CN103860468B - 一种t7肽修饰的zl006长循环脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,包括磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、治疗有效量的ZL006。本发明还公开了其制备方法。本发明T7肽修饰的ZL006长循环脂质体将药物ZL006包封于脂质双分子层中,大大提高药物在体内的循环时间;T7肽修饰提高其透过血脑屏障的能力,有效专一地将治疗脑卒中药物运输到大脑卒中部位,最大限度发挥药物的治疗作用,同时减少全身毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种T7肽修饰的ZL006长循环脂质体及其制备方法。
背景技术
随着人类社会的老龄化趋势和全球生态环境的恶化,脑部疾病的发病率正呈逐年上升的趋势,成为危害人类生命和健康的重大疾病。其中,脑卒中是一种高致死、高致残、高复发的神经系统疾病,被列为人类仅次于心血管疾病和恶性肿瘤的第三大杀手。临床上80%以上的脑卒中属于缺血性脑卒中,所以,对缺血性脑卒中的药物治疗研究具有重大的临床意义。研究显示:脑组织在缺血条件下,兴奋性氨基酸(如谷氨酸)过度释放,引起N-甲基-D天门冬氨酸受体(NMDAR)过度激活,导致通过NMDAR-PSD-95-nNOS途径病理性一氧化氮(NO)释放增多,提示缺血性脑卒中的产生可能与细胞浆内的nNOS和细胞膜上新PSD95结合增多有关。ZL006是一种小分子nNOS-PSD-95解偶联剂,其化学名为4-(2-羟基-3,5-二氯苄胺基)-2-羟基苯甲酸。结构如下式所示:
研究表明,ZL006能够有效抑制nNOS从细胞浆到细胞膜的转位,抑制NO的病理性释放,对谷氨酸刺激下的神经细胞损伤显示出明显的神经保护作用,改善中脑动脉闭塞(MCAO)再灌注引起的动物神经缺陷症状、缩小梗死容积。同时,ZL006避免了直接干预NMDAR、nNOS可能引起的学习记忆障碍、行为异常等副作用,具有很高的安全性。但化合物ZL006亲水性较强,透过血脑屏障能力有限,对其发挥治疗作用有一定程度的限制,使得药物疗效大大降低。
传统脂质体作为药物载体安全无毒、生物相容性好。具有合适粒径,高载药量,降低药物毒性等特点。但其容易被肝、脾网状内皮系统吸收而具有被动靶向肝脾的特性,其靶向效率低,特别是在治疗脑卒中时,脂质体包载的药物难以入脑发挥疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,解决现有技术中ZL006透过血脑屏障能力有限,药物疗效大大降低等缺陷。本发明还提供其制备方法以及T7肽修饰的ZL006长循环脂质体通过静脉给药作为脑卒中治疗药物的靶向递送物的应用。
为解决上述缺陷,本发明采用以下技术方案:
一种T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,包括磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、治疗有效量的ZL006;所述T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺是由T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺通过共价连接而成的线性嵌段共聚物,所述T7肽是在噬菌体展示技术筛选得到的序列HAIYPRH的多肽的一端增加一个半胱氨酸;其中,胆固醇与磷脂的摩尔比为1:6~2:1,甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与磷脂的摩尔比为1:800~100:800,T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与磷脂的摩尔比为0.1:800~100:800,ZL006与磷脂的质量比为1:4~1:10。
所述磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、二芥酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二癸酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、脑磷脂、神经鞘磷脂中的一种或几种。
所述甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中的磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
所述甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇重均分子量为400~5000。
上述T7肽修饰的ZL006长循环脂质体的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、将马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶液,T7肽溶于pH=6.5~7.5的磷酸盐缓冲液中得到T7肽溶液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶液和T7肽溶液分别滴加到pH=6.5~7.5的磷酸盐缓冲液中,氮气保护,搅拌10~14h,得到反应液,其中,T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1~5:1;
步骤二、将步骤一得到的反应液蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺,再透析除去未反应的T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺,之后冷冻干燥得到T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺;
步骤三、采用乙醇或乙醚注入法制备T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,按配方量将磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、ZL006溶入乙醇或乙醚中,混合均匀,得到混合溶液;在350~500rpm、45~60℃条件下将混合溶液加入到pH=5~6的磷酸盐缓冲液中,搅拌15~30min;之后蒸发除去乙醇或乙醚,超声减小粒径,再分别过0.45μm和0.22μm的微孔滤膜;最后用截留分子量3000MW的超滤离心管离心,得到所述T7肽修饰的ZL006长循环脂质体。
步骤三所述离心的条件为在20~25℃下4000~5000rpm离心2~3h。
上述T7肽修饰的ZL006长循环脂质体通过静脉给药作为脑卒中治疗药物的靶向递送物的应用。
本发明的有益效果:
1、T7肽修饰的ZL006长循环脂质体将药物ZL006包封于脂质双分子层中,大大提高药物在体内的循环时间;T7肽修饰提高其透过血脑屏障的能力,有效专一地将治疗脑卒中药物运输到大脑卒中部位,最大限度发挥药物的治疗作用,同时减少全身毒副作用。研究结果显示,本发明制备的含有HAIYPRH序列多肽修饰的主动脑靶向长循环脂质体给药系统可用于透过血脑屏障,使药物送达脑卒中部位。该系统通过静脉给药,可以作为脑卒中的治疗药物靶向递送。
2、本发明以高效的转铁蛋白受体作为脑部靶向的靶点,外源性小肽有效避免内源性转铁蛋白的干扰,靶向和治疗效率高。本发明制备出的脑靶向长循环脂质体粒径可以控制在100nm左右,具有较高的包封率与载药量以及较好的稳定性,且制备方法简单易行。
附图说明
图1为实施例1中Mal-PEG2000-DSPE(A)和HAIYPRH-PEG2000-DSPE(B)的核磁图谱。
图2为实施例2中HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006的透射电镜图。
图3为实施例3中HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006的体外释放图。
图4为实施例4中HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的粒径分布图。
图5为实施例4中HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的体内组织分布图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明,但并不用来限定本发明的实施范围。所述方法如无特别说明均为常规方法,所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
BBB主要由脑毛细血管内皮细胞构成,其阻止98%小分子和几乎全部大分子化合物入脑,是制约脑部递药的重要因素。在血脑屏障表面存在的众多受体中,转铁蛋白受体(TransferrinReceptorTfR)在血脑屏障细胞与神经元表面均有表达,因此,转铁蛋白受体被广泛应用于脑靶向递药系统的作用靶标。T7肽(HAIYPRH)是由噬菌体展示技术筛选出来的与转铁蛋白受体具有高度亲和力的多肽,其亲和作用与转铁蛋白相当。与转铁蛋白相比,T7肽具有分子量更小,稳定更好,且更易于人工合成等优点,并且T7肽与转铁蛋白受体的结合位点与转铁蛋白不同,不会与内源性转铁蛋白竞争抑制且不影响转铁蛋白本身的生理功能,相反转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合会促进T7肽的入胞效率。因此,T7肽是构建脑靶向递药系统理想的靶向功能分子。
一种T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,包括磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、治疗有效量的ZL006;所述T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺是由T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺通过共价连接而成的线性嵌段共聚物,所述T7肽是在噬菌体展示技术筛选得到的序列HAIYPRH的多肽的一端增加一个半胱氨酸;其中,胆固醇与磷脂的摩尔比为1:6~2:1,甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与磷脂的摩尔比为1:800~100:800,T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与磷脂的摩尔比为0.1:800~100:800,ZL006与磷脂的质量比为1:4~1:10。
所述磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、二芥酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二癸酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、脑磷脂、神经鞘磷脂中的一种或几种。
所述甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中的磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
所述甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇重均分子量为400~5000。
上述T7肽修饰的ZL006长循环脂质体的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、将马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶液,T7肽溶于pH=6.5~7.5的磷酸盐缓冲液中得到T7肽溶液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶液和T7肽溶液分别滴加到pH=6.5~7.5的磷酸盐缓冲液中,氮气保护,搅拌10~14h,得到反应液,其中,T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1~5:1;
步骤二、将步骤一得到的反应液蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺,再透析除去未反应的T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺,之后冷冻干燥得到T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺;
步骤三、采用乙醇或乙醚注入法制备T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,按配方量将磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、ZL006溶入乙醇或乙醚中,混合均匀,得到混合溶液;在350~500rpm、45~60℃条件下将混合溶液加入到pH=5~6的磷酸盐缓冲液中,搅拌15~30min;之后蒸发除去乙醇或乙醚,超声减小粒径,再分别过0.45μm和0.22μm的微孔滤膜;最后用截留分子量3000MW的超滤离心管在20~25℃下4000~5000rpm离心2~3h,得到所述T7肽修饰的ZL006长循环脂质体。
实施例1
T7肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(HAIYPRH-PEG2000-DSPE)的合成、纯化和表征
取马来酰亚胺-聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG2000-DSPE)8mg,溶于1mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF);另取T7肽10mg,溶于1mlpH7.0磷酸盐缓冲液。将两种溶液分别滴加到10mlpH7.0磷酸盐缓冲液中,氮气保护,磁力搅拌过夜,得初产物。初产物通过30℃旋转蒸发仪除去DMF同时浓缩体积,得产物。继而将产物通过透析(截留分子量3.5KDa)除去过量的T7肽。冷冻干燥后,得HAIYPRH-PEG2000-DSPE终产物。用NMR表征其结构,参见图1,其中A为Mal-PEG2000-DSPE的核磁图谱,B为HAIYPRH-PEG2000-DSPE的核磁图谱,由图可看出,A图显示出在6.67ppm处有马来酰亚胺特征峰,而B图中该峰消失,而其余峰基本保持不变,显示Mal-PEG2000-DSPE中的马来酰亚胺基团已经与T7肽反应,说明HAIYPRH-PEG2000-DSPE合成成功。
实施例2
T7肽修饰的ZL006长循环脂质体(HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006)的制备和表征
采用乙醇注入法制备,将大豆磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)、HAIYPRH-PEG2000-DSPE和ZL006溶于7.5ml乙醇中,充分涡旋混合,其中,大豆磷脂的质量为80mg,大豆磷脂/胆固醇/mPEG2000-DSPE/HAIYPRH-PEG2000-DSPE的摩尔比为20:5:2:1,大豆磷脂/ZL006的质量比为20:5。随后将混合均匀的溶液在50℃,转速为350rpm条件下,缓慢滴入25mlpH5.5磷酸盐缓冲液中。待滴加完,保持50℃,继续搅拌15min。随后,在60℃的水浴中,旋转蒸发仪蒸发5min(不放气)。旋蒸后,使用超声细胞粉碎机减小粒径,并将其依次挤压过0.45μm和0.22μm的微孔滤膜。最后用截留分子量3000MW的超滤离心管在20℃,4000rpm下离心2小时,得到HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006。HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006用透射电镜表征其形态,参见图2。图2中显示HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006为圆形囊泡结构,大小均匀。HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006的包封率(EE%)与载药量(DL%)以及zeta电位与粒径见表1。
表1
实施例3
HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006的体外释放
长循环脂质体-ZL006(与HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006的区别为未用T7肽修饰)以及HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006各取2ml(分别约含有药物4.1mg)于已处理好的透析袋(MWCO3.5kDa)中,两端用绳子系紧后放入装有30mL释放介质(含0.5%吐温80的pH5.5磷酸盐缓冲液以及含0.5%吐温80的pH7.4磷酸盐缓冲液)的50ml离心管中,摇床37℃条件下恒温振荡,转速为160rpm,于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、8、12、24、36、48、60、72h取介质0.5mL,同时补加相同温度(37℃)体积(0.5mL)的新鲜释放介质,平行操作2份。取出的介质过0.22μm膜,用高效液相色谱法测药物浓度,计算累计释药量(高效液相色谱法测药物浓度的条件为:流动相:甲醇v:醋酸铵缓冲液v=65:35;醋酸铵缓冲液的浓度为0.25mol/L;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;色谱柱:C18,5um,4.6mm*250mm;检测波长:284nm)。由图3可知(图中DSPE为长循环脂质体-ZL006,T7为HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006),在pH7.4与pH5.5两种条件下,HAIYPRH-长循环脂质体-ZL006在pH5.5的环境中,释放的比较缓慢,T7肽的加入没有影响长循环脂质体的释药速度。
实施例4
荧光示踪考察T7肽修饰的长循环脂质载体的脑靶向性
(1)、HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的制备和表征
采用乙醇注入法制备,将大豆磷脂、胆固醇、mPEG2000-DSPE、HAIYPRH-PEG2000-DSPE和香豆素-6溶于10ml乙醇中,充分涡旋混合,其中,大豆磷脂的质量为80mg,大豆磷脂/胆固醇/mPEG2000-DSPE/HAIYPRH-PEG2000-DSPE的摩尔比为20:5:2:1,大豆磷脂/香豆素-6的质量比为20:5。随后将混合均匀的溶液在50℃,转速为350rpm条件下,缓慢滴入25mlpH7.0磷酸盐缓冲液。待滴加完,保持50℃,继续搅拌15min。随后,在60℃的水浴中,旋转蒸发仪蒸发5分钟(不放气)。旋蒸后,使用超声细胞粉碎机减小粒径,并将其依次挤压过0.45μm和0.22μm的微孔滤膜。最后用截留分子量3000MW的超滤离心管在20℃,4000rpm下离心2小时,得到HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6。HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6用动态光散射法测定粒径与zeta电位,参见图4。图4中显示HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的粒径为65nm。
(2)、HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的小鼠的体内组织分布
取体重(20±2)g的ICR雄性小鼠15只,随机分为3组,按0.15mg/kg的剂量分别尾静脉注射脂质体-香豆素6(与HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的区别为未用T7肽修饰,并未用甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺修饰)、长循环脂质体-香豆素6(与HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6的区别为未用T7肽修饰)、HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6,给药后1h断头,取心、肝、脾、肺、肾、脑各组织,冷生理盐水冲洗后,滤纸吸干水分,称重,按照1g:10ml的比例加入裂解液(NaCl75mM,EDTA25mMand1%SDS,w/v)。组织匀浆后,取120μl匀浆加40μl甲醇和40μl内标香豆素7,用荧光液相色谱测组织内香豆素6的含量(荧光液相色谱法测药物浓度的条件为:流动相:甲醇v:水v=85:15;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;色谱柱:C18,5um,4.6mm*150mm;检测波长:EX465nm/EM502nm)。由图5(Lipsome为脂质体-香豆素6,Lipsome-DSPE为长循环脂质体-香豆素6,Lipsome-DSPE-T7为HAIYPRH-长循环脂质体-香豆素6)可知,T7肽修饰的长循环脂质体在脑组织中含量明显高于其他两组脂质体,由此可以说明T7肽修饰的长循环脂质载体是具有脑靶向的。
Claims (7)
1.一种T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,其特征在于,包括磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、治疗有效量的ZL006,ZL006是一种小分子nNOS-PSD-95解偶联剂,化学名为4-(2-羟基-3,5-二氯苄胺基)-2-羟基苯甲酸;所述T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺是由T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺通过共价连接而成的线性嵌段共聚物,所述T7肽是在噬菌体展示技术筛选得到的序列HAIYPRH的多肽的一端增加一个半胱氨酸;其中,胆固醇与磷脂的摩尔比为1:6~2:1,甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与磷脂的摩尔比为1:800~100:800,T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与磷脂的摩尔比为0.1:800~100:800,ZL006与磷脂的质量比为1:4~1:10。
2.根据权利要求1所述的T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,其特征在于,所述磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、二芥酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二癸酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、脑磷脂、神经鞘磷脂中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,其特征在于,所述甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中的磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,其特征在于,所述甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇重均分子量为400~5000。
5.权利要求1~4任一所述的T7肽修饰的ZL006长循环脂质体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、将马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶液,T7肽溶于pH=6.5~7.5的磷酸盐缓冲液中得到T7肽溶液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶液和T7肽溶液分别滴加到pH=6.5~7.5的磷酸盐缓冲液中,氮气保护,搅拌10~14h,得到反应液,其中,T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1~5:1;
步骤二、将步骤一得到的反应液蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺,再透析除去未反应的T7肽和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺,之后冷冻干燥得到T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺;
步骤三、采用乙醇或乙醚注入法制备T7肽修饰的ZL006长循环脂质体,按配方量将磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、T7肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、ZL006溶入乙醇或乙醚中,混合均匀,得到混合溶液;在350~500rpm、45~60℃条件下将混合溶液加入到pH=5~6的磷酸盐缓冲液中,搅拌15~30min;之后蒸发除去乙醇或乙醚,超声减小粒径,再分别过0.45μm和0.22μm的微孔滤膜;最后用截留分子量3000MW的超滤离心管离心,得到所述T7肽修饰的ZL006长循环脂质体。
6.根据权利要求5所述的T7肽修饰的ZL006长循环脂质体的制备方法,其特征在于,步骤三所述离心的条件为在20~25℃下4000~5000rpm离心2~3h。
7.权利要求1~4任一所述的T7肽修饰的ZL006长循环脂质体在制备静脉给药作为脑卒中治疗药物的靶向递送物的应用。
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