CN109758425A - 一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物载体领域，具体涉及一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体及其制备方法。所述海参皂苷纳米脂质体由磷脂与胆固醇组成的双分子层膜和中心药物海参皂苷组成，包封率达99％以上且无溶血毒性。本发明通过将海参皂苷包裹于脂质双分子层中制备海参皂苷纳米脂质体，克服了海参三萜皂苷的溶血毒性，为海参皂苷作为抗肿瘤药物的研究与开发提供一个安全有效的载药系统。

Description

一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物载体领域，具体涉及一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体及其制备方法。

背景技术

海参(seacucumber)隶属于棘皮动物门(Echinoermata)、海参纲(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirota)动物，是一种珍贵的滋补药材。明代《食物本草》中记载海参有补元气、滋养五脏六腑和虚损的养生功能。清朝《本草纲目拾遗》将海参列为补益药物。海参中含有皂苷、脂肪酸、神经节苷脂和多糖等多种重要的生物活性物质，具有抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、延缓衰老及增强免疫力等广泛的药理学作用。因此，从海参中提取分离生物活性物质成为研究热点之一。海参皂苷是海参体内重要的次生代谢产物，作为海参的化学防御物质，是毒素的主要成分。海参皂苷一般为三萜皂苷，它不仅对海参的生存具有重要的意义，而且还有抗肿瘤、抗菌、细胞毒性、溶血等药理活性。海参皂苷对肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制活性，但是海参皂苷的强溶血毒性限制了其体内注射的应用。

脂质体作为网状内皮系统最成功的药物递送载体之一，具有制备简单、组织相容性好、细胞亲和性好、毒副作用低、靶向性和缓释性等优点。目前，脂质体作为抗肿瘤药物载体已受到国内外研究者的关注。

发明内容

本发明要解决的技术问题是海参皂苷对肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制活性，但是海参皂苷的强溶血毒性限制了其体内注射的应用。

为解决上述问题，本发明将海参皂苷包裹于脂质双分子层中制备海参皂苷纳米脂质体，克服了海参三萜皂苷的溶血毒性，为海参皂苷作为抗肿瘤药物的研究与开发提供一个安全有效的载药系统。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现，一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体，所述海参皂苷纳米脂质体由磷脂与胆固醇组成的双分子层膜和中心药物海参皂苷组成，包封率达99％以上且无溶血毒性。

一种上述海参皂苷类纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)海参皂苷提取：海参经干燥、粉碎、乙醇水溶液脱脂和提取、离心，将上清液减压浓缩、冷冻干燥，得海参总皂苷A；

(2)海参皂苷分离纯化：步骤(1)中的海参总皂苷A经大孔树脂柱层析、正相硅胶柱层析、减压反相硅胶柱层析分离纯化，得海参皂苷单体化合物EA；

(3)海参皂苷纳米脂质体制备：以磷脂和胆固醇为壁材，海参皂苷单体化合物EA为包封药物，采用薄膜分散法制备海参皂苷纳米脂质体。

进一步的，海参皂苷提取步骤具体为海参经低温干燥、粉碎机粉碎，用体积比50％～70％乙醇水溶液室温机械搅拌提取3～5次，提取液离心，合并上清液减压浓缩、冷冻干燥，得海参总皂苷A。

进一步的，海参皂苷分离纯化步骤具体为：步骤(1)中的海参总皂苷A利用HP-20型大孔树脂进行分离纯化，收集体积比50％～70％乙醇洗脱组分，减压浓缩，冷冻干燥得海参总皂苷B；海参总皂苷B经正相硅胶柱层析分离纯化，收集体积比氯仿：甲醇：水＝7：1～3：0.1～0.3的洗脱组分；将该洗脱组分再次经减压反相硅胶ODS进一步纯化，60％(v/v)甲醇水溶液减压洗脱，薄层检测收集皂苷组分，得海参皂苷单体化合物EA，其结构式为

分子量为1184.5。

进一步的，海参皂苷纳米脂质体制备步骤具体为：

(a)磷脂与胆固醇在膜材中所占重量比分别为60％-75％和25％-40％；按上述重量比分别称取磷脂与胆固醇，加二氯甲烷10～30ml溶解；如上所述，适量胆固醇的加入在稳定脂质体双分子层膜的同时，又可大大降低溶血毒性，故控制磷脂与胆固醇的比例至关重要。

(b)将步骤(a)中所得溶液减压干燥除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

(c)加入骤(2)中所得海参皂苷单体化合物EA的生理盐水溶液，磷脂、胆固醇的混合物与海参皂苷单体化合物EA的质量比为10:1～30:1，探头超声60～120s，得乳白色脂质体混悬液，即为海参皂苷纳米脂质体。

另一方面，本发明提供所述海参皂苷类纳米脂质体在制备抗肿瘤药物方面的应用，具体地说，所述肿瘤为宫颈癌、肝癌、乳腺癌或耐药乳腺癌，尤其是敲除PTEN基因的耐曲妥珠单抗的乳腺癌。

本发明的有益效果在于：

(1)将海参皂苷包裹于脂质双分子层中制备海参皂苷纳米脂质体，克服了海参三萜皂苷的溶血毒性，可用于注射给药。

(2)提供了一种包封率达99％以上的有效海参皂苷类纳米脂质体的制备方法，能够更大程度上发挥海参皂苷的抗肿瘤、抗菌、细胞毒性、溶血等药理活性。

(3)提供了一种无溶血毒性的海参皂苷类纳米脂质体在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物上应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1海参皂苷单体EA的纯度鉴定图。

图2海参皂苷EA纳米脂质体的透射电镜图。

图3海参皂苷EA纳米脂质体水合粒径分布图。

图4海参皂苷EA纳米脂质体溶血毒性图。

图5海参皂苷EA纳米脂质体对肿瘤细胞及正常细胞的细胞毒性图。

图6磷脂与胆固醇的比例对溶血毒性的影响。

具体实施例

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体，所述海参皂苷纳米脂质体由磷脂与胆固醇组成的双分子层膜和中心药物海参皂苷组成，包封率达99％以上且无溶血毒性。

一种以菲律宾刺参为原料制备所述海参皂苷单体的方法，包括以下步骤：

(1)海参皂苷提取：海参经低温干燥、粉碎机粉碎，用60％(v/v)乙醇水溶液室温机械搅拌提取3次同时脱脂，提取液离心，合并上清液减压浓缩、冷冻干燥，得海参总皂苷A；

(2)海参皂苷分离纯化：步骤(1)中的海参总皂苷A利用HP-20型大孔树脂进行分离纯化，分别用水和70％(v/v)乙醇水溶液进行洗脱，收集70％(v/v)的乙醇洗脱组分，减压浓缩，冷冻干燥得海参总皂苷B；海参总皂苷B经正相硅胶柱层析分离纯化，用8:1:0-7:3:0.3(v/v/v)梯度比例的氯仿：甲醇：水依次洗脱，经TLC(展开剂氯仿：甲醇：水＝7:3:0.3(v/v/v)，显色剂为10％(v/v)的硫酸乙醇，110℃烘箱加热5min)检测，合并相应组分的洗脱组分；将该洗脱组分再次经减压反相硅胶ODS进一步纯化，60％(v/v)甲醇水溶液减压洗脱，薄层检测收集皂苷组分，得海参皂苷单体化合物EA等，其中海参皂苷单体Echinoside A(EA)结构式为：

分子量为1184.5。

如图1所示，高效液相色谱法分析表明海参皂苷单体EA的纯度为99.0％，表明采用本发明方法分离纯化的海参皂苷单体EA纯度高，作为抗肿瘤药物其有效性也更高。所用仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪，流动相为甲醇-水梯度洗脱，流速为1.0mL/min，色谱柱为XDB-C18(4.6*250mm)柱，柱温为30℃，检测波长为205nm。

(3)海参皂苷纳米脂质体制备：

(a)磷脂与胆固醇在膜材中所占重量比分别为2:1；按上述重量比分别称取磷脂与胆固醇，加二氯甲烷20ml溶解；如上所述，适量胆固醇的加入在稳定脂质体双分子层膜的同时，又可大大降低溶血毒性，故控制磷脂与胆固醇的比例至关重要。如图6所示，当磷脂与胆固醇的比例为2：1时，制得的海参皂苷纳米脂质体的溶血率小于5％，几乎无溶血毒性，当减少胆固醇所占的比例，其溶血毒性大大增加。

(b)将步骤(a)中所得溶液减压干燥除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

(c)加入步骤(2)中所得海参皂苷单体化合物EA的生理盐水溶液，磷脂、胆固醇的混合物与海参皂苷单体化合物EA的质量比为10:1(m/m)，探头超声120s，得乳白色脂质体混悬液，即为海参皂苷纳米脂质体。

如图2所示，透射电镜扫描检测得海参皂苷纳米脂质体得粒径约35nm，该粒径范围在30～80nm左右，分散系数小于0.2，包封率在99％以上，表明其几乎无溶血毒性。扫描方法为将脂质体悬液置于铜网上，用滤纸除去多余的液体，风干。然后用透射电镜观察。

如图3所示，纳米粒度仪检测海参皂苷纳米脂质体水合粒径约110nm，Zeta电位为-10.2mV。该状态下的脂质体比较稳定，不易聚集。检测方法为取稀释后的海参皂苷纳米脂质体于纳米粒度仪专用样品池中，马尔文Nano-ZS90型动态光散射粒径分析仪对脂质体的粒径和Zeta电位进行分析。

如图4所示，海参皂苷纳米脂质体在浓度为800μg/mL时，其溶血率小于5％。表明了采用本发明方法制备的海参皂苷纳米脂质体基本克服了海参三萜皂苷的溶血毒性，可用于注射使用。其检测方法如下：

(1)溶血毒性红细胞混悬液的制备：小鼠麻醉后取腹腔主动脉血，取血红细胞，4℃保存；用时配制成2％的红细胞悬浊液。

(2)受试样品的配制：

受试物：皂苷EA及其脂质体；

溶剂：生理盐水；

样品溶解：利用生理盐水将样品配制成相应浓度的溶液：5、10、50、100、200、400、800μg/ml。

(3)受试样品溶血当量的测定：精确吸取各样品0.5mL，取0.5mL蒸馏水作为阳性对照，取0.5mL生理盐水作为阴性对照，每管设3个平行。在上述各管中加入2％的红细胞悬浊液0.5mL，混匀，37℃水浴保温2h，取出立即冰浴终止反应，离心，取200μL上清液，用甲醇稀释至5ml，415nm波长处测其吸光度，并计算溶血率。溶血率计算公式：溶血率＝(A样-A阴)/(A阳-A阴)×100％。以样品的溶血率对样品浓度作图得到各样品溶血曲线。

本发明的海参皂苷纳米脂质体的包封率大于99％，载药量为9％。检测方法如下：海参皂苷纳米脂质体经透析后，经异丙醇破乳后，上清液采用高效液相色谱法测定海参皂苷的含量，计算脂质体的包封率和载药量。

另一方面，本发明提供所述海参皂苷类纳米脂质体在制备抗肿瘤药物方面的应用，具体地说，所述肿瘤为宫颈癌、肝癌、乳腺癌或耐药乳腺癌，尤其是敲除PTEN基因的耐曲妥珠单抗的乳腺癌。以下为抑制肿瘤细胞增殖实验。

1.实验材料

受试样品：实施例1中制备的海参皂苷纳米脂质体。

阴性对照品：0.9％NaCl。

空白对照品：磷酸盐缓冲溶液。

细胞株：肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7、乳腺癌细胞MDA-MB-231、耐药乳腺癌细胞BT474-PTEN-LTT

试剂与仪器：胰蛋白酶、MTT、酶标仪

2.实验方法

药物处理剂量及配制方法：将实施例1中制备的海参皂苷纳米脂质体分散于磷酸盐缓冲溶液中，配制成浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的系列溶液。

细胞培养：肝癌细胞SMMC-7721、耐药乳腺癌细胞BT474-PTEN-LTT用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7、乳腺癌细胞MDA-MB-231用含10％胎牛血清的DMEM培养基于5％CO2培养箱37℃培养，细胞贴壁生长至70～80％时，胰酶消化细胞，以2×10⁴个/mL细胞接种到96孔细胞培养板使细胞贴壁后加药。

海参皂苷纳米脂质体对肿瘤细胞生长的抑制作用：将不同浓度的海参皂苷纳米脂质体(1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、10μg/mL)加入到细胞培养板中，空白和阴性对照组分别加入等体积的磷酸缓冲溶液和0.9％NaCl，设置3个复孔，药物孵育细胞24、48和72h后，加入MTT，于培养箱中继续孵育4h，去掉上清液，加入二甲基亚砜，用酶标仪于490nm波长处测定各孔的吸光度值。数据处理：细胞增殖抑制率(％)＝100％-(OD_加药组-OD_空白)/(OD_{阴性对照组}-OD_空白)

得到如图5所示的结果，表明其体外对肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和BT474-PTEN-LTT等具有显著的抑制活性，且对正常肝细胞L-02毒副作用较小，有望开发为可供体内注射给药的抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物。

Claims (8)

1.一种可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体，其特征在于：所述海参皂苷纳米脂质体由磷脂与胆固醇组成的双分子层膜和中心药物海参皂苷单体化合物组成，包封率达99％以上且无溶血毒性。

2.一种权利要求1中的海参皂苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)海参皂苷提取：海参经干燥、粉碎、乙醇水溶液脱脂和提取、离心，将上清液减压浓缩、冷冻干燥，得海参总皂苷A；

(2)海参皂苷分离纯化：步骤(1)中的海参总皂苷A经大孔树脂柱层析、正相硅胶柱层析、减压反相硅胶柱层析分离纯化，得海参皂苷单体化合物EA；

(3)海参皂苷纳米脂质体制备：以磷脂和胆固醇为壁材，海参皂苷单体化合物EA为包封药物，采用薄膜分散法制备海参皂苷纳米脂质体。

3.根据权利要求2所述的可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于：海参皂苷提取步骤具体为海参经低温干燥、粉碎机粉碎，用体积比50％～70％乙醇水溶液室温机械搅拌提取3～5次，提取液离心，合并上清液减压浓缩、冷冻干燥，得海参总皂苷A。

4.根据权利要求2或3所述的可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于：所述海参为菲律宾刺参。

5.根据权利要求2所述的可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于：海参皂苷分离纯化步骤具体为：步骤(1)中的海参总皂苷A利用HP-20型大孔树脂进行分离纯化，收集体积比50％～70％乙醇洗脱组分，减压浓缩，冷冻干燥得海参总皂苷B；海参总皂苷B经正相硅胶柱层析分离纯化，收集体积比氯仿：甲醇：水＝7：1～3：0.1～0.3的洗脱组分；将该洗脱组分再次经减压反相硅胶ODS进一步纯化，体积比60％的甲醇水溶液减压洗脱，薄层检测收集皂苷组分，得海参皂苷单体化合物EA。

6.根据权利要求2或5所述的可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于：海参皂苷单体EA的结构式为：

分子量为1184.5。

7.根据权利要求2所述的可供注射给药的海参皂苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于：海参皂苷纳米脂质体制备步骤具体为：

(a)磷脂与胆固醇在膜材中所占重量比分别为60％-75％和25％-40％；按上述重量比分别称取磷脂与胆固醇，加二氯甲烷溶解；

(b)将步骤(a)中所得溶液减压干燥除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

(c)加入步骤(2)中所得的海参皂苷单体化合物EA的生理盐水溶液，磷脂、胆固醇的混合物与海参皂苷单体化合物EA的质量比为10:1～30:1，探头超声，得乳白色脂质体混悬液，即为海参皂苷纳米脂质体。

8.一种权利要求1中的海参皂苷纳米脂质体的应用，其特征在于：在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述肿瘤为宫颈癌、肝癌、乳腺癌或耐药乳腺癌，尤其是敲除PTEN基因的耐曲妥珠单抗的乳腺癌。