CN103494773B - 一种zl006脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ZL006脂质体及其制备方法，所述脂质体由脂质双分子层和ZL006组成，脂质双分子层的脂质材料和ZL006的重量比为10-4:1。所述的ZL006脂质体可以通过注入法或薄膜分散法制备得到。注入法制备步骤是：将ZL006、脂质材料溶解于有机溶剂中，混合均匀，得到有机相，把有机相加入到水相中，减小粒径后除去有机溶剂，然后经不同孔径的微孔滤膜过滤，得到所述的ZL006脂质体。本发明选择合适的材料成分，选用适当的制备工艺，获得了品质优良的ZL006脂质体，脂质体粒径较小，包封率较高，稳定性良好。

Description

一种ZL006脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种脂质体物质及其制备，尤其是新化合物ZL006的脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

脑卒中是一种高致死、高致残、高复发的神经系统疾病，临床上80%以上的脑卒中属于缺血性脑卒中。研究显示：脑组织在缺血条件下，兴奋性氨基酸（如谷氨酸）过度释放，引起N-甲基-D天门冬氨酸受体（NMDAR）过度激活，导致通过NMDAR-PSD-95-nNOS途径病理性一氧化氮（NO）释放增多，提示缺血性脑卒中的产生可能与细胞浆内的nNOS和细胞膜上新PSD95结合增多有关。ZL006是一种小分子nNOS-PSD-95解偶联剂，其化学名为4-（2-羟基-3,5-二氯苄胺基）-2-羟基苯甲酸。结构如下图所示：

研究表明，ZL006能够有效抑制nNOS从细胞浆到细胞膜的转位，抑制NO的病理性释放，对谷氨酸刺激下的神经细胞损伤显示出明显的神经保护作用，改善中脑动脉闭塞（MCAO）再灌注动物神经缺陷症状、缩小梗死容积。同时，ZL006避免了直接干预NMDAR、nNOS可能引起的学习记忆障碍、行为异常等副作用，具有很高的安全性。由于ZL006的亲水性较强，透过血脑屏障能力有限，对其发挥治疗作用有一定程度的限制。

脂质体作为类脂质双分子层结构的纳米递药系统，可将药物ZL006包封于脂质双分子层中，提高其透过血脑屏障的能力，增加其向靶组织分布的机会。目前脂质体的制备方法主要有薄膜分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法、注入法等。在选择合适的方法将ZL006制成脂质体后，后期可以对其进行靶向修饰，以实现脂质体脑内双级靶向递送。

发明内容

本发明的目的是，提出一种ZL006脂质体及其制备方法。使ZL006脂质体透过血脑屏障的能力大大增强，充分发挥其治疗作用。

本发明的技术方案是，ZL006脂质体，由脂质双分子层和ZL006组成，脂质双分子层的脂质材料和ZL006的重量比为10-4:1，优选6:1。

脂质双分子层是指脂质聚集形成的形式，疏水性的脂肪链朝向外边而亲水性的极性基团朝向中间。

所述脂质材料为磷脂、胆固醇或鞘脂，是组成生物细胞膜的基本材料；包括大豆磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、大豆磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、脑磷脂、神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱等磷脂材料和胆固醇、牛胆酸钠、胆固醇乙酰酯等材料中的一种或几种的混合物，优选大豆磷脂和胆固醇。

选用磷脂、胆固醇混合的脂质材料更好，磷脂与胆固醇的重量比例为2-10:1。

所述脂质材料中大豆磷脂和胆固醇的重量比例为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1，优选4:1。

本发明提供的ZL006脂质体可由注入法或薄膜分散法制备得到，优选注入法。

注入法包括下述步骤：（1）将ZL006、上述成分（包括重量比例）的脂质材料溶解于有机溶剂中，（涡旋）溶解并使之混合均匀，得到有机相，所述有机溶剂为无水乙醇或乙醚，优选无水乙醇；

（2）用微量注射器把有机相逐滴加入到不断搅拌的水相中，所述条件为温度50±10℃，搅拌速度150-750rpm，如150、350、550、750rpm，优选550rpm；

（3）减小粒径后减压（旋转）蒸发除去有机溶剂，然后分别经0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到ZL006脂质体。

或采用薄膜分散法，包括下述步骤：（1）将ZL006、脂质材料溶解于有机溶剂中，涡旋溶解并使之混合均匀，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正己烷和乙腈等溶剂中的一种或几种混合物，优选氯仿；

（2）减压（旋转）蒸发除去有机溶剂在瓶壁上形成薄膜；

（3）使薄膜彻底干燥，所述干燥方法为减压真空干燥，温度为40℃，真空度-0.1MPa；

（4）加入缓冲液，水浴超声使得薄膜充分水化；

（5）减小粒径，然后分别经0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到ZL006脂质体。

上述注入法或薄膜分散制备ZL006脂质体步骤中，注入法所述水相和薄膜分散法所述水化薄膜溶液的缓冲液为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、醋酸和醋酸钠中的一种或几种混合物，优选醋酸盐缓冲液。

所述缓冲液的pH为3.0-8.0，优选4.0，具体浓度是0.1mol/L。

上述注入法或薄膜分散制备ZL006脂质体步骤中，所述减压旋转蒸发的温度为60℃，真空度0.1MPa。

上述注入法或薄膜分散制备ZL006脂质体步骤中，所述减小粒径的方法为用超声细胞粉碎仪、高压均质和挤压过膜，优选用超声细胞粉碎仪；超声功率为190-950W，优选475W，超声时间为间歇超声，超声2s停3s，共超声5min。

利用上述方法制备得到的ZL006脂质体，属于本发明提供的保护范围，所述脂质体的包封率为31.43-97.99%，载药量（质量）为6.71-14.07%。

本发明提供的ZL006脂质体，其特征为：外观较澄清，有蓝色乳光；包封率为78.71-96.83%，载药量（质量）为9.88-11.38%；平均粒径121.7nm，Zeta电位-18.9mV。

本发明的有益效果是：本发明提出了一种ZL006脂质体及其制备方法。制备方法简明可靠，得到的制品外观澄清，有蓝色乳光，质量稳定。选用磷脂、胆固醇混合的脂质材料更好。

附图说明

图1是ZL006脂质体的透射电镜图。

图2是ZL006脂质体及ZL006药物溶液在两种pH介质中的释放曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，具体实施例是在本发明的优选条件下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1：ZL006脂质体的制备

采用乙醇注入法，精密称取ZL006 16.7mg、磷脂（发明内容中的磷脂均可，大豆磷脂较易得）80mg、胆固醇20mg，加入7.5mL的无水乙醇，涡旋使其溶解并混合均匀得到有机相；将有机相逐滴加入到不断搅拌的水相中，条件为温度50℃，搅拌速度550rpm，其中水相是pH为4.0、浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；滴加完毕后在相同条件下继续搅拌10min；接着用超声细胞粉碎仪减小粒径，超声条件为超声功率475W，间歇超声，超声2s停3s，共超声5min；然后减压旋蒸除去有机溶剂，条件为温度60℃，真空度0.1MPa；记录此时脂质体的体积V₁；然后分别用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，记录此时脂质体的体积V₂。得到ZL006脂质体。

或采用薄膜分散法，精密称取ZL006 25.0mg、磷脂（发明内容中的磷脂均可，大豆磷脂较易得）60mg、胆固醇40mg，加入20mL的氯仿，水浴超声使其溶解并混合均匀；减压旋蒸除去有机溶剂并在瓶壁上形成薄膜，条件为温度60℃，真空度0.1MPa；减压真空干燥使薄膜彻底干燥，温度为40℃，真空度-0.1MPa；加入缓冲液水化薄膜，水化薄膜的缓冲液是pH为4.0、浓度为0.1mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；接着用高压均质机减小粒径，均质条件为350-400bar，重复20次；记录此时脂质体的体积V₁；然后分别用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，记录此时脂质体的体积V₂。得到ZL006脂质体。

大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、大豆磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、蛋黄磷脂酰甘油等均与磷脂有相同效果。

实施例2：ZL006脂质体的质量评价

脂质体外观：较澄清，有蓝色乳光。

包封率（EE%）和载药量（DL%）测定。

（1）HPLC法建立ZL006标准曲线：

色谱条件，色谱柱：Hanbon Phecda C18（4.6mm×150mm，5μm；江苏汉邦科技有限公司）；流动相：甲醇-0.25mol/L pH6.0醋酸盐缓冲液（65:35；v/v）；流速：1.0ml/min；紫外检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量20μL。

标准曲线绘制：精密称定在105℃干燥至恒重的ZL006 0.0252g于50mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，得浓度约为504μg/mL的标准贮备液。分别精密移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL的系列贮备液于50mL容量瓶中，流动相稀释至刻度，得1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、80.0和100.0μg/mL样品液，再分别精密量取上述各液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积值A为纵坐标，进样量浓度C为横坐标作图，得到回归方程：

Y＝48016X-16679(R²＝0.9998)

式中：Y为峰面积，C为ZL006浓度（μg/mL）。

（2）包封率（EE%）和载药量（DL%）测定：

从体积为V₁的ZL006脂质体中量取1mL，用甲醇稀释10倍破乳，采用HPLC测定其浓度为C₁；体积为V₂的ZL006脂质体中量取1mL，用甲醇稀释10倍破乳，采用HPLC测定其浓度为C₂。

计算包封率：

$\mathrm{EE}\%=\frac{C_2\×V_2}{C_1\×V_1}\×100\%$

计算载药量：

测得具体实施例1中通过乙醇注入法制备获得的ZL006脂质体的包封率（EE%）：84.68%；载药量（质量）（DL%）：11.38%。

实施例3：ZL006脂质体的体外释放

精密移取制备的ZL006脂质体2mL（约含ZL006 2.5mg）于已处理好的透析袋中，两端用绳子系紧后放入装有50mL释放介质（加入0.5%吐温80醋酸盐缓冲液，pH为4.0以及pH为7.4，每个pH平行两组）的锥形瓶中，摇床37℃条件下恒温振荡，转速为160rpm，分别于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、8、12、24、36、48h取介质0.5mL，同时补加相同温度相同体积的新鲜释放介质。取出的介质经0.22μm的微孔滤膜过滤后，采用HPLC测定。

计算累积释放量（Q_n）：

$Q_n=C_n\×V_0+\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i\×V_i$

计算累积释放百分率（F%）：

F％＝Q_n/C₀×100％

式中Q_n为各时间点的累积释放量；F%为各时间点的累积释放百分率；C_n为第n个取样时间点的实测药物浓度；V₀为溶出介质总体积；V_i为每次取样体积；C_i为第i个取样时间点实测药物浓度；C₀为总药物浓度。

以时间t(h)为横坐标，释放百分率F(%)为纵坐标，作出ZL006脂质体及ZL006药物溶液在两种pH介质中的释放曲线。见图2。

由图2可知，在两种不同的pH介质中，ZL006药物溶液的释放明显要快于脂质体，24h药物已基本完全释放，累计释放百分率分别达91.63%、98.69%，脂质体的释放速度相对比较慢，24h的累计释放百分率为61.60%、60.95%，之后的释放曲线渐趋平稳，具有一定的缓释效应。

ZL006脂质体的外观澄清，有蓝色乳光，质量稳定。

应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (1)

1.一种ZL006脂质体，其特征在于：该脂质体由脂质双分子层和ZL006组成，所述ZL006是一种小分子nNOS-PSD-95解偶联剂，其化学名为4-（2-羟基-3,5-二氯苄胺基）-2-羟基苯甲酸；称取ZL006 16.7 mg、磷脂80 mg、胆固醇20 mg，加入7.5 mL的无水乙醇，涡旋使其溶解并混合均匀得到有机相；将有机相逐滴加入到不断搅拌的水相中，条件为温度50 ℃，搅拌速度550 rpm，其中水相是pH为4.0、浓度为0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；滴加完毕后在相同条件下继续搅拌10 min；接着用超声细胞粉碎仪减小粒径；然后减压旋蒸除去有机溶剂，条件为温度60 ℃，真空度0.1 MPa；得到ZL006脂质体；

用超声细胞粉碎仪减小粒径，超声条件为超声功率475 W，间歇超声，超声2 s停3 s，共超声5 min；减压旋蒸除去有机溶剂后，分别用0.45 μm和0.22 μm的微孔滤膜过滤；得到ZL006脂质体。