CN118005772A - 一种具有骨修复活性ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其包括以下步骤，S1先将破碎的软骨在水中煮沸，煮沸完成后冷却，再加入碱性蛋白酶酶解，酶解完成后灭酶，然后经过后处理，得到II型胶原蛋白酶解液；S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，得到多肽冻干粉；S3将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，依次经过超声处理和透析处理，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。本发明通过先对软骨进行酶解，将大分子的蛋白质酶解切割成小分子的肽，再在特定的环境体系中进行自组装，最后经过冻干得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体，能得到高收率的多肽及肽组装体，多肽可用于骨损伤和骨修复，可促进骨缺损修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术的技术领域，尤其是涉及一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法。
背景技术
骨骼系统的受损一直是医学领域的重要关注点，《中国骨质疏松白皮书》数据显示，中国每年有大约300万新的骨损伤患者。骨损伤的迅速恢复对于患者康复至关重要。但传统的治疗方式存在着种种限制，如手术过程繁琐、供体来源匮乏等问题。因此，寻找创新、高效的骨修复方法成为当下医学研究的紧迫需求。近年来，生物医学领域的不断进步带来了一系列新的骨修复方法。生物活性物质的应用，例如生长因子和干细胞等，成为治疗骨损伤的新途径。此外，口服胶原蛋白肽作为一种新兴的治疗手段，因其生物相容性和生物活性而受到广泛关注。
Ⅱ型胶原蛋白肽是由Ⅱ型胶原蛋白水解得到，具有维持细胞形态、促进细胞附着和增强细胞迁移的特性。这种特殊的蛋白结构为其在骨修复中的应用提供了理论基础。Ⅱ型胶原蛋白肽组装体通过自组装形成的三维结构模拟了自然骨骼组织的微环境，为骨细胞的附着、增殖和分化提供了理想的支持。其高表面积和丰富的生物活性基团有助于骨细胞的黏附和生长，从而促进骨组织的再生和修复。这种自组装形成的结构不仅提供了物理支持，更通过生物活性的特性，直接参与骨组织的再生过程，为损伤区域的修复提供更为全面的支持。
相对于传统的骨修复方法，口服胶原蛋白肽具有明显的优势。其便捷易用，避免了复杂的手术过程，减少了患者的痛苦和手术风险。通过胃肠道吸收，口服胶原蛋白肽可以全身作用于骨骼系统，促进整体骨代谢，具有更广泛的生物活性。然而，口服胶原蛋白肽治疗效果相对较缓慢，并存在一定适应症的限制。尽管如此，在特定病例或需求下，口服胶原蛋白肽作为一种新兴的治疗手段，有望成为传统骨修复方法的有力补充，为骨损伤和疾病的治疗提供更为便捷和全面的选择。
鉴于当前骨愈合相关技术手段的发展，从传统手术到生物活性物质应用，各自存在着优缺点。传统手术治疗因其创伤大、康复周期长等缺点而受到限制，而生物活性物质应用，如生长因子和干细胞，虽然带来了新的治疗思路和效果，但其需要更多针对性的研究、制备成本高等问题也限制了其在临床上的推广。口服胶原蛋白肽作为新兴治疗手段，尽管治疗效果较慢，但其便捷性、全身性作用等特点使其在某些特定情况下成为备受瞩目的替代选择。基于Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的骨修复技术成为当前研究的热点，通过合理设计和应用，有望提供更为生物相容、有效的骨损伤修复解决方案。
发明内容
本发明要解决的问题是针对现有技术中所存在的上述不足而提供一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其通过先对软骨进行酶解，将大分子的蛋白质酶解切割成小分子的肽，再在特定的环境体系中进行自组装，最后经过冻干得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体，能得到高收率的多肽及肽组装体，多肽可用于骨损伤和骨修复，可促进骨缺损修复。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1先将破碎的软骨在水中煮沸，煮沸完成后冷却，再加入碱性蛋白酶酶解，酶解完成后灭酶，然后经过后处理，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将所述S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，得到多肽冻干粉；
S3将所述S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，依次经过超声处理和透析处理，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
进一步地，在所述S1中，软骨为猪软骨、牛软骨、鱼软骨中一种或几种的组合物。
进一步地，在所述S1中，预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨。
进一步地，在所述S1中，控制软骨和水的体积比为1：2~10，煮沸时间为8~12min。
进一步地，在所述S1中，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为30~50℃，酶解时间为2~6h。
进一步地，在所述S1中，酶解完成后沸水浴灭酶，灭酶时间为10~20min，待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液。
进一步地，在所述S2中，控制冷冻干燥的时间为45~50h、冷阱温度为-60~-40℃、样品盘温度为-30~-10℃。
进一步地，在所述S3中，金属氯化物溶液的金属氯化物为氯化钙、氯化钠、氯化锌、氯化镁中一种或几种的组合物，金属氯化物溶液的溶剂为水或磷酸钠缓冲液。
进一步地，在所述S3中，控制溶解的温度为20~50℃、pH为1~10，溶解后，多肽浓度为1~30g/L，金属氯化物的金属离子浓度为30~200mmol/L。
进一步地，在所述S3中，控制超声的功率为50~500W、时间为5~40min，超声结束后静置8~48h。
进一步地，在所述S3中，将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
综上所述，本发明的有益技术效果为：
1.采用酶法制备鲟鱼软骨胶原蛋白肽，实现对软骨的高效酶解，迅速切割大分子蛋白质为小分子肽，提高了多肽的产量，降低了生产成本。通过优化酶解制备工艺，提高了产品的质量；
2.对鲟鱼软骨胶原蛋白肽的自组装研究揭示了在特定环境体系中形成的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体，为多肽的自组装机制和结构提供了深刻理解，为其在骨修复领域的应用提供基础支持；
3.本发明的创新制备方法和自组装研究使得鲟鱼软骨胶原蛋白肽在骨修复领域具有高生产效率、低成本、复杂结构和广泛应用前景等优势，成为该领域的创新性和实用性技术。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的电镜图。
图2是本发明实施例1制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的光谱图。
图3是本发明实施例1制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的涂抹组、空白对照组、阳性对照组的X射线图。
图4是本发明实施例1制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的灌胃低、中、高浓度肽组的X射线图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与作用更加清楚及易于了解，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步阐述。
实施例
实施例1：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为30℃、pH为5，溶解后，多肽浓度为6g/L，金属氯化物的金属离子浓度为120mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例2：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：8，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为40℃，酶解时间为3.5h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为NaCl，金属氯化物溶液的溶剂为0.05M磷酸钠缓冲液，控制溶解的温度为25℃、pH为3，溶解后，多肽浓度为4g/L，金属氯化物的金属离子浓度为100mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为300W、时间为30min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例3：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：8，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为35℃，酶解时间为5h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为15min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为ZnCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为35℃、pH为7，溶解后，多肽浓度为2g/L，金属氯化物的金属离子浓度为60mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为450W、时间为25min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例4：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为40、pH为5，溶解后，多肽浓度为1g/L，金属氯化物的金属离子浓度为120mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例5：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为20、pH为6，溶解后，多肽浓度为10g/L，金属氯化物的金属离子浓度为120mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例6：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为35、pH为8，溶解后，多肽浓度为15g/L，金属氯化物的金属离子浓度为200mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例7：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为40、pH为3，溶解后，多肽浓度为6g/L，金属氯化物的金属离子浓度为30mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
实施例8：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为35、pH为3，溶解后，多肽浓度为6g/L，金属氯化物的金属离子浓度为100mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
对比例
对比例1：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：4，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为35℃，酶解时间为5h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为不添加，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为25℃、pH为8，溶解后，多肽浓度为8g/L，金属氯化物的金属离子浓度为0；再经过超声处理，控制超声的功率为300W、时间为15min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
对比例2：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：6，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为40℃，酶解时间为4h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为15min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为不添加，金属氯化物溶液的溶剂为20%乙醇溶液，控制溶解的温度为25℃、pH为4，溶解后，多肽浓度为4g/L，金属氯化物的金属离子浓度为0；再经过超声处理，控制超声的功率为150W、时间为35min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
对比例3：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：5，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为30℃，酶解时间为2.5h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为15min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为DMSO溶液，控制溶解的温度为25℃、pH为6，溶解后，多肽浓度为8g/L，金属氯化物的金属离子浓度为60mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为450W、时间为40min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
对比例4：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为30℃、pH为5，溶解后，多肽浓度为35g/L，金属氯化物的金属离子浓度为120mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
对比例5：为本发明公开的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，包括以下步骤，
S1预先将软骨切碎并用打浆机破碎，用清水进行反复冲洗至洗脱液澄清，得到破碎的软骨，软骨为鲟鱼软骨；再将破碎的软骨在水中煮沸，控制软骨和水的体积比为1：10，煮沸时间为10min，煮沸完成后冷却；然后加入碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为45℃，酶解时间为3h，酶解完成后沸水浴（≥90℃）灭酶，灭酶时间为10min；待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，控制冷冻干燥的时间为48h、冷阱温度为-50℃、样品盘温度为-20℃，得到多肽冻干粉；
S3先将S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，金属氯化物溶液的金属氯化物为CaCl2，金属氯化物溶液的溶剂为纯水，控制溶解的温度为30℃、pH为5，溶解后，多肽浓度为6g/L，金属氯化物的金属离子浓度为250mmol/L；再经过超声处理，控制超声的功率为400W、时间为20min，超声结束后静置48h；然后将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
性能检测试验
（1）Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的吸光度
选取实施例1~8、对比例1~5制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体，用紫外分光光度计在313nm处测量吸光度，每6h监测自组装动力学，以冰浴混合溶液为对照，结果如表1所示。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | |
| 6h | 0.014 | 0.008 | 0.003 | 0.006 | 0.009 | 0.004 | 0.015 | 0.001 | 0.006 | 0.007 | -0.107 | 0.004 | 0.007 |
| 12h | 0.023 | 0.02 | 0.004 | 0.016 | 0.019 | 0.02 | 0.024 | 0.018 | 0.008 | 0.007 | -0.139 | 0.043 | 0.028 |
| 18h | 0.038 | 0.02 | 0.009 | 0.031 | 0.054 | 0.035 | 0.045 | 0.04 | 0.006 | 0.006 | -0.053 | 0.055 | 0.034 |
| 24h | 0.019 | 0.002 | 0.012 | 0.012 | 0.037 | 0.015 | 0.019 | 0.021 | 0.015 | 0.014 | -0.065 | 0.058 | 0.035 |
| 30h | 0.019 | 0.009 | 0.033 | 0.045 | 0.045 | 0.078 | 0.068 | 0.042 | 0.015 | 0.015 | -0.103 | 0.116 | 0.059 |
| 36h | 0.279 | 0.004 | 0.072 | 0.128 | 0.345 | 0.374 | 0.182 | 0.203 | 0.015 | 0.015 | -0.014 | 0.544 | 0.478 |
| 42h | 0.517 | 0.279 | 0.091 | 0.432 | 0.638 | 0.715 | 0.41 | 0.485 | 0.016 | 0.018 | -0.136 | 1.243 | 0.975 |
从表1可以看出，随着时间的变化，胶原蛋白肽的吸光度随之变化。以放置的第0h为空白，随时间的增加，当吸光度随之增加，则证明在该溶液体系下胶原蛋白肽拥有自组装的能力；而其吸光度越大，证明胶原蛋白肽的自组装程度越深，也就是整个胶原蛋白肽体系中的浊度越高，自组装效果越好。而吸光度为负值，说明胶原蛋白肽在该条件下溶解度不足，大部分胶原蛋白肽未溶解，不利于进行自组装。
（2）Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的结构表征
称取1.00mg实施例1制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的固体粉末与100mg干燥的KBr粉末混合，制成透明薄片，放置于样品架上进行红外光谱测试。设置测试分辨率为4cm-1，扫描范围为4000-400cm-1所有操作均在干燥的室温环境下进行。得到的光谱图利用OMNIC8.2软件进行数据分析；使用PeakFit4.12软件计算测试样品中二级结构的百分比组成，结果如图1~2所示。
从图1~2可以看出，低倍镜下胶原蛋白肽是一个平整的表面，钙组装体形成了网状结构和管状结构，镁组装体形成了网状结构。高放大倍数下，三个样品均只能看到细小颗粒。
光谱分析显示，3415.58cm-1的波段代表N-H和O-H键。在组合中，N-H键不受Ca2+和Mg2+影响，表明无螯合作用。1640.22cm-1处的吸收带对应C=O键，而在组合中移动到1636.40cm-1和1637.14cm-1，表明-COOH与Ca2+和Mg2+形成共价键。1066.29cm-1、1246.29cm-1和1406.39cm-1处条带对应C-H、N-H和C-C键的振动。而组合后，吸收谱带分别位于1078.08cm-1、1257.92cm-1和1420.41cm-1或1076.61cm-1、1251.62cm-1和1425.83cm-1，表明SHCPs在Ca2+和Mg2+影响下聚集成更密集的二级结构。
（3）基于Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的骨修复动物实验
8周龄雄性SD大鼠75只。将所有大鼠置于温度为25±2℃，光照-黑暗循环12h。他们被喂食常规的实验室饮食，并免费获得水。一周后，将大鼠随机分为7组，大鼠由专业骨科医生进行股骨缺损手术。手术在异氟醚麻醉下进行，将实施例1制得的Ⅱ型胶原蛋白肽组装体粉末在紫外光下消毒30min后，与无菌蒸馏水混合成膏体。双腿剃须和消毒后，在双股骨外侧上髁周围进行4次暴露然后用手钻钻出圆柱形骨缺损(φ10 mm×4mm)，将胶原组装体粉末植入制备好的缺损中。最后，将伤口一层一层缝合。术后1d，空白对照组口服生理盐水；灌胃低、中、高浓度肽组口服胶原蛋白肽组装体，浓度分别为200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg，涂抹组将胶原蛋白肽组装体膏体涂抹至骨缺损处。阳性对照组服用阿仑膦酸钠片，按照换算公式：小鼠每公斤用量=6.3*小鼠体重*人体每公斤摄入量，每俩天灌胃给药一次。经过4周喂养后，颈椎脱位安乐死后，立即取出双侧股骨，用10%中性缓冲福尔马林浸泡24h，然后用磷酸盐缓冲生理盐水替代。以待后续X射线和HE染色检测。治疗结束时，在异氟烷麻醉下，通过尾动脉法在黄帽采血管中采集血液样本，并将采集的血清样本用于随后的ELISA检测，结果如表2和图3~4所示。
表2
| 组别 | 骨钙素浓度（ng/ml） | P1NP浓度（ng/ml） |
| 假手术组 | 12.83±1.50a | 33.95±0.05a |
| 空白对照组 | 13.88±1.50ab | 62.60±10.52b |
| 阳性对照组 | 16.55±1.08ab | 108.05±12.67cd |
| 涂抹组 | 15.10±1.05ab | 90.5±10.25c |
| 灌胃低浓度肽组 | 13.5±0.70a | 92.5±5.45c |
| 灌胃中浓度肽组 | 14.85±0.25ab | 107.8±6.10cd |
| 灌胃高浓度肽组 | 17.45±0.80ab | 122.75±7.00d |
从表2可以看出，钙素浓度显示出肽浓度与修复效果成正比的趋势，高浓度肽组甚至超过药物组的效果。不同浓度的肽导致不同程度的修复，高浓度肽显示更优越的骨修复效果。然而，涂抹肽的效果不佳，可能是因为固定浓度和受血液冲刷影响导致肽在骨缺损处残留较少。
Ⅱ型胶原前端肽浓度结果显示了不同组的显著差异。高浓度肽组和药物组显示了较高的肽浓度，进一步证实了高浓度肽对于骨修复的积极作用。与此不同，涂抹肽组的效果较差，可能是因为肽固定浓度及被血液冲刷导致残留在骨缺损处的肽较少。
从图3~4中可以看出，大鼠股骨的X射线图呈现了当初造模的骨缺损，其中红色圈圈标记着局部放大图。这些X射线图展示了涂抹组个体间差异较大的骨修复效果。血液冲刷可能导致肽的损失，进而减弱了其在骨修复中的作用。与空白对照组相比，涂抹组和灌胃组都展现出了良好的修复效果，显示出骨缺损显著减小的趋势。特别是在灌胃组中，不同浓度的肽呈现出明显的骨修复效果差异，高浓度肽呈现出更佳的骨修复效果。然而，阳性对照组的修复效果只能模糊地观察到，未能呈现出明显的修复痕迹。
综合上述实验结果，提示Ⅱ型胶原蛋白肽组装体具有良好骨修复效果，可以加速骨缺损修复及新生骨的形成的作用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
S1先将破碎的软骨在水中煮沸，煮沸完成后冷却，再加入碱性蛋白酶酶解，酶解完成后灭酶，然后经过后处理，得到II型胶原蛋白酶解液；
S2将所述S1得到的II型胶原蛋白酶解液经过冷冻干燥处理，得到多肽冻干粉；
S3将所述S2得到的多肽冻干粉加入到金属氯化物溶液中溶解，依次经过超声处理和透析处理，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
2.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S1中，软骨为猪软骨、牛软骨、鱼软骨中一种或几种的组合物。
3.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S1中，控制软骨和水的体积比为1：2~10，煮沸时间为8~12min。
4.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S1中，碱性蛋白酶的体积用量占软骨和水的总体积的1~10%，控制酶解温度为30~50℃，酶解时间为2~6h。
5.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S1中，酶解完成后沸水浴灭酶，灭酶时间为10~20min，待酶解液冷却，离心分离，得到II型胶原蛋白酶解液。
6.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S2中，控制冷冻干燥的时间为45~50h、冷阱温度为-60~-40℃、样品盘温度为-30~-10℃。
7.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S3中，金属氯化物溶液的金属氯化物为氯化钙、氯化钠、氯化锌、氯化镁中一种或几种的组合物，金属氯化物溶液的溶剂为水或磷酸钠缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S3中，控制溶解的温度为20~50℃、pH为1~10，溶解后，多肽浓度为1~30g/L，金属氯化物的金属离子浓度为30~200mmol/L。
9.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S3中，控制超声的功率为50~500W、时间为5~40min，超声结束后静置8~48h。
10.根据权利要求1所述的一种具有骨修复活性Ⅱ型胶原蛋白肽组装体的制备方法，其特征在于：在所述S3中，将超声后的组装体溶液用截留分子量为8000kDa的透析袋放入去离子水中，透析48h，每8h换一次去离子水并去除其中的金属离子和氯离子，透析完成后，放入培养皿冻干48h，得到Ⅱ型胶原蛋白肽组装体。
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