本发明与现有技术相比具有以下突出特点： 

1、三重复合诱变技术构建出高效产酶菌株

本发明采用UV+ NTG+微波诱变的复合诱变技术，并按相同顺序重复诱变2次，其复合诱变的协同效应大大增强，比通常的2种复合诱变技术的效果提高了33%。筛选出新型的TQBm 菌株，可高效表达β --甘露聚糖酶，方法简便，效率高。

2、新碳源用作产酶诱导物提高了酶作用效率

本发明在发酵过程中的碳源分别采用魔芋胶和瓜尔豆胶的酶解物（糖度10Bx，粘度260～280 mPa.s，估算分子量为8,000～20,000）代替高分子魔芋胶和瓜尔豆胶分别进行诱导产酶，降低了培养基的粘度，使菌种能够更充分吸收碳营养素。尤其重要的是，用较小分子的碳营养素作有效诱导，酶分子的结构也发生了有益变化，大大提高酶作用的效率，特别是提高了底物浓度：酶作用于魔芋胶时，底物浓度可达到创记录的15～20%，1ml酶液转化30g魔芋胶，可降低能耗10～15%；而酶作用于瓜尔豆胶时，底物浓度可达到10～15%，1ml酶液转化15g瓜尔豆胶，可降低能耗15～20%，从而在全球范围内首次使酶解瓜尔豆胶的工业规模生产成为可能，远远高于目前的研究水平。

3、发酵产出的酶液收得率高

由于培养基中的碳营养素是用相对小分子的糖物质，菌种发酵产酶率提高了8～10%，再经精细化的酶液纯化操作，酶收得率可达到 85%，技术经济效果显著。

 具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。

实施例 1： 高效表达β --甘露聚糖酶的 TQBm 菌株选育。

从中国典型培养物保藏中心保藏取得的 TQK菌株（保藏号为 CCTCC No：M 207129）为出发菌，先采用UV（紫外线诱变），条件是：紫外灯功率15～3Ow，照射距离20～50cm，照射时间 l～8min；再采用NTG（亚硝基胍诱变），条件是：NTG 浓度 l～3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理 90～120min；最后采用微波诱变，条件是：家用微波炉，2450MHz，最小功率80w，最大功率800w，培养皿不加盖、快速冰上冷却，最佳处理时间为5Os。按上述3种复合诱变方法及顺序重复使用2次后，将菌种接种在含有0.1～0.5％的刚果红平板培养基中，30～35℃，诱导培养24～48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为：琼脂1.5～2.5％，魔芋胶酶解物<糖度10Bx>1.5～5.0%，瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>1.5～5.0%，以此对菌种进行适应性驯化和有效诱导），胰蛋白胨 0.5～2 %，酵母浸粉0.5～2%，NaCl 0.1～0.5%，刚果红0.1～0.5％。

选取水解圈直径H/C 菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过 DNS 法测定酶活。平均酶活力：培养基配方中碳源用魔芋胶酶解物的达到1600μ/ml，培养基配方中碳源用瓜尔豆胶酶解物的达到950μ/ml。

实施例 2：发酵生产β --甘露聚糖酶——用于酶解魔芋胶 

（l)将TQBm菌株（保藏号为 CCTCC No: M2011147）用划线接种在含酵母浸粉1.5%，胰蛋白胨1.5%，氯化钠0.5 %，魔芋胶酶解物（糖度10Bx）5.0%，琼脂2.0％的平面培养基上，33℃温度下培养 24 小时后使用。

（2）一级液体培养：用 500ml的三角瓶装 150ml 含酵母浸粉1.5%，胰蛋白胨1.5%, 氯化钠0.5%，魔芋胶酶解物（糖度10Bx）10.0%的液体培养基，10磅灭菌 20 分钟，接种一环，34℃ 摇床上震荡(26Or/min）培养 24 小时。

（3）用 7 升发酵罐装 5 升含酵母浸粉，胰蛋白陈，魔芋胶酶解物（糖度10Bx），无机盐复合成份，豆粕粉、玉米渣组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子150ml于35℃ 下通气搅拌18～24小时出罐放料。

（4）低温离心分离酶液：用大容量低温高速离心机以 600Or/min 的转速在 4 ℃ 条件下离心15～20 分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所说的酶液，置 0～4℃低温保存备用。此酶液专用于酶解魔芋胶，称为酶解魔芋胶专用酶液BM—Ⅰ。

（5）DNS 法检测发酵液酶活力。在 30～35℃，200～300r/min , pPH6.5～ 7. 5 条件下，酶活可达 2000μ/m1。 

实施例 3：发酵生产β --甘露聚糖酶——用于酶解瓜尔豆胶 

（l)将TQBm菌株（保藏号为 CCTCC No: M2011147）用划线接种在含酵母浸粉1.0%，胰蛋白胨l.0%，氯化钠0.5 %，瓜尔豆胶酶解物（糖度10Bx）5.0%，琼脂2.0％的平面培养基上，33℃温度下培养 24 小时后使用。

（2）一级液体培养：用 500ml的三角瓶装 150ml 含酵母浸粉1.5%，胰蛋白胨1.5%, 氯化钠0.5%，瓜尔豆胶酶解物（糖度10Bx）10.0%的液体培养基，10磅灭菌 20 分钟，接种一环，34℃ 摇床上震荡(26Or/min）培养 24 小时。

（3）用 7 升发酵罐装 5 升含酵母浸粉，胰蛋白陈，半纤维素之瓜尔豆胶，无机盐复合成份，豆粕粉、玉米渣组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子150ml于35℃下通气搅拌18～24小时出罐放料。

（4）低温离心分离酶液：用大容量低温高速离心机以 600Or/min 的转速在 4 ℃ 条件下离心15～20 分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所说的酶液，置 0～4℃低温保存备用。 

（5）DNS 法检测发酵液酶活力。在 30～35℃，200～300r/min , pPH6.5～7. 5 条件下，酶活可达 1350μ/m1，此酶液专用于酶解瓜尔豆胶，称为酶解瓜尔豆胶专用酶液BM—Ⅱ。

此种BM--Ⅱ酶液还可以高效酶解槐豆胶，田菁胶。

酶活的测定，采用 DNS 法测定酶液的活力。 

1、DNS法测酶活：以0.5%魔芋胶或瓜尔豆胶为底物，50℃水浴保温反应 10min, 加入DNS试剂，沸水浴中显色10min，用纯水稀释定容到25m1。用721分光光度计，在 520 nm处进行比色。通过测定OD值求出对应的还原糖含量，再用酶活公式计算求出酶活力。酶活力定义为：在50℃、pH6.0条样下，每分钟生成 1μmol 相当于D－甘露糖（D--mannose）的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

2、酶活计算公式为

公式 X = A × lml/V× F × 1 / T× 1000 / 180

式中： X：酶活力，μmol /ml，A：D－甘露糖生成量，mg。

3、降解测粘法：酶生产过程中，检验酶液质量的另一方法是：1ml酶液，于50℃，pH7.0左右，将10～20g半纤维素（底物浓度10～20%）降解成低聚甘露糖所需时间为 2～4小时，降解液粘度为60～120mPa.s。该方法和生产实践联系密切。

Claims (5)

1.一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽抱杆菌（ Bacillus subtill ) TQBm，其保藏号为 CCTCC No: M 211147。

2.一种β-甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于是使用权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 TQBm按下述步骤发酵生产的:

a、一级液体培养：即从斜面到 500ml三角瓶的放大培养，接种量为 TQBm 斜面菌一环，在 30～35℃，200～300r/min,  pH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～24小时，培养基配方按质量百分比计：魔芋胶酶解物<糖度10Bx>2.5～5.0%，胰蛋白胨0.5～2%，酵母浸粉0.5～2%，Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%，KH₂PO₄ 0.1～0.5%，NaCl 0.2～0. 5％，NH₄Cl 0.2～0.5，豆粕粉1～5%，玉米渣1～5%，其余为水，加水至500ml； 

b、7L小罐发酵产酶：以2～5％的接种量接种，培养条件：35～37 ℃，300～500r/min，pH6.5～7.5，培养18～24小时，培养基配方为魔芋胶酶解物<糖度10Bx>5～15%，无机盐复合成份1.5～3.5 %，胰蛋白胨0.5～2%，酵母浸粉0.5～2%，豆粕粉1～5%，玉米渣1～5%；发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为30％～80%；

所述无机盐复合成份为Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%、KH₂PO₄ 0.1～0.5%、NaCl 0.2～0. 5％、NH₄Cl 0.2～0.5；

c、酶的纯化

发酵完成后，用大容量低温高速离心机以 6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用0.1μm的微滤膜对粗滤液进行纯化处理，进一步除去残存的微量菌体，再用 6000D超滤膜进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶收得率≥85％；

d、β --甘露聚糖酶于低温0～4℃下贮存；此酶液称为酶解魔芋胶专用酶液BM—Ⅰ。

3.根据权利要求2所述的一种β-甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于在b）步骤中，

最佳配方:魔芋胶酶解物<糖度10Bx>10.0%，无机盐复合成份2.5%，酶母浸粉1.0%，胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%；最佳培养条件： 35士l℃，400r/min，pH7.0；最佳培养22小时；通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为65%； 

所述无机盐复合成份为Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%、KH₂PO₄ 0.1～0.5%、NaCl 0.2～0. 5％、NH₄Cl 0.2～0.5。

4.一种β-甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于是使用权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 TQBm按下述步骤发酵生产的：

a、一级液体培养：即从斜面到 500ml三角瓶的放大培养，接种量为 TQBm 斜面菌一环，在 30～35℃，200～300r/min,  pH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～ 24小时，培养基配方按质量百分比计：瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>2.5～5.0%，胰蛋白胨0.5～2%，酵母浸粉0.5～2%，Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%，KH₂PO₄ 0.1～0.5%，NaCl 0.2～0. 5％，NH₄Cl 0.2～0.5，豆粕粉1～5%，玉米渣1～5%，其余为水，加水至500ml； 

b、7L小罐发酵产酶：以2～5％的接种量接种，培养条件：35～37 ℃，300～500r/min，pH6.5～7.5，培养18～24小时，培养基配方为瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>5～15%，无机盐复合成份2.5～3.5 %，胰蛋白胨0.5～2%，酵母浸粉0.5～2%，豆粕粉1～5%，玉米渣1～5%，通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为30％～80%； 

c、酶的纯化

发酵完成后，用大容量低温高速离心机以 6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用0.1μm的微滤膜对粗滤液进行纯化处理，进一步除去残存的微量菌体，再用 6000D超滤膜进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶收得率≥85％；

d、β --甘露聚糖酶于低温0～4℃下贮存；此酶液称为酶解瓜尔豆胶专用酶液BM—Ⅱ。

5.根据权利要求4所述的一种β-甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于在b）步骤中，

最佳配方: 瓜尔豆胶酶解物<糖度10Bx>10.0%，无机盐复合成份2.5%，酶母浸粉1.0%，胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%；最佳培养条件： 35士l℃，400r/min，pH7.0；最佳培养22小时；通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为65%； 

所述无机盐复合成份为Na₂HPO₄??12H₂O 1～3%、KH₂PO₄ 0.1～0.5%、NaCl 0.2～0. 5％、NH₄Cl 0.2～0.5。