CN108339125A - 一种高效、靶向载药纳米胶束及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效、靶向载药纳米胶束及制备方法与应用，其制备步骤为：(1)将两亲性嵌段共聚物溶解于有机溶剂中，再加入小分子抗白血病药物盐酸盐，待充分溶解混匀后，加入三乙胺脱除盐酸形成小分子抗白血病药物，再加入PBS缓冲液中，形成内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束；经透析，干燥，得到载药纳米胶束；采用聚多巴胺修饰的方法将针对白血病细胞表面抗原的特异性抗体修饰上去，实现靶向性。本发明制备的载药纳米胶束粒径为50‑100nm，呈现出很好的单分散性，具有较高的载药量与包封率，靶向修饰步骤简单，靶向白血病细胞杀伤效果好，而对于正常细胞而言，生物安全性高，可实现缓慢释放，避免长期、多次给药的弊端。

Description

一种高效、靶向载药纳米胶束及制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米生物医学技术领域，涉及一种高效、靶向载药纳米胶束及制备方法与应用。
背景技术
迄今为止，肿瘤治疗依然是一个世界性的难题。而白血病是发生于造血器官，以血液和骨髓中白细胞及其前体细胞的增值和发育异常为特征的一种恶性肿瘤疾病。如急性淋巴细胞性白血病，它是儿童中最常见的血液系统肿瘤，其中急性B淋巴细胞性白血病约占急性淋巴细胞性白血病的70％-80％。近年来，随着联合化疗策略的逐渐完善，分子靶向治疗和免疫治疗的开发与应用，以及造血干细胞移植和支持治疗等技术的进步，儿童急性淋巴细胞性白血病的预后已得到极大的改善。然而，仍有20％左右的患者对化疗不敏感或易复发，对于这部分高危或复发的患者，其治愈率不超过50％，这无疑增加了白血病患者的死亡率。并且给患者及其家属造成很大的痛苦，因此，开发具有保持药物活性、高效靶向且对白血病具有高治愈率的治疗方法便迫在眉睫。
21世纪，得益于快速发展的纳米科学与技术，纳米材料以其独特的物理和生化特性，为具有挑战性的肿瘤治疗开辟了一条快速有效的途径。在利用纳米材料进行肿瘤精确治疗方面，国内外众多科学家已经取得了瞩目的成果。然而，大部分肿瘤治疗都是针对实体瘤而言的，而实体瘤具有高通透性和滞留效应。但是对于血液肿瘤而言，由于肿瘤细胞存在于整个外周血循环系统或骨髓中，所以高通透性和滞留效应不适用于血液肿瘤的治疗。同时，有研究(Journal of the American Chemical Society,2012,134(13):5722-5725)指出，细胞核膜具有强烈的屏蔽作用，进入细胞质的抗肿瘤药物，实际仅有不到1％可以进入细胞核并与DNA发生作用，因此导致抗肿瘤效果差。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生物安全性高、具有高效杀死白血病细胞、靶向功能好的长效缓释的高效、靶向载药纳米胶束。
本发明的第二个目的是提供一种高效、靶向载药纳米胶束的制备方法。
本发明的第三个目的是提供高效、靶向载药纳米胶束在制备白血病治疗药物中的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种高效、靶向载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将重均分子量为1.2×104-3×104的两亲性嵌段共聚物于500-800rpm条件下溶解于有机溶剂中使浓度为10-20mg/mL，加入相当于两亲性嵌段共聚物质量4％-10％的小分子抗白血病药物盐酸盐，待充分溶解混匀后，加入相当于小分子抗白血病药物盐酸盐摩尔1/3的三乙胺，搅拌1-3h，得到溶液一；以2mL/h-5mL/h的速度匀速将溶液一加入至pH＝7.2-7.6的PBS缓冲液中，形成内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束；经透析除去有机溶剂及游离小分子抗白血病药物，干燥，得到载药纳米胶束；所述溶液一与所述PBS缓冲液的体积比为1:6-1:10。
(2)使用10mM,pH＝8.5的Tris buffer作为溶剂配制0.5mg/mL的多巴胺溶液，加入载药纳米胶束，使载药纳米胶束的浓度为0.3-0.5mg/mL；于室温、500-1000rpm条件下磁力搅拌3-5h，然后在4℃、转速为8000-10000rpm条件下离心20-40min，弃上清，去离子水清洗一次，收集沉淀为聚多巴胺修饰的纳米胶束；将所述聚多巴胺修饰的纳米胶束重悬于浓度为2mg/mL的抗体溶液中，使聚多巴胺修饰的纳米胶束的浓度为1mg/mL，所述抗体为针对白血病细胞的抗体，所述抗体溶液中的溶剂为10mM,pH＝8.5的Tris buffer，在室温、500-800rpm条件下磁力搅拌30min-60min后，4℃条件下，转速为8000-10000rpm条件下离心20-40min，弃上清，去离子水清洗一次，得到高效、靶向载药纳米胶束，于4℃保存备用。
两亲性嵌段共聚物优选为mPEG-PLGA、PEG-PLA或mPEG-PCL，mPEG的重均分子量为2000-5000中，PEG的重均分子量为4000-6000。
所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮和三氯甲烷中的至少一种。
所述小分子抗白血病药物盐酸盐优选为阿霉素盐酸盐、盐酸伊达比星或盐酸米托蒽醌。
所述透析所用透析袋的截留分子量优选为3.5×103-1.2×104。
所述干燥为30-60℃真空干燥或冷冻干燥。
所述针对白血病细胞的抗体优选为anti-CD30、anti-CD33、anti-CD19或anti-CD9。
上述方法制备的一种高效、靶向载药纳米胶束。
上述一种高效、靶向载药纳米胶束在制备白血病治疗药物中的用途。
引起所述白血病的细胞为C1498、U937、HL-60或Nalm-6。
本发明的优点：
本发明采用可降解两亲性嵌段共聚物作为载体制备内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束，利用聚多巴胺修饰的方法制备靶向载药纳米胶束。本发明制备的载药纳米胶束粒径为50-100nm，呈现出很好的单分散性，具有较高的载药量与包封率，靶向修饰步骤简单，靶向白血病细胞杀伤效果好，而对于正常细胞而言，生物安全性高，可实现缓慢释放，避免长期、多次给药的弊端。
附图说明
图1为载药纳米胶束的透射电子显微镜形貌图。
图2为载药纳米胶束的电位图。
图3为高效、靶向载药纳米胶束应用于白血病细胞后的细胞存活率结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，本发明实施例是为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，但并不对本发明进行任何限制。
C1498、U937、HL-60或Nalm-6细胞购买于北纳生物科技有限公司。
实施例1
一种高效、靶向载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将重均分子量为1.2×104的mPEG-PLGA于500rpm条件下溶解于有机溶剂中使浓度为10mg/mL，加入相当于mPEG-PLGA质量4％的小分子抗白血病药物盐酸盐，待充分溶解混匀后，加入相当于小分子抗白血病药物盐酸盐摩尔1/3的三乙胺，搅拌1h，得到溶液一；以2mL/h的速度匀速将溶液一加入至pH＝7.2的PBS缓冲液中，形成内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束；经截留分子量为3.5×103的透析袋透析除去有机溶剂及游离小分子抗白血病药物，30℃真空干燥，得到载药纳米胶束,其粒径为85-105nm；所述溶液一与所述PBS缓冲液的体积比为1:6。
(2)使用10mM,pH＝8.5的Tris buffer作为溶剂配制0.5mg/mL的多巴胺溶液，加入载药纳米胶束，使载药纳米胶束的浓度为0.3mg/mL；于室温、500rpm条件下磁力搅拌3h，然后在4℃、转速为8000rpm条件下离心20min，弃上清，去离子水清洗一次，收集沉淀为聚多巴胺修饰的纳米胶束；将所述聚多巴胺修饰的纳米胶束重悬于浓度为2mg/mL的抗体溶液中，使聚多巴胺修饰的纳米胶束的浓度为1mg/mL，所述抗体为针对白血病细胞的抗体，所述抗体溶液中的溶剂为10mM,pH＝8.5的Tris buffer，在室温、500rpm条件下磁力搅拌30min后，4℃条件下，转速为8000rpm条件下离心20min，弃上清，去离子水清洗一次，得到高效、靶向载药纳米胶束，于4℃保存备用。
本实施例的mPEG的重均分子量为2000。
有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
小分子抗白血病药物盐酸盐为分子量为579.99的阿霉素盐酸盐。
针对白血病细胞的抗体为anti-CD19，引起白血病的细胞为Nalm-6细胞。
实施例2
一种高效、靶向载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将重均分子量为3×104的PEG-PLA于800rpm条件下溶解于有机溶剂中使浓度为20mg/mL，加入相当于PEG-PLA质量10％的小分子抗白血病药物盐酸盐，待充分溶解混匀后，加入相当于小分子抗白血病药物盐酸盐摩尔1/3的三乙胺，搅拌3h，得到溶液一；以5mL/h的速度匀速将溶液一加入至pH＝7.6的PBS缓冲液中，形成内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束；经截留分子量为1.2×104的透析袋透析除去有机溶剂及游离小分子抗白血病药物，60℃真空干燥，得到载药纳米胶束,其粒径为45-65nm(见图1)；所述溶液一与所述PBS缓冲液的体积比为1:10。
(2)使用10mM,pH＝8.5的Tris buffer作为溶剂配制0.5mg/mL的多巴胺溶液，加入载药纳米胶束，使载药纳米胶束的浓度为0.5mg/mL；于室温、1000rpm条件下磁力搅拌5h，然后在4℃、转速为10000rpm条件下离心40min，弃上清，去离子水清洗一次，收集沉淀为聚多巴胺修饰的纳米胶束；将所述聚多巴胺修饰的纳米胶束重悬于浓度为2mg/mL的抗体溶液中，使聚多巴胺修饰的纳米胶束的浓度为1mg/mL，所述抗体为针对白血病细胞的抗体，所述抗体溶液中的溶剂为10mM,pH＝8.5的Tris buffer，在室温、800rpm条件下磁力搅拌60min后，4℃条件下，转速为10000rpm条件下离心40min，弃上清，去离子水清洗一次，得到高效、靶向载药纳米胶束，于4℃保存备用。
本实施例的PEG的重均分子量为6000。
有机溶剂为体积比为1:3的N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃。
小分子抗白血病药物盐酸盐为分子量为533.97的盐酸伊达比星。
针对白血病细胞的抗体为anti-CD30，引起白血病的细胞为U937细胞。
还可以使用重均分子量为4000的PEG替代本实施例的重均分子量为6000的PEG，其它同本实施例，得到高效、靶向载药纳米胶束。
实施例3
一种高效、靶向载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将重均分子量为2×104的mPEG-PCL于650rpm条件下溶解于有机溶剂中使浓度为15mg/mL，加入相当于mPEG-PCL质量7％的小分子抗白血病药物盐酸盐，待充分溶解混匀后，加入相当于小分子抗白血病药物盐酸盐摩尔1/3的三乙胺，搅拌2h，得到溶液一；以3.5mL/h的速度匀速将溶液一加入至pH＝7.4的PBS缓冲液中，形成内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束；经截留分子量为8×103的透析袋透析除去有机溶剂及游离小分子抗白血病药物，冷冻干燥，得到载药纳米胶束,其粒径为60-85nm；所述溶液一与所述PBS缓冲液的体积比为1:8。
(2)使用10mM,pH＝8.5的Tris buffer作为溶剂配制0.5mg/mL的多巴胺溶液，加入载药纳米胶束，使载药纳米胶束的浓度为0.4mg/mL；于室温、800rpm条件下磁力搅拌4h，然后在4℃、转速为9000rpm条件下离心30min，弃上清，去离子水清洗一次，收集沉淀为聚多巴胺修饰的纳米胶束；将所述聚多巴胺修饰的纳米胶束重悬于浓度为2mg/mL的抗体溶液中，使聚多巴胺修饰的纳米胶束的浓度为1mg/mL，所述抗体为针对白血病细胞的抗体，所述抗体溶液中的溶剂为10mM,pH＝8.5的Tris buffer，在室温、650rpm条件下磁力搅拌45min后，4℃条件下，转速为9000rpm条件下离心30min，弃上清，去离子水清洗一次，得到高效、靶向载药纳米胶束，于4℃保存备用。
本实施例的mPEG的重均分子量为5000。
有机溶剂为体积比为1:2的丙酮和三氯甲烷。
小分子抗白血病药物盐酸盐为分子量为517.4的盐酸米托蒽醌。
针对白血病细胞的抗体为anti-CD33，引起白血病的细胞为C1498细胞。
实验例1
对实施例1-3制备的载药纳米胶束进行性能表征，具体表征方法如下：各取实施例1、2、3步骤(1)获得的载药纳米胶束，0.5mL分别放入膜分子量为3000的超滤离心管中进行离心：12000rpm×10min，然后测定游离药物的浓度，根据如下公式进行载药量与包封率的测定。
载药量＝(药物总量-游离药)/(聚合物+药物总量-游离药)×100％
包封率＝(药物总量-游离药)/药物总量×100％
经计算，制备的载药纳米胶束皆具有较高的载药量与包封率。
表1为不同载药纳米胶束的载药量与包封率计算结果：
实验组名称 载药量(％) 包封率(％)
实施例1 8.01 91.24
实施例2 8.23 91.53
实施例3 8.36 92.12
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
实验例2
对实施例1-3中制备的载药纳米胶束和高效、靶向载药纳米胶束进行粒径与电位表征，具体表征方法为：取载药纳米胶束0.1mL加入至塑料比色皿中，再加入1mL双蒸水充分混匀后进行粒径测试；将0.1mL载药纳米胶束和0.1mL高效、靶向载药纳米胶束分别与1mL双蒸水混匀，取一定量加入至电位池中，进行电位的测试。
经测试载药纳米胶束的粒径为50-100nm，单分散性好。电位皆为负值(见图2)，这与使用的两亲性嵌段共聚物有关，而高效、靶向载药纳米胶束由于表面带有氨基，故电位为正，这也证明了聚多巴胺的成功修饰。
表2为实施例1-3中的载药纳米胶束的粒径和其与高效、靶向载药纳米胶束的电位测试结果。
实验例3
对实施例2的高效、靶向载药纳米胶束进行白血病细胞应用后的细胞存活率表征，具体表征方法如下：接种密度为1×104的U937细胞于96孔板中，分别加入空白胶束(未加药物也不加三乙胺)、载药纳米胶束、高效、靶向载药纳米胶束、纯药物(盐酸伊达比星)，使浓度为0.01uM，空白对照组为单纯培养基，每组设5个复孔。4天后，测定各孔在450nm波长处的吸光度，其值越小，说明细胞死亡越多，效果越好。结果表明：与空白对照组及纯药组相比，空白胶束由于采用的生物安全性高的两亲性嵌段共聚物作为载体，所以对白血病细胞无毒性。而载药纳米胶束和高效、靶向载药纳米胶束杀死的细胞较多，其中高效、靶向载药纳米胶束的最多，说明他们对于白血病细胞具有较大的毒性，效果较好(图3)。
实验证明，实施例1、实施例3制备的高效、靶向载药纳米胶束分别对白血病细胞具有较大的毒性，效果较好。

Claims (10)

1.一种高效、靶向载药纳米胶束的制备方法，其特征包括如下步骤：
(1)将重均分子量为1.2×104-3×104的两亲性嵌段共聚物于500-800rpm条件下溶解于有机溶剂中使浓度为10-20mg/mL，加入相当于两亲性嵌段共聚物质量4％-10％的小分子抗白血病药物盐酸盐，待充分溶解混匀后，加入相当于小分子抗白血病药物盐酸盐摩尔1/3的三乙胺，搅拌1-3h，得到溶液一；以2mL/h-5mL/h的速度匀速将溶液一加入至pH＝7.2-7.6的PBS缓冲液中，形成内核包封药物、外壳亲水的纳米胶束；经透析除去有机溶剂及游离小分子抗白血病药物，干燥，得到载药纳米胶束；所述溶液一与所述PBS缓冲液的体积比为1:6-1:10。
(2)使用10mM,pH＝8.5的Tris buffer作为溶剂配制0.5mg/mL的多巴胺溶液，加入载药纳米胶束，使载药纳米胶束的浓度为0.3-0.5mg/mL；于室温、500-1000rpm条件下磁力搅拌3-5h，然后在4℃、转速为8000-10000rpm条件下离心20-40min，弃上清，去离子水清洗一次，收集沉淀为聚多巴胺修饰的纳米胶束；将所述聚多巴胺修饰的纳米胶束重悬于浓度为2mg/mL的抗体溶液中，使聚多巴胺修饰的纳米胶束的浓度为1mg/mL，所述抗体为针对白血病细胞的抗体，所述抗体溶液中的溶剂为10mM,pH＝8.5的Tris buffer，在室温、500-800rpm条件下磁力搅拌30min-60min后，4℃条件下，转速为8000-10000rpm条件下离心20-40min，弃上清，去离子水清洗一次，得到高效、靶向载药纳米胶束，于4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述两亲性嵌段共聚物为mPEG-PLGA、PEG-PLA或mPEG-PCL，mPEG的重均分子量为2000-5000中，PEG的重均分子量为4000-6000。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮和三氯甲烷中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述小分子抗白血病药物盐酸盐为阿霉素盐酸盐、盐酸伊达比星或盐酸米托蒽醌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述透析所用透析袋的截留分子量为3.5×103-1.2×104。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述干燥为30-60℃真空干燥或冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述针对白血病细胞的抗体为anti-CD30、anti-CD33、anti-CD19或anti-CD9。
8.根据权利要求1-7之一的方法制备的一种高效、靶向载药纳米胶束。
9.权利要求8的一种高效、靶向载药纳米胶束在制备白血病治疗药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征是引起所述白血病的细胞为C1498、U937、HL-60或Nalm-6。
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