CN104946606A - 一种基因工程改造的耐热抗逆sod及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐高温的超氧化物歧化酶及其编码基因和应用，该超氧化物歧化酶具有如下述氨基酸残基序列的蛋白质：SEQ ID NO.1。其表达方法，是构建含有耐热超氧化物歧化酶基因吃重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经诱导使耐热超氧化物歧化酶基因表达。本发明的表达产物具有突出的耐热性和良好的抗逆性，包括对酸碱、有机溶剂、清洁剂、蛋白变性剂和抑制剂的抗性，且易纯化，稳定性好，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种基因工程改造的耐热抗逆SOD及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别涉及一种耐热超氧化物歧化酶及其编码基因与其在耐热冲氧化物歧化酶。

背景技术

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase.简称 SOD）是美国科学家 Mccord 和Fridovich1969 从牛血红细胞中发现的一种含有金属离子的酶。该酶能专一的清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是机体对抗自由基的第一道防线，在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用。基于结合金属辅基的不同，可以将 SOD 分为四大类：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。SOD具有抗炎，抗辐射，抗肿瘤，抗衰老等作用,并用于病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病和癌症的临床治疗；在食品工业中可添加作为保健食品的功效因子；在化妆品中可添加用于防晒、抗氧化及防止皮肤衰老、防止瘢痕形成等。

由于SOD的营养和保健功能，国内市场上已经出现了许多 SOD 产品，如含有 SOD 的啤酒，水果，大米，口服液等等，产品加工中大多涉及加热、有机提取等步骤，常温SOD 在此过程有半衰期短，遇高温、变性剂、有机溶剂易失活等不利因素。这不仅使含SOD的产品开发增加了困难，限制了产品的加工工艺，而且使含SOD的产品有效期大大缩短，迫使产品的存储、运输销售周期变短，增大了经营困难。因此对天然SOD进行修饰改造，增加其对高温、酸碱、有机溶剂、清洁剂、蛋白变性剂和抑制剂等的抗逆性就显得十分必要。目前对SOD的改造方法主要有基因工程方法、化学修饰、酶固定化以及研究SOD模拟物。

本发明涉及一种基因工程改造的耐热抗逆SOD及其编码基因。ApSOD是来自严格需氧极端嗜热古生菌Aeropyrumpernix的一种天然嗜热SOD,具有潜在的工业应用价值。利用基因工程在其N端添加一段氨基酸序列，重组表达得到一种具有更强的耐高温、酸碱、有机溶剂、清洁剂、蛋白抑制剂和变性剂的高稳定性SOD,有利于在保健食品、化妆品、啤酒饮料等产品中的应用，是理想的生化功能添加剂，具有广阔市场和应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的、耐高温的超氧化物歧化酶及其编码基因。

本发明的超氧化物歧化酶SOD,名称为rApSOD，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1） 序列表中的SEQ ID NO.1;

2）将序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸的取代、缺失或添加且具有平衡机体内氧自由基作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.1由455个氨基酸残基组成。

MDDQTLFAQYAAEVNEWGEQVKQVLELRGASIDGASTLLQFIAEHDGKWTEEAVRELTRLVDDVYAAALRHYAIEAAEWGKQVEHALSMRGAAEDIGLSSLLARIEEHGDEWTEEEIHELQLLVDDVYARAIRLVEPLSDGQEEDLTRQEEVSALPEQEGGNREQMSKGTERSGEHKGDSEQEPVVAAERAEPFIASSTDSPDGEQLHEGDTMDEEWRHNADMTDKERLPEEGVTDGERQRAVSFKRYELPPLPYNYNALEPYIIEEIMKLHHQKHHNTYVKGANAALEKIEKHLKGEIQIDVRAVMRDFSFNYAGHIMHTIFWPNMAPPGKGGGTPGGRVADLIEKQFGGFEKFKALFSAAAKTVEGVGWGVLAFDPLTEELRILQVEKHNVLMTAGLVPILVIDVWEHAYYLQYKNDRGSYVENWWNVVNWDDVEKRLEQALNNAKPLYLLPQ

上述耐热超氧化物歧化酶的编码基因（rApsod）是具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.2的DNA序列；

2）编码序列中SEQ ID NO.1蛋白质序列的多核苷酸；

  序列表中的SEQ ID NO.2由1368个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1268位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列的蛋白质。

具体的碱基组成如下：

ATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCCAGTATGCGGCTGAAGTGAACGAATGGGGAGAACAAGTCAAGCAGGTGCTGGAACTGCGCGGGGCAAGCATTGATGGCGCTTCTACACTGTTGCAGTTTATCGCCGAACATGACGGGAAGTGGACGGAAGAGGCAGTCCGTGAGCTCACGCGCCTTGTTGATGACGTGTACGCTGCTGCGCTTCGTCACTATGCCATCGAAGCGGCTGAGTGGGGGAAACAAGTAGAACACGCTCTATCCATGCGCGGAGCAGCGGAGGACATCGGGCTTTCTTCTTTATTGGCGCGCATTGAAGAACACGGCGACGAGTGGACGGAGGAAGAAATTCATGAACTGCAACTCCTTGTCGACGACGTGTACGCTCGAGCCATCCGCCTTGTCGAACCGCTATCCGACGGGCAGGAGGAAGACTTGACGCGGCAGGAAGAAGTCTCGGCTTTGCCTGAACAGGAGGGCGGCAACAGAGAGCAAATGAGCAAGGGAACTGAACGGTCAGGCGAACACAAGGGGGATAGCGAACAAGAGCCGGTCGTTGCAGCTGAACGGGCGGAGCCGTTCATAGCCTCATCAACGGATTCTCCTGATGGCGAACAGCTGCATGAGGGAGATACGATGGACGAAGAATGGCGGCACAATGCAGACATGACAGATAAGGAGCGGCTGCCGGAGGAAGGTGTGACCGATGGTGAGCGGCAACGGGCGGTTTCGTTTAAGAGGTACGAGCTCCCCCCGCTACCCTACAACTACAACGCCCTGGAGCCCTACATTATAGAGGAGATAATGAAGCTGCACCACCAGAAGCATCACAACACGTATGTCAAAGGGGCTAACGCCGCACTCGAGAAGATAGAGAAGCATCTCAAGGGCGAGATACAGATAGACGTTAGGGCTGTCATGAGGGACTTCAGCTTCAACTACGCAGGCCACATAATGCACACCATATTCTGGCCCAACATGGCCCCGCCCGGCAAGGGCGGTGGAACACCTGGCGGCAGGGTGGCTGACCTCATAGAGAAGCAGTTCGGCGGCTTCGAGAAGTTCAAGGCCCTCTTCAGCGCCGCTGCGAAGACGGTGGAGGGCGTCGGGTGGGGCGTGCTCGCGTTCGACCCTCTGACAGAGGAGCTCAGGATACTGCAGGTGGAGAAGCACAACGTCCTCATGACGGCGGGCCTTGTGCCCATACTAGTTATTGACGTGTGGGAGCACGCCTACTACCTCCAGTACAAGAACGACAGGGGCAGCTACGTCGAGAACTGGTGGAACGTGGTCAACTGGGACGACGTTGAGAAGAGGCTGGAGCAGGCTCTAAACAACGCGAAGCCCCTCTACCTGCTCCCCCAGTAG

含有本发明的表达载体及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增rApsod中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述耐热超氧化物歧化酶的方法。

本发明所提供的表达上述耐热超氧化物歧化酶的方法，是构建含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使耐热超氧化物歧化酶基因表达。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为E.coli BL21（DE3）。

用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，优选为可表达His6-Tag结构的pET-28a（+）。

用于基因工程改造的N端基因序列（N-rApsod）来源于GeobacillusthermodenitrificansNG80-2Fe/Mn-sod（GTNG_2215）的N端1-732bp碱基。提取GeobacillusthermodenitrificansNG80-2基因组为模板，

以引物序列5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC和5' CGTACCTCTTAAACGAAACCGCCCGT扩增序列N-rApsod；天然嗜热ApSOD基因序列来源于Yamano et al，J Biochem 126:218-225，并由金唯智生物科技（北京）有限公司合成并克隆到载体pET-28a（+）。以含ApSOD基因序列的pET-28a（+）为模板，以引物序列5'ACGGGCGGTTTCGTTTAAGAGGTACG和5'CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC扩增序列Apsod。用重叠PCR方法，以N-rApsod和Apsod为模板，以引物序列5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC和5' CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC扩增得到耐热超氧化物歧化酶基因rApsod。

以pET-28a（+）为出发载体构建的含有超氧化物歧化酶基因rApsod的重组表达载体为pET-28a/rApSOD。重组表达载体pET-28a/rApSOD可按照常规方法构建。

培养含有本发明的耐热超氧化物歧化酶编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入的IPTG的浓度为0.1-1mM，优选为0.2mM，诱导温度为25-37℃，优选30℃，诱导时间为3-5小时。所述对表达产物耐热超氧化物歧化酶进行纯化的方法优选为Ni柱亲和层析法。

本发明更进一步公开了耐热超氧化物歧化酶在制备耐高温SOD酶方面的应用。本发明通过基因工程改造Aeropyrumpernix中的天然嗜热Fe/Mn-SOD得到一种新的超氧化物歧化酶基因rApsod，其编码的超氧化物歧化酶rApSOD最适温度为70℃，最适pH为7，100℃半衰期为11.5h，具有极高的热稳定性，酸碱、有机溶剂、清洁剂、蛋白变性剂和抑制剂耐受性，可应用于医药、卫生保健、食品或化妆品加工。

本发明公开的一种新的、耐高温的超氧化物歧化酶及其编码基因所具有的积极效果在于：

（1）利用基因工程改造所获得的SOD酶是一种耐高温酶，可在高温条件下保持极好的稳定性，克服了中温酶（20℃~50℃）及低温酶（2℃~20℃）在应用过程中出现的化学性质不稳定现象，有利于其在食品、化妆品、药品及保健品领域的工业应用。

（2）本专利中的SOD酶具有良好的抗逆性，可耐受酸碱、有机溶剂、清洁剂、蛋白抑制剂和变性剂，更有利于SOD酶制剂在成分复杂的产品中的添加与应用。

（3）本专利中的SOD酶具有良好的稳定性，重组表达方法简单，不仅可以使添加了SOD酶制剂的产品运用更加多样的加工工艺，而且可以延长产品的储存、运输销售周期，操作简便、可行性强、适应性好，成本低廉，具有重要的工业应用前景和实际意义。

附图说明：

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。需要特别说明的是实施例中所用到的试剂均由市售，嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2（CGMCC No. 1228）已保藏在国家菌种保藏中心，ApSOD基因序列由金唯智生物科技（北京）有限公司合成并克隆到载体pET-28a（+）。

实施例1

构建编码Aeropyrumpernix的Fe/Mn-SOD全序列基因（Apsod）的克隆，并且构建编码重组SOD（SOD-GTNG_2215的N端序列和Aeropyrumpernix的Fe/Mn-SOD的重组结合成重组SOD）全序列基因（rApsod）的克隆。并且测定表达蛋白的酶活性及抗逆性。

1. 嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2（CGMCC No. 1228）总DNA的提取

在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2（Geobacillusthermodenitrificans该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1228），取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离心收集菌体，菌体悬于250μL50mMTris缓冲液中（pH8.0），加入10μL0.4M EDTA（pH8.0），混匀后37℃保温20min，之后加入30μL20mg/L溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μL20mg/L蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μL10%SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100μLTE缓冲液（pH8.0，10mMTris，1mMEDTA），加入10mg/L RNase 2μL，65℃保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μLTE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=1.95，A260=0.73。

2. 超氧化物歧化酶基因的克隆和筛选

2.1 Aeropyrumpernix的Fe/Mn-SOD全序列基因（Apsod）由金唯智生物科技（北京）有限公司合成并克隆到载体pET-28a（+）上，构成重组质粒pET-ApSOD。

2.2 扩增重组SOD的DNA序列（rApsod）

2.2.1 扩增NG80-2 Fe/Mn-SOD的N端序列基因（N-rApsod），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr

上游引物：5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC3'

下游引物：5'CGTACCTCTTAAACGAAACCGCCCGT3'

2.2.2 扩增Aeropyrumpernix的Fe/Mn-SOD全序列基因（Apsod），取pET-ApSOD （约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr

上游引物：5'ACGGGCGGTTTCG TTTAAGAGGTACG3'

下游引物：5'CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC3'

2.2.3 扩增重组SOD的DNA序列（rApsod），N-rApsod和Apsod各取0.25μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr

上游引物：5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC 3'

下游引物：5' CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC 3'

rApsod的PCR产物纯化后用EcoRI/ HindIII双酶切，以上酶切产物分别与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，得到重组质粒pET-rApSOD。将pET-ApSOD与pET-rApSOD转化感受态大肠杆菌DH5α（本实验室保存）后，涂于含50μg/mL Kan（卡拉霉素）的LB固体培养基上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。将上述重组质粒pET-ApSOD与pET-rApSOD转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命名为BL01与BL02。

3.重组超氧化物歧化酶的纯化和特性

将上述重组菌BL01和BL02单克隆分别接入20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1%（V/V）接种量接入200mL含50μg/mL Kan的LB培养基（共2个摇瓶），37℃，220rpm/min培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM, 30℃, 180rpm/min诱导3小时。诱导完后离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl（pH8.0）缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose）镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。理论上推算ApSOD和rApSOD的分子量分别为24.6kD和51.6 kD，与SDS-PAGE检测结果一致。

4.  重组超氧化物歧化酶活性测定

3mL反应混合液中14.5mML-甲硫氨酸加入2.7mL，30μL EDTA-Na₂加入10μL，2.25mM NBT加入100μL，60μM核黄素加入100μL，PBS（pH7.8）加入90μL，加入10μL的样品酶液。各试剂加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸钠缓冲液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于25℃光强为4000Lux条件下光照15min，然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定各样品管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）

4.1 最适酶活性温度

将纯化的超氧化物歧化酶，分别在不同温度条件下（20℃，30℃，40℃，50℃,60℃，70℃，80℃，90℃，100℃）催化反应，测定超氧化物歧化酶的活性，将所得最高的酶活力定义为100％，分别计算各个温度条件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性（采用相对酶活性来表示，即在不同温度条件下的剩余的酶活性占酶活性最大值的百分比）。结果表明（见图1），ApSOD在50℃左右酶活性最高，随着温度继续升高，酶活性大幅降低，100℃时剩余活性仅为44%。rApSOD在70℃左右时酶活性最高，随着温度继续升高，酶活性逐渐降低，但是在100℃仍保留58%的剩余酶活性。可见rApSOD的有极好的嗜热性，可耐受较高的温度。

4.2 SOD的热稳定性测定

将纯化的超氧化物歧化酶，在没有底物的情况下分别置于不同温度条件下（50℃~100℃），保温一定时间（20min，40min，60min，120min，180min）后，用上述方法测定超氧化物歧化酶的活性。将没有温育的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性（采用相对酶活性来表示，即在不同条件下的剩余的酶活性占对照酶活性的百分比）。结果表明（见图2a&b），ApSOD在高于60℃时酶活就有所下降，100℃温育3h后剩余活性为40%，100℃的半衰期为5.2h。而rApSOD在70℃时依然很稳定，100℃温育3h后剩余活性为84%，100℃的半衰期为11.5h，这进一步证明了rApSOD具有超越天然嗜热SOD的热稳定性。

4.3 SOD的抗逆性

测定SOD对酸碱的耐受性，将纯化的超氧化物歧化酶分别置于25℃下pH3-10的缓冲液中温育90min后，测定酶的剩余活性。将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同pH条件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。缓冲液分别为50mM柠檬酸钠（pH3.0-8.0），50mM Tris-Hcl（pH8.0-9.0），50mM甘氨酸-氢氧化钠（pH9.0-10.0）。结果表明（见图3a），rApSOD在pH4.0-10.0都表现出较好的稳定性，剩余活性都保持在88%以上。而ApSOD只在pH6.0-8.0之间较稳定，超出这个范围剩余活性就低于60%。这表明rApSOD在酸性或碱性环境下都有很强的稳定性，对酸碱有较强的耐受性。

测定抑制剂、清洁剂和变性剂对SOD活性的影响，将纯化的超氧化物歧化酶（SOD），分别置于终浓度为1mM或10mM的变性剂（乙二胺四乙酸（EDTA）和β-巯基乙醇（β-ME））、0.1%或1%的清洁剂（十二烷基磺酸钠（SDS））和2.5M的变性剂（尿素和盐酸胍）中，25℃保温30分钟，用上述方法测定超氧化物歧化酶的活性。将不加变性剂、清洁剂、变性剂的反应作为对照，测得的酶活力定义为100%。分别计算不同条件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性（采用相对酶活性来表示，即在不同条件下的剩余的酶活性占对照酶活性的百分比）。结果表明（见图3b），rApSOD对抑制剂、清洁剂和变性剂的抗性均明显高于ApSOD，且剩余活性几乎都在90%以上，说明rApSOD有极强的抗逆性。

测定SOD在有机溶剂中的稳定性，将酶在85℃条件下置于含有40%的乙二醇缓冲液（Hepes-KOH pH 7.0）中0~50min，或在60℃条件下置于不同浓度的乙醇缓冲液（Hepes-KOH pH 7.0）中1h，用上述方法测定超氧化物歧化酶的活性。将不加有机溶剂的反应测得的酶活力定义为100%。分别计算不同条件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性（采用相对酶活性来表示，即在不同条件下的剩余的酶活性占对照酶活性的百分比）。结果表明（见图3c&d），rApSOD在40%的乙二醇溶液中温育50min活性依然没有下降，而ApSOD的活性却明显下降，且其在60℃不同浓度乙醇中失活的程度也要大于rApSOD。说明rApSOD在非极性的有机溶液中也能保持很好的稳定性。

结论：基因工程改造得到的rApSOD是一种耐高温酶，具有极强的热稳定性和良好的抗逆性，包括对酸碱、有机溶剂、清洁剂、蛋白变性剂和抑制剂的抗性。

实施例2：

由于SOD能专一的清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用，其在医药、日用化工、食品、农业以及环保等领域具有广泛的应用价值。目前，SOD临床应用主要集中在抗炎，抗辐射，抗肿瘤，抗衰老等方面，并用于病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病和癌症的临床治疗；在食品工业中可添加作为保健食品的功效因子；在化妆品中可添加用于防晒、抗氧化及防止皮肤衰老、防止瘢痕形成等。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

SEQUENCE LISTING

<110>  南开大学

<120>  一种基因工程改造的耐热抗逆SOD及其编码基因与应用

<160>  2

<170>PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  455

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

Met Asp AspGlnThrLeuPhe Ala Gln Tyr Ala AlaGlu Val AsnGlu

1               5                   10                  15     

TrpGlyGluGln Val Lys Gln Val LeuGluLeuArgGly Ala Ser Ile

            20                  25                  30         

Asp Gly Ala SerThrLeuLeuGlnPhe Ile Ala Glu His Asp Gly Lys

        35                  40                  45             

TrpThrGluGlu Ala Val ArgGluLeuThrArgLeu Val Asp Asp Val

    50                  55                  60                 

Tyr Ala AlaAlaLeuArg His Tyr Ala Ile Glu Ala AlaGluTrpGly

65                  70                  75                  80 

Lys Gln Val Glu His Ala LeuSer Met ArgGly Ala AlaGlu Asp Ile

                85                  90                  95     

GlyLeuSerSerLeuLeu Ala Arg Ile GluGlu His Gly Asp GluTrp

            100                 105                 110        

ThrGluGluGlu Ile His GluLeuGlnLeuLeu Val Asp Asp Val Tyr

        115                 120                 125            

Ala Arg Ala Ile ArgLeu Val Glu Pro LeuSer Asp GlyGlnGluGlu

    130                 135                 140                

Asp LeuThrArgGlnGluGlu Val Ser Ala Leu Pro GluGlnGluGly

145                 150                 155                 160

GlyAsnArgGluGln Met Ser Lys GlyThrGluArgSerGlyGlu His

                165                 170                 175    

Lys Gly Asp SerGluGlnGlu Pro Val Val Ala AlaGluArg Ala Glu

            180                 185                 190        

Pro Phe Ile Ala SerSerThr Asp Ser Pro Asp GlyGluGlnLeu His

        195                 200                 205            

GluGly Asp Thr Met Asp GluGluTrpArg His Asn Ala Asp Met Thr

    210                 215                 220                

Asp Lys GluArgLeu Pro GluGluGly Val Thr Asp GlyGluArgGln

225                 230                 235                 240

Arg Ala Val SerPhe Lys Arg Tyr GluLeu Pro ProLeu Pro Tyr Asn

                245                 250                 255    

Tyr Asn Ala LeuGlu Pro Tyr Ile IleGluGlu Ile Met Lys Leu His

            260                 265                 270        

His Gln Lys His HisAsnThr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ala AlaLeu

        275                 280                 285            

Glu Lys Ile Glu Lys His Leu Lys GlyGlu Ile Gln Ile Asp Val Arg

    290                 295                 300                

Ala Val Met Arg Asp PheSerPheAsn Tyr Ala Gly His Ile Met His

305                 310                 315                 320

Thr Ile PheTrp Pro Asn Met Ala Pro ProGly Lys GlyGlyGlyThr

                325                 330                 335    

Pro GlyGlyArg Val Ala Asp Leu Ile Glu Lys GlnPheGlyGlyPhe

            340                 345                 350        

Glu Lys Phe Lys Ala LeuPheSer Ala AlaAla Lys Thr Val GluGly

        355                 360                 365            

Val GlyTrpGly Val Leu Ala Phe Asp Pro LeuThrGluGluLeuArg

    370                 375                 380                

Ile LeuGln Val Glu Lys His Asn Val Leu Met Thr Ala GlyLeu Val

385                 390                 395                 400

Pro Ile Leu Val Ile Asp Val TrpGlu His Ala Tyr TyrLeuGln Tyr

                405                 410                 415    

Lys Asn Asp ArgGlySer Tyr Val GluAsnTrpTrpAsn Val ValAsn

            420                 425                 430        

Trp Asp Asp Val Glu Lys ArgLeuGluGln Ala LeuAsnAsn Ala Lys

        435                 440                 445            

Pro Leu Tyr LeuLeu Pro Gln

    450                 455

 

<210>  2

<211>  1368

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

atggacgaccaaacgttgtttgcccagtatgcggctgaagtgaacgaatggggagaacaa       60

gtcaagcaggtgctggaactgcgcggggcaagcattgatggcgcttctacactgttgcag      120

tttatcgccgaacatgacgggaagtggacggaagaggcagtccgtgagctcacgcgcctt      180

gttgatgacgtgtacgctgctgcgcttcgtcactatgccatcgaagcggctgagtggggg      240

aaacaagtagaacacgctctatccatgcgcggagcagcggaggacatcgggctttcttct      300

ttattggcgcgcattgaagaacacggcgacgagtggacggaggaagaaattcatgaactg      360

caactccttgtcgacgacgtgtacgctcgagccatccgccttgtcgaaccgctatccgac      420

gggcaggaggaagacttgacgcggcaggaagaagtctcggctttgcctgaacaggagggc      480

ggcaacagagagcaaatgagcaagggaactgaacggtcaggcgaacacaagggggatagc      540

gaacaagagccggtcgttgcagctgaacgggcggagccgttcatagcctcatcaacggat      600

tctcctgatggcgaacagctgcatgagggagatacgatggacgaagaatggcggcacaat      660

gcagacatgacagataaggagcggctgccggaggaaggtgtgaccgatggtgagcggcaa      720

cgggcggtttcgtttaagaggtacgagctccccccgctaccctacaactacaacgccctg      780

gagccctacattatagaggagataatgaagctgcaccaccagaagcatcacaacacgtat      840

gtcaaaggggctaacgccgcactcgagaagatagagaagcatctcaagggcgagatacag      900

atagacgttagggctgtcatgagggacttcagcttcaactacgcaggccacataatgcac      960

accatattctggcccaacatggccccgcccggcaagggcggtggaacacctggcggcagg     1020

gtggctgacctcatagagaagcagttcggcggcttcgagaagttcaaggccctcttcagc     1080

gccgctgcgaagacggtggagggcgtcgggtggggcgtgctcgcgttcgaccctctgaca     1140

gaggagctcaggatactgcaggtggagaagcacaacgtcctcatgacggcgggccttgtg     1200

cccatactagttattgacgtgtgggagcacgcctactacctccagtacaagaacgacagg     1260

ggcagctacgtcgagaactggtggaacgtggtcaactgggacgacgttgagaagaggctg     1320

gagcaggctctaaacaacgcgaagcccctctacctgctcccccagtag                  1368

Claims (10)

1.一种耐热超氧化物歧化酶，具有如下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1）序列表中的SEQ ID NO.1；

2）将序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸的取代、缺失或添加且具有平衡机体内氧自由基作用的蛋白质。

2.编码权利要求1所述耐热超氧化物歧化酶的基因，具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.2的DNA序列；

2）编码序列中SEQ ID NO.1蛋白质序列的多核苷酸。

3.含有权利要求1-2所述基因的表达载体、宿主菌及扩增权利要求1-2所述基因中任一片段的引物。

4.一种权利要求1所述耐热超氧化物歧化酶的表达方法，是构建含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使耐热超氧化物歧化酶基因表达。

5.根据权利要求3所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：用于构建所含超氧化物歧化酶基因的重组表达载体的出发载体为pET-28a（+）。

6.根据权利要求4所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：所述重组表达载体为pET-rApSOD。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体pET-rApSOD中rApsod基因的扩增方法，其特征在于包含如下步骤：用于基因工程改造的N端基因序列（N-rApsod）来源于GeobacillusthermodenitrificansNG80-2Fe/Mn-sod（GTNG_2215）的N端1-732bp碱基；

提取GeobacillusthermodenitrificansNG80-2基因组为模板，以引物序列5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC和5' CGTACCTCTTAAACGAAACCGCCCGT扩增序列N-rApsod；天然嗜热ApSOD基因序列来源于Yamano et al，J Biochem 126:218-225（1999），并由金唯智生物科技（北京）有限公司合成并克隆到载体pET-28a（+），以含ApSOD基因序列的pET-28a（+）为模板，以引物序列5' ACGGGCGGTTTCGTTTAAGAGGTACG和5'CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC扩增序列Apsod；

用重叠PCR方法，以N-rApsod和Apsod为模板，以引物序列5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC和5' CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC扩增得到耐热超氧化物歧化酶基因rApsod。

8.根据权利要求4所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征：所述宿主为E.coli BL21（DE3）；培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入的IPTG的浓度为0.1-1mM，诱导温度为25-37℃，诱导时间为3-5小时。

9.根据权利要求4-7任一所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：所述对表达产物超氧化物歧化酶进行纯化的方法为Ni亲和柱层析法。

10.权利要求1所述耐热超氧化物歧化酶在制备耐高温SOD酶方面的应用。