CN107213452A - 一种包含map30蛋白的脂质体的制备及包载方法 - Google Patents

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韩从辉
吕茜
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刘颖
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Abstract

本发明提供一种包含MAP30的脂质体的制备及包载方法，采用薄膜水化法制备，具体包括以下步骤：取10 mg二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、1 mg胆固醇、1 mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺‑甲氧基聚乙二醇2000DSPE‑mPEG2000溶于氯仿中，减压旋转蒸发成均匀的薄膜，真空过夜彻底挥发掉残留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mg ml‑1的PBS溶液，冰浴超声20min使脂质体膜脱落，在振荡器上震荡5min充分水化，形成浊液，然后将浊液转移到EP管中，用探头超声15％的功率135W超声30min，得到透明均一的蓝色脂质体悬液。本发明工艺简单，条件温和，重复性高，脂质体结构稳定，蛋白吸附容量大，脂质体粒径比较均匀，包封率高达78%。

Description

一种包含MAP30蛋白的脂质体的制备及包载方法
技术领域
本发明涉及一种包含MAP30蛋白的脂质体的制备及包载方法。
背景技术
MAP30即苦瓜Ⅰ型核糖体失活蛋白，是苦瓜中相对分子质量为30000的抗获得性免疫缺陷综合征病毒的蛋白质，它属于单链I型核糖体失活蛋白( ribosome inhibitingprotein, RIP)家族，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性，近年已成为抗癌药物研究的热点。Ⅰ型核糖体失活蛋白为单链蛋白，不能进入正常细胞，MAP30是一个毒性较大的蛋白，在其未进入细胞前就会对细胞包括正常细胞产生细胞毒性。
上述问题是在脂质体的制备及包载过程中应当予以考虑并解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种包含MAP30蛋白的脂质体的制备及包载方法解决现有技术中存在的Ⅰ型核糖体失活蛋白为单链蛋白，不能进入正常细胞，MAP30是一个毒性较大的蛋白，在其未进入细胞前就会对细胞包括正常细胞产生细胞毒性的问题。
本发明的技术解决方案是：
一种包含MAP30的脂质体的制备及包载方法，采用薄膜水化法制备，具体包括以下步骤：取10 mg二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、1 mg胆固醇、1 mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000DSPE-mPEG2000溶于氯仿中，减压旋转蒸发成均匀的薄膜，真空过夜彻底挥发掉残留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mg ml-1的PBS溶液，冰浴超声20min使脂质体膜脱落，在振荡器上震荡5min充分水化，形成浊液，然后将浊液转移到EP管中，用探头超声15％的功率135W超声30min，得到透明均一的蓝色脂质体悬液。
进一步地，用10kD的超滤管以12000 g的转速4℃超滤，每五分钟取出吹打一次并补充PBS洗去游离蛋白，收集滤液以及脂质体悬液，280紫外吸收测定滤液中的蛋白浓度以及加入的蛋白原液原始浓度，计算包封率：包封率=1-（滤液中蛋白含量-初始液蛋白含量）％。
本发明的有益效果是：该种包含MAP30蛋白的脂质体的制备及包载方法，采用薄膜水化法制备脂质体并对MAP30蛋白进行包载，工艺简单，条件温和，重复性高，脂质体的制备采用纳米技术，将MAP30蛋白载入纳米级别的脂质体内，脂质体由二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000DSPE-mPEG2000组成；可以提高MAP30蛋白的溶解度和吸收或靶向性，脂质体结构稳定，蛋白吸附容量大，脂质体粒径比较均匀，包封率高达78%。
附图说明
图1是本发明实施例中脂质体粒径扫描示意图。
图2是实施例中脂质体粒径分布示意图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。
实施例
一种包含MAP30的脂质体的制备及包载方法，采用薄膜水化法制备，具体包括以下步骤：取10 mg二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、1 mg胆固醇、1 mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000DSPE-mPEG2000溶于氯仿中，减压旋转蒸发成均匀的薄膜，真空过夜彻底挥发掉残留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mg ml-1的PBS溶液，冰浴超声20min使脂质体膜脱落，在振荡器上震荡5min充分水化，形成浊液，然后将浊液转移到EP管中，用探头超声15％的功率135W超声30min，得到透明均一的蓝色脂质体悬液。
该种包含MAP30蛋白的脂质体的制备及包载方法，采用薄膜水化法制备，工艺简单、条件温和、重复性高，蛋白质吸附容量大，脂质体结构稳定。
实施例可以提高MAP30蛋白的溶解度和吸收或靶向性。为了提高Ⅰ型核糖体失活蛋白膜的通透性；对其采用纳米级的脂质体包裹能够使得该蛋白在胞外不产生细胞毒性，顺利地导入肿瘤细胞，降低map30蛋白的胞外毒性，增加其胞内毒性，增加MAP30的肿瘤细胞靶向作用，待转运至肿瘤细胞胞内后再产生细胞毒性，从而高效地杀伤靶细胞。
用10kD的超滤管以12000 g的转速4℃超滤，每五分钟取出吹打一次并补充PBS洗去游离蛋白，收集滤液以及脂质体悬液，280紫外吸收测定滤液中的蛋白浓度以及加入的蛋白原液原始浓度，计算包封率：包封率=1-（滤液中蛋白含量-初始液蛋白含量）％。
实验结果及表征
脂质体制备结果及表征
如图1和图2中，透射电镜结果显示所制备的脂质体粒径比较均一，动态光散射结果表明脂质体的水合粒径约为132.6nm。
MAP30蛋白包封率测定
将脂质体进行MAP30蛋白的包载，通过测定超滤后滤液中的蛋白计算包封率，实验结果如表1所示，包封率约为78％。
表1 测定超滤后滤液中的蛋白计算包封率的结果
原液 滤液
A280 0.987 0.0737
体积（ml） 1 2.95
包封率=（1-0.0737×2.95/0.987）×100％=78%。
实施例的保存条件为：液态，-20℃保存。

Claims (2)

1.一种包含MAP30的脂质体的制备及包载方法，其特征在于，采用薄膜水化法制备，具体包括以下步骤：取10 mg二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、1 mg胆固醇、1 mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000DSPE-mPEG2000溶于氯仿中，减压旋转蒸发成均匀的薄膜，真空过夜彻底挥发掉残留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mg ml-1的PBS溶液，冰浴超声20min使脂质体膜脱落，在振荡器上震荡5min充分水化，形成浊液，然后将浊液转移到EP管中，用探头超声15％的功率135W超声30min，得到透明均一的蓝色脂质体悬液。
2.如权利要求1所述的一种包含MAP30的脂质体的制备及包载方法，其特征在于：用10kD的超滤管以12000 g的转速4℃超滤，每五分钟取出吹打一次并补充PBS洗去游离蛋白，收集滤液以及脂质体悬液，280紫外吸收测定滤液中的蛋白浓度以及加入的蛋白原液原始浓度，计算包封率：包封率=1-（滤液中蛋白含量-初始液蛋白含量）％。
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