CN103361358B

CN103361358B - 一种抗盐胁迫基因CbCRT1、制备方法以及其编码产物的氨基酸序列

Info

Publication number: CN103361358B
Application number: CN201210082208.3A
Authority: CN
Inventors: 安黎哲; 白慕群; 孙丽坤; 杨玉; 陈书燕; 岳修乐; 宋渊; 张华�; 何文亮; 樊立刚
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: CN103361358A

Abstract

本发明提供了一种抗盐胁迫的基因CbCRT1，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种抗盐胁迫的基因CbCRT1的编码产物CbCRT1，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还提供了基因CbCRT1的制备方法。

Description

一种抗盐胁迫基因CbCRT1、制备方法以及其编码产物的氨基酸序列

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高山离子芥抗盐胁迫基因CbCRT1、其编码产物CbCRT1的氨基酸序列，以及基因CbCRT1制备方法。

背景技术

西北地区的70%的土地为贫瘠土壤，其中高盐碱土壤又占了近一半，这导致大多数植物很难生存，这就进一步限制了农民的可用耕地面积（于法稳，2001）。因此，选育具有抗盐特性的作物就变得非常重要。但是，由于缺乏合理的筛选手段和技术，且随机选育所需的人力物力都十分巨大，目前筛选得到的具有抗盐特性的作物数量很少，且抗性不强。

近些年来，科学家发现了一些能在高盐碱土壤上生长的抗盐胁迫植株，并将该植株中抗盐胁迫相关的基因进行克隆获得具有抗盐胁迫能力的转基因作物（傅宣英，2006）。至今公开的抗盐胁迫基因的数量也很少。

钙网织蛋白基因（Calreticulins，CRTs）是一种内质网上的钙离子结合蛋白基因（Michalak et al 2002），其次，CRT还是一个重要的分子伴侣 (Trombetta 2003)。研究表明，CRTs在植物中的功能主要有四大方面：参与内质网上蛋白质翻译后的折叠；是细胞内Ca²⁺信号的重要连接体（Zhu et al.,1997, Kwon et al., 2000），调节胞内 Ca²⁺的内稳态（Fraser et al. 2000）；参与调节植物生长发育，免疫应答（Dupuis et al., 1993,Andrin et al., 1998）；是植物逆境响应（盐碱、低温）的重要调节因子。

高山离子芥（Chorispora bungeana）是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、高盐碱、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，该地区海拔3600～3900m。年平均气温在-5～-7 ℃之间，6～8月平均气温为3.6 ℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、高盐碱、强紫外、大风和生理干旱，适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。由于高山离子芥处于极端环境（高盐碱、低温、高辐射等），积累了适应极端胁迫的有益突变，所以克隆和研究高山离子芥的抗盐胁迫的钙网织蛋白基因CbCRT1将会为构建具有抗盐胁迫能力的转基因植株提供物质基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的高山离子芥抗盐胁迫基因CbCRT1。基因CbCRT1的克隆和研究能够扩大抗盐胁迫基因资源，从而为制备抗盐胁迫转基因植株的需要及基因工程改造的需要，提供更加丰富的优良候选基因。

本发明的另一个目的在于提供一种由抗盐胁迫基因CbCRT1编码的蛋白CbCRT1。

本发明的又一个目的在于提供一种高山离子芥抗盐胁迫基因CbCRT1的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明用RACE法扩增得到高山离子芥钙网织蛋白基因CbCRT1的cDNA全序列。CbCRT1全长1495bp，包含一个1272个碱基的开放阅读框（ORF），并含有一个长度为180个碱基的5‘非编码区和一个长度为187个碱基，包含poly（A）的3’非编码区，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。基因CbCRT1编码得到的蛋白CbCRT1长度为424 氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

通过序列同源性分析得知：高山离子芥钙网织蛋白基因CbCRT1与拟南芥钙网织蛋白基因AtCRT1同源性为96%（图1）。

本发明对盐胁迫诱导CbCRT1基因进行了鉴定。利用150 mM NaCl处理高山离子芥悬浮细胞0 h，1 h，3 h，6 h，12 h后，提取植物总蛋白，通过West Blotting法检测CbCRT1蛋白表达量的变化。结果显示（图2），NaCl处理能显著增强 CbCRT1蛋白表达，而且CbCRT1参与了高山离子芥对NaCl胁迫的响应。

本发明还采用插入失活获得突变体的方式进一步鉴定了CbCRT1基因所具有的抗盐胁迫的能力，即采用拟南芥CRT1 T-DNA插入突变纯合体鉴定基因功能。从ABRC上购买了两种CRT1 T-DNA插入拟南芥突变体种子，分别为salk-055452和salk-055449，筛选获得了突变纯合体CRT1。利用不同浓度的NaCl处理，发现与野生型相比，突变体对NaCl的敏感性增强了（图3）。证明了基因CbCRT1与高山离子芥的抗盐胁迫能力密切相关。

附图说明

图1 高山离子芥钙网织蛋白基因CbCRT1核苷酸序列在NCBI同源性比对。

图2 NaCl处理对高山离子芥中的CbCRT1基因转录分析。

图3 拟南芥CRT1 T-DNA插入突变纯合体CRT1与高山离子芥野生型的比较分析。

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥（Chrisporabungeana)(西部植物种质资源库数据平台）。

实施例1

高山离子抗盐胁迫基因CbCRT1序列的克隆方法

（1）CbCRT cDNA 3′末端的克隆（3′-RACE）

利用RNA提取分离试剂（Trizol，Invitrogen）分离高山离子芥愈伤组织总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥愈伤组织100 mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1 mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5 ml的离心管中；室温放置5 min；加入0.2 ml新鲜氯仿，剧烈振摇15 s，室温静置3 min；4 ℃，12000 g离心15 min；上清水相转移到一个新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇混匀，4 ℃，12000 g离心10 min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70 ℃保存备用。

cDNA第一链合成用3′-full RACE core kit（Takara）提供的oligo dT-3 siteadaptor primer, 按照说明合成。根据GeneBank已发表的拟南芥CRT基因（GeneBankaccess number NM_104513）和水稻CRT基因（GeneBank access number NM_001058334）设计两个简并套式正义引物AOCRTF （5′-GAGGACTACAGATTCTACGC -3′），AOCRTFn （5′-GTSAAGCAYGAGCAGAAGCT -3′），与3-RACE Kit 提供的3′ -inner primer 和3′ -outerprimer配对进行PCR扩增，得到CbCRT的3′-末端，扩增程序为94 ℃ 5 min，重复扩增步骤30个循环（94 ℃ 50 sec，57 ℃ 50 sec，72 ℃ 90 sec），最后在72 ℃扩增5 min。电泳后，扩增产物切胶纯化，与pGEM-T载体连接到，测序。

（2）CbCRT cDNA 5′末端的克隆（5′-RACE）

参照上一步的操作步骤提取高山离子芥的总RNA，按照5′-full RACE kit（Takara）使用说明，用随机引物合成cDNA第一链。用CbCRT特异性的引物CbCRTR（5′-CATTGGTGCCTTCCACTTGCCCTTG-3′）和CbCRTRn（5′-CTTCCATTCACCGTCGTACTCGGGG-3′）为反义引物，与试剂盒提供的5′-inner primers和5′-outer primer配对，扩增CbCRT的5′-末端。扩增产物切胶纯化，与pGEM-T载体连接到，测序。

将上述两个片段进行序列拼接，最终得到大小为1495个碱基的核苷酸序列，全长包含一个1272个碱基的开放阅读框。

实施例2

盐胁迫下CbCRT1基因表达水平分析。

利用150mM NaCl处理高山离子芥悬浮细胞0 h，1 h，3 h，6 h，12 h后，提取植物总蛋白，通过West Blotting法检测CbCRT1蛋白表达量的变化。结果显示（图2），NaCl处理能显著增强 CbCRT1蛋白表达，而且CbCRT1参与了高山离子芥对NaCl胁迫的响应。

实施例3

CbCRT1基因的功能鉴定。

从ABRC上购买了两种CRT1 T-DNA插入拟南芥突变体种子，分别为salk-055452和salk-055449，筛选获得了突变纯合体CRT1，该突变体。利用不同浓度的NaCl处理，发现与野生型相比，突变体对NaCl的敏感性增强了（图3）。

Claims

1.一种高山离子芥抗盐胁迫的钙网织蛋白基因CbCRT1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的抗盐胁迫基因CbCRT1的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）提取高山离子芥愈伤总RNA，经多序列比对软件clustalx和蛋白质分类与同源性数据库block make分析得到氨基酸序列保守区，最后用引物设计软件Primer primier针对上述保守区设计出简并引物；

（2）以简并引物：5-GAGGACTACAGATTCTACGC-3和5-GTSAAGCAYGAGCAGAAGCT -3进行保守区3`端的克隆，测序；

（3）以简并引物：5-CATTGGTGCCTTCCACTTGCCCTTG-3和5-CTTCCATTCACCGTCGTACTCGGGG-3进行保守区5'端的克隆，测序；

（4）将上述两个片段进行序列拼接，最终得到大小为全长1498 bp，包含一个1131碱基的开放阅读框。

3.一种由权利要求1所述的基因CbCRT1编码的蛋白质CbCRT1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。