CN112843017A - 一种包载海参皂苷的自组装纳米体系及其制备方法和应用 - Google Patents
一种包载海参皂苷的自组装纳米体系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种包载海参皂苷的自组装纳米体系及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明首先利用1,6‑α‑D‑葡聚糖与棕榈酰氯反应生成棕榈酰化葡聚糖，分离纯化得到棕榈酰化葡聚糖化合物；再将得到的棕榈酰化葡聚糖溶于乙醇中制成薄膜，加入含海参皂苷的磷酸盐缓冲溶液，搅拌形成包载海参皂苷的棕榈酰化葡聚糖自组装体系。本发明制备的包载海参皂苷的棕榈酰化葡聚糖自组装体系包封率为69％，在海参皂苷浓度为600μg/mL时溶血率小于5％，符合注射药物的要求。通过细胞毒性试验证明了本发明制备的包载海参皂苷的棕榈酰化葡聚糖自组装体系具有抑制肿瘤细胞的作用，能够用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种包载海参皂苷的自组装纳米体系及其制备方法和应用。
背景技术
海参皂苷是海参体内重要的次生代谢产物，具有抗肿瘤、抗真菌等多种药理活性。近年来，海参皂苷较好的抗肿瘤活性逐渐引起大家的关注。但口服海参皂苷易被消化系统内的酶降解，影响其生物利用度。静脉注射给药海参皂苷，因其可与生物膜上的甾醇分子结合，使红细胞穿孔引起溶血，以上原因限制了海参皂苷作为抗肿瘤药物的开发利用。因此，降低海参皂苷类化合物的溶血毒性对其临床抗肿瘤药物的开发具有重要的意义。
据文献报道，目前仅从几种滋补品如龙眼、人参、甘薯等中分离得到1,6连接的α-D-葡聚糖。非专利文献“葛根中(1→6)-α-D-葡聚糖的结构，构象及其硫酸化衍生物抗氧化活性，崔恒祥等”公开了葛根中提取的(1→6)-α-D-葡聚糖，中国专利文件CN104861085A公开了板栗中提取的1,6-α-D-葡聚糖。但现有尚未有利用1,6-α-D-葡聚糖降低海参皂苷溶血毒性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种包载海参皂苷的自组装纳米体系及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，将海参皂苷包载于棕榈酰化葡聚糖的自组装体系中形成纳米复合物，克服了海参皂苷的溶血毒性，为海参皂苷作为抗肿瘤药物的开发利用提供一个安全有效的纳米载药体系。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种包载海参皂苷的自组装纳米体系，所述的自组装纳米体系为棕榈酰化葡聚糖自组装纳米体系。
本发明提供一种所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，包括以下步骤：
1)棕榈酰化葡聚糖合成：用1,6-α-D-葡聚糖与棕榈酰氯反应生成棕榈酰化葡聚糖，分离纯化得到棕榈酰化葡聚糖化合物；
2)包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系构建：将步骤1)中得到的棕榈酰化葡聚糖化合物溶于乙醇中制成薄膜，加入含海参皂苷的磷酸盐缓冲溶液，搅拌形成包载海参皂苷的棕榈酰化葡聚糖自组装纳米体系。
优选的，所述步骤1)具体步骤为：称取1,6-α-D-葡聚糖至无水N,N-二甲基甲酰胺中，加热使其充分溶解，再加入无水吡啶和无水棕榈酰氯，搅拌反应，反应结束后加入去离子水终止反应，乙醇醇沉，离心收集多糖衍生物，凝胶色谱分离纯化，硫酸-苯酚检测，收集多糖组分，浓缩冻干后即得棕榈酰化葡聚糖化合物。
优选的，所述1,6-α-D-葡聚糖与无水N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为12.5mg：1ml。
优选的，所述无水棕榈酰氯与1,6-α-D-葡聚糖的质量比为3：10。
优选的，所述步骤1)中搅拌反应的时间为80h。
优选的，步骤2)中将棕榈酰化葡聚糖化合物溶于乙醇中制成薄膜的具体步骤为：棕榈酰化葡聚糖化合物30mg溶于乙醇溶液中，40℃减压旋转蒸发干燥，制备棕榈酰化葡聚糖的薄膜。
优选的，所述步骤2)中的含海参皂苷的磷酸盐缓冲溶液中海参皂苷的浓度为1mg/mL。
优选的，所述步骤2)中搅拌的方法为：轻轻振摇，室温搅拌过夜后，超声探头超声2min。
本发明还提供所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系在制备抗肿瘤或抗肿瘤辅助药物中的应用。
1,6-α-D-葡聚糖为多羟基化合物，可与棕榈酰氯(十六烷酰氯)发生反应生成棕榈酰化葡聚糖。在水相体系中，亲水端的葡聚糖和疏水端的棕榈酰基会发生自组装行为形成自组装体系。
本发明公开了以下技术效果：
(1)将海参皂苷装载于棕榈酰葡聚糖的纳米自组装体系中，解决了海参皂苷类化合物具有溶血毒性的问题，可用于体内注射给药。
(2)提供了一种包封率在69％以上的包载海参皂苷棕榈酰葡聚糖的纳米自组装体系的制备方法，能更大程度上发挥海参皂苷的抗肿瘤、抗菌等药理活性。
(3)提供了一种无溶血毒性的海参皂苷棕榈酰葡聚糖的纳米自组装体系在抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为棕榈酰化葡聚糖红外光谱图；
图2为包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的扫描电镜图；
图3为不同浓度包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系对红细胞悬浊液的影响图；图中从左到右依次为生理盐水，去离子水，5μg/mLEA，1000μg/mLEA，800μg/mLEA，600μg/mLEA；
图4为包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系溶血毒性图；图中1为生理盐水，2为去离子水，3为5μg/mLEA，4为1000μg/mLEA，5为800μg/mLEA，6为600μg/mLEA；
图5为包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖纳米自组装体系对MCF-7细胞的细胞毒性图；
图6为包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖纳米自组装体系对SMMC-7721细胞的细胞毒性图；
图7为包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖纳米自组装体系对HeLa细胞的细胞毒性图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
实施例1
1、包载海参皂苷的棕榈酰葡聚糖自组装纳米体系的制备
(1)棕榈酰葡聚糖的制备：首先把1,6-α-D-葡聚糖进行减压干燥，反应瓶烘箱中进行干燥，DMF、吡啶、棕榈酰氯经分子筛除水，保证反应容器、样品、试剂均干燥无水。称取100mg的无水1,6-α-D-葡聚糖溶于8mL的无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，45℃加热使其溶解，加入1.0mL无水吡啶和30mg棕榈酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液2mL，30℃磁力搅拌反应80h，加入1mL去离子水终止反应，加入3倍体积的无水乙醇醇沉棕榈酰化葡聚糖化合物。
(2)棕榈酰葡聚糖的分离纯化：称取50mg的棕榈酰化葡聚糖化合物溶于1mL去离子水中，采用Sephadex G-25凝胶渗透柱色谱分离纯化，硫酸-苯酚法检测收集多糖组分，洗脱液浓缩，冷冻干燥后得棕榈酰化葡聚糖。
(3)包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的构建：取上述步骤(2)中的棕榈酰化葡聚糖30mg溶于无水乙醇中，40℃减压旋转蒸发干燥，制备棕榈酰化葡聚糖的薄膜，加入含有浓度为1mg/mL的海参皂苷EA(echinoside A)的磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌过夜后，轻轻振摇，超声探头超声2min，离心收集沉淀部分，得包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系。
2、包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的检测
2.1包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的性质检测
以无水KBr压片，进行红外光谱分析。葡聚糖、棕榈酰化葡聚糖的红外光谱如图1所示。从图1中可以看出，棕榈酰化葡聚糖红外光谱中O-H峰明显减小，C-H的吸收峰明显增大，这说明棕榈酰氯可以与葡聚糖中的羟基发生反应，生成棕榈酰化葡聚糖。
将包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系悬液置于硅片上，加热除去多余的液体，风干，然后用扫描电镜观察，结果如图2所示。扫描电镜检测得包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖纳米自组装体系的粒径约100nm。
取包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系于纳米粒度仪专用样品池中，马尔文Nano-ZS90型动态光散射粒径分析仪对包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的Zeta电位进行分析。纳米粒度仪检测包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的Zeta电位为-5.98mV。
将包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖纳米复合物溶于N,N-二甲基甲酰胺释放海参皂苷，10000rpm/min离心10min，收集上清液，测定海参皂苷的含量。结果表明包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的包封率大于69％。
2.2包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系的溶血率
溶血毒性红细胞混悬液的制备：取小鼠红细胞，配制成2％的红细胞悬浊液备用。将包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系分散于生理盐水中，用生理盐水将样品稀释成海参皂苷浓度为2000、1600、1200μg/ml。取各样品溶液0.5mL，加入0.5mL2％的红细胞悬浊液，以去离子水为阳性对照，生理盐水为阴性对照，每管设3个平行，混匀，37℃水浴孵育2h，离心，取上清液，用甲醇稀释至5ml，在570nm波长处测其吸光度，并计算溶血率。溶血率计算公式：溶血率＝(A样-A阴)/(A阳-A阴)×100％。反应后的各组红细胞悬浊液如图3所示，各组溶血率如图4所示，图4中从1到6依次为生理盐水，去离子水，5μg/mLEA，1000μg/mLEA，800μg/mLEA，600μg/mLEA，其中5μg/mLEA组为游离的海参皂苷，其他的浓度为包载在棕榈酰葡聚糖中的海参皂苷。
包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系在海参皂苷浓度为600μg/mL时，溶血率为4.5％，小于5％，满足临床对溶血毒性大小的要求。
实施例2
抑制肿瘤细胞增殖实验
1、材料与方法
1.1实验材料
受试样品：实施例1中制备的包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系。
阴性对照品：0.9％NaCl；阳性对照品：盐酸阿霉素5μg/mL；空白对照品：磷酸盐缓冲溶液。
细胞株：肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7。
试剂与仪器：胰蛋白酶、MTT、酶标仪。
1.2实验方法
1.2.1药物处理剂量及配置方法
将实施例1中制备的包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系分散于磷酸盐缓冲溶液中，配制成浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL的系列溶液。
1.2.2细胞培养
肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7用含10％胎牛血清的DMEM培养基于5％CO2培养箱37℃培养，细胞贴壁生长至70～80％时，胰酶消化细胞，按照每毫升2×104个细胞接种到96孔细胞培养板使细胞贴壁后加药。
1.2.3包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系对肿瘤细胞生长的抑制作用
将不同浓度的包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系(以海参皂苷的浓度计，海参皂苷的初始浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL，分散在无菌的PBS中)加入到细胞培养板中，90ul的细胞培养基加入10ul的样品，空白和阴性对照组分别加入等体积的磷酸缓冲溶液和0.9％NaCl，设置3个复孔，药物孵育细胞24和48h后，加入MTT继续孵育4h，吸弃上清液加入二甲基亚砜，于490nm波长处测定吸光度值。细胞增殖抑制率(％)＝100％-(OD加药组-OD空白)/(OD阴性对照组-OD空白)
2、实验结果
不同浓度的包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系对MCF-7、SMMC-7721和HeLa细胞的细胞毒性如图5、图6、图7所示，可见随着海参皂苷浓度的上升，包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系对肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性均逐渐上升。并且在浓度为8μg/mL时能够起到比阿霉素更好的肿瘤抑制效果。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种包载海参皂苷的自组装纳米体系，其特征在于，所述的自组装纳米体系为棕榈酰化葡聚糖自组装纳米体系。
2.一种权利要求1所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)棕榈酰化葡聚糖合成：用1,6-α-D-葡聚糖与棕榈酰氯反应生成棕榈酰化葡聚糖，分离纯化得到棕榈酰化葡聚糖化合物；
2)包载海参皂苷棕榈酰化葡聚糖自组装体系构建：将步骤1)中得到的棕榈酰化葡聚糖化合物溶于乙醇中制成薄膜，加入含海参皂苷的磷酸盐缓冲溶液，搅拌形成包载海参皂苷的棕榈酰化葡聚糖自组装纳米体系。
3.根据权利要求2所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体步骤为：称取1,6-α-D-葡聚糖至无水N,N-二甲基甲酰胺中，加热使其充分溶解，再加入无水吡啶和无水棕榈酰氯，搅拌反应，反应结束后加入去离子水终止反应，乙醇醇沉，离心收集多糖衍生物，凝胶色谱分离纯化，硫酸-苯酚检测，收集多糖组分，浓缩冻干后即得棕榈酰化葡聚糖化合物。
4.根据权利要求3所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，所述1,6-α-D-葡聚糖与无水N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为12.5mg：1ml。
5.根据权利要求3所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，所述无水棕榈酰氯与1,6-α-D-葡聚糖的质量比为3：10。
6.根据权利要求3所述的棕榈酰化葡聚糖自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中搅拌反应的时间为80h。
7.根据权利要求2所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，步骤2)中将棕榈酰化葡聚糖化合物溶于乙醇中制成薄膜的具体步骤为：棕榈酰化葡聚糖化合物30mg溶于乙醇溶液中，40℃减压旋转蒸发干燥，制备棕榈酰化葡聚糖的薄膜。
8.根据权利要求2所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的含海参皂苷的磷酸盐缓冲溶液中海参皂苷的浓度为1mg/mL。
9.根据权利要求2所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中搅拌的方法为：轻轻振摇，室温搅拌过夜后，超声探头超声2min。
10.一种权利要求1所述的包载海参皂苷的自组装纳米体系在制备抗肿瘤或抗肿瘤辅助药物中的应用。
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