CN110551650B - 一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其筛选方法，包括枯草芽孢杆菌，其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18001，保藏日期为2019年6月19日。本发明从不同低温地区土壤的中分离筛选高效低温纤维素酶枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌其生物学特征为:在LB培养基上菌落较小，圆形，湿润，光滑，粘稠，易挑取，具有典型的细菌菌落特征；并研究其对温度、碳源、氮源、pH等的条件对纤维素酶影响。再通过应用在东北低温寒冷地区秸秆还田上，减少东北地区秸秆焚烧对环境的影响，为农业可持续发展奠定坚实基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体说是一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其筛选方法。
背景技术
低温微生物是指在低温环境下具有生长繁殖能力的微生物群体，它们在各种低温的环境中生长繁殖。根据微生物的生长温度的选择，将低温微生物分为两类，嗜冷型和耐冷型两种微生物，其中嗜冷型微生物的能够生长、繁殖的，而最适温度是在15℃左右，可以生存的温度是在20℃左右的微生物；耐冷型微生物是生存温度在0℃左右，能够生长、繁殖的最适温度在20℃左右的微生物。在生物圈中存在非常丰富的微生物资源和低温微生物资源，因此将微生物资源充分的运用到生活、生产实践中，而低温微生物的生长、繁殖的温度一般在常温下就可以进行，无需使用其他能源，极易得到，分布的也较为广泛，因此人们开始致力于研究低温微生物，也受到了一些专家和学者的关注。目前为止，对于低温微生物的开发和利用上相对较少，从国内外的研究进展来看，仍然是研究中、高温微生物的居多，而且对于土壤低温微生物降解菌的研究甚少。
迄今，国内外有记录报道的能够分泌纤维素酶的微生物菌种多为一些真菌菌群，比如：木霉菌、曲霉菌等，迄今，国内外有记录报道的能够分泌纤维素酶的微生物菌种多为一些真菌菌群，比如：木霉菌、曲霉菌等，低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌报道极少。
并且现阶段研究的产酶菌株种类有限，且多存在生产成本高、产酶能力和产酶量不够高效稳定、pH适应范围狭窄等缺陷，因此有必要继续探寻和开发高活性、作用范围更广泛的新菌种，进一步拓展纤维素酶类来源思路。但国内外学者对中高温纤维素酶的关注较高，对低温条件下产纤维素酶的菌涉猎不多。低温纤维素酶，在节能和降低成本方面更具优势和潜力，极具开发前景。
总之，一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其筛选方法尚未见报道。
发明内容
本发明目的是针对上述问题，提供了一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其筛选方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，枯草芽孢杆菌TY-1保藏编号为CGMCC No.18001，保藏日期为2019年6月19日。
枯草芽孢杆菌TY-1该菌16SrDNA序列发表在GenBank，登陆号为DPYBCB8U015，其16SrDNA序列为：
gggaatggcgggtgctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcggggcagagtgacaagtgtgcatgctgtcgtcagctcgtgtcatgagatgtgggttagtcccgcaacgagcgcaacctgatcttgtgccagcattcagtggcactcctaaggtgactgccggtgtccaaccacttcctgtcacttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagac。
枯草芽孢杆菌生物学特征为:在LB培养基上为菌落较小，圆形，湿润，光滑，粘稠，易挑取，具有典型的细菌菌落特征。
菌株的分离方法：
将采集的东北地区寒地森林土壤悬液按10％的接种量接种于含有100mg/L秸秆粉末的无机盐培养基中，10℃下摇床150r/min，培养3天后，以5℃下10％接种量转至秸秆浓度为300mg/L的无机盐培养基中，继续培养；按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基中的秸秆浓度依次为300mg/L、600mg/L、1000mg/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于5℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入秸秆浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，得到秸秆降解菌菌悬液。
无机盐培养基的组成为(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 2g，Na2HPO 41.3g，秸秆100～1000mg，NaCl 5g，余量为水定容到1L；培养基的PH＝4.8～7.2。
菌株的发酵条件优化：
a、碳源对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
无机盐培养基采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、玉米粉、甘油、乳糖、果糖、甘露醇、柠檬酸、可溶性淀粉中一种作为培养基中的碳源，配置液体培养液；取1mL枯草芽孢杆菌TY-1培养液接种于培养液中，1000mg/L无机盐液体秸秆粉发酵培养基，20℃120rmp振荡培养2天后，13000rmp离心15min，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选碳源；
b、氮源对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
无机盐培养基采用蛋白胨、酵母膏、黄豆粉、干酪素、尿素、硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏中一种作为培养基中的氮源，配置氮源液体培养液；其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选氮源；
c、无机盐对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
无机盐培养基采用MgSO4、NaCl、KH2PO4中一种作为培养基中的无机盐，配置不同无机盐的液体培养液；其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选无机盐；
d、初始pH对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
配置pH值2，3，4，5，6，7，8，9，10，11的液体培养基；其余方法同上，测定上清液测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选初始pH值；
e、温度对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
配置h液体培养基；取1mL枯草芽孢杆菌种子培养液接种于液体培养液中，放置于温度分别为15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃的振荡培养箱中，其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选温度。
一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，筛选步骤如下：
a.初筛：将5ml，1000mg/L无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，121℃下灭菌30min后冷却至室温，然后将1ml秸秆降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，5℃低温避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；将纯化后的菌株点种到纤维素刚果红培养基上，5℃培养4天.根据水解圈直径D与菌落直径d比值D/d的大小进行初选,即D/d值越大越好；
b、复筛：将50ml，1000mg/L无机盐培养基加到250ml三角瓶中,121℃下灭菌30min后冷却至室温，接着将每个三角瓶中加入1ml初筛得到的秸秆降解菌菌悬液，5℃下避光培养10天，检测秸秆残留量，同时设立空白对照组，空白对照组中用无菌水代替菌悬液，计算降解率；并将初筛得到的秸秆分解菌株的菌悬液1mL分别接种到1000mg/L无机盐液体发酵培养基中，5℃下培养3天，测定其纤维素酶活力，进行复选。
本发明的优点是：
1、本发明通过在采集东北地区低温森林土壤，富集分解秸秆低温培养，筛选到低温高效降解秸秆的微生物菌株，可在低温(5℃)下产生高效纤维素酶，分解秸秆，可用于东北低温冷凉地区秸秆还田的腐熟菌剂。通过上述菌剂低温发酵降解玉米秸秆，异位还田后改善土壤团粒结构，营造有益菌群优势，促进了土壤团粒结构的形成，极大地改善了土壤的微生态系统，增强了土壤透气性，提高了土壤保水保肥能力。
2、本发明使土壤有了可持续增产增收的发展潜力。并且有效转化秸秆中的养分，释出小分子养份与活性因子，改良土壤肥力，培肥土壤。
3、本发明生产的肥料产品具有独特的低温分解秸秆的特点，并且成本低廉，施用后可以有效改善改良土壤理化性状，提高种子出苗率，增强秧苗的抗旱、抗寒、病虫害的能力。
附图说明
图1是本发明的不同碳源条件下TY-1纤维酶变化图。
图2是本发明的不同氮源条件下TY-1纤维酶变化图。
图3是本发明的不同无机盐条件下TY-1纤维酶变化图。
图4是本发明的不同酸碱度条件下TY-1纤维酶变化图。
图5是本发明的不同温度条件下TY-1纤维酶变化图。
图6是本发明的5℃条件下液体培养条件下TY-1纤维酶酶学动力学变化图。
图7本发明的低温产纤维素酶枯草芽孢杆菌对玉米秸秆堆肥温度的影响图。
图8是本发明的低温产纤维素酶枯草芽孢杆菌对玉米秸秆堆肥中木质素的影响图。
图9是本发明的低温产纤维素酶枯草芽孢杆菌对玉米秸秆堆肥中纤维素的影响图。
具体实施方式
下面结合说明书附图1-9及实施例对本发明进一步详细说明。
一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，枯草芽孢杆菌TY-1保藏编号为CGMCC No.18001，保藏日期为2019年6月19日。
枯草芽孢杆菌TY-1该菌16SrDNA序列发表在GenBank，登陆号为DPYBCB8U015，其16SrDNA序列为：
gggaatggcgggtgctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcggggcagagtgacaagtgtgcatgctgtcgtcagctcgtgtcatgagatgtgggttagtcccgcaacgagcgcaacctgatcttgtgccagcattcagtggcactcctaaggtgactgccggtgtccaaccacttcctgtcacttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagac。
枯草芽孢杆菌生物学特征为:在LB培养基上为菌落较小，圆形，湿润，光滑，粘稠，易挑取，具有典型的细菌菌落特征。
菌株的分离方法：
将采集的东北地区寒地森林土壤悬液按10％的接种量接种于含有100mg/L秸秆粉末的无机盐培养基中，10℃下摇床150r/min，培养3天后，以5℃下10％接种量转至秸秆浓度为300mg/L的无机盐培养基中，继续培养；按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基中的秸秆浓度依次为300mg/L、600mg/L、1000mg/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于5℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入秸秆浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，得到秸秆降解菌菌悬液。
无机盐培养基的组成为(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 2g，Na2HPO 41.3g，秸秆100～1000mg，NaCl 5g，余量为水定容到1L；培养基的PH＝4.8～7.2。
菌株的发酵条件优化：
a、碳源对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
无机盐培养基采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、玉米粉、甘油、乳糖、果糖、甘露醇、柠檬酸、可溶性淀粉中一种作为培养基中的碳源，配置液体培养液；取1mL枯草芽孢杆菌TY-1培养液接种于培养液中，1000mg/L无机盐液体秸秆粉发酵培养基，20℃120rmp振荡培养2天后，13000rmp离心15min，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选碳源；
b、氮源对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
无机盐培养基采用蛋白胨、酵母膏、黄豆粉、干酪素、尿素、硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏中一种作为培养基中的氮源，配置氮源液体培养液；其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选氮源；
c、无机盐对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
无机盐培养基采用MgSO4、NaCl、KH2PO4中一种作为培养基中的无机盐，配置不同无机盐的液体培养液；其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选无机盐；
d、初始pH对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
配置pH值2，3，4，5，6，7，8，9，10，11的液体培养基；其余方法同上，测定上清液测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选初始pH值；
e、温度对枯草芽孢杆菌TY-1菌株生长及纤维素酶的影响；
配置h液体培养基；取1mL枯草芽孢杆菌种子培养液接种于液体培养液中，放置于温度分别为15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃的振荡培养箱中，其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选温度。
一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，筛选步骤如下：
a.初筛：将5ml，1000mg/L无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，121℃下灭菌30min后冷却至室温，然后将1ml秸秆降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，5℃低温避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；将纯化后的菌株点种到纤维素刚果红培养基上，5℃培养4天.根据水解圈直径D与菌落直径d比值D/d的大小进行初选,即D/d值越大越好；
b、复筛：将50ml，1000mg/L无机盐培养基加到250ml三角瓶中,121℃下灭菌30min后冷却至室温，接着将每个三角瓶中加入1ml初筛得到的秸秆降解菌菌悬液，5℃下避光培养10天，检测秸秆残留量，同时设立空白对照组，空白对照组中用无菌水代替菌悬液，计算降解率；并将初筛得到的秸秆分解菌株的菌悬液1mL分别接种到1000mg/L无机盐液体发酵培养基中，5℃下培养3天，测定其纤维素酶活力，进行复选。
本发明的枯草芽孢杆菌菌株酶学动力学上，在96小时达到纤维素酶峰值，最适碳源为果糖、最适氮源为酵母膏、最适无机盐为氯化钠、最适pH为7，最适发酵温度为25℃。其中酸碱度3-10之间、发酵温度从10℃-40℃均产生高含量的纤维素酶，说明该菌对温度和酸碱度均表现为耐受性较好，可以进一步开发成工业生产纤维素酶的功能菌株。
实施案例
CK：1吨玉米秸秆调节含水量达到50％。
TY-1：在CK基础上添加菌剂TY-1 6kg。
堆肥时间：2019.3.13-2019.4.25。
堆肥地点：沈阳。
具体流程:堆肥每堆1000kg，将玉米秸秆平行于地面整齐堆放，每升高20cm时，在其表面分别撒少许接种菌剂，同时踩踏紧实，堆高保持1.5高，外表面覆盖农用塑料薄膜，共堆积45d。
指标：测定不同时期的秸秆堆肥温度和秸秆的木质素、纤维素含量。
结果表明：在春季平均气温6℃条件下，通过添加低温产纤维素酶枯草芽孢杆菌，秸秆堆肥平均温度达到47.3℃，比对照提高50.7％，木质素比对照降低31.5％、纤维素含量比对照降低36.9％。说明低温产纤维素酶枯草芽孢杆菌可以提高堆肥温度，并加速分解秸秆中木质素和纤维素含量。
序列表
<110> 辽宁省农业科学院
<120> 一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其筛选方法
<141> 2019-08-09
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2022
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<213> Bacillus subtilis
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gggaatggcg ggtgctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
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tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga 1740
gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat 1800
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct 1860
cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg 1920
catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc 1980
caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag ac 2022
Claims (1)
1.一种低温产纤维素酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，枯草芽孢杆菌TY-1保藏编号为CGMCC No.18001，保藏日期为2019年6月19日。
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| Cellulolytic potential of probiotic Bacillus Subtilis AMS6 isolated from traditional fermented soybean (Churpi): An in-vitro study with regards to application as an animal feed additive;Ajay K. Manhar 等;《Microbiological Research》;20160323;第186-187卷;全文 * |
| 产纤维素酶低温菌株的分离鉴定;刘晓辉 等;《山东农业科学》;20141231;第46卷(第3期);全文 * |
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