CN112226378B

CN112226378B - 一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112226378B
Application number: CN202011195277.6A
Authority: CN
Inventors: 陈新华; 黎球华; 许丽冰; 母尹楠; 何天良
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-10-31
Filing date: 2020-10-31
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2040-10-31
Also published as: CN112226378A

Abstract

本发明提供一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明构建了高效表达大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020369。利用毕赤酵母工程菌生产的大黄鱼Cystatin重组蛋白，可抑制木瓜蛋白酶、大黄鱼组织蛋白酶B和S的活性，上调巨噬细胞内炎症相关因子TNFα的表达水平，并诱导巨噬细胞中抗菌活性物质一氧化氮产生，表明大黄鱼Cystatin重组蛋白作为蛋白酶抑制剂和免疫增强剂具有良好的应用前景。

Description

一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用。

背景技术

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatins）是一类与半胱氨酸蛋白酶紧密结合、可逆的天然抑制剂。它们能够调节半胱氨酸蛋白酶的功能，保护机体免受来自于自身、细菌或病毒的蛋白酶的破坏性水解，在维持机体内环境稳态、抗细菌和病毒感染以及调节炎症反应中发挥重要作用 (Natasˇa Kopitar-Jerala. 2006. The role of cystatins in cells ofthe immune system. FEBS Letters 580: 6295–6301)。根据定位、大小和多肽链复杂程度不同，半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员分为3种类型：第一个类型是stefins，包括Cystatin A和B，由约98个氨基酸组成，没有二硫键和糖基化，主要分布于细胞内；第二个类型是Cystatin，包括Cystatin C、D、E、F等，由约120个氨基酸组成，含有两个链内二硫键，具有胞外定位的信号肽；第三类是kininogens，主要存在于血浆和哺乳动物的分泌物中，包含3个Cystatin结构域（Josiah Ochieng, Gautam Chaudhuri. 2010. Cystatinsuperfamily. J Health Care Poor Underserved. 21: 51-70）。目前，多种Cystatin基因已经在鱼类中报道，但是其应用性研究仍比较欠缺。

发明内容

本发明在于提供一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种生产的大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌，所述工程菌为毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020369，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

上述工程菌的制备方法为：将如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列克隆到表达载体pPICZαA，电转毕赤酵母后得到工程菌。

利用上述工程菌表达大黄鱼Cystatin重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

进一步地，将上述大黄鱼Cystatin重组蛋白应用于制备蛋白酶抑制剂或者免疫增强剂，所述蛋白酶抑制剂用于抑制木瓜蛋白酶或大黄鱼组织蛋白酶B和S的活性；所述免疫增强剂用于上调巨噬细胞内炎症相关因子TNFα的表达水平，并诱导巨噬细胞中抗菌活性物质一氧化氮的产生。

本发明的优点在于：利用本发明毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin表达的大黄鱼Cystatin重组蛋白不仅能够抑制多种蛋白酶的活性，而且增强巨噬细胞抗菌功能。

附图说明

图1为本发明实施例提供的大黄鱼Cystatin重组蛋白电泳图。A，M为蛋白分子量标准；泳道1为含有pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌培养液上清；泳道2为毕赤酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-Cystatin培养液上清。B，M为蛋白分子量标准；泳道1为纯化的大黄鱼Cystatin重组蛋白。

图2 为本发明实施例提供的大黄鱼Cystatin重组蛋白抑制活性。A，大黄鱼Cystatin重组蛋白对木瓜蛋白酶活性的抑制作用；B，大黄鱼Cystatin重组蛋白对大黄鱼组织蛋白酶B（Cathepsin B）活性的抑制作用；C，大黄鱼Cystatin重组蛋白对大黄鱼组织蛋白酶S（Cathepsin S）活性的抑制作用。

图3为本发明实施例提供大黄鱼Cystatin重组蛋白增强巨噬细胞功能。A，大黄鱼Cystatin重组蛋白处理后巨噬细胞中TNFα表达水平变化；B，大黄鱼Cystatin重组蛋白处理后巨噬细胞内一氧化氮含量变化。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施例对本发明所述的技术方案做进一步的说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非任何形式对本发明进行限制。

实施例1 构建高效表达大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌

本发明所述的大黄鱼Cystatin重组蛋白为大黄鱼Cystatin成熟肽序列（氨基酸20-138，如SEQ ID NO.2所示），大黄鱼Cystatin的序列已经公布（Genbank：XM_027278065.1）。以大黄鱼脾脏cDNA为模板，使用引物Cystatin-F和Cystatin-R扩增出编码大黄鱼Cystatin成熟肽的基因片段（序列如SEQ ID NO.1所示），再使用全式金公司的pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit将目的片段连接到酵母表达载体pPICZαA上，获得重组表达载体pPICZαA-Cystatin。重组载体pPICZαA-Cystatin经Mss I酶切线性化后，电击转化至毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，即得到高效表达大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌的命名为：毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020369，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

将转化后的菌液分别涂布于含终浓度250 µg/ mL、500 µg/ mL和1 mg/ mL 博来霉素的酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上，30℃静置培养2-4天，长出的单菌落经PCR验证后得到毕赤酵母（Pichia pastoris） SMD1168/pPICZαA-Cystatin工程菌；

所述Cystatin-F为GAGGCTGAAGCTGAATTCAGAGACGTGATGACCG， Cystatin-R为GATGAGTTTTTGTTCTAGACTTGCAATTATTATGCAGTCGAC；所述酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基配方为2%蛋白胨、1 %酵母抽提物、2%葡萄糖和1.5%琼脂粉。

实施例2大黄鱼Cystatin重组蛋白表达与纯化

（1）大黄鱼Cystatin重组蛋白表达分析

将实施例1获得的毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-Cystatin工程菌接种到酵母培养基1中，30 °C，220 rpm 震荡培养。待OD600 至2.0，将上述菌液倒入离心管，4 °C，6000 g离心7 min，去除上清，用酵母培养基2重悬菌体，30 °C震荡培养，每隔24 h添加1%甲醇，诱导表达4天，再使用SDS-PAGE分析培养上清中大黄鱼Cystatin重组蛋白表达情况。结果显示，与对照菌株相比，毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-Cystatin工程菌的培养上清中，观察到分子量约为16 kDa目的条带，以及分子量约为20 kDa和25kDa糖基化后的大黄鱼Cystatin重组蛋白条带（图1A）；

所述酵母培养基1配方：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)、 1%甘油和1.34%无氨基酵母氮源培养基（YNB）；

所述酵母培养基2配方：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/L磷酸钾缓冲液(PH6.0)、1%甲醇、1.34% YNB和0.00004%生物素。

（2）大黄鱼Cystatin重组蛋白纯化

将上述毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-Cystatin工程菌的培养上清，加入终浓度为0.2 M的NaCl和终浓度10 mM的咪唑，4 °C静置过夜后， 12000 g，4 °C离心10 min，上清液再使用0.45 μm滤膜过滤。将过滤后的上清液缓慢滴入含有1 mL Ni²⁺介质的层析柱，流速为3~4 mL/min，接着使用杂蛋白洗涤液洗涤5次，每次10 mL，再用蛋白脱液洗收集目的蛋白。纯化大黄鱼Cystatin重组蛋白经PBS缓冲液透析三次，4℃，12000 r/min离心30 min去除沉淀，即获得高纯度的大黄鱼Cystatin重组蛋白（图1B）；

所述杂蛋白洗涤液配方为：20 mM NaH₂PO₄、500 mM NaCl、20 mM咪唑，pH=7.4；

所述蛋白洗脱液配方为：20 mM NaH₂PO₄、500 mM NaCl、750 mM咪唑，pH=7.4。

实施例3大黄鱼Cystatin重组蛋白的抑制活性

（1）对木瓜蛋白酶papain的抑制活性

在100 µL反应体系中，加入20 µL papain（20 nM），10 µL 10×papain缓冲液，40µL ddH₂O，再分别加入10 µL终浓度为0 nM、5 nM、10 nM、20 nM和25 nM的大黄鱼Cystatin重组蛋白，最后与20 µL终浓度为12.5 µM的底物Z-FR-AMC混匀，使用多功能酶标仪SpectraMax M5在激发波长为380 nm，发射波长为460 nm的条件下，每隔30 s测量一次Z-FR-AMC水解释放的荧光。结果显示，大黄鱼Cystatin重组蛋白对木瓜蛋白酶papain的活性具有明显抑制作用，抑制常数为3.012×10^-11M（图2A）；

所述10×papain缓冲液配方为：4 M磷酸钠，40 mM EDTA， 40 mM DTT， pH 6.2。

（2）对大黄鱼组织蛋白酶B的抑制活性

在100 µL反应体系中，加入20 µL大黄鱼组织蛋白酶B重组蛋白（20 nM）（Li, M.

Li, Q. et al. 2014. Identification of cathepsin B from large yellowcroaker (Pseudosciaena crocea) and its role in the processing of MHC classII-associated invariant chain. Dev Comp Immunol. 45 (2) 313-320），10 µL 10×组织蛋白酶B缓冲液，40 µL ddH₂O，再分别加入10 µL终浓度为0 nM、10 nM、100 nM、200 nM和400nM的大黄鱼Cystatin重组蛋白，再与20 µL终浓度为12.5 µM的底物Z-FR-AMC混匀后，使用多功能酶标仪SpectraMax M5在激发波长为380 nm，发射波长为460 nm的条件下，每30 s测量一次Z-FR-AMC水解释放的荧光。结果显示，大黄鱼Cystatin重组蛋白对大黄鱼组织蛋白酶B重组蛋白活性具有抑制作用，经计算抑制常数为3.477×10^-11M（图2B）；

所述10×组织蛋白酶B缓冲液配方为：1 mM醋酸钠，20 mM EDTA，10 mM DTT，pH5.5。

（3）对大黄鱼组织蛋白酶S的抑制活性

在100 µL体系中，加入20 µL重组大黄鱼组织蛋白酶S（20 nM）（Li, Q. Ao, J. etal. 2015. Cathepsin S, but not cathepsin L, participates in the MHC class II-associated invariant chain processing in large yellow croaker (Larimichthys crocea). Fish Shellfish Immunol. 47(2): 743-750），10 µL 10×组织蛋白酶S缓冲液，40 µL ddH₂O，再分别加入10 µL终浓度为0 nM、10 nM、20 nM、30 nM和60 nM的大黄鱼Cystatin重组蛋白，再与20 µL终浓度12.5 µM的底物Z-FR-AMC混匀，使用SpectraMax M5在激发波长为380 nm，发射波长为460 nm的条件下，每30 s测量一次Z-FR-AMC水解释放的荧光，得出在不同浓度的抑制剂作用下测得蛋白酶的反应速度。结果显示：大黄鱼Cystatin重组蛋白对重组大黄鱼组织蛋白酶S有抑制作用，抑制常数为6.784×10^-11M（图2C）；

所述10×组织蛋白酶S缓冲液配方为：100 mM 磷酸钾，5 mM EDTA，5 mM DTT，pH7.5。

这些结果表明，大黄鱼Cystatin重组蛋白显著抑制多种组织蛋白酶的活性。

实施例4 大黄鱼Cystatin重组蛋白增强巨噬细胞抗菌功能

为了研究大黄鱼Cystatin重组蛋白对巨噬细胞功能的影响，使用终浓度为1 µg/mL大黄鱼Cystatin重组蛋白处理大黄鱼头肾巨噬细胞，于处理后3、6、12、24和36 h收集细胞，提取总RNA，检测炎症因子TNF-α的转录水平变化。结果显示：大黄鱼Cystatin重组蛋白诱导后，大黄鱼头肾巨细细胞中TNF-α基因的表达水平显著提高，在处理后6 h达到峰值，是对照组的12倍（图3A）。

分别使用终浓度为0.5、1、2和5 µg/mL的大黄鱼Cystatin重组蛋白处理大黄鱼头肾巨噬细胞，8 h后，使用碧云天公司的一氧化氮检测试剂盒测定细胞内的一氧化氮浓度；BSA蛋白作为对照蛋白。结果显示，大黄鱼Cystatin重组蛋白处理后，大黄鱼头肾巨噬细胞中一氧化氮的浓度显著增加，终浓度为1 µg/mL的大黄鱼Cystatin重组蛋白处理组一氧化碳的浓度最高，达到对照组2倍以上（3B）。

这些数据表明，大黄鱼Cystatin重组蛋白通过诱导炎症因子表达和一氧化氮产生来增强巨噬细胞的抗菌功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagacgtga tgaccggtga gccgcgtgaa gtcgcagtga acggcaccag agttgtgaac 60

gcagcccggt ttgctgtggt tgaattcaac aaagccaacg cagaagacgt gtttgcttat 120

aaactttcga acatatcatc ggccaaaatc caggtggtcg cgggaataaa ctacatcctg 180

gaagtgaaga ttagtcgtac aatgtgcaag acaagcgtca cgacagacgg tgaaccatgt 240

atttaccact ctgaacccaa ggaacttcag tgccacttca ttgttacaga agtcccttgg 300

gaggattcac gtgcactcac tcaaaacaag tgtcgactgc ataataattg caag 354

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Arg Asp Val Met Thr Gly Glu Pro Arg Glu Val Ala Val Asn Gly Thr

1 5 10 15

Arg Val Val Asn Ala Ala Arg Phe Ala Val Val Glu Phe Asn Lys Ala

20 25 30

Asn Ala Glu Asp Val Phe Ala Tyr Lys Leu Ser Asn Ile Ser Ser Ala

35 40 45

Lys Ile Gln Val Val Ala Gly Ile Asn Tyr Ile Leu Glu Val Lys Ile

50 55 60

Ser Arg Thr Met Cys Lys Thr Ser Val Thr Thr Asp Gly Glu Pro Cys

65 70 75 80

Ile Tyr His Ser Glu Pro Lys Glu Leu Gln Cys His Phe Ile Val Thr

85 90 95

Glu Val Pro Trp Glu Asp Ser Arg Ala Leu Thr Gln Asn Lys Cys Arg

100 105 110

Leu His Asn Asn Cys Lys

115

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggctgaag ctgaattcag agacgtgatg accg 34

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatgagtttt tgttctagac ttgcaattat tatgcagtcg ac 42

Claims

1.一种生产大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌为毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020369。

2.如权利要求1所述工程菌的制备方法，其特征在于，将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆到表达载体pPICZαA，电转毕赤酵母后得到工程菌。

3.一种利用权利要求1所述的工程菌表达的大黄鱼Cystatin重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。