CN105030673A - 一种预防药物泄露的高载药量的新型Asulacrine脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种新的抗癌药物脂质体的制备方法。Asulacrine是一种水难溶性及亲脂性较强的抗癌药物，将其制备成脂质体，很容易发生泄漏，本发明将采用改良的主动载药和老化内核药物沉淀的方法，增加药物的包载量以及脂质体的稳定性，此方法工艺简单，操作方便，能够达到临床所需剂量，并能有效地预防脂质体中药物的泄露。

Description

一种预防药物泄露的高载药量的新型Asulacrine脂质体

技术领域

本发明涉及一种抗癌药物的脂质体制剂及其制备方法。

背景技术

Asulacrine(ASL)是amsacrine的衍生物，是由奥克兰大学癌症中心合成的抗肿瘤药物，它能够抑制拓扑异构酶II，临床研究表明，它具有很强的抗乳腺癌，抗肺癌活性，然而静脉输注ASL的羟乙基磺酸盐葡萄糖溶液，常常会使病人产生疼痛刺激感，甚至造成脉管炎，这大大限制了该药物的临床应用。

许多的抗肿瘤药物如比生群，多柔比星，长春瑞滨，5氟尿嘧啶等，静脉使用时均会造成脉管炎，目前关于脉管炎的机制还不是很清楚，据报道，药物本身的刺激性，注射后析出沉淀以及制剂偏离体液pH，均与脉管炎的发生密切相关。许多水难溶性药物注射入体内后由于长时间与组织接触会析出沉淀，ASL的pK_a是6.7，其在pH7.4环境下的溶解度只有0.8μg/mL，体外采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释ASL的羟乙基磺酸盐溶液，会使其迅速析出沉淀，这表明ASL在静脉输入后可能也会析出沉淀。

通过制剂的手段可以减少药物的刺激性和沉淀析出，这些手段包括制成微乳，环糊精包合物，胶束等。脂质体作为一种生物相容性的药物载体，近年来越来越受到关注，它不但可以包裹药物使其与周围的机体组织液分离，还能通过控制药物释放阻止其沉淀析出，从而减少刺激性；此外，脂质体特有的增强滞留和渗透效应(EPR)能增加药物的肿瘤靶向性，进而提高治疗效果，减少毒性。

脂质体包载药物的方式有被动和主动两种，对于前者，药物包载与脂质体制备同时进行，该方法包封率低，且由于药物释放受到脂质体外药物浓度梯度的影响，稀释后也很容易产生泄露；主动法是利用跨膜势能作为驱动力将药物载入制备好的空白脂质体内，与前者相比，主动载药能够通过“泵入”机制获得更高的载药量，并将药物“锁在”脂质体内水相中，从而更有效地控释药物。其中可以作为载药驱动力的化学势能包括铵盐，醋酸钙，EDTA，过渡金属元素梯度等。

尽管主动载药法优于被动载药法，对于水难溶性药物要通过跨膜转运进行主动载药是很困难的。Zuker等人以九种不同理化性质的药物建立了一个工作模型来预测药物脂质体的载药量，根据这个模型，药物的溶解性会大大限制其被包封的效率，Boman等人研究发现药物被脂质摄取的速率与脂质体外分子型的药物浓度成正比，对于难溶性药物要获得较高的跨膜浓度梯度尤其是分子型药物的浓度梯度是十分困难的。为了解决该问题，Anderson课题组设计了使用药物过饱和溶液进行载药的方法，从而达到了很高的载药量(17％)。然而这种方法还未得到广泛地应用，也没有关于该方法制备的脂质体的稳定性报道。

对于脂溶性较高的药物，即使采用主动载药的方法获得了较高的载药量，也会由于其较高的膜扩散性而导致药物泄露，如长春新碱，环丙沙星等。目前，所采用的手段主要是使用水溶性较高的药物衍生物，通过交联脂质体膜或包衣来增加膜的稳定性，或者是利用内水相包载第三种物质，与药物结合生成溶解度更小的复合物，从而减缓药物的释放。但这些方法或涉及到化学合成，或不易实现，甚至会影响脂质体的释放，因此不具有推广性。

发明内容

为了解决水溶性差药物脂质体载药量低和泄露的问题，发明者采用如下技术方案：

一种Asulacrine脂质体，其特征是：以药物，磷脂，胆固醇为原料制备而成，药物在核心可形成沉淀，防止药物泄露。

上述脂质体制剂，各组分以摩尔比计算，所占的比重为：药物5％～26％，磷脂占25％～60％，胆固醇占5％～40％。

该脂质体的特征在于所用磷脂为DSPE-mPEG和大豆磷脂、蛋黄磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬质酰磷脂酸胆碱，或二棕榈酰磷脂酰甘油，二硬质酰磷脂酰甘油中的一种或几种任意比混合物。

脂质体的平均粒径大小在80～200nm之间。

上述任一种脂质体的制备方法，其特征在于采用铵盐梯度主动载药法，其药物溶液采用环糊精增溶的过饱和溶液，通过控制载药溶液的pH和温度得到高载药量的脂质体，制备后于低温的等渗溶液中储存使药物老化沉淀。

该主动载药方法其特征在于，所使用的铵盐可以是硫酸铵，磷酸铵，碳酸铵中的任一种。

上述载药方法中增溶药物溶液的环糊精为低浓度的羟丙基-β-环糊精，磺丁基醚-β-环糊精溶液。

上述载药方法中低温储存所使用的等渗溶液可以是葡萄糖溶液，蔗糖溶液，生理盐水，磷酸盐溶液。

环糊精具有亲水外部和疏水内腔的结构，能够增溶脂溶性药物，形成复合物。据报道，环糊精可与磷脂和胆固醇相互作用，从而破坏脂质体膜，本发明关注了环糊精对脂质体膜的破坏作用，突破了常规利用脂质体包载药物的环糊精复合物的三元体系，利用环糊精的增溶作用，配制高浓度的药物过饱和溶液，以增加主动载药时的浓度梯度，从而更有利于载药过程，载药结束后，未被包载的环糊精将被除去，保证了脂质体的稳定性。因此，本发明使用环糊精应能够增溶药物，形成复合物，且药物能够在主动载药的驱动力下从复合物解离再进入脂质体内水相。

此外，为了避免载药过程中环糊精与脂质体膜接触引起的药物泄露，对环糊精的浓度进行筛选，最终采用适宜的低浓度环糊精溶液，并对载药工艺，如温度，时间，pH加以控制，保证增溶药物的同时，减少环糊精对脂质体膜的破坏。目前，对该过程工艺参数的控制还尚未报道。

采用聚乙二醇化的磷脂制备脂质体，其亲脂基团与其他磷脂形成脂质体双层膜，PEG长链附着在膜外侧，并伸入水相，这种结构不仅能够避免脂质体被网状内皮吞噬系统识别，延长脂质体在体内的循环时间，从而增加脂质体富集肿瘤组织的几率，提高药效，还能通过增加膜的亲水性，减少脂溶性药物在双层膜中的扩散以及血浆蛋白对脂质体的破坏，对减少药物泄露起到了积极的作用，从而避免静脉输注时引起的刺激性或脉管炎。

本发明还公开了一种加速药物在脂质体内核沉淀的方法。采用前述的环糊精增溶的主动载药法载药，由于内水相强大的pH驱动力、脂质体膜内外浓度梯度以及电荷效应，使药物高效地包载于脂质体内核，且浓度远远超过了药物在内水相的溶解度，在脂质体内部形成过饱和的溶液或凝胶沉淀，该过饱和溶液或凝胶沉淀可以减慢药物向脂质体膜的扩散，增加在内水相的保留，但药物的溶解电离平衡很容易随外部释放介质的稀释而被打破，最终造成药物泄露。本发明是在高载药量的脂质体(内部所载药物的浓度已超过药物的溶解度)的基础上，通过改变脂质体的储存条件老化脂质体，如温度，渗透压，溶液的离子强度等，使内部药物的过饱和溶液或凝胶沉淀进一步转化为稳定的药物结晶，可以大大延缓药物的释放，最终达到缓释的效果。

本发明所制备的脂质体大部分为单室，药物在其内部为球状或针束状，电镜图如图1。平均粒径～180nm，能够更好地利用肿瘤的EPR效应，实现对肿瘤的被动靶向，包封率＞90％，载药量＞9％，zeta电位＜-40mV，稳定性良好。

经过低温老化的脂质体，通过电镜观察，可见其内部的药物针束状结构增加(图1)，通过DSC分析，发现新鲜制备的脂质体在药物熔点270℃附近没有熔融峰，说明药物为无定型，而经过老化后的脂质体出现了明显的吸热峰，表明所包裹的药物发生了晶型转变(图2)。

稳定性试验表明，脂质体混悬液在5％葡萄糖溶液中储存80天，其粒径，zeta电位，包封率未发生显著性变化，表明稳定性良好。

采用pH7.4的PBS溶液为释放介质，以透析法考察脂质体的释放行为，结果(如图3)表明未经老化的脂质体在1h后药物发生泄漏，累积释放达90％以上，而经过老化的脂质体释放缓慢，24h的累积释放量小于30％，该结果与DSC结果一致，表明脂质体经过老化后，药物形成结晶，从而增加了在脂质体内部的滞留，且不影响药物的释放。

附图说明

图1为脂质体的冷冻透射电镜图。图中显示新鲜制备的脂质体具有双层膜结构，内部阴影部分为包裹药物，其大部分呈圆形，少量为针束状沉淀(A)，而经过老化后的脂质体内部药物大部分呈针束状，甚至具有多个针束排列(B)。

图2为药物及含药脂质体的差示扫描量热量分析图，从图中看出，药物(D)的熔点在270℃附近，新鲜制备的脂质体(B)以及以超速离心后的凝胶状态储存的脂质体(A)在加热以后，并未出现药物的熔融峰，而在溶液中老化的脂质体(C)出现了药物的熔融峰。

图3为新鲜制备的和等渗溶液中老化的脂质体在pH7.4的PBS溶液中的释放行为。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1：

将处方量的二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬质酰磷脂酸胆碱，胆固醇溶于甲醇和氯仿(体积比为1∶3)的混合溶剂中，完全溶解后，在旋转蒸发仪上减压蒸发得到均匀的磷脂膜，采用1ml的250mM磷酸铵水溶液水合，超声，得到脂质体混悬液后，过100nm滤膜挤出后得到空白脂质体，透析法除去外部的磷酸铵。将Asulacrine与羟丙基-β-环糊精混合配成1ml溶液后，与空白脂质体在37℃水溶下孵育1.5小时，超高速离心除去未包封药物，得到载药脂质体沉淀，用0.9％氯化钠溶液混悬，于4℃储存10天进行老化。所制备的脂质体的平均粒径为153.3nm，包封率为95％，24h累计释放量为35％。

实施例2：

制备工艺及脂质体老化条件同实施例1，所制备的脂质体的平均粒径为183.3nm，包封率为94％，24h累计释放量为33％。

实施例3：

制备工艺同实施例1，得到载药脂质体沉淀，用0.12MpH7.4的磷酸盐溶液混悬，于4℃储存20天进行老化。所制备的脂质体的平均粒径为170.5nm，包封率为91％，24h累计释放量为29％。

实施例4：

制备工艺同实施例1，得到载药脂质体沉淀，用0.12MpH7.4的磷酸盐溶液混悬，于4℃储存30天进行老化。所制备的脂质体的平均粒径为165.6nm，包封率为97％，24h累计释放量为32％。

实施例5：

制备工艺同实施例1，得到载药脂质体沉淀，用5％葡萄糖溶液混悬，于4℃储存40天进行老化。所制备的脂质体的平均粒径为185.6nm，包封率为93％，24h累计释放量为27％。

实施例6：

制备工艺同实施例1，得到载药脂质体沉淀，用5％葡萄糖溶液混悬，于4℃储存50天进行老化。所制备的脂质体的平均粒径为185.6nm，包封率为92％，24h累计释放量为29％。

Claims (8)

1.一种Asulacrine脂质体，其特征是：由药物，磷脂，胆固醇，为原料制备而成，药物在核心可形成沉淀，防止药物泄露。

2.权利要求1的药物制剂，各组分以摩尔比计算，所占的比重为：药物5％～26％，磷脂占25％～60％，胆固醇占5％～40％。

3.权利要求1的药物制剂的特征在于所用磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬质酰磷脂酸胆碱，或二棕榈酰磷脂酰甘油，二硬质酰磷脂酰甘油中的一种或几种任意比混合物。

4.根据权利要求1所述的制剂，其平均粒径大小在80～200nm之间。

5.权利要求1-4所述的任一种脂质体的制备方法，其特征在于采用铵盐梯度载药法，其药物溶液采用环糊精增溶的过饱和溶液，通过控制载药溶液的pH和温度得到高载药量的脂质体，制备后于低温的等渗溶液中储存使内核药物老化沉淀。

6.权利要求5所述的制备方法其特征在于，所使用的铵盐可以是硫酸铵，磷酸铵，碳酸铵中的任一种。

7.权利要求5所述的制备方法其特征在于，增溶药物溶液的环糊精为低浓度的羟丙基-β-环糊精，磺丁基醚-β-环糊精溶液。

8.权利要求5所述的制备方法其特征在于，低温储存所使用的等渗溶液可以是葡萄糖溶液，蔗糖溶液，生理盐水，磷酸盐溶液。