CN100374554C

CN100374554C - 一种耐热超氧化物歧化酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100374554C
Application number: CNB2005100052079A
Authority: CN
Inventors: 董志扬; 黄力; 杨克迁; 何永志; 贾翠娟
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Zhejiang Qi Mei Mei Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2005-02-01
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2025-02-01
Also published as: CN1814753A

Abstract

本发明公开了一种耐热超氧化物歧化酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种耐热超氧化物歧化酶及其编码基因与其在耐热超氧化物歧化酶生产中的应用。该耐热超氧化物歧化酶的氨基酸残基序列如SEQIDNO：1所示，其表达方法是，构建含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经诱导使耐热超氧化物歧化酶基因表达。本发明的表达产物具有突出的耐热性和良好的耐酸碱性，且易纯化，稳定性好，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种耐热超氧化物歧化酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别是涉及一种耐热超氧化物歧化酶及其编码基因与其在耐热超氧化物歧化酶生产中的应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是1969年Fridovich和McCord从牛血红细胞中发现并被正式命名的。它是广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子发生歧化反应，专一清除生物体内的超氧离子，平衡机体的氧自由基。SOD按照其结合的金属离子，主要分为Fe-SOD，Mn-SOD，CuZn-SOD和Ni-SOD四种。SOD在抗衰老，抗辐射，消炎，抑制肿瘤和癌症，以及自身免疫疾病的治疗方面具有重要作用。

目前，对SOD基因的克隆仅局限于人、鼠、酵母和昆虫等真核生物，但普通来源的SOD耐热性差，一般在高于50℃情况下就会失活，半衰期短，限制了其应用。迄今为止，国内还未见有关耐热SOD基因克隆的报道。

Aquifex pyrophilus是一种来源于海洋的极端嗜热菌，它生长于67-95℃的环境中，其Fe-SOD是首个从极端嗜热菌克隆到的SOD基因。该基因在大肠杆菌中实现了表达，重组SOD的比活为1400U/mg，在pH 4.0-10.0的环境中酶活稳定，具有极高的耐热性，耐热温度可达95℃。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热性较好的超氧化物歧化酶及其编码基因。

本发明所提供的耐热超氧化物歧化酶，名称为Fe-SOD1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID№：1；

2)将序列表中SEQ ID№：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有平衡机体内氧自由基作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID№：1由211个氨基酸残基组成。

上述耐热超氧化物歧化酶的编码基因(Fe-SOD1)是具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID№：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID№：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由636个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第636位碱基，编码具有序列表中SEQ ID№：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增Fe-SOD1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述耐热超氧化物歧化酶的方法。

本发明所提供的表达上述耐热超氧化物歧化酶的方法，是构建含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使耐热超氧化物歧化酶基因表达。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)或B834等。

用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，优选为可表达His6-Tag结构的pET-28a、pET-28b或pET-28c。

以pET-28a为出发载体构建的含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体为pET28a(+)/Fe-SOD1。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

培养含有本发明的耐热超氧化物歧化酶编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入IPTG的浓度为0.1-1mM，优选为0.75mM，诱导温度为30-37℃，诱导时间为3-5小时。

所述对表达产物耐热超氧化物歧化酶进行纯化的方法优选为Ni柱亲和层析法。

本发明从腾冲热泉环境DNA的质粒文库中克隆到Fe-SOD1，并使其获得表达，表达方法简单易行，表达产物易纯化，稳定性好，比活可达2100U/mg，且该酶具有突出的耐热性和良好的耐酸碱性，对其辅基所螯合的金属离子进行分析，证明该酶为Fe-SODs。本发明的Fe-SOD1将具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为表达蛋白的SDS-PAGE图谱

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、Fe-SOD1基因的克隆

一、环境样品中DNA的粗提

参考王啸波黄力，环境样品中DNA的分离纯化和文库构建，2001，第二期，微生物学报，中的方法提取云南腾冲热泉(80℃，pH 7.0)环境样品中DNA，具体步骤如下：

1)称取5g(干重)环境样品，充分研磨后，置于离心管中，加入13.5mL DNA抽提缓冲液(含100mmol/L Tris-HCL pH8.0，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.0，1.5mol/L NaCL，1％CTAB)混匀后置液氮中，然后取出在60℃水浴中保温至融化，冻融三次。

2)加入50μL蛋白酶K(20mg/mL)和15mL 10％SDS混匀后，60℃保温2-3min，每隔15-20min倒管混匀几次，然后7000g/min室温离心10min，收集上清液，用同样方法将沉淀洗涤两次(向沉淀中加入5mL水)，合并三次收集的上清液，用等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提两次。

3)加入1g酸洗交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，37℃保温30min，经孔径为0.45um的滤膜过滤除去PVPP，再向滤液中加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置30min后，12000g/min、4℃离心15min，将沉淀用70％乙醇洗涤后溶于1.5mL TE(pH 8.0)。

4)加入0.1g无水乙酸铵混匀后，8000g/min、4℃离心30min，取上清液，加入1倍体积的异丙醇，冰浴10min后，12000g/min、4℃离心30min，将沉淀用70％乙醇洗涤后溶于0.5mL TE(含20μg/mL RNase A)，得到环境样品中的DNA。

二、环境样品DNA质粒文库的构建

构建过程包括以下步骤：

1)采用低溶点凝胶对步骤-粗提的DNA进行纯化和回收；

2)用限制性内切酶Pst I对纯化的DNA进行酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物；

3)用DEAE纤维素滤纸回收长度为3-8kb的酶切片段，将这些酶切片段与经PstI酶切和经碱性磷酸酯酶去磷酸化处理的载体pUC 19连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌D H5α，然后用蓝白斑法筛选整合有重组质粒的大肠杆菌菌落，得到环境样品DNA的质粒文库。

三、Fe-SOD1基因的克隆

对步骤二获得的阳性克隆进行随机测序，并利用Genebank的BlastX程序进行序列比对，结果表明其中的一个阳性克隆H314含有完整的超氧化物歧化酶成熟蛋白编码序列以及上游部分调控序列。根据该测序结果设计引物，引物序列为(带下划线碱基为限制性内切酶识别位点)；

SODF：(上游引物)5′-CGGGATCCATGCCAGTGCATAAGTTA-3′

SODR：(下游引物)5′-CCAAGCTTTTATTTCACAAAATCCTT-3′

以上述阳性克隆H314的基因组DNA为模板，PCR扩增该潜在的SOD成熟蛋白的编码序列，对PCR扩增产物进行测序，测序结果表明其具有序列表中序列2的核苷酸序列，由636个碱基组成，编码序列为自5’端第1至第636位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质，该蛋白的理论分子量为24kD。将该DNA片段命名为Fe-SOD1。

实施例2、Fe-SOD1的表达及金属离子分析

一、Fe-SOD1的表达

将实施例1获得的Fe-SOD1克隆入载体pET28a(+)(Novagen公司)中，得到含有Fe-SOD1的重组表达载体，将其命名为pET28a(+)/Fe-SOD1，再将重组表达载体pET28a(+)/Fe-SOD1用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)，用蓝白斑法筛选重组子，将重组子接种于含有LB液体培养基的试管中37℃振荡培养12-24小时，再按1％接种量接种于装有50mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，在30℃、0.75mM IPTG诱导下表达(以未添加IPTG的为对照)，4h后取样，离心后分别收集上清液和经超声破碎的沉淀，并进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示，泳道1为蛋白标准分子量，泳道2为未加IPTG诱导的菌体破碎上清液，泳道3为经IPTG诱导的菌体破碎上清液，泳道4为纯化的Aquifex pyrophilus Fe-SOD，经IPTG诱导，胞外表达了分子量大小约为28kD的蛋白，与SOD单亚基的理论分子量相符，表明用上述方法获得了正确表达的Fe-SOD1，且在变性条件下其部分蛋白仍保持多聚体的结构，与Aquifex pyrophilusFe-SOD的性质相似。按SNBC 3S NTA Resin(上海生能博彩生物科技有限公司)的操作方法在非变性条件下可对上清液中带有His-Tag标签的表达产物进行抽提。用临苯三酚自氧化法测定表达的Fe-SOD1的活性，其活力单位约为324U/mL培养液，比活为2100U/mg，用Folin-酚法测定蛋白表达量为0.16mg/mL发酵液。

二、Fe-SOD1辅基的金属离子分析

1、对Fe-SOD1进行脱离子处理，并进行Fe，Mn SOD的重建以分析其离子螯合特性，方法为：用8M尿素对实施2获得的Fe-SOD1进行脱离子处理，使其失去活性，然后再分别用Fe，Mn金属离子对其进行重建，结果表明重建的Fe-SOD恢复原有比活1890U/mg，而重建的Mn-SOD比活大幅降低为45U/mg，表明SOD1为Fe-SODs。

2、用原子吸收光谱(AAnalyst 100，Parkin Elmer)分析Fe-SOD1蛋白亚基所螯合金属离子的种类和含量，结果表明Fe-SOD1辅基所螯合的金属离子为铁离子。

3、NaN₃可专一性地抑制Fe/Mn SODs，而对其它类型的SOD没有影响，因而在测定Fe-SOD1的酶活时，向反应液中加入不同浓度的抑制剂NaN₃和NaF以测定其对酶活的影响，测定结果表明NaN₃对Fe-SOD1的半抑制浓度为37mM，符合Fe/Mn SODs的特性。

4、H₂O₂通过SOD活性中心的Fe离子可抑制Fe SODs的活性，而对MnSODs没有影响。将Fe-SOD1分别溶于含0.24mM和1.2mM H₂O₂的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，在25℃下保温，处理不同时间后加入过氧化氢酶并测定其剩余酶活力。测定结果表明Fe-SOD1对H₂O₂敏感，在含1.2mM H₂O₂的磷酸盐缓冲液中其酶活的半抑制时间为82min，符合Fe SODs的性质。

上述实验证明Fe-SOD1为Fe SODs。

实施例3、Fe-SOD1及其酶学性质分析

1、在90℃和100℃下，对实施例2表达的Fe-SOD1分别处理1-3小时分析其耐热性，结果在90℃下处理2小时酶活几乎没有损失，在100℃下处理60分钟酶活仍保持在60％以上，表明Fe-SOD1具有较高的耐热性。

2、在pH值为2.2-12的缓冲系统中处理三小时测定Fe-SOD1的酸碱稳定性，结果在pH4.0-11.0范围内Fe-SOD1的酶活稳定，表明该酶具有良好的耐酸碱性。

3、用凝胶层析法测定Fe-SOD1的分子量(层析柱型号：Superdex 200HR 10/30，层析系统：AKTFPLC)，测定结果表明Fe-SOD1在天然状态下的分子量为64kDa，推测其为二聚体。

序列表

<160>2

<210>1

<211>211

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

Met Pro Val His Lys Leu Glu Pro Lys Asn His Leu Lys Pro Ser Asn

1 5 10 15

Leu Asn Gly Ile Ser Asn Glu Gln Ile Glu Pro His Phe Glu Ala His

20 25 30

Tyr Lys Gly Tyr Val Thr Lys Tyr Asn Glu Ile Gln Glu Lys Leu Ala

35 40 45

Asp Leu Asn Phe Ser Asp Arg Ser Lys Ala Asn Gln Asn Tyr Ser Glu

50 55 60

Tyr Arg Glu Leu Lys Val Glu Glu Thr Phe Asn Tyr Met Gly Val Val

65 70 75 80

Leu His Glu Leu Tyr Phe Gly His Leu Gly Ala Lys Gly Glu Pro Ser

85 90 95

Glu Ala Phe Lys Lys Lys Val Glu Glu Asp Phe Gly Ser Trp Asp Ala

100 105 110

Cys Ile Gln Glu Ile Lys Ala Ala Gly Met Ala Phe Arg Gly Trp Ala

115 120 125

Ile Leu Gly Leu Asp Ile Phe Ser Gly Arg Leu Val Val Asn Gly Leu

130 135 140

Asp Ala His Asn Val Tyr Asn Tyr Thr Gly Leu Ile Pro Leu Ile Val

145 150 155 160

Leu Asp Thr Tyr Glu His Ala Tyr Tyr Val Asp Gln Lys Asn Lys Arg

165 170 175

Pro Pro Tyr Ile Asp Ala Phe Leu Gln Asn Leu Asn Trp Glu Val Ile

180 185 190

Asn Glu Arg Phe Glu Lys Ala Met Lys Ala Tyr Glu Thr Leu Lys Asp

195 200 205

Phe Val Lys

210

<210>2

<211>636

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>2

atgccagtgc ataagttaga gccaaagaac catcttaagc cttcaaacct caatggcatt 60

tccaacgagc agattgagcc acactttgaa gctcattata agggctatgt gactaaatac 120

aacgagattc aggaaaagct cgcagacctt aacttctctg acagaagcaa agcaaaccaa 180

aactactctg agtataggga gctaaaggtg gaggagactt tcaattacat gggtgttgtt 240

ctacacgagc tttattttgg tcatcttggt gcaaagggag agccttcaga ggctttcaaa 300

aagaaagtag aagaagactt tggctcttgg gatgcctgta ttcaggagat aaaggcagca 360

ggtatggctt ttagaggatg ggctattctt ggacttgata tattctctgg caggcttgtg 420

gtaaacggtc ttgacgctca caatgtttac aactacacag ggcttatacc tctcatagtc 480

cttgacactt acgaacacgc ctactatgtg gaccaaaaga acaagagacc tccttacatt 540

gatgccttcc tccagaacct aaactgggaa gttataaacg aaaggtttga aaaggctatg 600

aaggcttatg aaaccctcaa ggattttgtg aaataa 636

Claims

1.一种耐热超氧化物歧化酶，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述耐热超氧化物歧化酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1氨基酸序列的核苷酸。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

7.一种权利要求1所述耐热超氧化物歧化酶的表达方法，是构建含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使耐热超氧化物歧化酶基因表达。

8.根据权利要求7所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：用于构建所述含有耐热超氧化物歧化酶基因的重组表达载体的出发载体为pET-28a、pET-28b或pET-28c。

9.根据权利要求7所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：所述宿主为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)或B834。

10.根据权利要求9所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入IPTG的浓度为0.1-1mM，诱导温度为30-37℃，诱导时间为3-5小时。

11.根据权利要求7-10任一所述的耐热超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：所述对表达产物耐热超氧化物歧化酶进行纯化的方法为Ni柱亲和层析法。