CN112159527A - 一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA‑PG)及其合成方法和其在药物制剂中的应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。所述的透明质酸基团由D‑葡萄糖醛酸和N‑乙酰葡糖胺组成双糖单位并通过β‑1,4‑糖苷键连接，透明质酸分子上的羧基通过酯键与聚甘油脂肪酸酯上的羟基连接，结构式为：
Figure DDA0002748803780000011
其中HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在HA分子中PG片段的数目，Y为HA分子中唾液酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700，X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。

Description

一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方 法和其在药物制剂中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。
背景技术
癌症是危害人类健康、破坏家庭与社会和谐最严重的疾病之一。进入21世纪后，癌症已经成为除心血管疾病以外人类的头号杀手。2018年2月，国家癌症中心发布的最新一期的全国癌症统计数据显示(陈万青,孙可欣,郑荣寿,等. 中国肿瘤,2018,27(1):1-14.)：(1)全国癌症的发病率以惊人的速度增长，2014 年全国恶性肿瘤估计新发病率数380.4万例(男性211.4万例，女性169.0万例)，平均每分钟就有7人被确诊为癌症；(2)国内不同地区恶性肿瘤发病率有所不同，随恶性肿瘤发病率由高到低排列依次为东部、中部、西部，其中各地区男性发病率均高于女性；(3)全国各地区肿瘤发病情况与患者年龄息息相关，0～30岁恶性肿瘤发病率较低，30岁以上人群发病率快速增长，80岁以后达到高峰； (4)在全国范围内，肺癌位居全国肿瘤发病率首位，每年发病约78.1万，其后依次是胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病率的第1位。随着全球人口的不断增长与老龄化，加上越来越多的人群沾染上不健康的生活习惯，肿瘤的发病率与死亡率已呈逐年上升的趋势，如何有效地治疗肿瘤已成为人类必须面对的世界性难题。
化疗是利用化学药物抑制肿瘤细胞的生长、繁殖、浸润与转移等最终杀灭肿瘤细胞的一种治疗方式，是一种全身治疗的手段，无论采用何种给药途径，化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官与组织。化疗应用范围最广，是目前治疗癌症最有效的手段之一(DAI W,WANG X,GE S,et al.Advanced Drug Delivery Reviews,2017,115:23-45.)。化疗以杀死肿瘤细胞为目的，但由于化疗药物的体内选择性不强，体内分布较广泛，导致在抑制肿瘤细胞生长的同时，也不可避免地抑制了机体的正常细胞与免疫细胞，因此，常规治疗剂量的化疗药物就会对正常组织器官造成严重的毒副作用，对肿瘤患者造成极大的痛苦，使得其治疗的顺应性较差。因此，科研人员试图赋予药物靶向性，降低药物对非靶部位的毒副作用，同时提高药物的治疗指数。
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。D-葡萄糖醛酸及N- 乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸(Hyaluronan)，又称糖醛酸、透明质酸，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。透明质酸分子能携带500倍以上的水分，为当今所公认的最佳保湿成分，广泛的应用在保养品跟化妆品中。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合，保水作用等。透明质酸作为一种天然多聚糖，具有较高稳定性、安全、低毒性、亲水性、易于化学修饰和可生物降解等特性， HA受体CD44和HA介导能动性的受体(Receptor for hyaluronic acid-mediated motility,RHAMM)在多种正常组织细胞(骨髓充间质干细胞，软骨细胞，破骨细胞等)和肿瘤细胞中表面均有不同程度的表达，可以与HA发生特异性结合，利用这一特性，以透明质酸为基础的给药系统可以实现治疗药物在细胞水平上的特异型靶向作用。因此，基于透明质酸共聚物和其作为药物传递系统的研究是。 Jae Hyung Park等制备了一种新型基于透明质酸衍生物胶束给药系统，通过将胆酸通过化学反应连接到透明质酸骨架上，从而形成一种两亲性的透明质酸衍生物，其在水溶液中可以自聚集形成胶束，文章中使用这一载体包裹药物，实现了结肠癌的治疗(Choi KY,Chung H,Min KH,et al.Biomaterials,2010,31(1):106-114.)。此外，还有Dae-Duk Kim等人使用其构建的透明质酸衍生物给药系统实现肿瘤靶向治疗的报道(ChoHJ,Yoon HY,Koo H,et al.Biomaterials,2011, 32(29):7181-7190.)。然而，由于HA的亲水性较强，并且游离的HA在血浆中极易被降解清除。因此，我们需要对HA进行衍生化，制备两亲性具有长循环能力的HA衍生物。
聚甘油脂肪酸酯(PG)是一种多元醇酯类的非离子表面活性剂，它属于单甘酯的衍生物，但又不同于有机酸单甘酯。(蔡云升,卜永士.食品工业科技,2003(07):54-56.)聚甘油脂肪酸酯是由甘油在一定条件下聚合生成一系列不同聚合度的聚甘油，再进一步同脂肪酸酯化而得的产品。正是由于其聚合度、脂肪酸种类以及酯化度的不同，使得聚甘油脂肪酸酯具有较宽范围的HLB值，亲水亲油性差异跨度大，因而可广泛应用到多个不同领域。聚甘油脂肪酸酯应用最广泛的领域是食品工业，其不仅具有较强的乳化、粘度调节、结晶调整、品质改良、抗菌、分散、渗透及溶化力，且具有比其他多羟基类脂肪酸酯更强的耐酸和耐热能力，早已被联合国粮农组织、世界卫生组织和欧共体确认为无毒无害的高安全性食品添加剂。Amr等人研究证明(BASALA,AKN,ATS,et al.Int J Pharm,2013, 456(1):235-242.)，聚甘油或聚乙二醇(PEG)修饰的纳米脂质体均具有体内长循环特性，但是重复注射PEG修饰的脂质体会诱导机体产生抗PEG-IgM，并诱发强烈的免疫反应——加速血液清除现象(Accelerated blood clearance,ABC phenomenon)，而重复注射PG修饰的脂质体，不会诱导ABC现象，也不会产生抗PG-IgM。因此，聚甘油衍生物具有较低的免疫原性和较高的生物安全性，并且具备替代PEG的潜力。
综上所述，我们期望通过将HA与PG进行共价偶联，并将其稳定修饰于胶束、脂质体、囊泡、乳剂和纳米粒等微粒给药制剂表面，制备成一系列具有低免疫原性，肿瘤特异性靶向能力，长循环能力的靶向化疗药物递送系统。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提出一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用。基于HA能够高效靶向肿瘤细胞表面高表达的CD44受体，通过PG对HA进行衍生化，将 HA-PG稳定修饰于微粒制剂表面，制备一种HA修饰的具有低免疫原性，肿瘤特异性靶向能力，长循环能力的靶向化疗药物递送系统。该药物递送系统通过长循环作用，有效利用高渗透长滞留效应(Enhancedpermeability and retention，EPR effect)蓄积于肿瘤部位，进一步通过HA主动靶向高表达CD44受体的肿瘤细胞，对肿瘤进行靶向化疗。
本发明是通过如下技术方案实现的：
提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA-PG)，所述透明质酸基团由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成双糖单位通过β-1,4-糖苷键连接，所述透明质酸上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：
Figure BDA0002748803760000041
其中，HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在 HA分子中PG片段的数目，Y为HA片段中透明质酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700， X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。
优选的，1≤X≤500，10≤Y≤1000，X/Y为1％～50％，1≤n≤12，8≤m≤20。
在一些实施例中，所述HA聚合度是1-3700，平均分子量为396-1400000道尔顿；优选HA聚合度为10-1000；平均分子量为3800-380000道尔顿。
在一些实施例中，所述PG的聚甘油部分具有1-100甘油重复单元，平均分子量为92-7400道尔顿；优选PG的聚甘油部分具有1-40甘油重复单元，平均分子量为92-3000道尔顿；更优选PG的聚甘油部分具有1-12甘油重复单元，平均分子量为92-1500道尔顿。
在一些实施例中，所述PG的非极性碳氢链数量为1～3，分别为1条碳氢链 (聚甘油单脂肪酸酯)，2条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)，3条碳氢链(聚甘油三脂肪酸酯)，优选一条碳氢链(聚甘油单脂肪酸酯)和两条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)。
在一些实施例中，所述PG的碳氢链长度包含4～32个碳原子的烷基和烯基；优选地，所述PG的碳氢链选自辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生四烯酸，油酸中一种或多种；更优选是，所述PG的碳氢链选自是棕榈酸和硬脂酸中的至少其中之一。
本发明还提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物的合成方法，所述合成方法包括：反应投料比例为，HA/PG/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；首先，将HA溶在5mL的FA中，加入EDC/NHS，活化1.5h，此时体系澄清，HA浓度为1～500mg/mL，EDC浓度为1～400mg/mL，NHS浓度为1～200 mg/mL；再将溶解在2mL的甲酰胺(FA)中的PG加入反应体系中，PG浓度为 1～500mg/mL；然后，加入TEA，TEA浓度为0.1～200mg/mL。氮气保护下，室温搅拌反应48h后，将反应液转移至透析袋中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100) 体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h；采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质HA-PG。
将反应液转移至透析袋(MWCO 8～14kDa，美国光谱)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100)体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h；随后，采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质HA-PG。
本发明还提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物在药物制剂中的应用，尤其是所述的HA-PG在微粒给药制剂的制备和修饰中的应用，所述的微粒给药制剂可以为胶束、脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。HA-PG与药物可以直接组装制备成纳米胶束，也可以选择磷脂、泊洛沙姆、吐温、司盘等表面活性剂混合组装制备成脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。药物与HA-PG的质量比为 1:1～1:100；优选地，药物与HA-PG的质量比为1:3～1:20。
综上所述，本发明提供了一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，该衍生物制备的微粒制剂能够主动靶向肿瘤细胞表面高表达的CD44受体，进行靶向化疗；同时，HA-PG具有极好的保湿和防腐功能，可应用于皮肤保护功能的化妆品等。本发明的HA-PG采用低免疫原性的HA和PG通过共价偶联获得，其生物相容性和生物可降解性较好，并且HA-PG具有两亲性，能够稳定修饰在纳米制剂表面，具备良好的临床转化和产业化开发前景。
附图说明
图1为透明质酸-十聚甘油二硬脂酸酯的1H-NMR；
图2为透明质酸-十二聚甘油二棕榈酸酯的1H-NMR；
图3为透明质酸-六聚甘油月桂酸酯的1H-NMR；
图4为透明质酸-三聚甘油辛酸酯的1H-NMR；
图5为重复注射大鼠体内药动学行为(A)和组织分布(B)；
图6为DOX-HL荷瘤小鼠体内药动学行为；
图7为S180荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；
图8为S180荷瘤小鼠肿瘤生存曲线；
图9为CD44阳性S180细胞对HA97-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的摄取。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA-PG)，所述透明质酸基团由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成双糖单位通过β-1,4-糖苷键连接，所述透明质酸上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：
Figure BDA0002748803760000061
其中，HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在 HA分子中PG片段的数目，Y为HA片段中透明质酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700， X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。
材料来源：
本发明中，所用HA的聚合度分别为2～10、14、27、53、97、350～400、800～1000、2400～2600、3500～3700，对应分子量分别为774，1152，1530，1908，2286，2664， 3042，3420，3798及平均分子量为5000，1万，2万，3.9万，13～15万，90～100 万及130～140万道尔顿。聚合度2～10、14、97、2400～2600、3500～3700的HA 购买自山东华熙生物科技股份有限公司；其余分子量的HA通过水解聚合度为 3500～3700的HA制得。
实施例1十聚甘油二硬脂酸酯与HA97的合成
本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA97)/十聚甘油二硬脂酸酯(PG10-2C18)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量 HA97溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG10-2C18加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10 kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质透明质酸-十聚甘油二硬脂酸酯(HA97-PG10-2C18)。
在IR光谱中，HA97-PG10-2C18在1741.5cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于HA97，其在2922.3，2845.4cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在721cm-1处有直链碳数大于7的峰。
请参考图1，HA97的特征峰(–COCH3)在δ1.99ppm可以检测到。δ1.23ppm和δ0.89ppm处的两个峰分别对应于PG10-2C18中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与HA97相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％
DS可通过1H-NMR谱图中PG10-2C18上的1.23ppm的特征-CH2-质子峰(60H，不包括酯键相邻的-CH2-)与HA97单元上的1.99ppm的特征–COCH3质子峰(3H) 的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：δ1.23ppm＝6.37δ1.99ppm＝1.00
DS＝6.37×3/(1.00×60)×100％＝31.4％(此公式中，X为30，Y为97)
实施例2十二聚甘油二棕榈酸酯与HA13的合成
本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA13)/十二聚甘油二棕榈酸酯(PG12-2C16)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量HA13溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG12-2C16加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10 kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质透明质酸-十二聚甘油二棕榈酸酯(HA13-PG12-2C16)。
在IR光谱中，HA13-PG12-2C16在1737.2cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于HA，其在2922.3，2846.7cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在720cm-1处有直链碳数大于7的峰。
如图2所示，HA的特征峰(–COCH3)在δ2.03ppm可以检测到。δ1.25ppm和δ0.88ppm处的两个峰分别对应于PG12-2C16中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与HA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％
DS可通过1H-NMR谱图中PG12-2C16上的1.25ppm的特征-CH2-质子峰(52H，不包括酯键相邻的-CH2-)与HA单元上的2.03ppm的特征–COCH3质子峰(3H) 的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.31ppm＝5.27δ2.03ppm＝1.00
DS＝5.27×3/(1.00×52)×100％＝30.4％(此公式中，X为4，Y为13。)
实施例3六聚甘油月桂酸酯与HA97的合成
本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA97)/六聚甘油月桂酸酯(PG6-C12)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量 HA溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG6-C12加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质透明质酸-六聚甘油月桂酸酯 (HA97-PG6-C12)。
在IR光谱中，HA97-PG6-C12在1728.5cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于HA，其在2918.4，2849.3cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在718cm-1处有直链碳数大于7的峰。
如图3所示，HA的特征峰(–COCH3)在δ2.05ppm可以检测到。δ1.22ppm和δ0.85ppm处的两个峰分别对应于PG6-C12中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与 HA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％
DS可通过1H-NMR谱图中PG6-C12上的1.22ppm的特征-CH2-质子峰(18H，不包括酯键相邻的-CH2-)与HA单元上的2.05ppm的特征–COCH3质子峰(3H) 的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.22ppm＝1.04δ2.05ppm＝1.00
DS＝1.04×3/(1.00×18)×100％＝17.3％(此公式中，X为16.8，Y为97。)
实施例4三聚甘油辛酸酯与HA13的合成
本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA13)/三聚甘油辛酸酯(PG3-C8)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量HA13溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG3-C8加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10kDa) 中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4 小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质透明质酸-三聚甘油辛酸酯 (HA13-PG3-C8)。
在IR光谱中，HA13-PG3-C8在1740.2cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于HA，其在2919.8，2845.4cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在722cm-1处有直链碳数大于7的峰。
如图4所示，HA的特征峰(–COCH3)在δ1.99ppm可以检测到。δ1.26ppm和δ0.90ppm处的两个峰分别对应于PG3-C8中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与 HA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％
DS可通过1H-NMR谱图中PG3-C8上的1.26ppm的特征-CH2-质子峰(10H，不包括酯键相邻的-CH2-)与HA单元上的1.99ppm的特征–COCH3质子峰(3H) 的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.26ppm＝1.07δ1.99ppm＝1.00
DS＝1.07×3/(1.00×10)×100％＝32.1％(此公式中，X为4.2，Y为13)
实施例5 HA衍生物临界胶束浓度(CMC)的测定
根据实施例1～4中合成的HA97-PG10-2C18、HA13-PG12-2C16、HA97-PG6-C12、 HA13-PG3-C8分子结构分析，其中均存在亲水端(HA基团)和亲脂端(PG中的碳氢链)，作为高分子嵌段物能够在水中自发形成胶束，可以利用荧光探针法测定其临界胶束浓度。
精密移取0.1mL浓度为1×10-5M芘工作液若干份于西林瓶中，氮气吹干，精密称取每种HA-PG衍生物若干份，置于上述西林瓶中，分别加10mL纯水，得到芘工作液的浓度为10- 7M(芘在水中的饱和溶解度为7×10-7M)，水浴超声 30min，放置过夜，即得到浓度分别为5×10-4，1×10-3，3×10-3，5×10-3，1×10-2， 3×10-2，5×10-2，1×10-1，5×10-1，1，5g/L的HA-PG衍生物溶液。将上述芘的水溶液以393nm作为发射波长在300nm-350nm波长范围内扫描，叠加各激发波长图谱并记录数据。以340nm和335nm的荧光强度(I340/I335)之比为纵坐标，对数浓度值为横坐标作图，曲线的拐点即为HA-PG衍生物的CMC值。如表1所示，HA97-PG10-2C18、HA13-PG12-2C16、HA97-PG6-C12、HA13-PG3-C8的CMC值分别为1.3±0.2、3.5±1.1、25.6±2.5、47.3±4.1μg/mL。由于HA97-PG10-2C18衍生物具有较低的CMC，更容易自组装形成胶束等微粒制剂，因此，后面实施例中未注明处均采用HA97-PG10-2C18。
表1 HA-PG衍生物的临界胶束浓度
Figure BDA0002748803760000111
实施例6紫杉醇HA-PG10-2C18胶束制备
称取一定量的紫杉醇(PTX)、HA97-PG10-2C18共同溶解在乙醇中，药物与载体的质量比为1:8、1:10及1:15，在磁力搅拌下缓慢滴入去离子水，继续搅拌 30min。将所得的溶液装入透析袋中，室温下，用去离子水透析48h，除去乙醇，过0.45和0.22μm的微孔滤膜除去未包封的多西他赛。采用ZS90激光测定仪测定各组制剂的平均粒径在50-80nm之间，均小于100nm。其中在比例为1:15中载药量为0.049g/g，包封率为73.6％，15天内未见结晶析出，稳定性良好。
实施例7 HA97-PG10-2C18修饰装载多柔比星(DOX)脂质体的制备
制备工艺如下：根据表2处方称取脂质体膜材置于西林瓶中，加入500μL 无水乙醇并于65℃水浴中搅拌溶解。待膜材及药物溶解后，敞开体系，继续搅拌挥除80％无水乙醇。以1mL·S-1的速度将预热至相同温度的柠檬酸-柠檬酸钠溶液(200mM，pH 4.0)注入膜材中，注入5mL。65℃水浴搅拌20min，得到脂质体初品。将初品超声分散处理(功率和时间：200W×2min+400W×6min，工作1s 间歇1s)，后依次通过0.80、0.45、0.22μm微孔滤膜，即得空白脂质体(磷脂浓度为50mg·mL-1)。取空白脂质体混悬液适量，加入磷酸钠溶液(500mM)调节外水相 pH，再加入适量灭菌注射用水，混合均匀，即得pH梯度脂质体。按照药脂比 1:10(wt/wt)将上述梯度脂质体与4.0mg·mL-1DOX药物溶液混合，60℃水浴搅拌孵育，20min后取出，置于冰水浴2min终止载药，即得多柔比星脂质体(DOX)。 DiR脂质体采用被动载药，包封率均大于98％；DOX脂质体采用主动载药，包封率均大于95％。
表2 DOX脂质体处方
Figure BDA0002748803760000112
Figure BDA0002748803760000121
DiR脂质体制备处方如表3所示，制备工艺与DOX脂质体相同，只需将DiR 替换DOX。
表3 DiR脂质体处方
Figure BDA0002748803760000122
实施例8 HA97-PG10-2C18修饰β-胡萝卜素(CAR)乳剂的制备
制备工艺：根据表4处方参数，将处方量水相55℃预热备用。将处方量油相(CAR、MCT、S90G、HA97-PG10-2C18)于55℃下搅拌至全部溶解。搅拌下将预热至相同温度的水相加入油相，高速分散，即得初乳。探头超声(200w×2min； 400w×6min)处理后，过0.22μm微孔滤膜除菌即得(修饰密度约为总磷脂量的10％， mol/mol)。实验结果表明，所得CAR乳剂的平均粒径为105.2±4.5nm，Zeta电位-37.2±2.6mV，4℃放置1个月后粒径与电位无显著性变化，CAR含量仍高达为97.5±0.8％，也无分层和乳滴合并现象，制剂稳定性良好。
表4 HA97-PG10-2C18修饰乳剂处方
Figure BDA0002748803760000123
Figure BDA0002748803760000131
实施例9 HA97-PG10-2C18修饰辅酶Q10(Q10)纳米粒的制备
制备方法：根据表5处方参数，适量乙醇溶解处方量的Q10、EPCs、GMS、 HA97-PG10-2C18并于65℃搅拌下熔融；挥干乙醇，恒速注入预热至相同温度的5％葡萄糖溶液，孵育10min；之后探头超声8min，超声工艺为200w条件下2min，400w条件下6min，过0.22μm微孔滤膜。实验结果表明，固体纳米粒的粒径为 141.3±8.2nm，Zeta电位为-52.7±5.8mV，包封率为93.5±4.3％，4℃放置1 个月粒径、电位和包封率无明显变化，表明制剂稳定性良好。
表5 HA-PG10-2C18修饰纳米粒处方
Figure BDA0002748803760000132
实施例10 HA97-PG10-2C18修饰表柔比星(EPI)囊泡的制备
制备方法：60℃下将处方量Tween80、S80、CH、HA97-PG10-2C18用适量乙醇溶解，挥干乙醇后，搅拌条件下加入溶解有EPI的灭菌注射用水溶液，使用葡聚糖凝胶(G50)柱层析除去外水相的EPI，即得到包封有EPI的由HA-PG衍生物修饰的囊泡。实验结果表明，所得囊泡的平均粒径为118.4±3.9nm，Zeta电位-58.2±2.7mV，包封率为29.3％，4℃放置1个月粒径、电位和包封率无明显变化，表明制剂稳定性良好。
表6 HA97-PG10-2C18修饰多柔比星囊泡处方
Figure BDA0002748803760000133
Figure BDA0002748803760000141
实施例11 HA-PG急性毒性初步实验
HA-PG衍生物溶液的制备：取HA-PG衍生物适量，加入50.0mg蛋黄卵磷脂E80，500μL无水乙醇溶解，加灭菌注射用水稀释至5mL，过0.22μm微孔滤膜即得。
HA-PG衍生物急性毒性考察方案：81只小鼠随机分为27组，每组3只，即 HA97-PG10-2C18、HA13-PG12-2C16、HA97-PG6-C12、HA13-PG3-C8(由实施例1～4所合成)四个制剂组，每个制剂组又分为高、中、低三个剂量组，分别为 HA97-PG10-2C18药效学试验中给药制剂中材料的1000、100和10倍。各组小鼠以不同剂量给予相应的制剂，尾静脉给药后，1h内即时记录各组小鼠的死亡时间，随后每隔1h记录小鼠死亡时间，至24h结束试验。计算各组小鼠的平均存活时间，结果见表7。
表7 HA-PG衍生物的药动学实验结果
Figure BDA0002748803760000142
Figure BDA0002748803760000151
*ND代表小鼠存活时间超过24h.
由上表可知，材料HA97-PG6-C12在15和1.5mmol·kg-1的给药剂量下，小鼠平均存活时间仅为1和120min，材料HA13-PG3-C8在15mmol·kg-1的给药剂量下，小鼠平均存活时间仅为10min，提示了HA97-PG6-C12和HA13-PG3-C8存在潜在的毒性；；材料HA97-PG10-2C18、HA13-PG12-2C16在药效学给药剂量1000倍时(15 mmol·kg-1)，仍未出现小鼠死亡现象，其致死剂量可能远远高于15mmol·kg-1。此外，分别对上述材料以15mmol·kg-1的剂量腹腔注射，均未观察到小鼠死亡现象，充分体现了上述实施例中合成材料低毒性的优势。
实施例12 HA97-PG10-2C18体内重复注射ABC现象的实验
为了考察重复注射在大鼠体内的药动学及组织分布，给药方案如表8。根据实施例7中的处方工艺制备脂质体。首次注射，DiR-HL和DiR-PL以磷脂剂量为0.01μmol/kg尾静脉注射，间隔7天以5μmol磷脂/kg的剂量二次注射DiR-PL 脂质体。对照组首次注射5％的葡萄糖注射液。二次给药后分别于0.083、0.25、 0.5、1、2、4h经眼眶静脉丛取血，4500rpm离心10min获取血浆。4h后处死动物，取出肝脾，生理盐水洗净，滤纸吸干，所得血浆及组织样品于-20℃冷冻保存待用。
结果：如图5所示，重复注射DiR-PL后其DiR的血浆浓度迅速降低(P<0.01)，肝脾聚集量显著增加，即DiR-PL会引起严重的ABC现象。然而，DiR-HL的药动曲线首次和二次基本相似。肝脾聚集量没有差异，结果表明，SL重复注射不会诱导ABC现象。
表8重复注射HA97-PG10-2C18修饰脂质体的药动学实验结果
Figure BDA0002748803760000152
注：ABC index用来评价ABC现象强弱。ABC index＝AUC二次注射/AUC首次注射。
ABC index越大，表明诱导ABC现象越弱，本研究中，HA修饰脂质体的 ABC index(0–30min)为0.97±0.02，而PEG修饰脂质体为0.15±0.04，两者具有显著性差异(P<0.01)。结果表明HA修饰脂质体会避免ABC现象的发生。
实施例13 HA97-PG10-2C18修饰DOX脂质体的S180荷瘤小鼠体内药动学实验
药动学实验：取12只健康雄性S180荷瘤昆明小鼠，瘤体积为300～400mm3，随机分成4组，每组3只，分别通过尾静脉注射Free DOX、DOX-HL、DOX-PL， DOX给药剂量为5mg·kg-1，并于给药后0.083、0.25、0.5、1、4、8、12和24h 眼眶取血于肝素抗凝管中，4500rpm离心10min分离血浆，取所得血浆样品100μL，加入900μL甲醇/水(1/1v/v)，涡旋5min，10000rpm离心10min，取上清液600μL 至另一EP管中，继续10000rpm离心10min。取上清液200μL上样于96孔板中，在激发波长λex＝450nm和发射波长λem＝490nm下测定荧光强度F，并计算血浆中DOX注射剂量百分比(Injected dose，％ID)，以％ID对时间作图，得药动学曲线图，荷瘤小鼠给予不同制剂后药时曲线见图6。
由图6的药动学行为可知，令人振奋的是，DOX-HL和DOX-PL均具有长循环特性，能够有效利用实体瘤高渗透长滞留效应(EPR效应)，为DOX-HL 的抗肿瘤药效学奠定了良好的基础。
实施例14 HA97-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的体内抗肿瘤药效学实验
如图7和图8所示，S180抗肿瘤实验：将24只荷瘤小鼠随机分为4组，即对照组(Control，0.9％NaCl注射液，10mL·kg-1)、药物溶液组(Free DOX)、PEG 修饰DOX脂质体组(DOX-PL)和HA修饰DOX脂质体组(DOX-HL)组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后第3天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后第3、6、9、12和15天)，各组多柔比星的单次给药剂量均为5mg·kg-1。治疗期间每天记录小鼠死亡事件，隔天称量小鼠体质量并测量肿瘤长径(a)和短径(b)。
抗肿瘤实验表明，如图8所示，HA97-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体 (DOX-HL)表现出最佳的抗肿瘤效果，S180肿瘤体积远小于Free DOX和 DOX-PL，同时，DOX-HL治疗组的S180荷瘤小鼠生存率为100％，显著优于优于其他治疗组。
实施例15 HA97-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的细胞靶向性实验
为了进一步研究载体在细胞内转运行为，取对数生长期的CD44阳性S180细胞，小心吸走培养皿中的培养基，PBS清洗一遍后加入新鲜的培养基，轻轻吹打细胞使其成为细胞悬液。取洁净细胞爬片在75％乙醇中浸泡5min，用无菌的PBS 洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于十二孔板内，接种细胞并置于5％CO2，37℃的培养箱中培养过夜，使其约为50％～80％满。更换培养基为含 HA97-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的培养基和含多柔比星游离溶液的培养液 (多柔比星浓度均为5mg/mL)，置于5％CO2,37℃的培养箱中培养4h后。取出爬片细胞板，除去上清液，800g离心5分钟，富集细胞。采用流式细胞仪的PE通道检测DOX阳性细胞。
如图9所示，DOX-PL由于PEG层的阻隔作用，S180细胞对DOX-PL摄取受阻，细胞中DOX摄取量较少，阳性率较低；令人惊喜的是，DOX-HL能够被CD44阳性S180细胞快速大量摄取，并且加入HA97进行抑制实验时，CD44阳性S180细胞对DOX-HL的摄取能力急剧降低。证明S180肿瘤细胞能够通过HA介导高效靶向摄取DiR-HL。因此，这也可以充分解释实施例14中，DOX-HL能通过靶向肿瘤部位，释放DOX，杀伤肿瘤。
实施例16长期稳定性实验
为了进一步研究HA-PG制备的微粒制剂的长期稳定性，我们采用实施例1～4 中合成的HA97-PG10-2C18、HA13-PG12-2C16、HA97-PG6-C12、HA13-PG3-C8四种材料制备成10mg/mL的未载药胶束，对照组采用10mg/mL的HA13溶液和HA97溶液，121℃灭菌12分钟后分装，在4℃、25℃和37℃下储存，进行长期稳定性实验，计算每种材料制备的微粒制剂的有效期。
如表9所示，HA97-PG10-2C18、HA13-PG12-2C16、HA97-PG6-C12、HA13-PG3-C8四种材料制备成10mg/mL的未载药胶束长期稳定性显著优于单独的HA溶液，并且 HA97-PG10-2C18和HA13-PG3-C8两种材料效果较好。
Figure BDA0002748803760000171
Figure BDA0002748803760000181
表9长期稳定性实验。

Claims (10)

1.一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA-PG)，其特征在于，所述透明质酸基团由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成双糖单位并通过β-1,4-糖苷键连接，透明质酸上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：
Figure FDA0002748803750000011
其中，HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在HA分子中PG片段的数目，Y为HA片段中透明质酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700，X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。
2.如权利要求1所述的含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物，其特征在于，1≤X≤500，10≤Y≤1000，X/Y为1％～50％，1≤n≤12，8≤m≤20。
3.如权利要求1或2所述的含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物，其特征在于，所述PG的非极性碳氢链数量为1～3，分别为1条碳氢链(聚甘油单脂肪酸酯)，2条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)，3条碳氢链(聚甘油三脂肪酸酯)。
4.如权利要求3所述的含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物，其特征在于，所述PG的碳氢链选自辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生四烯酸，油酸中一种或多种。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
投料比例为，HA/PG/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；
将HA溶在5mL的甲酰胺(FA)中，加入EDC/NHS，活化1.5h，此时体系澄清，HA浓度为1～500mg/mL，PG浓度为1～500mg/mL，EDC浓度为1～400mg/mL，NHS浓度为1～200mg/mL，TEA浓度为0.1～200mg/mL；
氮气保护下，室温搅拌反应48h后，将反应液转移至透析袋中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100)体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h；
采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质HA-PG。
6.一种如权利要求1-4任意一项所述的含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物在药物制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物制剂为微粒给药制剂，所述HA-PG可应用于微粒给药制剂的制备和修饰。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微粒给药制剂为胶束、脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述微粒给药制剂中，药物与HA-PG的质量比为1:1～1:100。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述微粒给药制剂中，药物与HA-PG的质量比为1:3～1:20。
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