CN103131680A

CN103131680A - 利用胁迫发酵生产重组耐热超氧化物歧化酶的方法

Info

Publication number: CN103131680A
Application number: CN2011103833988A
Authority: CN
Inventors: 朱虎; 刘建国; 曲剑波; 高欣良; 潘涛; 吕建仁
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及利用胁迫发酵生产重组耐热超氧化物歧化酶的方法，属于生物发酵工程技术领域，主要是应用铵盐和金属离子胁迫发酵技术，提高重组大肠杆菌表达耐热超氧化物歧化酶的水平，最高酶活可达489.18U/ml。运用本发明所述的发酵策略，成功地实现从摇瓶培养到发酵罐的顺利放大，使重组耐热酶在高密度培养时能够高水平表达。本发明具有高效价廉、操作简单、推广性强的特点，特别适用于极端生物酶制剂工业的放大生产。

Description

利用胁迫发酵生产重组耐热超氧化物歧化酶的方法

技术领域

本发明属于生物发酵工程技术领域，主要是应用NH₄ ⁺和Mn²⁺胁迫发酵策略，发酵放大生产重组耐热超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的方法，最高酶活可达489.18U/ml。

背景技术

SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，同时SOD是一种很有用途的药用酶。医学界已经证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。

热变性是导致酶失活的常见原因，在实际应用中，SOD的热稳定性是决定其能否商业化的一个主要因素。因此，从极端耐热微生物中克隆SOD基因，然后在E.coli中重组表达，从而制备耐高温SOD成为一个研究热点。用E.coli作为外源基因的原核表达系统进行重组酶生产的主要目的，是获取较高的细胞密度和高水平表达的重组酶。在大规模工业化的生产中，人们往往采用不同的分批补料方式、不同营养要素的配比、控制相关发酵参数(溶氧、pH值、温度)等手段，提高细胞密度，进而提高重组酶的表达水平。但是，许多重组E.coli菌株在摇瓶培养时，其目标酶的表达水平较高，但在发酵罐放大培养时，表达水平就下降了；在工业生产中重组菌株在低细胞密度时，表达水平较高，但在高密度培养时，表达水平就明显下降了。为了避免和减少以上方法的缺陷，研发新型发酵调控策略，利用重组E.coli大规模生产耐热SOD，将具有十分重要的意义。

本发明首先从嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27中克隆SOD基因，构建重组载体，实现耐热Mn-SOD的异源表达；然后公开了利用胁迫发酵技术放大生产重组耐热Mn-SOD的方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足工业化生产的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的胁迫发酵生产重组耐热超氧化物歧化酶的方法。

本发明采取的技术路线是：

1.以嗜热栖热菌(T.thermophilus HB27)基因组DNA为模板，采用PCR技术克隆SOD基因，PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a⁽⁺⁾表达载体上，产生重组质粒pETSOD，将重组载体pETSOD导入大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))，获得基因重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETSOD。

2.在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)或加糖LB培养基(含50μg/ml kanamycin，10g/1glucose)中加入铵盐或金属离子，NH₄ ⁺或金属离子的浓度分别为50～400和1～10mmol/L。所用的氨离子来源于过硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、氯化铵、柠檬酸铵、硫酸铵；所用的金属离子有Na⁺，K⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Sr²⁺，Al³⁺，Zn²⁺。

3.将E.coli BL21(DE3)/pETSOD培养3小时(37℃，200rpm)，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至浓度为1mM，培养温度调至30℃，继续培养5小时。

4.取步骤3得到的发酵液30ml，离心10min(离心条件为4℃，离心力为10,000×g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TE Buffer(pH 8.0)3ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间3s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液测定酶活，SOD酶活采用邻苯三酚自氧化法测定。

5.利用确定的最佳NH₄ ⁺(140mM)和Mn²⁺(8mM)浓度，在5-L发酵罐上进行耐热Mn-SOD的放大生产，胁迫发酵方法如下：在铵盐胁迫发酵时，先将E.coli BL21(DE3)/pETSOD培养 3小时(37℃，200rpm)，然后同时加入诱导剂IPTG(1mM)和NH₄ ⁺(140mM)，并将培养温度调至30℃，继续培养6小时；在金属离子胁迫发酵时，先将E.coli BL21(DE3)/pETSOD培养3小时(37℃，200rpm)，然后加入诱导剂IPTG(1mM)，并将培养温度调至30℃，诱导表达2小时后，加入Mn²⁺(8mM)，继续培养4小时；在双胁迫发酵时，先将E.coli BL21(DE3)/pETSOD培养3小时(37℃，200rpm)，然后同时加入诱导剂IPTG(1mM)和NH₄ ⁺(140mM)，并将培养温度调至30℃，诱导表达2小时后，加入Mn²⁺(8mM)，继续培养4小时。样品制备及SOD活性分析采取步骤4所述方法。

本发明产生的技术效果

本发明采用在发酵培养基中添加一定浓度氨盐和金属离子的方法，提高重组耐热Mn-SOD的表达水平，最高酶活达到489.18U/ml；而且利用该胁迫发酵技术，可以成功实现E.coli BL21(DE3)/pETSOD从摇瓶到发酵罐的放大培养，在高细胞密度时，提高重组耐热Mn-SOD的表达水平。该胁迫发酵技术具有高效价廉、操作简单和推广性强的特点，特别适用于极端生物酶制剂工业的放大生产。

具体实施方式

实施例1

(1)在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)中，加入一定体积的氨盐((NH₄)₂S₂O₈，NH₄NO₃，NH₄Ac，NH₄Cl，(NH₄)₂HC₆H₅O₇，或(NH₄)₂SO₄)，使培养基中NH₄ ⁺浓度达到100mM，并设空白对照；

(2)将E.coli BL21(DE3)/pETSOD培养3小时(37℃，200rpm)，加入诱导剂IPTG至浓度为1mM，培养温度调至30℃，继续培养5小时；

(3)取样、破碎及酶活测定参照“本发明采取的技术路线”部分。

实验结果如图1所示，醋酸铵能有效促进E.coli BL21(DE3)/pETSOD表达重组耐热Mn-SOD，与对照相比(44.42U/ml)，SOD活性可达129.8U/ml。

实施例2

(1)在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)中，加入不同浓度的NH₄Ac，使培养基中NH₄ ⁺浓度达到50～400mM，并设空白对照；

实验结果如图2所示，当NH₄ ⁺浓度从50增加到140mM时，耐热Mn-SOD活性也随之增加，最高可达268.51U/ml；当NH₄ ⁺浓度继续增加时，SOD活性受到抑制，当NH₄ ⁺浓度为400mM时，SOD活性仅仅为83.68U/ml，与对照水平相当(64.19U/ml)。

实施例3

(1)在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)中接入E.coli BL21(DE3)/pETSOD菌株，进行摇床培养(37℃，200rpm)，分别在培养时间为0，1，2，3，4，5，6或7小时时，加入终浓度为140mM的NH₄ ⁺，并在培养3小时后，加入诱导剂IPTG至浓度为1mM，培养温度调至30℃，继续培养5小时；

(2)取样、破碎及酶活测定参照“本发明采取的技术路线”部分。

实验结果如图3所示，NH₄ ⁺添加时间对SOD活性的影响并不大，培养3小时后添加NH₄ ⁺，SOD酶活性最高可达479.9U/ml，是对照(112.72U/ml)的4.26倍；由于培养3小时后，也是诱导剂加入的时间，因此为了不影响菌体生长，我们选择在添加诱导剂时一起加入NH₄ ⁺，这样既简化了操作，又提高了SOD酶产量。

实施例4

(1)在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)中，加入一定浓度的金属离子(Na⁺，K⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Sr²⁺，Al³⁺，Zn²⁺)，使培养基中金属离子浓度达到5mM，并设空白对照；

实验结果如图4所示，Na⁺，K⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺和Al³⁺能显著提高SOD表达水平，其中Mn²⁺是最有效的金属离子，Mn²⁺的添加能使SOD酶活达到480.73U/ml；与对照(109.868U/ml)相比，Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺和Sr²⁺明显抑制SOD表达。

实施例5

(1)在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)中，加入不同浓度的MnCl₂，使培养基中Mn²⁺浓度达到1～10mM，并设空白对照；

实验结果如图5所示，当Mn²⁺浓度从1增加到10mM时，SOD活性的变化不明显，当Mn²⁺浓度为8mM时，耐热Mn-SOD活性最高可达489.18U/ml。

实施例6

(1)在LB培养基(含50μg/ml kanamycin)中接入E.coli BL21(DE3)/pETSOD菌株，进行摇床培养(37℃，200rpm)，分别在培养时间为0，1，2，3，4，5，6或7小时时，加入终浓度为8mM的Mn²⁺，并在培养3小时后，加入诱导剂IPTG至浓度为1mM，培养温度调至30℃，继续培养5小时；

实验结果如图3所示，Mn²⁺添加时间对SOD活性有微小的影响，诱导培养2小时后添加Mn²⁺，SOD酶活性最高可达485.65U/ml，是对照(112.72U/ml)的4.31倍；由于Mn²⁺在一定程度上影响细胞生长，因此，我们选择在诱导培养2小时后加入Mn²⁺，不和诱导剂IPTG一起加入，这样也有利于提高SOD酶产量。

实施例7

本发明所述的胁迫发酵技术应用于耐热Mn-SOD的放大生产，相关步骤简述如下：

(1)菌种：宿主为E.coli BL21(DE3)，表达质粒为pET28a⁽⁺⁾，构建重组质粒pETSOD，并获得基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pETSOD；

(2)发酵罐培养

从保种平板上，挑取1个E.coli BL21(DE3)/pETSOD菌落接入到装有50ml的LB培养基中，同时加入50μg/ml kanamycin，摇床培养8小时(37℃，200rpm)；取此培养液5ml接入100ml的LB培养基中，同时加入50μg/ml kanamycin，摇床培养5小时(37℃，200rpm)；再将此活化的种子液100mL加入到5-L发酵罐中(工作条件3.51)，同时加入kanamycin使得浓度达到50μg/ml；初始培养温度设定37℃，诱导表达之后温度改为30℃，搅拌转速为200rpm，发酵罐通气量设为每升发酵液每分钟3.0l空气，pH自然；在铵盐胁迫发酵时，培养3小时后，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG和140mM NH₄ ⁺，继续培养6小时；在金属离子胁迫发酵时，培养3小时后，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG，诱导培养2小时后，加入8mM的Mn²⁺，继续培养4小时；在NH₄ ⁺和Mn²⁺双胁迫发酵时，培养3小时后，加入IPTG诱导剂(1mM)和NH₄ ⁺(140mM)，诱导表达2小时后，加入Mn²⁺(8mM)，继续培养4小时；同时分批培养设为对照。

实验结果如图7所示，NH₄ ⁺和Mn²⁺添加能有效提高耐热Mn-SOD的产量，在Mn²⁺胁迫发酵实验中，诱导表达5小时后，SOD活性最高可达482.04U/ml，与分批发酵的最大SOD产量187.51U/ml相比，提高了157％；NH₄ ⁺也明显刺激了Mn-SOD的表达，在NH₄ ⁺胁迫发酵实验中，诱导表达4小时后，SOD活性最高可达413.45U/ml，比对照提高了121％；在NH₄ ⁺和 Mn²⁺双胁迫发酵时，SOD表达水平比对照有明显提高，但是不如NH₄ ⁺和Mn²⁺分别单独添加时SOD产量高，也就是在双胁迫发酵时，NH₄ ⁺和Mn²⁺没有体现出协同效应。因此，在大规模培养时，我们选择单独添加NH₄ ⁺或Mn²⁺的胁迫发酵策略，提高Mn-SOD的产量。

附图说明

图1是不同铵盐种类对SOD酶活影响图

图2是不同NH₄ ⁺浓度对SOD酶活影响图

图3是NH₄ ⁺不同补加时间对SOD酶活影响图

图4是不同金属离子对SOD酶活影响图

图5是不同Mn²⁺浓度对SOD酶活影响图

图6是Mn²⁺不同补加时间对SOD酶活影响图

图7是胁迫发酵策略在5-L发酵罐放大实验中的应用图

Claims

1.将氨盐和金属离子胁迫发酵策略应用于重组耐热锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的生产放大，其特征在于，在发酵培养基中，添加一定量的NH₄ ⁺和Mn²⁺，其浓度分别为100～160和1～10mmol/L。

2.根据权利要求1所述的发酵胁迫方法，其特征在于，所用重组菌株为E.coli BL21(DE3)/pETSOD。

3.根据权利要求1所述的发酵胁迫方法，其特征在于，所用的氨离子来源于过硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、氯化铵、柠檬酸铵、硫酸铵；所用的金属离子有Na⁺，K⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Sr²⁺，Al³⁺，Zn²⁺。