CN105434370B - 雷公藤甲素壳聚糖纳米粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及雷公藤甲素壳聚糖纳米粒及其制备方法。本发明通过冷冻干燥法制备了两种性质优良的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒，即雷公藤甲素‑壳聚糖纳米粒和雷公藤甲素‑半乳糖‑壳聚糖纳米粒。所述纳米粒粒径大小均匀，包封率和载药量高，冻干前后性质变化不大。所述制备方法简单易行，但所制备的纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度，延长药物疗效，还大大加强了雷公藤甲素的靶向给药能力。

Description

雷公藤甲素壳聚糖纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及雷公藤甲素壳聚糖纳米粒及其制备方法。
背景技术
雷公藤甲素(即雷公藤内酯醇)是从卫矛科雷公藤属植物雷公藤根皮中提取分离到的环氧二萜内酯，无色柱状晶体，无臭，较难溶解。雷公藤甲素是一种免疫抑制剂，由于它生理活性强，具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗生育及免疫调节作用，临床上常用于治疗白血病等肿瘤性疾病，并在多种自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎等)及肾、心脏移植排斥反应中也发挥着重要的作用。
但雷公藤甲素也是一个毒性较大的药物，目前在雷公藤甲素制剂的临床用药中，在表现出理想的疗效时，同时也出现严重的毒副反应。正是由于雷公藤甲素制剂的严重毒副反应而限制了它的使用。为解决此焦点问题，雷公藤甲素新剂型的开发，已成为众多科学家锲而不舍的目标。
纳米粒是指粒径10～1000nm的固态胶体颗粒。由于纳米药物可以显著提高药物的生物利用度，亦即在达到同样治疗效果的条件下，可大幅度减少药物的服用剂量，可使雷公藤甲素的有效用量显著地低于其中毒用量。因此，研制雷公藤甲素纳米药物，为安全使用雷公藤甲素创造了良好的条件。
壳聚糖是一种带正电荷的天然多糖，无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用，具有良好的生物相容性和生物降解性。壳聚糖以其优良的理化性质和生物特性在药物制剂中已得到广泛的应用。多篇文献报道壳聚糖作为药物载体可以控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用，提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物的稳定性及改变给药途径，还可以大大加强制剂的靶向给药能力。
因此，雷公藤甲素壳聚糖纳米粒或许能够解决上述制剂所存在的严重缺陷，从而使雷公藤甲素具有更好的应用前景。但如何制备性质优良的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒却不是简单易行的；所制备的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒是否具有优良的释放效果也是难以预期的。因为所制备纳米粒的粒径大小、复溶前后的稳定性、包封率、载药量和释药特性都是应用纳米粒制剂时一直存在的问题。
发明内容
本发明人基于丰富的理论研究，通过不断探索和尝试，采用冷冻干燥法制备了两种性质优良的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒，即雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒(TP-CS)和雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒(TP-LACS)。该制备方法简单易行，但所制备的纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度，延长药物疗效，还大大加强了雷公藤甲素的靶向给药能力。
本发明的一个目的是提供一种雷公藤甲素壳聚糖纳米粒，即雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度。
进一步地，所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的平均粒径为50～500nm；优选的平均粒径为100～400nm、150～300nm；更优选的平均粒径为200～250nm。
进一步地，所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒溶液的平均电位大于+5mV；优选的平均电位大于+10mV、大于+15mV；更优选的平均电位大于+20mV。
进一步地，所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的包封率大于75％；优选的包封率大于80％、大于85％；更优选的包封率大于90％。
进一步地，所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的载药量大于10％；优选的载药量大于15％，更优选的载药量大于18％。
本发明还提供了雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括配制壳聚糖溶液、雷公藤甲素和壳聚糖的交联反应、以及冻干的步骤。
进一步地，所述制备方法的具体步骤包括：
(1)称适量壳聚糖(CS)，投入乙酸中，溶胀得到1mg/ml的壳聚糖溶液；
(2)向所述壳聚糖溶液中加入tween80，搅拌下加入含雷公藤甲素(TP)的二氯甲烷溶液混合均匀，继续搅拌至乳白色褪去，匀速加入三聚磷酸钠(TPP)溶液，搅拌得雷公藤甲素-壳聚糖(TP-CS)溶液；
(3)向所述雷公藤甲素-壳聚糖溶液中加入冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒。
进一步地，所述制备方法中的冻干保护剂为甘露醇和乳糖；优选的重量比是1∶1。
更进一步地，所述制备方法的具体步骤包括：
(1)称适量壳聚糖CS，投入1％乙酸溶液中，溶胀3天，得到1mg/ml的CS溶液；
(2)取5ml所述CS溶液于西林瓶中，加入2％tween80，磁力搅拌下加入0.5ml雷公藤甲素的二氯甲烷溶液(雷公藤甲素的浓度为2mg/ml)混合均匀，强力搅拌60分钟左右，待乳白色褪去，缓慢匀速加入1ml三聚磷酸钠TPP溶液(TPP的浓度为2mg/ml)，混合均匀，搅拌1小时使其充分交联，得雷公藤甲素-壳聚糖(TP-CS)溶液；
(3)向所述TP-CS溶液加入7％冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒。
进一步地，所述制备方法中的冻干前雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的平均粒径为205.5nm；平均电位为+22.3mV。
进一步地，所述制备方法中的冻干再复溶后雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的平均粒径为223.2nm；平均电位为+22.4mV。
本发明的另一个目的是提供另一种雷公藤甲素壳聚糖纳米粒，即雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度。
进一步地，所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的平均粒径为50～500nm；优选的平均粒径为100～400nm、150～300nm；更优选的平均粒径为200～250nm。
进一步地，所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒溶液的平均电位大于+5mV；优选的平均电位大于+10mV、大于+15mV；更优选的平均电位大于+18mV。
进一步地，所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的包封率大于75％；优选的包封率大于80％、大于85％；更优选的包封率大于90％。
进一步地，所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的载药量大于10％；优选的载药量大于15％，更优选的载药量大于17％。
本发明还提供了雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括半乳糖-壳聚糖的制备、配制半乳糖-壳聚糖溶液、雷公藤甲素和半乳糖-壳聚糖的交联反应、以及冻干的步骤。
进一步地，所述制备方法的具体步骤包括：
(1)水中加入四甲基二乙胺(TEMED)，调节pH值至4-5，加入半乳糖(LA)，冰浴下加入EDC和NHS，搅拌活化；加入壳聚糖(CS)，调节pH值至1.5-2.0溶解壳聚糖；调节pH值至4-5，室温反应；取反应液过滤，透析，冻干得到半乳糖-壳聚糖(LA-CS)；
(2)称适量半乳糖-壳聚糖，投入乙酸中，溶胀得到1mg/ml的半乳糖-壳聚糖溶液；
(3)向所述半乳糖-壳聚糖溶液中加入tween80，搅拌下加入含雷公藤甲素的二氯甲烷溶液混合均匀，继续搅拌至乳白色褪去，匀速加入三聚磷酸钠(TPP)溶液，搅拌得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖(TP-LACS)溶液；
(4)向所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖溶液加入冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒。
进一步地，所述制备方法中的冻干保护剂为甘露醇和乳糖；优选的重量比是1∶1。
进一步地，所述制备方法中的用HCl溶液和/或NaOH溶液调节pH值。
更进一步地，所述制备方法的具体步骤包括：
(1)取50毫升纯化水，加入1.5毫升四甲基二乙胺TEMED，HCl调pH至4.7，加入1.1克半乳糖LA，冰浴下加入0.6克EDC和0.14克NHS，搅拌活化1小时；加入0.5克壳聚糖CS，用HCl将pH调至1.5-2.0溶解CS，用NaOH将pH调至4-5，室温反应72小时；取反应液过滤，透析24小时，冻干得到半乳糖-壳聚糖LA-CS；
(2)称适量LA-CS，投入1％乙酸溶液中，溶胀1天，得到1mg/ml的LA-CS溶液；
(3)取5ml所述LA-CS溶液于西林瓶中，加入2％tween80，磁力搅拌下加入0.5ml雷公藤甲素的二氯甲烷溶液(雷公藤甲素的浓度为2mg/ml)混合均匀，强力搅拌60分钟左右，待乳白色褪去，缓慢匀速加入1ml三聚磷酸钠TPP溶液(TPP的浓度为1.5mg/ml)，混合均匀，搅拌1小时使其充分交联，得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖(TP-LACS)溶液；
(4)向所述TP-LACS溶液加入7％冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒。
进一步地，所述制备方法中的冻干前雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的平均粒径为203.3nm；平均电位为+18.4mV。
进一步地，所述制备方法中的冻干再复溶后雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的平均粒径为229.0nm；平均电位为+18.8mV。
本发明通过冷冻干燥法制备的雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒(TP-CS)和雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒(TP-LACS)，粒径大小均匀，包封率和载药量高，冻干前后性质变化不大。并且该制备方法简单易行，但所制备的纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度，延长药物疗效，还大大加强了雷公藤甲素的靶向给药能力。
附图说明
图1流动相空白色谱图。
图2壳聚糖空白色谱图。
图3 100％浓度雷公藤甲素的色谱图。
图4雷公藤甲素测定的线性标准曲线图。
图5 TP-CS纳米粒冻干前粒径图。
图6 TP-CS纳米粒冻干前电位图。
图7 TP-CS纳米粒复溶后粒径图。
图8 TP-CS纳米粒复溶后电位图。
图9 CS氢谱图。
图10 LA-CS氢谱图。
图11 CS氢谱处理结果图。
图12 LA-CS氢谱处理结果图。
图13 LA-CS结构式。
图14 TP-LACS纳米粒冻干前粒径图。
图15 TP-LACS纳米粒冻干前电位图。
图16 TP-LACS纳米粒复溶后粒径图。
图17 TP-LACS纳米粒复溶后电位图。
图18雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的体外释放图。
图19 TP-LACS纳米粒的TEM图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1、雷公藤甲素方法学
仪器：万分之一天平、HPLC、C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)、10ml容量瓶15只、50ml容量瓶1只、5ml容量瓶1只、1ml移液管、0.22μm微孔滤膜、液相进样小瓶、0.01ml移液管
试剂：色谱级甲醇、up水、雷公藤甲素(已知纯度)
1.色谱条件
色谱柱 C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流动相 V甲醇-V水(45∶55)，流速0.9ml/min
测定波长 218.0nm
柱温 30℃
进样量 20μl
2.标准储备液：
精密称取已知纯度的雷公藤甲素对照品25mg于50ml容量瓶(0.5mg/ml)中，溶解，用流动相定容摇匀后作为标准储备液。
精密称取壳聚糖20mg于50ml容量瓶中，溶解，用甲醇定容使甲醇与水的比例与流动相比例基本一致，作为壳聚糖储备液。
3.专属性
取1ml空白纳米粒溶液于10ml容量瓶(应为处方比)中，用流动相稀释至刻度，作为空白纳米粒溶液；精密量取标准储备液0.25ml至10ml容量瓶中制得12.5μg/ml的雷公藤甲素溶液(100％溶液)，分别取空白纳米粒溶液和12.5μg/ml雷公藤甲素溶液，过0.22μm微孔滤膜取续滤液，精密吸取20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
图1～3分别为流动相空白、壳聚糖空白、100％浓度雷公藤甲素的色谱图，对比三个色谱图可以发现，主药雷公藤甲素约在7.6min左右出峰，100％浓度雷公藤甲素色谱图中虽然有其他的峰，但该位置的峰在流动相进样时也出，推测是柱或者液相色谱系统有残留干扰。壳聚糖空白的色谱图在7.6min时也未出峰，初步推得该方法专属性尚可。
4.准确度
4.1相对回收率
分别移取雷公藤甲素储备液0.20ml、0.25ml、0.30ml于10ml容量瓶中，用流动相定容制备成测试浓度80％、100％、120％的溶液，每个浓度水平配三份，过0.22μm微孔滤膜，进样，记录峰面积代入线性计算实际浓度、回收率及RSD。
表1相对回收率试验结果
结果如表1所示，回收率均在98％～102％内，RSD小于2.0％，说明方法能够准确测取雷公藤甲素浓度。
4.2空白加样回收率
分别移取雷公藤甲素储备液0.20ml两份、0.25ml两份、0.30ml两份于10ml容量瓶中，再分别移入0.10ml壳聚糖储备液，流动相定容，过0.22μm微孔滤膜进样，记录峰面积，代入标准曲线计算得到实际浓度、回收率及RSD。
表2空白加样回收率试验结果
结果如表2所示，回收率在98％～102％内，RSD小于2.0％，说明在辅料的影响下，该方法依然能准确测定雷公藤甲素浓度。
5.精密度
取3中配制100％浓度的雷公藤甲素溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积的相对标准偏差。
表3精密度试验结果
RSD小于2.0％，符合要求，说明该法进样精密度良好。
6.线性及线性范围
用移液管分别精密量取0.10ml、0.15ml、0.25ml、0.35ml、0.50ml于10ml容量瓶中(即测试浓度的40％、60％、100％、140％、200％，即5μg/ml、7.5μg/ml、12.5μg/ml、17.5μg/ml、25μg/ml)，用流动相定容，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液进进样小瓶，用移液管精密量取1ml40％溶液至5ml容量瓶中(1μg/ml)，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液进进样小瓶，进样，记录峰面积，作出峰面积对测试浓度线性曲线。
表4线性试验结果
由该表4和图4的线性标准曲线可知，雷公藤甲素在1.028～25.70μg/ml浓度范围内线性相关性良好。
7.检测限
移取30μl 100％浓度(12.85μg/ml)溶液于25ml容量瓶中，用流动相定容，过0.22μm微孔滤膜进样，此时S/N＝3.3，即该方法检测限为0.01542μg/ml。
8.溶液稳定性
取100％浓度溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，于0h、2h、4h、6h，8h，12h，24h分别进样(具体时间由一针的长度再确定)，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差。
表5溶液稳定性试验结果
RSD小于2.0％，溶液稳定性较好。
经验证该方法专属性尚可，线性、精密度、溶液稳定性也符合相关要求，并且该方法回收率符合要求，检测限可达到0.015μg/ml左右，初步认为该方法可以用于雷公藤甲素纳米粒包封率的测定。
实施例2、雷公藤甲素-壳聚糖(TP-CS)纳米粒制备
(1)称适量壳聚糖CS，投入1％乙酸溶液中，溶胀3天，得到1mg/ml的CS溶液；
(2)5毫升1mg/ml的CS溶液于西林瓶中，加入2％tween80，磁力搅拌下加入0.5毫升雷公藤甲素(TP)的二氯甲烷溶液(雷公藤甲素的浓度为2mg/ml)混合均匀，强力搅拌60分钟左右，待乳白色褪去，缓慢匀速加入1毫升三聚磷酸钠TPP溶液(TPP的浓度为2mg/ml)，混合均匀，搅拌1小时使其充分交联，制得TP-CS溶液；
4000转离心15分钟，取上清1毫升用流动相稀释10倍，超声摇匀，过0.22微米滤膜进HPLC测包封率和载药量；
(3)余下TP-CS溶液加入7％冻干保护剂(甘露醇∶乳糖＝1∶1)，涡旋溶解，测粒径电位(见图5和图6)，冻干得雷公藤甲素-壳聚糖(TP-CS)纳米粒。产物复溶，4000转离心15分钟取上清1毫升，用流动稀释10倍，超声摇匀，过0.22微米滤膜进HPLC测包封率和载药量；离心后的其余溶液用于粒径电位检测(见图7和图8)。
表6 TP-CS冻干前后包封率和载药量
项目 包封率 载药量
冻干前 109.75％ 18.29％
冻干后 89.39％ 14.90％
实施例3、雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖(TP-LACS)纳米粒制备
(1)半乳糖-壳聚糖(LA-CS)合成
取50毫升纯化水，加入1.5毫升四甲基二乙胺(TEMED)，HCl调pH至4.7，加入1.1克半乳糖LA，冰浴下加入0.6克EDC和0.14克NHS，搅拌活化1小时；加入0.5克壳聚糖CS，用HCl将pH调至1.5-2.0溶解CS，用NaOH将pH调至4-5，室温反应72小时；取反应液过滤，透析24小时，冻干得到LA-Cs；
(2)称适量LA-CS，投入1％乙酸溶液中，溶胀1天，得到1mg/ml的LA-CS溶液；
(3)5毫升1mg/ml的LA-CS溶液于西林瓶中，加入2％tween80，磁力搅拌下加入0.5毫升雷公藤甲素的二氯甲烷溶液(雷公藤甲素的浓度2mg/ml)混合均匀，强力搅拌60分钟左右，待乳白色褪去，缓慢匀速加入1毫升三聚磷酸钠(TPP)溶液(1.5mg/ml)，混合均匀，搅拌1小时使其充分交联，得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖(TP-LACS)溶液；
4000转离心15分钟，取上清1毫升用流动相稀释10倍，超声摇匀，过0.22微米滤膜进样测包封率和载药量；
(4)余下TP-CS溶液加入7％冻干保护剂(甘露醇∶乳糖＝1∶1)，涡旋溶解，测粒径电位(见图14和图15)，冻干得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒。产物复溶，4000转离心15分钟取上清1毫升，用流动稀释10倍，超声摇匀，过0.22微米滤膜进HPLC测包封率和载药量；离心后的其余溶液用于粒径电位检测(见图16和图17)。
表7 CS的1H-NMR
化学位移值ppm H归属类型 积分强度
2.13 NOCOCH 3 2.73
3.18 H2 11.36
3.38-4.16 H3-6 72.38
4.88 H1 13.52
表8 LA-CS的1H-NMR
化学位移值ppm H归属类型 积分强度
2.08 -COCH3中的H 3.23
3.01 H2 12.58
3.35-4.01 H3-6，H2’-6’，Ha-e 75.13
4.17 Hc 1.93
4.23 H1’ 1.47
4.62 H1 5.67
半乳糖化壳聚糖的取代度＝Hc积分强度/H2积分强度×100％＝1.93/12.58＝15.3％。
表9 TP-LA-CS冻干前后包封率和载药量
项目 包封率 载药量
冻干前 107.76％ 17.96％
冻干后 88.77％ 14.79％
实施例4、纳米粒体外释放及TEM
1、纳米粒体外释放
①TP饱和溶解度
10毫克TP溶于10毫升1％吐温80的PBS溶液(pH＝7.4)，摇床100r/min，37℃，振摇24h以上；
取出上清，摇匀并从中取出1毫升，过0.22μm滤膜，进HPLC；
测得浓度为201微克/毫升。
②纳米粒制备
TP-CS与TP-LACS纳米粒制备同实施例2和3。
③体外释放
TP-CS溶液取3ml于7k透析袋中，共3个样；
TP-LACS溶液取3ml于7k透析袋中，共3个样；
10mg药物加入60ml 20％乙醇中溶解，取3ml加入7k透析袋；
分别加入15ml 37℃的1％吐温80的PBS缓冲液(7.4)，置于恒温振荡摇床中(100r/min)按照时间点取液，每次取液1ml，并补等温缓冲液1ml；
时间点：0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24h；
将各样品过0.22μm滤膜，进样HPLC，计算各个时间点药物释放量。
根据结果图18可知，采用曲线相似性f2因子法评价，TP-LACS释放曲线与TP释放曲线f2＝40，不相似；TP-CS释放曲线与TP释放曲线f2＝39，不相似；因此可以确认纳米粒的释放与原料药释放是不相似的。所制备的TP-CS和TP-LACS纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度，延长药物疗效。
2、纳米粒TEM
TP-LACS制备同上述步骤；
样品处理：将纳米粒溶液滴2-3滴于铜网上，滴2滴磷钨酸染色，烘干，进行TEM拍摄；(JEM-2100型透射电子显微镜)。

Claims (6)

1.一种雷公藤甲素壳聚糖纳米粒，即雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度；所述纳米粒的平均粒径为50～500nm，所述纳米粒溶液的平均电位大于+5mV；所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的包封率大于85％；所述雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒的载药量大于10％；
所述雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的制备方法包括：
(1)称适量壳聚糖，投入乙酸中，溶胀得到1mg/ml的壳聚糖溶液；
(2)向所述壳聚糖溶液中加入tween80，搅拌下加入含雷公藤甲素的二氯甲烷溶液混合均匀，继续搅拌至乳白色褪去，匀速加入三聚磷酸钠溶液，搅拌得雷公藤甲素-壳聚糖溶液；
(3)向所述雷公藤甲素-壳聚糖溶液中加入冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒。
2.根据权利要求1所述的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括配制壳聚糖溶液、雷公藤甲素和壳聚糖的交联反应、以及冻干的步骤；
所述制备方法的具体步骤包括：
(1)称适量壳聚糖，投入乙酸中，溶胀得到1mg/ml的壳聚糖溶液；
(2)向所述壳聚糖溶液中加入tween80，搅拌下加入含雷公藤甲素的二氯甲烷溶液混合均匀，继续搅拌至乳白色褪去，匀速加入三聚磷酸钠溶液，搅拌得雷公藤甲素-壳聚糖溶液；
(3)向所述雷公藤甲素-壳聚糖溶液中加入冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-壳聚糖纳米粒。
3.一种雷公藤甲素壳聚糖纳米粒，即雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒能够减缓雷公藤甲素的释放速度；所述纳米粒的平均粒径为50～500nm，所述纳米粒溶液的平均电位大于+5mV；所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的包封率大于85％；所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒的载药量大于10％；
所述雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的制备方法包括：
(1)水中加入四甲基二乙胺，调节pH值至4-5，加入半乳糖，冰浴下加入EDC和NHS，搅拌活化；加入壳聚糖，调节pH值至1.5-2.0溶解壳聚糖；调节pH值至4-5，室温反应；取反应液过滤，透析，冻干得到半乳糖-壳聚糖；
(2)称适量半乳糖-壳聚糖，投入乙酸中，溶胀得到1mg/ml的半乳糖-壳聚糖溶液；
(3)向所述半乳糖-壳聚糖溶液中加入tween80，搅拌下加入含雷公藤甲素的二氯甲烷溶液混合均匀，继续搅拌至乳白色褪去，匀速加入三聚磷酸钠溶液，搅拌得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖溶液；
(4)向所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖溶液加入冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒。
4.根据权利要求3所述的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括半乳糖-壳聚糖的制备、配制半乳糖-壳聚糖溶液、雷公藤甲素和半乳糖-壳聚糖的交联反应、以及冻干的步骤；
所述制备方法的具体步骤包括：
(1)水中加入四甲基二乙胺，调节pH值至4-5，加入半乳糖，冰浴下加入EDC和NHS，搅拌活化；加入壳聚糖，调节pH值至1.5-2.0溶解壳聚糖；调节pH值至4-5，室温反应；取反应液过滤，透析，冻干得到半乳糖-壳聚糖；
(2)称适量半乳糖-壳聚糖，投入乙酸中，溶胀得到1mg/ml的半乳糖-壳聚糖溶液；
(3)向所述半乳糖-壳聚糖溶液中加入tween80，搅拌下加入含雷公藤甲素的二氯甲烷溶液混合均匀，继续搅拌至乳白色褪去，匀速加入三聚磷酸钠溶液，搅拌得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖溶液；
(4)向所述雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖溶液加入冻干保护剂，涡旋溶解，冻干得雷公藤甲素-半乳糖-壳聚糖纳米粒。
5.根据权利要求4所述的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法中的用HCl溶液和/或NaOH溶液调节pH值。
6.根据权利要求2或4所述的雷公藤甲素壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法中的冻干保护剂为甘露醇和乳糖。
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