CN106337042A - 双碱基酶kex2变体及其高效表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双碱基酶kex2变体及其高效表达方法。本发明人发现，采用毕赤酵母来表达Kex2时，适当地截短可实现蛋白的高表达，且良好地保留蛋白的生物活性，并且在适当位点的突变还能进一步促进其与底物结合效率。本发明人的新发现解决了现有技术中难以高效表达Kex2的技术难题，并为Kex2的生产提供了一种简单而稳健的发酵工艺。

Description

双碱基酶kex2变体及其高效表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及双碱基酶kex2变体及其高效表达方法。

背景技术

来源于自然界中的蛋白酶，是维持生物体正常代谢不可缺少的专一的高效的催化剂。一般情况下，在生物体内，除了某些特殊的蛋白酶在极酸极碱的情况下可以发挥作用，一般蛋白酶作用条件比较温和，适应于生物体内的环境，这也是自然选择的结果。酶稳定性极高对生物体会产生危害，比如胰腺炎，由于胰蛋白酶分子上基因突变，使得胰酶酶活升高，稳定性增强，导致胰酶易自激活或难以降解，过度酶切导致胰脏受损。但是在现代的工业应用中，人们更希望得到的是耐酸、耐碱、耐冷热的稳定蛋白酶。这是与自然法则相悖的，在生物体内蛋白酶在特定的环境中发挥功能，是维持生物体正常代谢所需的。过度稳定的蛋白酶会对生物体造成伤害。

双碱基酶Kex2是酵母自身编码的一种蛋白质前体加工酶，是一个钙离子依赖型的丝氨酸蛋白酶，属于枯草杆菌蛋白酶家族，其专一性地切割Lys-Arg，Arg-Arg，Pro-Arg的C末端肽键。Kex2负责在毕赤酵母中重组表达蛋白的分泌和成熟。在前人的研究中已发现，Kex2分子稳定性较差，无论在培养过程中还是在胞内向胞外的分泌过程中，都会发生降解，但至今未得出降解的原因。分子降解影响总体的蛋白产率，对蛋白的应用带来阻碍。

因此，本领域迫切需要找到能够稳定表达Kex2的方法，并且藉由该方法获得具有良好酶活性的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供双碱基酶kex2变体及其高效表达方法。

在本发明的第一方面，提供一种稳定表达活性双碱基酶kex2的方法，所述方法包括：

(1)提供双碱基酶kex2的变体，所述变体是kex2的第20-667位截短体，或是kex2的第20-599位截短体；

(2)将包含(1)的变体的编码序列的重组质粒转化酵母，获得重组酵母；和

(3)培养(2)的重组酵母，表达活性双碱基酶kex2。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的截短体还包括：以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L。

在另一优选例中，所述的酵母是毕赤酵母。

在另一优选例中，所述方法中，在步骤(3)之后，还包括：分离纯化活性双碱基酶kex2。

在另一优选例中，所述的kex2的第20-667位截短体或kex2的第20-599位截短体或它们的变体还与kex2的第1-19位的天然信号肽相连。

在本发明的另一方面，提供双碱基酶kex2的变体，所述变体是：

kex2的第20-667位截短体，且以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L；或

kex2的第20-599位截短体，且以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L；或

kex2的第20-667位截短体；或

kex2的第20-599位截短体。

在另一优选例中，所述的双碱基酶kex2的变体的蛋白比活均在8.0U/mg以上，最适pH 9.0，最适温度为37℃，稳定的pH范围5.0～6.0。

在另一优选例中，所述的双碱基酶kex2的变体是kex2的第20-667位截短体，且其以α-factor信号肽为信号肽，其表达量高。

在另一优选例中，所述的双碱基酶kex2的变体是第225位由K突变为L或H的变体，其pH稳定性高；pH4.0～5.0之间有10％的活性，且在pH7.0～9.0之间其活性均在90％以上；其Kcat/Km值比野生型序列高20％，与底物的亲和力强，催化效率高。

在本发明的另一方面，提供编码所述的双碱基酶kex2的变体的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供重组表达质粒，所述的重组表达质粒包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供宿主细胞，所述的宿主细胞包含所述的重组表达质粒，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种在保留双碱基酶kex2的酶活性的情况下提高酶的稳定性的方法，所述方法包括：制备双碱基酶kex2的变体，所述变体相对于野生型双碱基酶kex2去除了C端跨膜区和胞浆区的截短体，或是相对于野生型双碱基酶kex2去除了C端Ser/Thr富集区、跨膜区和胞浆区的截短体。

在一个优选例中，所述变体是kex2的第20-667位截短体，或是kex2的第20-599位截短体；较佳地，所述的截短体还包括：以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L。

在另一优选例中，所述的稳定性包括：温度稳定性，pH稳定性，金属离子耐受性。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、Kex2蛋白酶的结构示意图(814氨基酸残基)。Kex2包含814个氨基酸残基：信号肽(signal sequence，1-19残基)，前肽(propeptide，20-113残基)，催化结构域(catalysis domain，114-410残基)，P-结构域(P-domain，411-624残基)，Ser/Thr富集区(Ser/Thr rich domain，625-679残基)，跨膜区(transmembrancedomain，680-699残基)，胞浆区(C-terminal tail，700-814残基)。

图2、Kex2p(667)和Kex2△p(599)蛋白序列及其突变体K225位点和K316结构示意图。

图3、Kex2p菌株筛选及表达鉴定。

(A)Kex2p诱导后24h表达鉴定；lane 1-8：Kex2p 1-8号菌株；M：Marker。

(B)Kex2p诱导后48h表达鉴定；lane 1-8：Kex2p 1-8号菌株；M：Marker。

图4、Kex2p分泌表达鉴定。

Kex2蛋白酶表达鉴定：(A)胞内蛋白鉴定：lane 1，GS115细胞破碎后；lane 2，对照菌(包含Ppic9k空载质粒的GS 115菌株)细胞破碎后；lane 3，Kex2Δp细胞破碎后；(B)上清液蛋白鉴定：lane 1，GS 115细胞培养上清；lane 2对照菌(包含Ppic9k空载质粒的GS 115原始菌)诱导48h后的培养液上清；lane 3，Kex2Δp诱导48h后的培养液上清。

图5、Kex2p的纯化后的SDS-PAGE鉴定(上图)及洗脱曲线(下图)。

上图：Lane1，上样液；lane2，平衡液；lane3-41，洗脱流出液。

下图：洗脱曲线。

图6、kex2p和Kex2Δp的温度稳定性试验。

图7、kex2p和Kex2Δp的pH稳定性试验。

图8、Kex2p(上图)和Kex2p-K225L(下图)的最适pH。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过在毕赤酵母细胞中进行表达研究，发现采用毕赤酵母来表达Kex2时，适当地截短可实现蛋白的高表达，且良好地保留蛋白的生物活性，并且在适当位点的突变还能进一步促进其与底物结合效率。本发明人的新发现解决了现有技术中难以高效表达Kex2的技术难题，并为Kex2的生产提供了一种简单而稳健的发酵工艺。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为kex2截短体或变体)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

Kex2截短体及变体

在利用毕赤酵母重组表达Kex2的过程中，本发明人发现，不同序列长度的Kex2截短体，其蛋白表达量和蛋白活性存在较为显著的差别。因此，本发明人设计了一系列Kex2截短体，研究其在毕赤酵母中的表达情况，经过反复研究试验，确定了若干个能实现在酵母中稳定表达且保留良好酶活性的kex2截短体。

提高Kex2蛋白酶的稳定性是本发明人的研究目标。本发明人在研究中发现，在Kex2Δp纯化过程中，Kex2Δp分子不稳定，降解条带大小一致，在SDS-PAGE呈现出一定的规律，条带大小分别为35kD，44kD，55kD左右。毕赤酵母本身外分泌的蛋白量较小，且多次出现这种情况，其他蛋白切割Kex2Δp的概率较少。因此，本发明人推测Kex2蛋白特异性的识别和切割Arg-Arg↓、Lys-Arg↓等双碱基氨基酸羧基端肽键，而其分子本身结构中，K224-K225、K290-K291、K436-K437、K503-R504也是Kex2的识别位点。其中224，437位置的位于分子表面的loop结构上，更易于被分子识别从而切割。断裂后分子量约为，11、55、30、35kD。可能是Kex2蛋白酶分子之间相互作用，切割暴露在蛋白分子表面的成对的碱性氨基酸形成降解。在以上推测基础上，本发明人进一步突变这两个潜在的自降解位点，以期提高Kex2分子的稳定性。

基于本发明人的上述发现，提供了双碱基酶kex2的变体，所述变体是相对于野生型双碱基酶kex2去除了C端跨膜区和胞浆区的截短体，或是相对于野生型双碱基酶kex2去除了C端Ser/Thr富集区、跨膜区和胞浆区的截短体；且其信号肽由α-factor信号肽替换。

作为本发明的优选方式，所述变体是kex2的第20-667位截短体，或是kex2的第20-599位截短体；较佳地，所述的截短体还包括：第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L；且其信号肽由α-factor信号肽替换。

编码所述截短体或变体的多核苷酸也包含在本发明中，其多核苷酸序列可以是天然的或是经过密码子优化的。此外，应理解，在本发明的提示下，包含kex2的第1-19位的信号肽的上述截短体或其变体也应具有所述的技术效果，也被包含在本发明内。

本发明的kex2截短体或其变体的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。还可用人工合成的方法来合成有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成法来得到编码所述的kex2截短体或其变体的核苷酸序列。然后可将该序列引入表达载体和细胞中。

表达系统

本发明也涉及包含本发明的kex2截短体或其变体的编码基因的表达载体，以及用本发明的载体经基因工程转化产生的宿主细胞。

本发明所述的表达载体是适用于酵母，特别是毕赤酵母细胞表达的表达载体，其中含有kex2截短体或其变体的表达盒。

作为本发明的优选方式，所述的表达盒包括以下操作性连接的元件：启动子，包含酿酒酵母α-Factor信号肽编码基因的kex2截短体或其变体的编码基因，终止子。当考虑纯化方便时，与所述kex2截短体或其变体共同表达的还可包括蛋白纯化标签，从而有利于后续的纯化操作。多种蛋白纯化标签可应用于本发明的方法，例如6×HIS。

将所述的表达载体转化酵母，特别是毕赤酵母，培养转化有所述表达载体的重组酵母，从而可表达kex2截短体或其变体。较佳地，所述的表达载体先进行线性化，之后转化酵母。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物如毕赤酵母时，可选用如下的DNA转染方法：电转化、磷酸钙共沉淀法、显微注射、脂质体包装等；较佳地选用电转化。

多种纯化方法可应用于本发明中来实现kex2截短体或其变体的纯化。作为本发明的优选方式，采用透析、纯化和浓缩得到电泳纯的目的蛋白。纯化后的Kex2Δp、Kex2p、Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L蛋白比活均在8.0U/mg以上，最适pH 9.0，最适温度为37℃，稳定的pH范围5.0～6.0。

在本发明的实施例中，本发明人利用毕赤酵母的信号肽取代kex2本身的信号肽获得了活性kex2系列衍生物和突变体的分泌表达。表达部分P结构域的kex2Δp以及含有全部P结构域和部分丝氨酸富集区的kex2p，并将自水解位点K225和K436进行突变获得系列，突变体Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L。

在本发明的实施例中，证实了含完整P-结构域和部分丝氨酸富集区的Kex2p表达量比Kex2Δp高50％，温度稳定性和金属离子耐受性增强。在培养液中稳定且表达量高，上清液活性最高为380U/L，目的蛋白含量30mg/L。

Kex2p的K225位点突变为Leu后，Kex2p-K225L在最适pH方面。Kex2p、Kex2Δp-K225L在pH3.0～5.0之间没有活性，Kex2p-K225L在pH4.0～5.0之间有10％的活性。且在pH7.0～9.0之间，Kex2p-K225L的活性均在90％以上。这一点对于Kex2的应用将有重要的作用。

Kex2p-K225L的Kcat/Km值比原始序列高20％。表明K225位点的突变会改变Kex2分子与底物的结合能力，增强与底物的亲和力，提高催化效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、Kex2蛋白酶突变体设计

Kex2包含814个氨基酸残基：信号肽(signal sequence，1-19残基)，前肽(propeptide，20-113残基)，催化结构域(catalysis domain，114-410残基)，P-结构域(P-domain，411-624残基)，Ser/Thr富集区(Ser/Thr rich domain，625-679残基)，跨膜区(transmembrance domain(TMD)，680-699残基)，胞浆区(C-terminaltail，700-814残基)，其结构示意图如图1。其序列如下(SEQ ID NO:1)：

在全长Kex2氨基酸序列基础上，本发明人设计了若干种Kex2蛋白酶突变体，包括Kex2p(667)、Kex2△p(599)及其突变体K225位点和K316，结构示意图如图2。其中：

Kex2p(667)如下构建：截取全长Kex2的第1-667位，并且，将Kex2第1-19位的信号肽去除(即获得第20-667位序列)，后续以pPIC9K质粒上自带的α-factor信号肽作为信号肽(MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTGDETANIPAGAVIGYSDLGGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA(SEQ ID NO:2))。Kex2p(667)简写为Kex2p。

Kex2△p(599)如下构建：截取全长Kex2的第1-599位，并且，将Kex2第1-19位的信号肽去除(即获得第20-599位序列)，后续以pPIC9K质粒上自带的α-factor信号肽作为信号肽。Kex2△p(599)简写为Kex2△p。

Kex2Δp-K225L如下构建：在Kex2△p基础上，将第225位(该序列位点根据全长Kex2氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的位数计)的K突变为L。

Kex2p-K225L如下构建：在Kex2p基础上，将第225位(该序列位点根据全长Kex2氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的位数计)的K突变为L。

Kex2Δp-K225H如下构建：在Kex2△p基础上，将第225位(该序列位点根据全长Kex2氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的位数计)的K突变为H。

Kex2Δp-K436D如下构建：在Kex2△p基础上，将第436位(该序列位点根据全长Kex2氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的位数计)的K突变为D。

Kex2Δp-K436L如下构建：在Kex2△p基础上，将第436位(该序列位点根据全长Kex2氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的位数计)的K突变为L。

在构建入pPIC9K之前，上述截短体或变体的核苷酸序列按照毕赤酵母偏好加以常规的密码子优化。

实施例2、重组毕赤酵母kex2p和Kex2Δp的构建和诱导表达

含有目的基因的质粒pPIC9K-Kex2p的构建方法：将Kex2p的编码序列克隆入pPIC9K的EcoRI/NotI酶切位点中。

含有目的基因的质粒pPIC9K-Kex2Δp的构建方法：将Kex2Δp的编码序列克隆入pPIC9K的EcoRI/NotI酶切位点中。

采用常规的方法将pPIC9K-Kex2p或pPIC9K-Kex2Δp转入毕赤酵母GS 115，获得重组毕赤酵母。使用限制性内切酶将重组闭合环状的质粒切割为线性质粒。在Ppic9k质粒与GS 115原始菌株的重组中，在质粒上选取不同的位点切割，会产生Mut⁺和Mut^s两种重组子。经分析Kex2的基因序列，选取SalI限制性内切酶做质粒线性化，与GS 115重组后，得到Mut⁺重组子。G418筛选多拷贝重组子。

Ppic9k含有细菌Kana基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，整合的Kana基因数量与菌株抗G418的能力有线性关系。单拷贝整合进毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的G418抗性水平，通过不同浓度的G418浓度，可得知菌株内外源基因拷贝数，筛选出多拷贝子。

分别配制0.25～4.0mg/ml G418浓度的YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)平板。将2～3ml无菌水加入长有His+转化子的MD平板上，用刮子将菌落收集，菌液放置到EP管中。测定菌液的OD600。按照每块G418平板涂布107个菌落涂布。30℃培养3～5天，可见单菌落。

活性测定方法：选择了Boc-Gln-Arg-Arg-pNA(Boc-QRR-pNA)作为测活底物，酶活力单位(U)的定义为：在25℃，pH 8.0的条件下，每分钟催化1μmol的Boc-QRR-PNA转化为产物所需要的酶量。测活缓冲液为：50mM的Tris-HCl，PH 8.0，2mM Ca²⁺，100μmol/L Boc-QRR-pNA。3ml底物溶液中加入适量的酶，在波长405nm下，每间隔20s记录吸光值A₄₀₅，连续记录3分钟，保证每分钟的吸光值的变化不超过0.040。通过下列公式计算酶活力。

酶活力U(μmol/L)＝△A/min×F。

其中：TV为反应总体积(ml)，SV为加入的样品体积(ml)，L为比色皿的光径，L＝1cm，ε为该反应体系被检测物质的摩尔消光系数，ε＝1.02×10⁴(L.mol^-1cm^-1)。

Kex2p或Kex2Δp蛋白酶的诱导表达

挑取高浓度G418平板上长出的单菌落，在2ml YPD试管中培养18h，转接1％到BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，100mM磷酸钾缓冲液pH 5.0，1％甘油)培养基中，培养20～24h，将菌体全部离心，转移到BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，100mM磷酸钾缓冲液pH 5.0，1％甲醇)培养基中，每天添加0.5～1％的甲醇，诱导72h。测定不同诱导时间后的酶活。

在3.0mg/ml的G418平板上挑取的表达Kex2p的8株菌，诱导3天后的表达情况。结果见图3，由图可见，第2天(图3B)明显比第1天(图3A)上清中的目的蛋白量增加。

挑取的Kex2p的8株菌，诱导后第2天是第1天活性的两倍以上，第3天是第2天的1.5倍。1-8号菌株72h内的上清液中的酶活力测定如表1。上清液中活性最低的为317.52U/L，最高的为352.8U/L。后期培养过程中Kex2p上清液中的活性可达380U/L，蛋白含量30mg/L。

表1、Kex2p上清液酶活力测定

Kex2p分泌表达鉴定如图4。

采用上述同样的方法进行诱导表达，Kex2p的分泌表达量为30mg/L。Kex2Δp的分泌表达量为20mg/L。可见Kex2p表达量比Kex2Δp高50％。

实施例3、kex2p或Kex2Δp的纯化

离心后的培养外液对10mM NaAc-HAc pH 5.0缓冲液透析，每4h更换透析外液，共4次。透析后的样品上样到事先用10mM NaAc-HAc pH 5.0缓冲液平衡好的Q-FF(3cm*30cm)离子交换柱，用相同缓冲液平衡，之后用含0-500mM的NaCl的缓冲液进行连续梯度洗脱，分部收集。测定各收集管中的A280和蛋白酶活性，绘制洗脱曲线。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，根据电泳结果，合并蛋白收集液，超滤除盐，-20℃保存。

Kex2p的纯化后的SDS-PAGE鉴定及洗脱曲线结果见图5。可以看出，通过纯化，得到了蛋白条带单一的Kex2p。将对应的收集管中的样品合并，对保存液透析，-20℃冻存。

测定纯化后蛋白的比活。Kex2p的比活为10.3U/mg。Kex2Δp的比活为8.33U/mg。Kex2p比Kex2Δp高。

实施例4、kex2p和Kex2Δp的温度稳定性试验

取纯化后0.5mg/ml的酶液，分别置于4℃、25℃、37℃、45℃水浴中温育，分别在1、2、4、8、12、24h后测定活性，以水浴前纯酶的初始活性作为100％，计算各温度下的残余酶活。

考量了Kex2Δp、Kex2p在pH5.2的醋酸钠缓冲液置于16℃～45℃下、12h内酶活性的变化情况。结果见图6，Kex2p比Kex2Δp更稳定性。Kex2Δp、Kex2p在16℃、25℃下，12小时内活力相对稳定，残余酶活力均在85％以上。在37℃时，Kex2Δp活性下降明显，4h内活力下降15％，12h时酶活力为初始酶活力的70％，相比之下在37℃，Kex2p 12h后残余酶活为80％。在45℃水浴12h，Kex2Δp、Kex2p分别下降25％和15％。

综上，Kex2p比Kex2Δp稳定性更为理想。

实施例5、kex2p和Kex2Δp的pH耐受性试验

在25℃下分别配制pH为3.0～11.0，50mmol/L如下缓冲液依次为NaAc-HAc(pH 3.0～6.0)，Tris-HCl(pH 7.0～8.0)，Gly-NaOH(pH 9.0～11.0)，在缓冲液中加入1mM Ca²⁺。将纯酶液分别置于以上缓冲液中，蛋白浓度控制在0.5mg/ml，在25℃下水浴，分别在1、2、4、8、12、24h后测定活性，以水浴前的酶液初始活性作为100％，计算不同pH下的残余酶活。

分别考量了Kex2Δp、Kex2p在不同pH值下，25℃水浴2h、4h、8h、12h酶活的变化情况。pH稳定性的比较结果如图7所示。在4h以内，Kex2Δp、Kex2p、在pH5～7范围内表现良好的稳定性，残余酶活均在80％以上。在pH6.0Kex2Δp和Kex2p均非常稳定，12h内活性无降低。在pH5.0，活性下降了10％以内。然而在碱性环境下，pH9.0～11.0，Kex2不稳定。在pH10、11，4h内蛋白全部失活。

Kex2在偏酸环境中稳定，最稳定的pH值为5.0～6.0；在碱性条件下不稳定。可以利用稳定性特征确定Kex2蛋白酶的保存条件。从Kex2Δp和Kex2p比较来看，pH条件对二者作用没有大区别，稳定性相当。

实施例6、kex2p和Kex2Δp的金属离子耐受性试验

配制100mmol的金属离子母液和EDTA，充分混匀。金属离子包括：Mg²⁺，Ba²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺。将保存的纯酶液(10mmolNaAc-HAc，1mmol CaCl₂)取出，稀释10倍，加入终浓度为2mmol/L的金属离子，设置一组空白对照。在25℃，温浴2h，检测酶活，以没有加入任何金属离子和EDTA的对照组酶活力为100％，计算各种离子对酶的影响，结果表示为活性残余率。结果如表2。

表2、kex2p和Kex2Δp的金属离子及其他试剂对Kex2的影响

由表2可以看出，将纯酶液稀释后加入同浓度的不同金属离子及不同浓度的EDTA溶液，对酶的活性产生了很大的影响。从整体数据分析看出，Kex2p的金属离子耐受性比Kex2Δp对金属离子的耐受性强，钙离子对Kex2酶活力有激活作用，二价铜离子和三价铁离子对酶活性的抑制作用最为明显。

在2mmol Cu²⁺离子的作用下，Kex2Δp和Kex2p蛋白全部失活。在2mmolFe³⁺离子作用2h后，亦是如此，表现出Kex2蛋白对三价铁离子的敏感性。加入Mn²⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Ni²⁺后，Kex2蛋白活性均有所降低。其中Kex2Δp在加入Mn²⁺后，活性降低15％，而Kex2p在加入Mn²⁺后，活性降低2％。以上离子对Kex2均有微弱的抑制作用。作为钙离子依赖型的丝氨酸蛋白酶Kex2，在溶液中加入钙离子后，活性较其他实验组高，与理论一致。但不及空白对照组，空白对照组中的钙离子浓度为0.2mmol，推测可能是2mmol钙离子超过了溶液中酶对钙离子的需求，产生了微弱的抑制。EDTA螯合钙离子，当溶液中加入5mmol活性下降18％，Kex2p在1mmol EDTA中活性基本没有下降。这说明Kex2p比Kex2Δp有更好的金属离子耐受性。

实施例7、kex2p和Kex2Δp的K225，K436位点的系列突变体的性质

Kex2p-K225L、Kex2p-K225H、Kex2Δp-K436D、Kex2Δp-K436L的构建方法及表达和纯化方法与实施例2和实施例3相同。

最适pH测定方法：在25℃下分别配制pH为3.0～11.0，0.5mol如下缓冲液依次为NaAc-HAc(pH 3.0～6.0)，Tris-HCl(pH 7.0～8.0)，Gly-NaOH(pH9.0～11.0)。稀释10倍后使用50mmol/L的缓冲液，1mmol Ca²⁺配制底物Boc-QRR-pNA。按照标准的测活方法，分别使用不同的pH的底物测定酶活，结果以酶活力最高组的酶活性值为100％。计算其它组与最高值的比值，结果表示为百分比。

包含Kex2Δp-K225H、Kex2p-K225L、Kex2Δp-K436D、Kex2Δp-K436L的pPIC9K重组质粒，通过电转得到表达菌株，但在蛋白表达鉴定中发现，K225H和K436系列的突变体不仅在蛋白活性上有所降低、表达量也降低，K225H在纯化过程中降解成为有规律的片段，难以得到纯蛋白。K436D蛋白虽然活性低，但相比于原始序列稳定性有所提高。在温度稳定性和pH稳定性方面，K225L突变体与原始序列稳定性相当，并没有达到预期的效果。

突变体Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L表达正常，培养的上清液中活性较原始序列上清活性相当。通过纯化得到较纯的目的蛋白，纯化后Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L的比活分别为11.11U/mg、10.3U/mg。从最适pH来看，Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L的最适pH与原始序列Kex2Δp、Kex2p相同，倾向于中性偏碱，pH9.0左右。在酸性pH下，pH3.0-5.0之间，Kex2Δp、Kex2Δp-K225L、Kex2p均没有活性，而Kex2p-K225L在pH4.0～5.0之间有活性。pH10以上，Kex2蛋白衍生物活性都大大降低。从最适温度上看，突变体最适温度均为37℃，与原始序列没有差别。

最适pH结果见图8。Kex2p-K225L在最适pH方面，与Kex2p、Kex2Δp-K225L都有很大的不同。Kex2p、Kex2Δp-K225L在pH3.0～5.0之间没有活性，Kex2p-K225L在pH4.0～5.0之间有10％的活性。且在pH7.0～9.0之间，Kex2p-K225L的活性均在90％以上。这一点对于Kex2的应用将有重要的作用。

实施例8、kex2p的突变体Kex2p-K225L，Kex2Δp及其突变体LKex2Δp-K225L的酶促反应动力学参数

酶促反应动力学的测定：利用Lineweawer-Burk双倒数作图法，在不同底物浓度下检测酶的反应速率，得到V(μmol/min)，以1/V--1/[S]作图，得出一条直线。选取其中直线关系较好的点，点数大于等于6个，使得直线的R2大于0.99。其中横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax。

酶促反应动力学参数见表3。

表3、kex2p和Kex2Δp及其突变体的酶学动力学常数

从酶促反应动力学上看，突变体K225L对底物的亲和力增强，表现为Kex2Δp-K225L的Km值是Kex2Δp的Km值的70％，Kex2p的30％。再从催化效率上看，Kex2Δp的Kcat/Km值为1.10×10⁷，而Kex2Δp-K225L的Kcat/Km值为1.32×10⁷，突变体是原始序列的1.32倍。说明K225L突变影响了酶与底物的结合和催化效率，提高了与底物的亲和力。

Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L的Km值在分别是0.0107和0.0143mmol/L，比原始序列Km值降低，且Kex2Δp-K225L、Kex2p-K225L的Kcat/Km值比原始序列高20％。表明K225位点的突变会改变Kex2分子与底物的结合能力，增强与底物的亲和力，提高催化效率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种稳定表达活性双碱基酶kex2的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供双碱基酶kex2的变体，所述变体是kex2的第20-667位截短体，或是kex2的第20-599位截短体；

(2)将包含(1)的变体的编码序列的重组质粒转化酵母，获得重组酵母；和

(3)培养(2)的重组酵母，表达活性双碱基酶kex2。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的截短体还包括：以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母是毕赤酵母。

4.双碱基酶kex2的变体，其特征在于，所述变体是：

kex2的第20-667位截短体，且以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L；或

kex2的第20-599位截短体，且以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L；或

kex2的第20-667位截短体；或

kex2的第20-599位截短体。

5.编码权利要求4所述的双碱基酶kex2的变体的多核苷酸。

6.重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒包含权利要求5所述的多核苷酸。

7.宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求6所述的重组表达质粒，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种在保留双碱基酶kex2的酶活性的情况下提高酶的稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括：制备双碱基酶kex2的变体，所述变体相对于野生型双碱基酶kex2去除了C端跨膜区和胞浆区的截短体，或是相对于野生型双碱基酶kex2去除了C端Ser/Thr富集区、跨膜区和胞浆区的截短体。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述变体是kex2的第20-667位截短体，或是kex2的第20-599位截短体；较佳地，所述的截短体还包括：以全长双碱基酶kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位由K突变为L或H；或第436位由K突变为D或L。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的稳定性包括：温度稳定性，pH稳定性，金属离子耐受性。