CN106754943A - 一种蜘蛛神经毒素tx4(6‑1)重组蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜘蛛神经毒素TX4(6‑1)重组蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：（1）根据TX4(6‑1)成熟毒素的氨基酸序列和毕赤酵母表达系统的特点优化并合成C‑端带有6×His标签的TX4(6‑1)的基因并构建毕赤酵母分泌表达载体；（2）转化重组载体到毕赤酵母宿主中，通过筛选，得到了高水平分泌表达的酵母转化子；（3）酵母宿主中表达重组蜘蛛昆虫神毒素TX4(6‑1)蛋白，经镍亲合层析法，快速得到了纯度达95%以上的重组蜘蛛昆虫神毒素TX4(6‑1)蛋白，该蛋白对家蚕具有显著毒性。本发明能快速获得大量稳定的重组蜘蛛昆虫神毒素TX4(6‑1)蛋白，对于抗虫领域，特别是培育抗虫植物品种有重要的价值，对提高农作物的产量具有重要的意义。

Description

一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1)重组蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)重组基因及其蛋白的制备方法与应用。

背景技术

昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自蜘蛛子、蜘蛛、螨虫、胡蜂、蚂蚁等动物毒腺分泌的毒液。到目前为止，已分离纯化和命名的昆虫神经毒素有近百种，主要来自于蜘蛛子，其次来自蜘蛛。蜘蛛神经毒素基因TX4(6-1)是一种源自巴西流浪蜘蛛”(Phoneutria nigriventer)的昆虫专一性神经毒素，对农业害虫具有很可的毒杀活性。昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等，为大量制备该类神经毒素提供了有效手段。

大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将昆虫神经毒素构建大肠杆菌表达载体，经转化E. coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具其它显著优点。目前，还没有一种利用真核表达系统可以高效表达Tx4(6-1)重组蛋白的方法，极大影响了Tx4(6-1)活性测定、杀虫谱分析及其在抗农业害虫中的应用，因此开发出一种利用毕赤酵母高水平分泌表达大量Tx4(6-1)蛋白并快速、低成本的制备具有生物活性的昆虫神毒素Tx4(6-1)蛋白是十分必要的。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1)重组基因及其蛋白制备的方法。

本发明提供基因，为编码蜘蛛神经毒素TX4(6-1)类蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子。其中，序列表中的序列1由165个脱氧核苷酸组成，该序列为包含6个组氨酸标签(18个脱氧核苷酸)的TX4(6-1)基因读码框(144个脱氧核苷酸)和终止密码子(3个脱氧核苷酸)，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的重组蛋白由TX4(6-1) 的48个氨酸酸残基和6个组氨酸标签组成。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16°C连接，得重组载体pPICZαA/TX4(6-1)；

S2：将所述重组载体pPICZαA-TX4(6-1)用BamHⅠ和BglⅡ将酵母完整表达框切下，切下的表达框连接到经BgⅡl酶切的pPICZαA-TX4(6-1)载体，得到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，用BamHⅠ和BglⅡ将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下，再连接到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体中，得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，电击转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1500 μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导48小时，得发酵的上清液。以6×His兔单抗为一抗，以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗，间接ELISA法检测目标蛋白表达水平，筛选出高水平表达的酵母转化子。高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基扩大培养，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导48小时，收集发酵的上清液；

优选地，在步骤S3的扩大培养时，在诱之后且收集上清液之前，还包括进一步诱导表达的如下步骤：

S4：在28°C继续诱导培养48小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%；

优选地，在步骤S3之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.5~8.0，以大于或等于15000 g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用10倍层析柱体积的pH 8 的含10 mM Tris-HCl和30~50 mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10 mM Tris-HCl和100~400 mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为3 kDa的透析袋于10 mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩；

优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)的酵母转化子也属于本发明保护的范围。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本发明保护的范围。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-TX4(6-1)上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫神毒素TX4(6-1)的方法和快速高效纯化蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是纯化的带组氨酸标签的重组蛋白对家蚕5龄幼虫具有很强的毒杀活性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA- TX4(6-1)构建示意图；

图2 为本发明实施例中对酵母转化子的PCR验证结果图；

图3为本发明实施例中的高水平分泌表达酵母转化子在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图；

图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的TX4(6-1) 蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图5为本发明实施例中纯化得到的TX4(6-1) 蛋白浓缩前后的SDS-PAGE检测结果图；

图6为本发明实施例中的重组TX4(6-1)蛋白生物学活性结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。本发明中的引物具体序列如序列表中的序列3和序列4所示。

所用培养基配方如下：

1）酵母生长培养基（BMGY）

完全溶解10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，定容到800 mL。121 ℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100 mL 1 M磷酸钾溶液，100 mI YNB，2 mL 500×生物素，20 mL 50%灭菌甘油；

2）酵母诱导培养基（BMMY）

完全溶解10 g 酵母提取物，20 g蛋白胨，定容到800 mL。121 ℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100 mL 1 M磷酸钾溶液，100 mL YNB，2 mL500×生物素，10 mL甲醇；

3）YPD培养基

完全溶解10 g 酵母提取物，20 g蛋白胨，定容到900 mL，121 ℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100 mL20%灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.5-1.8%的琼脂可制得YPD固体培养基。

实施例一

本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的TX4(6-1)基因，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列，是合成TX4(6-1)神经毒素的天然DNA，然后根据毒素基因和毕赤酵母密码子表达特点，优化并合成优化后的DNA。NCBI数据库仅能找到Tx4(6-1)的天然蛋白序列(GenBank登录号2108421A)而没有其对应的核酸序列，因此优化合成的Tx4(6-1)基因没有同源DNA序列。

将人工合成的C-端带有6×His标签的DNA分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体。将所得重组载体pPICZαA-TX4(6-1)用BamH Ⅰ和BglⅡ将酵母完整表达框切下，切下的表达框连接到经BglⅠ酶切的pPICZαA-TX4(6-1)载体，得到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，用BamHⅠ和BglⅡ将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下，再连接到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体中，得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，电击转化法转化到毕赤酵母宿主菌中。转化后分别用含有400 µg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1500 µg/mL Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到优化后人工合成的C-端带有6×His标签DNA的高抗性毕赤酵母转化子。

实施例二

本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例一的优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-TX4(6-1)，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA- TX4(6-1)构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

（1）用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切含合成的TX4(6-1)基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

含合成的TX4(6-1)基因的质粒 15 μL

10×M 缓冲液 5 μL

XhoⅠ 5 U

XbaⅠ 5 U

无菌水 至50 μL

（2）用Xho 和Xba 双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

质粒pPICZαA 15 μL

10×M 缓冲液 5 μL

XhoⅠ 5 U

Xba Ⅰ 5 U

无菌水 至50 μL

（3）将步骤（1）和（2）得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；

（4）将步骤（3）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

载体pPICZαA片段 1μL

目的片段落 3μL

10×缓冲液 1μL

T4连接酶 0.5 μL

无菌水 至10 μL

将上述所得重组载体pPICZαA-TX4(6-1)用BamH Ⅰ和BglⅡ将酵母完整表达框切下，切下的表达框连接到经BglⅡ酶切的pPICZαA-TX4(6-1)载体，得到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，用BamHⅠ和BglⅡ将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下，再连接到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体中，得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体；

S2：重组质粒的转化：将含4个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体按照Invitrogen公司操作手册提供的电转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有400 µg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，部分转化子PCR筛选结果如图2所示；

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有不同浓度的 Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将高抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，在28℃， 300 rpm培养条件下培养至菌体OD₆₀₀=6.0，取上述菌液，接种至含500mL BMGY培养基的2000 mL摇瓶中，每甁接种5 mL，于28℃，250 rpm培养至OD₆₀₀=12；室温下2500g离心5 min，收集菌体，用1/7原培养体积的BMMY重悬菌体，向培养基中添加100%甲醇至终浓度（质量分数）为1~2%，诱导24小时，在28°C继续诱导培养48小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%，收集发酵的上清液。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，其分泌表达的上清液以6×His兔单抗为一抗，以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗，间接ELISA法检测目标蛋白表达水平。从十株高抗性(抗性水平大于或等于1500 µg/mL Zeocin)转化子中筛选得到一株稳定且高水平分泌表达昆虫神毒素TX4(6-1)的酵母转化子，而从50株抗性水平低于1500µg/mL Zeocin YPD平板的转化子没有筛选到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，部分转化子筛选的ELISA结果如表1所示。表1为本发明实施例中不同Zeocin抗性的昆虫神经毒素TX4(6-1)的酵母转化子的ELISA检测结果，从结果可看出，高抗生转化子普遍具有更高的目标蛋白分泌能力，但仅有一株转化子具有显著更高水平的分泌表达TX4(6-1)，其在表1中的编号为A7。

表1，各转化子分泌表达Tx4(6-1)的数值(n=3)。

选取高水平分泌表达的酵母转化子A7单菌落，接种至装有50 mL YPD液体培养基的250 mL三角瓶中，在28℃， 300 rpm培养条件下培养至菌体OD₆₀₀=6.0，取上述菌液，接种至含500mL BMGY培养基的2000 mL摇瓶中，每甁接种5 mL，于28℃，250 rpm培养至OD₆₀₀=12；室温下2500g离心5 min，收集菌体，用1/7原培养体积的BMMY重悬菌体，向培养基中添加100%甲醇至终浓度（质量分数）为1~2%，诱导24小时，在28°C继续诱导培养96小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%，收集发酵的上清液。用SDS-PAGE检测甲醇诱导下不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图，目标蛋白如箭头所示。经诱导1~4天，在10 kDa左右均有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，在一定时间内，诱导得到的目的蛋白含量更高，具体目的蛋白占上清总蛋白的含量结果如下表2所示。

表2 不同诱导时间得到的目的蛋白占蛋白诱导液上清总蛋白的百分比含量结果。

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量（%）	13	34	30	25

SDS-PAGE和目标蛋白含量检测结果表明，经48小时的诱导，目标蛋白即达到最高水平的分泌表达，延长诱导时间会导致目标蛋白的降解。高水平分泌表达的转化子，以100倍的比例扩大培养。高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导48小时，收集发酵的上清液。

S4：为实现目标蛋白的最大分泌表达水平，目标蛋白的大量表达是在BMMY继续诱导培养48小时后，其间每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%；

S5：将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.5~8.0，以大于或等于15000 g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用10倍层析柱体积的pH 8 的含10 mM Tris-HCl和30~50 mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10 mM Tris-HCl和100~400 mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为3 kDa的透析袋于10 mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩；

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。

需要说明的是，将步骤S5洗脱下来的纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示(目标蛋白如箭头所示)，图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的TX4(6-1)蛋白的SDS-PAGE检测结果图。从结果可以看出，先利用40 mM咪唑的漂洗液可以将大量杂蛋白去除，再利用100、200和 400 mM咪唑的缓冲液洗脱层析柱时均能洗脱得到高纯度的目标蛋白。

本实施例提供的技术方案目的蛋白TX4(6-1)的表达量在酵母分泌表达蜘蛛神经毒素的报道中达到了很高的水平，从S3收集发酵的上清液，经过步骤S5纯化，从1 L的培养液中可以纯度在95%以上的TX4(6-1)蛋白45 mg。

将实施例二经过步骤S7得到纯化后的TX4(6-1)蛋白进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下：

实验方法1：在10 cm 培养皿中将昆虫细胞SF9于昆虫细胞培养基中培养至90%生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×10⁵ cell/mL，向 96孔细胞培养板中每孔加入100 μl的昆虫SF9细胞悬液，培养过夜后，向各培养孔分别加入不同终浓度TX4(6-1)蛋白(0、1、5、10、20 ng/ml ) ，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，显微镜下测定细胞的生长成况，。

同样将HEK293细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基中培养至90%生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×10⁵ cell/mL，向 96孔细胞培养板中每孔加入100 μl的HEK293细胞悬液，培养过夜后，各培养孔分别加入不同终浓度TX4(6-1)蛋白(0、1、5、10、20 ng/ml )，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，显微镜下测定细胞的生长成况，同时设加入PBS的对照实验组。

实验结果1：本发明实施例中的重组TX4(6-1)蛋白的生物学活性结果示如下表3所示。细胞增殖活性测定结果表明，本发明所采用的方法制备的TX4(6-1) 重组蛋白具有很高的生物学活性，并且保持毒害昆虫的专一性，对人的HEK293细胞在测试浓度内没有毒性。

表3重组TX4(6-1)蛋白生物学活性分析结果。

实验方法2：利用PBS将纯化后的TX4(6-1) 蛋白稀释至2 mg/ml，按1 μg/g体重注射5龄东亚飞蝗30只，同时以注射相同体积PBS的5龄东亚飞蝗作为对照，观察5龄东亚飞蝗的中毒死亡症状。

实验结果2：结果发现，注射纯化后的TX4(6-1) 蛋白的东亚飞蝗表现出了神经系统中毒症状，并在12小时内死亡率达到60%，注射纯化的TX4(6-1)蛋白的东亚飞蝗立即表现出强烈的神经毒素中毒症状，并在24小时内所有蝗虫全部死亡，而注射相同体积PBS的对照组蝗虫无一出现中毒症状。其中注射纯化的TX4(6-1)蛋白的东亚飞蝗12小时观察到的部分死亡蝗虫结果如图6所示。生物学活性检测结果表明，本发明技术方案制备的重组TX4(6-1)蛋白具有很强的生物活性。具体结果如下表3所示：

表4 生物学活性分析结果（n=3）。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 怀化学院

<120> 一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1)重组蛋白的制备方法

<130> 3

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtggtgaca tcaacgctgc ttgtaaagaa gactgtgact gttgtggtta cactacagct 60

tgtgactgtt actggtctaa atcttgtaag tgtagagaag ctgctatcgt tatctacact 120

gctcctaaaa agaaattgac atgtcatcac catcaccatc actaa 165

<210> 2

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Gly Asp Ile Asn Ala Ala Cys Lys Glu Asp Cys Asp Cys Cys Gly

1 5 10 15

Tyr Thr Thr Ala Cys Asp Cys Tyr Trp Ser Lys Ser Cys Lys Cys Arg

20 25 30

Glu Ala Ala Ile Val Ile Tyr Thr Ala Pro Lys Lys Lys Leu Thr Cys

35 40 45

His His His His His His

50

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggatcctg tggtgacatc aacgctg 27

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaagctttt aacatgtcaa tttcttttta g 31

Claims (9)

1.一种经过优化和筛选的蜘蛛TX4(6-1)基因，是由序列表中序列1所示编码具有毒杀昆虫活性的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的一种由序列表中序列2所示蛋白质分子。

3.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述重组载体具体为将权利要求1所述的基因插入表达载体中，得到表达权利要求 2所述蛋白的重组载体，所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4.一种利用权利要求1所述的基因制备蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16°C连接，得重组载体pPICZαA-TX4(6-1)；

S2：将所述重组载体pPICZαA-TX4(6-1)用BamHⅠ和BglⅡ将酵母完整表达框切下，切下的表达框连接到经Bgl酶切的pPICZαA-TX4(6-1)载体，得到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，用BamHⅠ和BglⅡ将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下，再连接到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体中，得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZαA载体，电击转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过400 μg/mL Zeocin的YPD平板筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1500 μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1%~2%，诱导48小时，得发酵的上清液；以6×His兔单抗为一抗，以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗，间接ELISA法检测目标蛋白表达水平，筛选出高水平表达的酵母转化子；高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导48小时，收集发酵的上清液。

5.根据权利要求4所述的制备蛋白的方法，其特征在于：在步骤S3的诱导后且收集发酵的上清液之前，为提高目标蛋白的表达水平，甲醇的添加还包括如下步骤：

S4：经扩大培养，在28°C继续诱导培养48小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%。

6.根据权利要求4或5所述的制备蛋白的方法，其特征在于：在步骤S4之后，还包括如下步骤：

S5：将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.5~8.0，以大于或等于15000 g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用10倍层析柱体积的pH 8 的含10 mM Tris-HCl和30~50 mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10 mM Tris-HCl和100~400 mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为3 kDa的透析袋于10 mM Tris-Cl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

7.根据权利要求6所述的制备蛋白的方法，其特征在于：在步骤S6之后，还包括如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。

8.根据权利要求4-7任一项所述的制备蛋白的方法制备得到的蛋白。

9.权利要求2、3或8所述蛋白、权利要求1所述基因或权利要求4所述重组载体或重组菌在抗虫领域中的应用。