CN107793380B - 2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌及其制备方法和含其的药物 - Google Patents

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Abstract

2,3‑环氧‑2‑丙砜‑5,8‑二甲氧基‑1,4‑萘醌及其制备方法和含其的药物；属于医药技术领域。其结构式为：
Figure DDA0001449173310000011
本发明方法：一、将5,8‑二甲氧基‑1,4萘醌溶解于甲醇中，加入1‑丙硫醇，室温下反应，再加入重铬酸钠和浓硫酸，继续反应，然后用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥；二、然后溶解于氯仿中，继续加入3‑氯过氧苯甲酸，室温下反应，反应完全后加入5％NaHCO3溶液中和反应中过剩的间氯过氧苯甲酸后终止反应，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥。本发明的化合物和药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

Description

2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌及其制备方法和 含其的药物
技术领域
本发明属于医药技术领域；具体涉及一种2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物。
背景技术
传统的新药开发途径是以天然产物中有效成分作为先导化合物开发并研究新药的。紫草是药用历史悠久、药理作用广泛的传统中药，其主要药效成分紫草素是非常具有发展潜力的先导化合物。紫草素为代表的萘醌类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗疟疾、抗肿瘤等多种生理活性。特别是在抗癌研究中，已报道其具有抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，抑制DNA拓扑异构酶，抑制蛋白酪氨酸激酶，抗血管生成等多种作用机制。因此，萘醌类一直是很多研究者感兴趣的一类化合物。
肝癌化疗主要分为三类：第一类为肝动脉介入治疗，常用的化疗药物包括阿霉素(ADM)或表阿霉素(EADM)、顺铂(PDD)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、羟基喜树碱(HCTP) 以及丝裂霉素(MMC)；第二类分子靶向治疗，常用化疗药物包括索拉非尼(Sorafenib)、布立尼布(Brivanib)、贝伐单抗(Bevacizumab)等；第三类系统化疗，三氧化二砷(As2O3)、 FOLFOX(亚叶酸钙、氟尿嘧啶、奥沙利铂)等。目前，临床上治疗癌症是以杀死癌细胞为目的，但化疗没有辨别能力，往往在杀死癌细胞的同时，杀死大量的正常细胞，多次化疗后患者出现肝功能损害，胃肠道反应、血象降低、腹部疼痛、发热等症状，这些均为临床上肝癌癌治疗药物普遍的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物。本发明降低了化合物本身的毒副作用，且刺激性和毒性均低。对癌细胞还具有一定的靶向性，对正常细胞的杀伤作用较低。
为解决上述技术问题，本发明的2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物的结构式为：
Figure GDA0001561308680000011
其制备方法是按下述步骤进行的：
一、将5,8-二甲氧基-1,4萘醌溶解于甲醇中，加入1-丙硫醇，室温下反应3-5小时，再加入重铬酸钠和浓硫酸，继续反应5-10分钟，然后用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌；
二、将步骤一获得的2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌溶解于氯仿中，继续加入3-氯过氧苯甲酸，室温下反应1.5-2.5小时，反应完全后加入5％NaHCO3溶液中和反应中过剩的间氯过氧苯甲酸后终止反应，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌。
进一步地限定，步骤一所述1-丙硫醇与5,8-二甲氧基-1,4萘醌的摩尔比为1.5:1。
进一步地限定，步骤一所述重铬酸钠与1,4-萘醌的摩尔比为1:5。
进一步地限定，步骤一所述浓硫酸与1,4-萘醌的摩尔比为3:4；所述浓硫酸的浓度为 98％(质量)。
进一步地限定，步骤二所述间氯过氧苯甲酸与2-丁巯基-1,4-萘醌的摩尔比为2.2:1
本发明的药物组合物含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。
本发明的化合物和药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉浆、羟丙甲纤维素、聚维酮、糖浆等，湿润剂如乙醇、水等，崩解剂如干淀粉，羟甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、泡腾崩解剂、交联聚维酮等，吸收促进剂如硫酸钙、磷酸氢钙、轻质氧化镁、碳酸钙等，吸附载体如壳聚糖等，润滑剂如硬脂酸镁、聚二乙醇、滑石粉、氢化植物油、微粉硅胶等，着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等，包衣材料如丙烯酸树脂、羟甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂和甜味剂等。
本发明的药用组合物可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、口服液、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。
本发明的药用组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使本化合物活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药用组合物优选含有摩尔比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有摩尔比为0.5％-95％的活性成分。
本发明的药用组合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01-100mg/m2体表面积，优选10-100mg/m2体表面积。可以一次或多次施用。
本发明提供一种新的化合物2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌，该化合物属于 2,3位环氧的2位取代的5,8-二甲氧基-1,4-萘醌，使得该萘醌类化合物除具有优越的抗癌活性外，还具有较低的毒副作用。本发明通过上调人肝癌Hep3B细胞内活性氧(ROS)水平，上调p-p38、p-ERK和Bad蛋白的表达，下调p-AKT和Bcl-2蛋白的表达，从而诱导肝癌细胞发生凋亡。并且本发明通过上调人肺癌A549细胞内活性氧(ROS)水平，上调p-p38、p-JNK、Bad和PARP蛋白的表达、下调p-ERK、p-AKT、p-STAT3和Bcl-2蛋白的表达，从而诱导肝癌细胞发生凋亡。同时，本发明对7种肝癌细胞具有良好的杀伤作用。
本发明的化合物活性高，使用较低浓度的化合物时就能够很好地杀伤癌细胞。
本发明的化合物对正常细胞毒性较低。
本发明的化合物药效强。
本发明的化合物几乎没有副产物，产品纯度98％。
本发明的化合物制作方法较简单，易操作。
本发明的化合物成本较廉。
附图说明
图1是EPDMNQ对人肝癌Hep3B细胞的杀伤作用；
图2是EPDMNQ对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用；
图3是EPDMNQ对人肝癌Huh7细胞的杀伤作用；
图4A是用EPDMNQ处理Hep3B细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图；
图4B是图4A的定量分析图；
图5A是用EPDMNQ处理Hep3B细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；
图5B是图5A的定量分析图；
图6A是用EPDMNQ处理Hep3B细胞后，利用蛋白免疫印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白情况图；
图6B是图6A的定量分析图；
图7A是用EPDMNQ处理Hep3B细胞后，利用流式细胞术检测细胞内活性氧水平情况图；
图7B是图7A的定量分析图；
图8是EPDMNQ对人肺癌A549细胞的杀伤作用；
图9是EPDMNQ对人肺癌NCI-H23细胞的杀伤作用；
图10是EPDMNQ对人肺癌NCI-H460细胞的杀伤作用；
图11A是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图；
图11B是图11A的定量分析图；
图12是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；
图13是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用蛋白免疫印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白情况图；
图14是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用流式细胞术检测细胞内活性氧水平情况图；
图15是EPDMNQ对人肝癌AGS细胞的杀伤作用；
图16是EPDMNQ对人肝癌MKN-28细胞的杀伤作用；
图17是EPDMNQ对人肝癌MKN-45细胞的杀伤作用；
图18是EPDMNQ对人肝癌SNU-216细胞的杀伤作用；
图19是EPDMNQ对人肝癌SNU-484细胞的杀伤作用；
图20是EPDMNQ对人肝癌YCC-1细胞的杀伤作用；
图21是EPDMNQ对人肝癌NCIN87细胞的杀伤作用。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对本发明做进一步的说明：
实施例：本实施例中2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物的制备：
一、2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的合成
在100ml反应瓶中，加入5,8二甲氧基-1,4萘醌218.21mg(1mmol)和甲醇50ml，混合均匀后加入1-丙硫醇111.02μ1(1.5mmol)，室温下反应4小时后，向混合物中加入重铬酸钠149.8mg(0.2mmol)和浓硫酸27.2μ1(0.75mmol)，反应5-10分钟后结束。经二氯甲烷和饱和食盐水萃取，适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得粗品，经柱层析制备，2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌。
二、2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的合成(EPDMNQ)
在50ml反应瓶中，加入上述产物2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌310.41mg(1mmol) 和氯仿30ml，缓缓加入间氯过氧苯甲酸(MCPBA)276.1mg(2.2mmol)，室温下反应四个小时，反应完全后加入5％NaHCO3溶液，终止反应。经二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得粗品，经经柱层析制备，2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌。
(产品的性状：橙黄色晶体)。产品的结构式:
Figure GDA0001561308680000051
产品纯度98％。
采用下述试验验证发明效果：
一、EPDMNQ对肝癌细胞的杀伤作用
实验方法：(MTT实验)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积为200μl；
②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③血清饥饿：加药2h以前换培养液(含1％FBS的培养液)；
④药物处理：将制备出的EPDMNQ分别取终浓度为1、3、10、30、及100μM处理人肝癌Hep3B、HepG2和Huh7细胞24h；
⑤呈色反应：每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH 7.4)20μl继续孵育 2-4h后，小心吸弃孔内培养上清液，小心用PBS洗涤2次，然后每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10分钟，使结晶充分溶解；
⑥比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长柱状图，结果见图1-图3及表1。
结果分析：
在图1-图3中可以看出EPDMNQ对人肝癌Hep3B、HepG2和Huh7都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
由下表1也可以看出，EPDMNQ对人肝癌Hep3B、HepG2和Huh7都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
表1 EPDMNQ对人肝癌细胞杀伤作用的IC50值
Figure GDA0001561308680000061
二、EPDMNQ对肝癌细胞的凋亡作用
实验方法：(体外实验-Annexin-V染色法)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；
②培养细胞：5％CO2，37C孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③药物处理：加入制备出的EPDMNQ，用浓度为4μM的处理人肝癌Hep3B细胞0、 3、6、12及24h；
④用PBS洗涤2次，加入195μlAnnexinV-FITC结合液，再加入5μLAnnexin V-FITC轻轻混匀；
⑤加入10μ1碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液，轻轻混匀；
⑥室温(20-25℃)避光孵育15分钟；
⑦(A)在荧光显微镜下观察细胞的形态及颜色的改变，绿色荧光为AnnexinV-FITC染色阳性细胞，红色荧光为碘化丙啶阳性细胞。仅被绿色荧光染色，且体积较小的细胞为凋亡细胞；被红色或绿色和红色双染，且体积较大的细胞为坏死细胞；未被染色的细胞为正常细胞。随机观察200个细胞，求得各种细胞所占的百分比，每个样本计数3次取平均； (B)同时，也利用流式细胞术方法检测EPDMNQ对人肝癌细胞的凋亡。
实验方法：(体外实验-蛋白免疫印迹法)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；
②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③药物处理：加入制备出的EPDMNQ，用用浓度为4μM的处理人肝癌Hep3B细胞 0、3、6、12及24h；
④分离电泳：回收细胞提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。取30μg蛋白样品，加入5×上样缓冲液，上样至12％SDS-PAGE进行电泳分离，半干转膜至NC膜上， 5％脱脂乳封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，ECL化学发光试剂显色，应用化学发光型凝胶成像系统呈像。
⑤通过Image J图像分析软件对条带进行分析。
1、用EPDMNQ处理Hep3B细胞，检测EPDMNQ对人肝癌Hep3B细胞的凋亡
采用上述实验方法，得到的实验结果见图4A、图4B、图5A及图5B，其中图4A是用EPDMNQ处理Hep3B细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图，5-FU为阳性对照组；图4B是图4A的定量分析图。图5A是用EPDMNQ处理Hep3B细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；图5B是图5A的定量分析图。图6A是用EPDMNQ处理 Hep3B细胞后，利用蛋白免疫印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白表达情况图；图6B是图6A 的定量分析图。
结果分析
用浓度为4μM的EPDMNQ处理人肝癌Hep3B细胞0、3、6、12及24h后，进行 Annexin V-FITC/PI双染实验，井在荧光显微镜观察。从图4B中可以看出，随着药物处理浓度的不断增加，AnnexinV-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当浓度为8μM时，细胞的荧光强度最高。结果说明，EPDMNQ可以有效诱导Hep3B 细胞的凋亡，并呈浓度依赖性。
用浓度为4μM的EPDMNQ处理人肝癌Hep3B细胞0、3、6、12及24h后，进行 Annexin V-FITC和PI进行标记，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。从图5B中可以看出，随着药物处理浓度的不断增加，肝癌Hep3B细胞凋亡的程度也随之增加，尤其当浓度为8μM时，细胞的凋亡强度最高。结果说明，EPDMNQ可以有效诱导Hep3B细胞的凋亡，并呈浓度依赖性。
用浓度为4μM的EPDMNQ处理人肝癌Hep3B细胞0、3、6、12及24h后，采用蛋白免疫印迹法，得到的实验结果见图6A及图6B，其中图6A是用EPDMNQ处理Hep3B 细胞后，蛋白免疫印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白表达情况。
综上所述，EPDMNQ可以通过调节细胞内凋亡蛋白表达量诱导人肝癌Hep3B、HepG2和Huh7细胞的凋亡，其癌细胞凋亡能力随着浓度的增加而逐渐升高。
三、EPDMNQ对肝癌细胞内ROS的调节作用
实验方法：(DCFH-DA染色法)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；
②培养细胞：5％CO2，37C孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③药物处理：加入制备出的EPDMNQ，用浓度为2、4、6及8μM的处理人肝癌Hep3B细胞24h；
④用PBS洗一次，加入终浓度为10μmol/L的DCFH-DA，37℃恒温水浴30min，PBS洗一次，离心收集细胞，500μL PBS重悬，转移至流式管中，通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平情况。
结果分析：
在图7A和7B中可以看出EPDMNQ可以升高人肝癌Hep3B细胞内的ROS水平，其升高强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
四、EPDMNQ对肺癌细胞的杀伤作用
实验方法：(MTT实验)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积为200μl；
②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③血清饥饿：加药2h以前换培养液(含1％FBS的培养液)；
④药物处理：将制备出的EPDMNQ分别取终浓度为1、3、10、30、及100μM处理人肺癌A549、NCI-H23和NCI-H460细胞24h；
⑤呈色反应：每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH 7.4)20μl继续孵育 2-4h后，小心吸弃孔内培养上清液，小心用PBS洗涤2次，然后每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10分钟，使结晶充分溶解；
⑥比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长柱状图，结果见图1-图3及表1。
结果分析：
在图8-图10中可以看出EPDMNQ对人肺癌A549、NCI-H23和NCI-H460细胞都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
由下表2也可以看出，EPDMNQ对人肺癌A549、NCI-H23和NCI-H460细胞都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
表2 EPDMNQ对人肺癌细胞杀伤作用的IC50值
Figure GDA0001561308680000091
五、EPDMNQ对肺癌细胞的凋亡作用
实验方法：(体外实验-Annexin-V染色法)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；
②培养细胞：5％CO2，37C孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③药物处理：加入制备出的EPDMNQ，用浓度为2、4、6及8μM的处理人肺癌 A549细胞24h；
④用PBS洗涤2次，加入195μlAnnexinV-FITC结合液，再加入5μLAnnexin V-FITC轻轻混匀；
⑤加入10μ1碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液，轻轻混匀；
⑥室温(20-25℃)避光孵育15分钟；
⑦(A)在荧光显微镜下观察细胞的形态及颜色的改变，绿色荧光为AnnexinV-FITC染色阳性细胞，红色荧光为碘化丙啶阳性细胞。仅被绿色荧光染色，且体积较小的细胞为凋亡细胞；被红色或绿色和红色双染，且体积较大的细胞为坏死细胞；未被染色的细胞为正常细胞。随机观察200个细胞，求得各种细胞所占的百分比，每个样本计数3次取平均； (B)同时，也利用流式细胞术方法检测EPDMNQ对人肺癌细胞的凋亡。
实验方法：(体外实验-蛋白免疫印迹法)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；
②培养细胞：5％CO2，37C孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③药物处理：加入制备出的EPDMNQ，用浓度为2、4、6及8μM的处理人肺癌 A549细胞24h；
④分离电泳：回收细胞提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。取30μg蛋白样品，加入5×上样缓冲液，上样至12％SDS-PAGE进行电泳分离，半干转膜至NC膜上， 5％脱脂乳封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，ECL化学发光试剂显色，应用化学发光型凝胶成像系统呈像。
⑤通过Image J图像分析软件对条带进行分析。
1、用EPDMNQ处理Hep3B细胞，检测EPDMNQ对人肺癌A549细胞的凋亡
采用上述实验方法，得到的实验结果见图11A、图11B、及图12，其中图11A是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图，5-FU为阳性对照组；图11B是图11A的定量分析图。图12是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图。图13是用EPDMNQ处理A549细胞后，利用蛋白免疫印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白表达情况图。
结果分析
用浓度为2、4、6及8μM的EPDMNQ处理人肺癌A549细胞24h后，进行Annexin V-FITC/PI双染实验，井在荧光显微镜观察。从图11B中可以看出，随着药物处理浓度的不断增加，Annexin V-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当浓度为8μM时，细胞的荧光强度最高。结果说明，EPDMNQ可以有效诱导A549细胞的凋亡，并呈浓度依赖性。
用浓度为2、4、6及8μM的EPDMNQ处理人肺癌A549细胞24h后，进行Annexin V-FITC和PI进行标记，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。从图12中可以看出，随着药物处理浓度的不断增加，人肺癌A549细胞凋亡的程度也随之增加，尤其当浓度为8μM 时，细胞的荧光强度最高。结果说明，EPDMNQ可以有效诱导人肺癌A549细胞的凋亡，并呈浓度依赖性。
用浓度为2、4、6及8μM的EPDMNQ处理人肺癌A549细胞24h后，采用蛋白免疫印迹法，得到的实验结果见图13，用EPDMNQ处理A549细胞后，蛋白免疫印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白表达情况。
综上所述，EPDMNQ可以诱导人肺癌A549细胞的凋亡，其癌细胞凋亡能力随着浓度的增加而逐渐升高。
六、EPDMNQ对肺癌细胞内ROS的调节作用
实验方法：(DCFH-DA染色法)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；
②培养细胞：5％CO2，37C孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③药物处理：加入制备出的EPDMNQ，用浓度为2、4、6及8μM的处理人肺A549 细胞24h；
④用PBS洗一次，加入终浓度为10μmol/L的DCFH-DA，37℃恒温水浴30min， PBS洗一次，离心收集细胞，500μL PBS重悬，转移至流式管中，通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平情况。
结果分析：
在图14中可以看出EPDMNQ可以升高人肺癌A549细胞内的ROS水平，其升高强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
七、EPDMNQ对肝癌细胞的杀伤作用
实验方法：(MTT实验)
①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积为200μl；
②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；
③血清饥饿：加药2h以前换培养液(含1％FBS的培养液)；
④药物处理：将制备出的EPDMNQ分别取终浓度为1、3、10、20、30及100μM 处理人肝癌AGS、MNK-28、MKN-45、SNU-216、SNU-484、NCIN87和YCC-1细胞24 h；
⑤呈色反应：每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH 7.4)20μl继续孵育 2-4h后，小心吸弃孔内培养上清液，小心用PBS洗涤2次，然后每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10分钟，使结晶充分溶解；
⑥比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长柱状图，结果见图1-图3及表1。
结果分析：
在图15-图21中可以看出EPDMNQ对人肝癌AGS、MNK-28、MKN-45、SNU-216、 SNU-484、NCIN87和YCC-1细胞都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。
表3 EPDMNQ对人肝癌细胞杀伤作用的IC50值
Figure GDA0001561308680000121
由下表3也可以看出，EPDMNQ对人肝癌AGS、MNK-28、MKN-45、SNU-216、 SNU-484、NCIN87和YCC-1细胞都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。

Claims (7)

1.2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物，其结构式为：
Figure FDA0002981806320000011
2.权利要求1化合物的制备方法，该方法是按下述步骤进行的：
一、将5,8-二甲氧基-1,4萘醌溶解于甲醇中，加入1-丙硫醇，室温下反应3-5小时，再加入重铬酸钠和浓硫酸，继续反应5-10分钟，然后用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌；
二、将步骤一获得的2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌溶解于氯仿中，继续加入3-氯过氧苯甲酸，室温下反应1.5-2.5小时，反应完全后加入5％NaHCO3溶液中和反应中过剩的间氯过氧苯甲酸后终止反应，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤一所述1-丙硫醇与5,8-二甲氧基-1,4萘醌的摩尔比为1.5:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤一所述重铬酸钠与5,8-二甲氧基-1,4萘醌的摩尔比为1:5。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤一所述浓硫酸与5,8-二甲氧基-1,4萘醌的摩尔比为3:4。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤二所述间氯过氧苯甲酸与2-丙巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的摩尔比为2.2:1。
7.用于治疗肝癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。
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