CN101985614A

CN101985614A - 一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法

Info

Publication number: CN101985614A
Application number: CN2010105044690A
Authority: CN
Inventors: 曲剑波; 朱虎; 刘建国; 吕建仁
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2011-03-16

Abstract

本发明提供了一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用金属螯合层析分离技术，采用自制的超大孔金属螯合介质，经过发酵液离心、细胞破碎、破碎液离心和层析四个简单步骤，即可从重组大肠杆菌中快速分离高纯度的耐高温锰超氧化物歧化酶，可达常规色谱分离速度5倍以上，SOD酶活性损失小，回收率高，纯度达到85％以上，为低成本、高纯度SOD酶的批量生产提供了可能。

Description

一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法

技术领域

本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超大孔金属螯合层析介质快速分离纯化在大肠杆菌中表达的重组耐高温锰超氧化物歧化酶(SOD)的方法，产品纯度达85％以上。

背景技术

SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，同时SOD是一种很有用途的药用酶。医学界已经证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用(Bioehem J，1991，274：153-158)。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。

热变性是导致酶失活的常见原因，在实际应用中，SOD的热稳定性是决定其能否商业化的一个主要因素。从极端耐热微生物中克隆SOD基因，然后在大肠杆菌中重组表达，从而制备耐高温SOD成为一个研究热点(Extremophiles，2005，9：1-6；J Mol Biol，270：259-274；JBiochem，1999，126：218-225)。在本发明中我们从嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27中克隆SOD基因，构建重组载体，在大肠杆菌中表达耐高温Mn-SOD。

目前，从基因工程菌中分离SOD的方法主要有：多级离心分离、双水相萃取、超滤、层析等。然而，多级离心分离、双水相萃取、超滤分离的SOD纯度不高，通常只能得到粗酶制品，作为医药级产品达不到应用标准。层析法虽然能够得到高纯度的SOD，但是现有的生物大分子层析介质均属于软基质(琼脂糖、葡聚糖、纤维素等)，孔径小，分离速度慢，很难进行工业放大。

美国生物系统公司上世纪90年代开发了一种超大孔聚苯乙烯树脂(J Chromatog，1990，519：1-29)，粒径8-10μm，平均孔径有100nm和400nm两种，被用于反相色谱和离子交换色谱对生物大分子进行快速、高分离度的制备分离。这种超大孔介质机械强度高，传质速度快，有效降低了“停滞流动相的传质阻力”，分离速度比常规介质快10-100倍。但由于微球制备方法复杂，重复性差，近年来少有POROS介质的应用报道。Gustavsson等人依据这一原理(J.Chromatogr.A，1999，830(2)：275-284)，将琼脂糖制成同时具有特大孔和扩散孔的色谱介质，用于生物大分子的分离，分离时间比常规琼脂糖珠体分别快5和3倍。但是由于琼脂糖微球自身属于多糖类软凝胶，机械强度是该微球应用的一个限制因素。目前，在蛋白质等生物大分子分离纯化领域，超大孔介质的应用报道较少，或局限于实验室规模分离模型蛋白，应用于分离纯化耐高温SOD酶的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的重组耐高温SOD酶快速分离制备方法。

本发明采取的技术路线是：

1.以嗜热栖热菌(T.thermophilus HB27)基因组DNA为模板，采用PCR技术克隆SOD基因，PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a⁽⁺⁾克隆/表达载体上，产生重组质粒p28ASOD，将重组载体p28ASOD导入大肠杆菌(E.coli)，获得基因重组工程菌E.coli/p28ASOD。

2.将重组大肠杆菌培养至OD600约为0.6(37℃，250rpm)，加入诱导剂IPTG至浓度为1mM；继续培养8小时。

3.取步骤2得到的发酵液500ml，离心15min(离心条件为4℃，离心力为1000×g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TE Buffer(pH 8.0)5ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液备用。

4.利用超大孔金属螯合介质层析柱对步骤3所得上清液进行上样，洗脱，一步得到目标产品。

本发明步骤4中所用的超大孔金属螯合介质为自制，平均粒径55μm，孔径300-500nm，金属螯合配基为亚氨基二乙酸(IDA)，金属离子为Ni²⁺，金属螯合量为40μmol/ml介质。

本发明步骤4中超大孔介质的金属螯合配基还可以为次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)、N，N，N-三羧甲基乙二胺(TED)，金属离子还以为Cu²⁺，Co²⁺，Zn²⁺。金属离子螯合量范围10-120μmol/ml介质。

本发明中的技术路线4是关键步骤，所用超大孔介质的孔径范围在100-1000nm。如果所用超大孔介质孔径过小(＜100nm)，则传质速率变慢，操作压力过高，无法保证分离速度；如果超大孔介质孔径过大(＞1μm)则介质的机械强度降低，容易变形或破碎，无法保证正常操作。

本发明产生的技术效果

本发明所述耐高温SOD酶的快速分离工艺，仅涉及离心、破碎、上柱分离三个步骤，分离速度快，可达常规色谱分离速度5倍以上，SOD酶活性损失小，回收率高，纯度达到85％以上，为低成本、高纯度SOD酶的批量生产提供了科学依据。

附图说明

图1实施例一2528cm/h流速下SOD酶的分离色谱图

图中P0为穿透峰，P1为洗脱峰；流动相流速为2528cm/h。

图2实施例二3251cm/h流速下SOD酶的分离色谱图

图中P0为穿透峰，P1为洗脱峰；流动相流速为3251cm/h。

图3实施例三1806cm/h流速下SOD酶的分离色谱图

图中P0为穿透峰，P1为洗脱峰；流动相流速为1806cm/h。

从以上三个图中可以看出，不同流速下洗脱峰均只有一个，且峰形完好。

具体实施方式

实施例一

取发酵液500ml，离心15mm(离心条件为4℃，离心力为1000×g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TE Buffer(pH 8.0)5ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，上清液即为粗酶液。取粗酶液5ml，利用上样器上样，在装有半制备级超大孔镍柱(300×10mm I.D.)的 purifier 100system上进行层析分离，分离条件：流动相，20mM磷酸缓冲液+0.5M NaCl+0.12M咪唑，pH 7.4；洗脱相，20mM磷酸缓冲液+0.5M NaCl+0.5M咪唑，pH 7.4；洗脱方式，阶跃洗脱；操作流速，2528cm/h。收集洗脱峰(图1)即为耐高温SOD酶溶液，在此条件下SOD酶的分离时间为3min，回收率为89.8％，纯度为85.36％。

实施例二

取发酵液500ml，离心15min(离心条件为4℃，离心力为1000×g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TE Buffer(pH 8.0)5ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，上清液即为粗酶液。取粗酶液5ml，利用上样器上样，在装有半制备级超大孔镍柱(300×10mm I.D.)的

purifier 100system上进行层析分离，分离条件：流动相，20mM磷酸缓冲液+0.5M NaCl+0.1M咪唑，pH 7.4；洗脱相，20mM磷酸缓冲液+0.5M NaCl+0.5M咪唑，pH 7.4；洗脱方式，阶跃洗脱；操作流速，3251cm/h。收集洗脱峰(图2)即为耐高温SOD酶溶液，在此条件下SOD酶的分离时间为2min，回收率为89.6％，纯度为83.84％。

实施例三

取发酵液500ml，离心15min(离心条件为4℃，离心力为1000×g)，用1M的TE Buffer (pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TE Buffer(pH 8.0)5ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，上清液即为粗酶液。取粗酶液5ml，利用上样器上样，在装有半制备级超大孔镍柱(300×10mm I.D.)的

purifier 100system上进行层析分离，分离条件：流动相，20mM磷酸缓冲液+0.5M NaCl+0.1M咪唑，pH 7.4；洗脱相，20mM磷酸缓冲液+0.5M NaCl+0.1M咪唑，pH 5；洗脱方式，阶跃洗脱；操作流速，1806cm/h。收集洗脱峰(图3)即为耐高温SOD酶溶液，在此条件下SOD酶的分离时间为4min，回收率为94.1％，纯度为86.05％。

Claims

1.一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，是以装有超大孔金属螯合介质的色谱柱处理粗酶液，通过一步洗脱获得SOD酶，分离速度快，产品纯度高。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超大孔金属螯合介质基质为球形有机树脂，平均孔径范围100-1000nm，优选500nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超大孔金属螯合介质螯合配体选自次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)、N，N，N-三羧甲基乙二胺(TED)一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超大孔金属螯合介质金属离子可为Cu²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Zn²⁺中任一种，金属离子螯合量范围10-120μmol/ml介质。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，除了所分离的SOD酶，还可快速分离其他带有组氨酸标签的人工重组蛋白。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的层析操作流速可在180-3612cm/h范围内变动，优选2528cm/h.

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的层析操作，根据实际情况既可以是线性梯度洗脱，也可以是阶跃梯度洗脱。