CN110559272B

CN110559272B - 一种抗乳腺癌纳米药物及其制备方法

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Publication number: CN110559272B
Application number: CN201910806494.5A
Authority: CN
Inventors: 苏鑫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110559272A

Abstract

本发明涉及一种抗乳腺癌的靶向性的T7‑细胞膜‑PLGA‑柴胡皂苷D(Ssd)仿生纳米药SCMNPs及其制备方法，所述方法主要包括以下步骤：1)提取RAW264.7原始细胞膜泡；2)合成Ssd‑PLGA载药纳米核；3)合成T7肽偶联聚乙二醇化磷脂(T7‑PEG‑DSPE)；4)融合装载细胞膜‑T7‑PEG‑DSPE囊泡与载药Ssd‑PLGA纳米粒子，即得。所述纳米药具有典型的核‑壳结构、良好的单分散性和稳定性。Ssd载药量高，从SCMNPs中释放SsD的过程呈时间依赖性，其在肿瘤环境中快速释放，有利于缓解化疗期间的副作用。SCMNPs纳米药具有靶向肿瘤的能力，可以在相对较低的药物浓度下选择性地抑制乳腺癌细胞的生长。

Description

一种抗乳腺癌纳米药物及其制备方法

发明领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗乳腺癌的装载柴胡皂苷D的聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)的纳米药物复合体及其制备方法。

技术背景

乳腺癌是世界第二大癌症，是女性癌症患者中发病率第一高的癌症。2012年，国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局公布了一组我国女性癌症数据。数据表明，我国乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率(粗率)统计如下：全国范围42.55/10万人，城市为51.91/10万人，农村为23.12/10万人。目前，在临床治疗中，乳腺癌的常规治疗方法是化疗法，但化疗会带来很多副作用，且在终止化疗后易病情复发。治疗乳腺癌常用的药物有阿霉素(adriamycin，ADM)，但由于阿霉素易产生耐药性，使其成为乳腺癌化疗中难以解决的难点问题。枸橼酸他莫昔芬是一种治疗女性复发转移乳腺癌的常用西药，缺点是对生殖系统产生不良影响，轻者月经失调，闭经，重者导致内膜息肉和内膜癌，且长时间(17个月以上)大量服用可出现视网膜病或角膜混浊。其他西药药物，包括依西美坦(对胎儿有影响、肝功能异常)、氯氧喹胶囊(扰乱血液系统、肝功能异常)、来曲唑(对胎儿有影响)、曲妥珠单抗(具有心肌毒性、肺毒性、胚胎毒性)和醋酸甲地孕酮(影响肝功能)对人体均有较大的不良反应。因此寻找毒性小、耐药性小、靶向性强、有效性高的药物成为临床上急需解决的问题。

我国中草药资源丰富，从中草药中寻找低毒、高效的抗癌药物拥有着巨大的潜力，因此从中草药中寻找有效药物治疗乳腺癌具有应用价值。柴胡是我国广谱应用的中药材，常见于临床应用，应用历史可追溯到唐代以前，最早明确记载于《神农本草经》，具有超过1400年的药用历史。柴胡皂苷D(Ssd)是柴胡药材的主要功能性成分之一，是环氧醚型五环三萜类齐果烷型衍生物。研究表明柴胡皂苷d具有抗肿瘤、退热、镇静、抗炎和止痛等功效，此外，柴胡皂苷d可以抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖，但是会诱导LO2肝细胞线粒体凋亡，激活细胞凋亡蛋白酶，进而导致肝毒性。

聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)是由乳酸和羟基乙酸的单体聚合而成的一种具有生物降解功能的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性和生物降解性且降解速度可控，目前常被用作药物缓释载体材料。

但是，目前没有将柴胡皂苷D(Ssd)作为有效成分以PLGA为载体制成靶向纳米药物的相关报道。

发明内容

为弥补现有技术中的空白，本发明的目的是提供一种抗乳腺癌的靶向性的T7-细胞膜-PLGA-Ssd仿生纳米药SCMNPs的制备方法。

为解决上述技术问题，所述SCMNPs的制备方法包括以下步骤：

1)提取RAW264.7原始细胞膜泡；

2)合成SsD-PLGA载药纳米核；

3)合成T7肽偶联聚乙二醇化磷脂(T7-PEG-DSPE)；

4)融合装载细胞膜-T7-PEG-DSPE囊泡与载药Ssd-PLGA纳米粒子，即得SCMNPs。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤1)的操作步骤包括：取细胞用PBS洗涤，将细胞悬浮在低温低渗裂解缓冲液中，并用聚碳酸酯膜微挤出机挤出，所得细胞匀浆、离心，收集上清液，再离心，留上清液，再用超速离心机离心，所得为纯化的细胞膜，保存备用。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤1)中所述低温低渗裂解缓冲液的组成为20mM Tris-HCl，pH 7.4；0.10mM MgCl₂；10mM KCl；胰蛋白酶裂解液。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤1)的优选操作步骤包括：取1×10⁶个细胞，用1×PBS洗涤3次。细胞悬浮在低温低渗裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl，pH 7.4；0.10mMMgCl₂；10mM KCl；胰蛋白酶裂解液)，并用聚碳酸酯膜微挤出机挤出20次，所得细胞匀浆在4℃条件下用3200g进行离心5min，收集上清液，再用20000g离心30min，留上清液，再用超速离心机，在80000g条件下离心1.5h。最后所得为纯化的细胞膜，保存在4℃，备用。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤2)的操作步骤包括：将PLGA和Ssd溶解于有机溶剂中，将该混合液逐滴加入到水中，在水中迅速乳化，边加边用磁力搅拌器搅拌直至有机溶剂完全挥发，离心，洗涤所合成的纳米药，最后把上清液保留在PBS中，得到纯化后的Ssd-PLGA核。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤2)中的有机溶剂优选丙酮。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤2)的具体操作步骤包括：4mg PLGA和1.56mg Ssd溶解于200微升丙酮中，将该混合液逐滴加入到1mL水中，在水中迅速乳化，边加边用磁力搅拌器搅拌直至丙酮完全挥发，磁力搅拌器转速为900rpm，以12000rpm离心3次，每次离心30min来洗涤所合成的纳米药，最后把上清液保留在PBS中，得到纯化后的Ssd-PLGA纳米核。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤3)的操作步骤包括：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并孵化，然后将T7肽(HAIYPRH)加入到混合液中摇匀，加入二硬脂酰磷脂酰乙二醇氨基(PEG-DSPE-NH₂)孵化后，离心，除去未反应的T7肽、EDC和NHS，即得T7肽偶联聚乙二醇化磷脂(T7-PEG-DSPE)。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤3)的具体操作步骤包括：将1mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并孵化30min，然后将浓度为1mM的T7肽(HAIYPRH)加入到混合液中摇匀，摇动30min，加入二硬脂酰磷脂酰乙二醇氨基(PEG-DSPE-NH₂)孵化12h后，以5000rpm离心两次，每次15min，除去未反应的T7肽、EDC和NHS，即得T7肽偶联聚乙二醇化磷脂(T7-PEG-DSPE)。

在本发明的一个优选的实施方案中，步骤4)的具体操作步骤包括：将步骤1)所得的细胞膜和T7-PEG-DSPE通过聚碳酸酯纤维膜物理挤压，最终形成含有T7的具有肿瘤细胞靶向性的囊泡，通过挤压作用囊泡，将步骤2)所得的Ssd-PLGA纳米核包裹在其中，获得SCMNPs纳米药。

本发明的另一个目的是提供一种所述方法制备得到的抗乳腺癌的靶向性的T7-细胞膜-PLGA-Ssd仿生纳米药SCMNPs，所述制备方法包括以下步骤：

1)提取RAW264.7原始细胞膜泡；

2)合成SsD-PLGA载药纳米核；

3)合成T7肽偶联聚乙二醇化磷脂(T7-PEG-DSPE)；

有益效果

本发明的T7-细胞膜-PLGA-Ssd仿生纳米药SCMNPs具有典型的核-壳结构、良好的单分散性和稳定性。Ssd载药量高，从SCMNPs中释放Ssd的过程呈时间依赖性，其在肿瘤环境中快速释放，有利于缓解化疗期间的副作用。

SCMNPs纳米药在乳腺癌细胞(包括MCF-7和4T-1细胞)中的细胞毒性显著高于正常肝细胞，具有靶向肿瘤的能力，可以在相对较低的药物浓度下选择性地抑制乳腺癌细胞的生长。

附图说明

图1.靶向肿瘤治疗的T7-细胞膜-PLGA-柴胡皂苷d仿生纳米药的制备流程图。A，柴胡皂苷D的化学结构式。B，SCMNPs的具体制备路线。

图2.SsD/PLGA纳米粒子和SCMNPs纳米药的照片(A)。SCMNPs的扫描电镜图像(B)和透射电镜图像(C)。

图3.SCMNPs纳米药的粒径(A)和zeta电位(B)。bar值为1μm。

图4.SDS-PAGE分析(A)；(i)Ssd/PLGA，(ii)原始264.7细胞裂解液，(iii)原始264.7细胞膜，(iv)SCMNPs。细胞膜标志物Western blot分析(B)。PBS或血清中孵育0～80小时SCMNPs的DLS粒径(C)。

图5SCMNPs纳米药的SsD装载能力(A)(SsD浓度分别为1、5、10、50和100μM)；不同浓度SsD对HPLC峰面积响应的标准曲线(B)；SCMNPs纳米药的SsD装载效率(C)(SsD浓度分别为1、5、10、50、100μM)；37℃、PBS条件下SCMNPs纳米药的体外Ssd释放效率(D)。

图6细胞毒性实验。

图7SCMNPs纳米药的体外治疗效果。(A-B)不同浓度的SCMNPs纳米药处理MCF-7和4T-1乳腺癌细胞的克隆实验。24孔板克隆实验的细胞照片(A)；乳腺癌细胞数量统计图(B)；细胞的细胞迁移率伤口愈合试验；SCMNPs纳米药处理36小时后的MCF-7乳腺癌细胞(C)和4T-1乳腺癌细胞(D)。

图8SCMNPs纳米药通过调节血管生成相关基因诱导细胞死亡。(A)经SCMNPs纳米药处理的MCF-7或4T-1的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测目标基因的表达水平；(B)SCMNPs纳米药处理12h的MCF-7和4T-1细胞中的phospho-Erk1/2(Thr202/Tyr204)和phospho-Akt(Ser473)的Western blot蛋白谱图；(C)SCMNPs纳米药抗肿瘤作用的分子机制示意图。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例

1.细胞培养

MCF-7，4T-1，RAW264.7细胞株购自American Type Culture Collection。LO2细胞株来源于中国医学科学院基础医学研究所。所有细胞均在含10％胎牛血清(FBS)(LifeTechnology)的DMEM中，37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

2.提取RAW264.7细胞膜

巨噬细胞膜是从RAW264.7细胞中分离出来的。取1×10⁶个细胞，用1×PBS洗涤3次。细胞悬浮在低温低渗裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl，pH 7.4；0.10mM MgCl₂；10mM KCl；胰蛋白酶裂解液)，并用聚碳酸酯膜微挤出机挤出20次。所得细胞匀浆在4℃条件下用3200g进行离心5min。收集上清液，再用20000g离心30min，留上清液，再用超速离心机(LE-80K，Beckman)在80000g条件下离心1.5h。最后所得为纯化的细胞膜，保存在4℃，以进一步制备SCMNPs纳米颗粒。

3.PLGA-柴胡皂苷D(Ssd)纳米颗粒的制备

4mg PLGA和1.56mg Ssd溶解于200微升丙酮中，将该混合液逐滴加入到1mL水中，在水中迅速乳化。边加边用磁力搅拌器搅拌直至丙酮完全挥发，磁力搅拌器转速为900rpm。以12000rpm离心3次，每次离心30min来洗涤所合成的纳米药，最后把上清液保留在PBS中，得到纯化后的Ssd-PLGA核。

4.靶向性的T7-细胞膜-PLGA-Ssd仿生纳米药(SCMNPs)的制备

1mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并孵化30min，然后将浓度为1mM的T7肽(HAIYPRH)加入到混合液中摇匀(摇动30min)。加入二硬脂酰磷脂酰乙二醇氨基(PEG-DSPE-NH₂)孵化12h后，离心两次(5000rpm，15min)，除去未反应的T7肽、EDC和NHS。为了获得仿生细胞膜囊泡，巨噬细胞膜和DSPE-PEG-T7通过一个220nm的聚碳酸酯纤维膜7次物理挤压，最终形成含有T7的具有肿瘤细胞靶向性的囊泡。通过挤压作用囊泡最后将柴胡皂苷D-PLGA纳米颗粒包裹在其中，获得SCMNPs纳米药。

试验例

1.SCMNPs纳米药的尺寸和形貌

采用动态光散射仪(DLS，ZEN 3600Zetasizer，Malvern)测定了SCMNPs纳米药物颗粒的粒径和表面电位。用扫描电镜(SEM)观察纳米粒子的形貌。如图2所示。

扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图像显示，SCMNPs呈球形，表面光滑，具有典型的核-壳结构，具有良好的单分散性，平均粒径为198±2nm(图2A～2C)。DLS结果表明，SCMNPs的平均水动力直径为222±17nm，略大于未包覆PLGA芯材或SsD/PLGA芯材(图3A)。SCMNPs的zeta电位小于核，这是由于巨噬细胞细胞膜的关系，证实了仿生表面已形成电荷(图3B)。

2.免疫印迹(Western Blotting)实验

经过不同浓度的预处理后，将对数生长细胞用PBS洗涤2次，用添加蛋白酶的RIPA裂解缓冲液裂解。使用细胞蛋白裂解物进行Western blot分析，如前所述。简单地用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，然后将其转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温(RT)条件下，用5％脱脂奶粉封膜1h。随后，对膜进行细胞信号技术购买的抗体孵育:anti-CD135(3464S)、anti-phospho-Akt(4060S)、anti-phospho-erk1/2(4370S)、anti-Akt(4691S)、anti-Erk(4695S)、anti-CD309(2478S)。Anti-β-Actin从σ和采购anti-CD44从圣克鲁斯生物技术(sc-13131)。

3.RAW 264.7细胞和SCMNPs中蛋白的检测

为了进一步证实巨噬细胞膜修饰SCMNPs的成功，系统地研究了SCMNPs表面各种蛋白的含量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对初始的264.7细胞膜进行了表征；以证实初始的264.7细胞裂解物和SCMNPs中的蛋白是否具有相同的蛋白谱。将提取的蛋白煮沸，加入缓冲液5分钟后，用小型电泳系统(Bio-Rad Laboratories)对等量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。凝胶经考马斯亮蓝染色，脱水12h后显影，在凝胶成像系统(Chemi Doc MP，Bio-Rad)上采用增强化学发光法检测蛋白信号。Western Blotting实验结果表明，SCMNPs和RAW264.7细胞膜囊泡与RAW264.7细胞裂解液的蛋白谱相似，如图4A所示。巨噬细胞膜蛋白的蛋白组成主要保留在SCMNPs中；但NPs中未检测到蛋白信号。然而，在PLGA核中没有检测到蛋白信号。Western blot分析进一步证实了巨噬细胞膜蛋白的表达，提示SCMNPs成功被巨噬细胞膜包裹(图4B)。在添加10％FBS的介质中，SCMNPs的粒度分布在80小时内保持稳定，表明SCMNPs具有良好的稳定性(图4C)。

4.包封效率和载药量

药物包封率是根据包封率(EE)相对于处方中所含总药物的比值来估算的。采用高效液相色谱法(HPLC)测定了SsD在PLGA NPs中的载药量(DL)和包封率(EE)。简而言之，取下载药纳米粒后上清液中剩余的SsD量，采用HPLC系统(Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)检测SsD含量，HPLC系统配备C18柱，30℃，203nm检测。以乙腈和0.1％甲酸-水为流动相，流速为1.0mL/min。DL和EE计算公式如下:

DL(100％)＝药物在NPs中的重量/NPs的重量×100％

EE(100％)＝药物在NPs中的重量/给药重量×100％

SsD的载药量(LC)较高，重量达48.1％，最高载药效率(LE)为83.3％(图5、图5B、图5C)。最后，用PBS、pH 7.0、37℃、24h体外释放试验。从SCMNPs中释放SsD是一个时间依赖的过程，其在肿瘤环境中快速释放，本质上有利于缓解化疗期间的副作用(图5D)。

5.细胞毒性试验

通过细胞计数Kit-8(CCK8)实验考察了SCMNPs纳米药、PLGA和SsD对细胞的毒性实验。将细胞种在96孔板里，培养24小时，随后，向细胞溶液中加入不同浓度的SCMNPs纳米药、PLGA和SsD，让药物与细胞作用，作用时间为24小时和48小时。然后，向每个载样的96孔板中加入10μL CCK8，37℃条件下孵化30分钟。使用酶标仪(Thermo Scientific，USA)在450nm下进行吸光度读数。

将MCF-7、4T-1或LO-2细胞与不同药物浓度的游离SsD和SCMNPs纳米药进行处理，并进行24小时和48小时的CCK8测定(对照组为PLGA空载体)。如图6A、6B所示，观察到游离药物SsD对癌细胞和正常细胞都有细胞毒性，说明游离药物SsD没有选择性。然而，用空的载药颗粒PLGA处理细胞对三种乳腺癌细胞系无影响。与细胞摄取研究一致，SCMNPs纳米颗粒在乳腺癌细胞(包括MCF-7和4T-1细胞)中的细胞毒性显著高于正常肝细胞LO2细胞(图6C)，证实了SCMNPs纳米药具有靶向肿瘤的能力。综上所述，这些发现表明SCMNPs纳米药可以在相对较低的药物浓度下选择性地抑制癌细胞的生长。

6.伤口愈合实验

将经SCMNPs纳米药处理的4T-1和MCF-7乳腺癌细胞接种于24孔微孔板中。培养24小时后，用无菌塑料吸管尖端(1mL)在融合细胞单层中划痕，形成线状细划痕“伤口”。用PBS轻柔地冲洗，去除划痕产生的细胞碎片。在光镜下观察细胞向创面和创面闭合的离体迁移。使用CorelDRAW X8软件(Corel Corporation)确定迁移率。

7.克隆形成试验

将MCF-7和4T-1乳腺癌细胞(5x10⁵细胞/2ml培养基)种在24孔板中。24h培养后，加入SCMNPs纳米药作用24小时。在指定时间内用甲醇固定细胞，并进行Giemsa染色。

为了进一步验证SCMNPs纳米药的体外的治疗效果，进行了克隆形成试验，4T-1和MCF-7细胞与不同浓度的SCMNPs纳米药(0、5、10、20μM)作用下48小时。如图7A、7B所示，随着药物浓度的增加，SCMNPs纳米药处理的细胞呈现出一定程度的克隆性。为了研究SCMNPs是否能抑制乳腺癌细胞的迁移，本发明对MCF-7和4T-1细胞进行了伤口愈合实验。当细胞处于亚融合状态时，本发明通过划痕在细胞单层中手工生成一个“伤口间隙”。观察伤口的“愈合”情况，并在创口形成36小时后捕捉创口的图像。如图7C和7D，当SCMNPs纳米药物浓度达到10μM时明显抑制了MCF-7和4T-1乳腺癌细胞迁移。

7.实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验

总RNA采用miRNA easy Kit(217004,Qiagen)提取，cDNA采用Super Script III第一链合成系统(18080-051,Invitrogen)合成。采用qRT-PCR检测使用SYBR-Green(4309155)ABI Prism 7000序列检测系统完成。采用SDS 7000软件对qRT-PCR结果进行分析，采用2-△△CT法对相关基因表达水平进行定量。

8.基因表达综合分析(GEO)

GSE85871基因表达数据来自国家生物技术信息地理数据中心。GSE85871收录了102种从中药中提取的小分子化合物治疗乳腺癌细胞的基因表达谱。使用GraphPad Prism6软件对被分析样品进行标准化、管理和分析。分析基因表达的折叠变化；当DEGs上调或下调至少2倍时，差异有统计学意义(P<0.05)。利用DAVID bioinformatics resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov)对GSE85871乳腺癌细胞治疗后的DEGs进行通路分析。

为了了解SCMNPs抑制乳腺癌生长的分子机制，本发明分析了包含MCF-7到102种不同中药成分基因表达谱的GEO数据集(GSE85871)。在此，本发明只关注SsD治疗中表达改变的基因。首先，为了更好地了解Ssd促进细胞死亡过程中哪些生物学通路受到影响，本发明使用DAVID bioinformatics resources 6.8进行了功能注释分析，找到了显著上调和下调的基因。发现与血管生成、信息反应、细胞迁移、药物反应和细胞生长因子相关的通路显著上调。以SsD处理后的细胞组和对照组之间的差异倍数(fold-change)表达水平对差异最大的基因进行排序。考虑到数据库中这些关键基因的改变，本发明推测SCMNPs纳米药对乳腺癌的抑制作用可能是通过血管生成途径实现的。为了研究这个问题，本发明选择了一些重要的血管生成相关基因。血管内皮生长因子(VEGF)主要通过PI3K/AKT和MAPK/ERK两种信号通路促进内皮细胞存活和血管生成。基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤的增殖、迁移和侵袭过程中起着重要作用。MMPs通过增加VEGF的生物利用度来促进血管生成。先前的报道表明PI3K/AKT和ERK通路参与了MMPs的诱导。ELTD1作为血管形成的关键参与者，也调控肿瘤血管生成。因此，通过qRT-PCR分析了SCMNPs处理MCF-7或4T1细胞中这些基因的RNA表达水平。与预期结果一致，SCMNPs处理后VEGFR、CSF1R、MMP16基因表达显著下调，而ELTD1基因表达显著上调(图8A)，与基因表达谱数据分析结果一致。最引人注目的是，western blot分析显示，SCMNPs在12小时内诱导AKT和Erk去磷酸化，且呈剂量依赖性(图8B)，证实血管生成介导的AKT和Erk信号通路是SCMNPs的纳米药的靶点(图8C)。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims

1.一种抗乳腺癌的靶向性的T7-细胞膜-PLGA-柴胡皂苷D仿生纳米药的制备方法，其特征在于，所述纳米药的制备方法包括以下步骤：

1)取1×10⁶个细胞，用1×PBS洗涤3次；细胞悬浮在低温低渗裂解缓冲液中，并用聚碳酸酯膜微挤出机挤出20次，所得细胞匀浆在4℃条件下用3200g进行离心5min，收集上清液，再用20000g离心30min，留上清液，再用超速离心机，在80000g条件下离心1.5h；最后所得为纯化的细胞膜，保存在4℃，备用；其中,所述低温低渗裂解缓冲液的组成为20mM Tris-HCl，pH7.4；0.10mM MgCl₂；10mM KCl；胰蛋白酶裂解液；

2)4mg PLGA和1.56mg柴胡皂苷D溶解于200微升丙酮中，将该混合液逐滴加入到1mL水中，在水中迅速乳化，边加边用磁力搅拌器搅拌直至丙酮完全挥发，磁力搅拌器转速为900rpm，以12000rpm离心3次，每次离心30min来洗涤所合成的纳米药，最后把上清液保留在PBS中，得到纯化后的柴胡皂苷D-PLGA纳米核；

3)将1mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合并孵化30min，然后将浓度为1mM的T7肽加入到混合液中摇匀，摇动30min，加入二硬脂酰磷脂酰乙二醇氨基孵化12h后，以5000rpm离心两次，每次15min，除去未反应的T7肽、1mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，即得T7肽偶联聚乙二醇化磷脂；

4)将步骤1)所得的细胞膜和步骤3)所得的T7肽偶联聚乙二醇化磷脂通过聚碳酸酯纤维膜物理挤压，最终形成含有T7的具有肿瘤细胞靶向性的囊泡，通过挤压囊泡，将步骤2)所得的柴胡皂苷D-PLGA纳米核包裹在其中，获得纳米药；

5)所述T7肽的序列为HAIYPRH。

2.一种根据权利要求1所述制备方法得到的抗乳腺癌的靶向性的T7-细胞膜-PLGA-柴胡皂苷D仿生纳米药。