CN1875944B

CN1875944B - 一种聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球及其制备方法

Info

Publication number: CN1875944B
Application number: CN2006100283701A
Authority: CN
Inventors: 甘勇; 张馨欣; 甘莉
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Jiankangyuan Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Priority date: 2006-06-29
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: CN1875944A

Abstract

本发明涉及一种静脉注射用的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球及其制备方法。该脂质纳米球含有治疗有效量的羟基喜树碱、聚乙二醇酯类、注射用油、磷脂、药学上可接受的辅料，重量百分比分别为0.01～0.2％、1～10％、5～25％、0～10％、0～10％，余量为水。其制备方法为：将羟基喜树碱、注射用油、磷脂等脂溶性材料溶于有机溶剂中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相，将水溶性辅料及添加剂溶于水中，与有机相混合，均质或超声即得，灭菌后低温密封保存或制成冻干制剂。该隐形脂质纳米球增加了羟基喜树碱内酯环的稳定性，且制剂稳定性良好，在体内对肿瘤组织具有被动靶向作用，可以增加药物在病变部位的分布，提高药物疗效并降低副作用。

Description

一种聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种聚乙二醇修饰的隐形脂质纳米球及其制备方法，具体涉及聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球及其制备方法。

背景技术

羟基喜树碱是上世纪60～70年代从喜树中提取的同类抗肿瘤单体中抗癌作用最强的微量生物碱，于80年代应用于临床。羟基喜树碱属于细胞周期特异性药物，主要作用于DNA合成期(S期)。药理研究表明，其抗癌机理为抑制DNA拓扑异构酶I(Topo I)，对腹水型肝癌、头颈部肿瘤、胃癌、膀胱癌及白血病有一定疗效。羟基喜树碱属于细胞毒类药物，在杀死癌细胞的同时，对正常细胞有明显的影响，其毒性反应主要表现在泌尿系统、消化系统及造血功能的抑制等，但其毒性明显低于喜树碱，特别是泌尿系统反应少，临床上易被接受。该药存在的主要问题有半衰期短(30min左右)，需反复给药；脂溶性水溶性都不好，而制成开环形式的水溶性钠盐其抗癌活性降低90％，毒副作用增大；药物的内酯环对pH敏感，开环后药理活性大大下降。因此，研究新剂型以克服上述问题是很有必要的。

目前，羟基喜树碱以钠盐注射液(CN1739515)、钠盐粉针(CN1376468)及片剂(CN1397279)应用于临床。钠盐注射液是通过用氢氧化钠使羟基喜树碱内酯环打开成盐制成的，而其开环结构的抗癌活性低，在人体内存留时间短，难于通过生物膜进入组织细胞，疗效降低。且由于其分子结构中具有酚羟基，暴露于空气中或遇光不稳定，易氧化和水解，使得药物含量下降；钠盐粉针解决了钠盐注射液的稳定性问题，但仍存在内酯开环疗效降低且半衰期短的问题；片剂口服给药，适合于治疗胃肠道肿瘤，但给药剂量加大，增加了对胃肠道的毒副作用。

有试验表明，利用乳剂(CN1493289A)作为喜树碱类药物传递系统，在保持药物静脉注射时以内酯形式存在，提高药物的抗肿瘤活性方面体现了一定的优越性。然而，乳剂作为药物传递系统具有明显的淋巴系统和单核吞噬细胞系统(MPS)靶向性，对肝癌的治疗作用较好，但若病灶部位不在网状内皮系统，该类制剂会增加药物对网状内皮系统的毒性。此外，由于乳剂的界面膜较薄，在长期放置过程中，容易发生羟基喜树碱泄漏，导致包封率降低，药物析出，从而影响制剂的稳定性。

脂质纳米球(lipid nanospheres LN)是将药物溶于脂肪油中经磷脂乳化分散于水相后制成的一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒体分散系，平均粒径小于200nm。近年来，聚乙二醇修饰的纳米微粒给药系统作为一种新型药物传递系统，在提高药物溶解度、增加药物稳定性、降低药物毒副作用、缓控释给药和基因传输等方面有着广泛的应用。聚乙二醇是一种在生理条件下可以稳定存在的水溶性聚合物，由于它的空间结构可以阻止血浆蛋白的靠近，已广泛应用于改变药物的性质。在胶体微粒给药系统方面，PEG长链能够在微粒的表面形成亲水性保护层，可以防止微粒聚集，亦可避免被体内的网状内皮系统识别、吞噬，从而延长药物在血液循环中的保留时间，达到隐形即长循环的目的。将羟基喜树碱制成聚乙二醇修饰的脂质纳米球有助于增加内酯型药物的稳定性，改善药物的体内分布，提高临床疗效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是研究一种静脉注射用的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其能够保持药物静脉注射时以内酯形式存在；改善药物的体内分布，增加其在病变部位的被动靶向性，从而增强抗肿瘤活性、提高临床疗效；显著改善制剂的长期稳定性。

为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的一个技术方案，提供一种静脉注射用的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其含有治疗有效量的羟基喜树碱、聚乙二醇酯类、注射用油、磷脂、药学上可接受的辅料及水，重量百分比分别为0.01～0.2％、1～10％、5～25％、0～10％、0～10％、余量。

其中注射用油构成了隐形脂质纳米球的脂质核心。磷脂及聚乙二醇酯类一方面可形成稳定的乳化膜包裹脂质核心，另一方面对羟基喜树碱的增溶起到了重要作用。聚乙二醇酯类PEG长链的空间结构不仅可避免被体内网状内皮系统识别、吞噬，增加药物对病变部位的被动靶向性，亦可增加脂质纳米球的放置稳定性。

本发明的羟基喜树碱隐形脂质纳米球的粒径范围为10～1000nm、优选10～200nm，在该粒径范围可以有效避免网状内皮系统的吞噬。

所述聚乙二醇酯类为关键性辅料，其选自PEG分子量为1000～10000的维生素E琥珀酸酯、硬脂酸酯；PEG硬脂酸酯与分子量为200～10000的PEG的混合物；PEG化磷脂；Myrj类、Brij类及其组合。

所述磷脂选自卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂及其组合。

所述注射用油选自包括天然植物油、可注射用大豆油、花生油、红花油、橄榄油和脂肪酸酯、油酸、亚油酸、肉豆蔻酸异丙酯、维生素E、维生素A、维生素酯类的组的一种或几种。优选流动性溶解性较好的脂肪酸酯，更优选链长在C₈～C₁₀之间的中等链长脂肪酸甘油酯(medium-chain glyceride，简称MCT)。

所述药学上可接受的辅料包括界面膜稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、pH调节剂。

界面膜稳定剂的作用是形成稳定的界面膜包裹药物和形成脂质纳米球，其选自丙三醇、丙二醇、甘露醇、油酸、油酸钠、胆固醇及其组合。

由于聚乙二醇酯类、磷脂均易被氧化，根据需要，本发明所述的微粒给药系统中还含有抗氧剂，其选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、维生素C、维生素E及其组合。

根据需要，本发明的给药系统可以加入渗透压调节剂，其选自氯化钠、葡萄糖、甘露醇、丙二醇、丙三醇及其组合。

根据需要，本发明的给药系统可加入pH调节剂，包括各类缓冲盐系统如柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸盐等。

根据本发明的另一技术方案，提供一种聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球的制备方法：

将羟基喜树碱、注射用油、磷脂等脂溶性材料溶于有机溶剂中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相，将水溶性辅料及添加剂(界面膜稳定剂、抗氧剂、渗透压调节剂、pH调节剂)溶于水中，与有机相混合，高剪切均质、500～1500bar高压均质或超声即得，灭菌后低温密封保存或加入冻干保护剂制成冻干制剂。

本发明制备方法中所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醇或异丙醇。

冻干工艺为：取含有冻干保护剂的羟基喜树碱隐形脂质纳米球溶液置冷冻干燥箱中，于-40℃预冻3h，打开真空系统使真空度达5～8Pa，升温至-20℃保温8h，再缓慢升温至0℃，通过加热板将样品温度加热至30℃，压盖得羟基喜树碱隐形脂质纳米球冻干样品。

本发明制备方法中所述的冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖及其组合。

有益效果：

1、本发明的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球及其制备方法简单易行，生产设备、工艺流程较为成熟；

2、实验数据表明，以聚乙二醇修饰后的脂质纳米球作为药物传递系统可避免药物对淋巴系统和单核吞噬细胞系统(MPS)靶向性，避免肝脾网状内皮系统的吞噬，增加药物在中央室的浓度，通过EPR效应(肿瘤组织血管生长迅速，外膜细胞缺乏，基底膜变形，淋巴管道回流系统缺损，使微粒可以穿透肿瘤血管内皮细胞进入肿瘤组织，且可以高浓度蓄积在肿瘤组织中)提高药物在病变部位的被动靶向性，改善疗效；

3、聚乙二醇长链的空间结构使纳米球的界面膜增厚且稳定性良好，从而防止放置过程微粒聚集，粒径增大，可以显著改善制剂的长期稳定性；

4、药物包裹于脂质纳米球中，可以使药物免受外界因素的破坏，提高了药物在体内内酯环的稳定性。

附图说明

图1实施例1羟基喜树碱隐形脂质纳米球的粒径分布图。

图2隐形脂质纳米球和普通乳剂放置6个月后包封率比较图。

图3实施例2羟基喜树碱隐形脂质纳米球的粒径分布图。

图4巨噬细胞(MPM)对隐形脂质纳米球及乳剂的体外摄取。

图5羟基喜树碱隐形脂质纳米球与乳剂大鼠体内组织分布。

具体实施方式

实施例1

处方：

羟基喜树碱 0.02％

维生素E 2％

MCT 8％

聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯 3％

大豆卵磷脂 2％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、维生素E、MCT、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、大豆卵磷脂溶于乙醇中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相，与处方量的水混合，高压均质即得，4℃密封保存。用生理盐水稀释后，以Nicomp TM 380ZLS粒径测定仪测定平径粒径，见图1。

所得产品平均粒径为130.9nm，多分散系数(PI)＝0.063。

实施例2

处方：

羟基喜树碱 0.04％

维生素E 2％

MCT 8％

聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯 5％

蛋黄卵磷脂 3％

油酸 0.02％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、维生素E、MCT、聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯、蛋黄卵磷脂、油酸溶于乙醇中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相；与处方量的水混合，高压均质即得，4℃密封保存。用生理盐水稀释后，以Nicomp TM 380ZLS粒径测定仪测定平径粒径，见图3。

所得产品平均粒径为102.9nm，多分散系数(PI)＝0.174。

实施例3

处方：

羟基喜树碱 0.02％

MCT 15％

聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯 6％

大豆卵磷脂 4％

维生素C 0.02％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、MCT、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、大豆卵磷脂溶于二氯甲烷中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相；取处方量的维生素C溶于水，水相与有机相混合，高压均质即得，4℃密封保存。

冻干工艺为：取10％(重量比)的海藻糖，溶于聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球的水分散体中，分装于西林瓶中，置冷冻干燥仪中-40℃预冻3h，然后以5℃/h升温至-10℃，维持8h，再以5℃/h升温至0℃，维持6h，最后升温至15℃保温8小时后出箱，加塞密封即可。

以生理盐水对其再分散后测得产品平均粒径为116.3nm，多分散系数(PI)＝0.147。

实施例4

处方：

羟基喜树碱 0.1％

注射用大豆油 15％

聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯 8％

大豆卵磷脂 5％

油酸钠 0.1％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、注射用大豆油、聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯、大豆卵磷脂溶于乙醇中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相；取处方量的油酸钠溶于水，水相与有机相混合，高压均质即得，4℃密封保存。

所得产品平均粒径为144.7nm，多分散系数(PI)＝0.286。

实施例5

处方：

羟基喜树碱 0.05％

注射用大豆油 5％

聚乙二醇5000硬脂酸酯 3％

大豆卵磷脂 6％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、注射用大豆油、大豆卵磷脂溶于乙醇中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相，取处方量的聚乙二醇5000硬脂酸酯溶于水，水相与有机相混合，高压均质即得，4℃密封保存。

所得产品平均粒径为120.8nm，多分散系数(PI)＝0.216。

实施例6

处方：

羟基喜树碱 0.02％

注射用大豆油 10％

聚乙二醇2000硬脂酸酯 5％

大豆卵磷脂 5％

焦亚硫酸钠 0.01％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、注射用大豆油、大豆卵磷脂溶于乙醇中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相；取处方量的焦亚硫酸钠、聚乙二醇2000硬脂酸酯溶于水，水相与有机相混合，高压均质即得，4℃密封保存。

所得产品平均粒径为137.2nm，多分散系数(PI)＝0.301。

对比实施例1

处方：

羟基喜树碱 0.02％

维生素E 2％

MCT 8％

大豆卵磷脂 4％

水余量

制备方法：

取处方量的羟基喜树碱、维生素E、MCT、大豆卵磷脂溶于乙醇中，以旋转蒸发仪挥干有机溶剂作为有机相，与处方量的水混合，高压均质即得，4℃密封保存，得到羟基喜树碱普通乳剂。

试验实施例

羟基喜树碱隐形脂质纳米球与普通乳剂放置稳定性对比试验：

取实施例1的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球与对比实施例1的羟基喜树碱普通乳剂，在4℃及25℃下密封保存，分别于0、1、2、3、6个月取样对外观、平均粒径及多分散系数(PI)进行考察，见表1。另取六个月放置样品，置于截留分子量为10K的超滤管中，45000rpm，离心10min，分别测定原液及下清液中羟基喜树碱的含量，计算包封率，结果见图2。

结果表明，羟基喜树碱隐形脂质纳米球在4℃及25℃下的放置稳定性均优于其普通乳剂。

表1实施例1的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球与羟基喜树碱普通乳剂放置稳定性对比

聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球与羟基喜树碱原料药开环百分率对比试验：

羟基喜树碱原料药的开环百分率：取羟基喜树碱适量，以0.1mol/LNaOH溶液溶解，取5份，分别以pH3.00，5.79，6.98，7.93，8.36的缓冲液稀释定容，测定pH3.00溶液中羟基喜树碱的总浓度C₀及其它缓冲液中内酯形式羟基喜树碱的浓度C_L，按公式1计算开环百分率，结果见表2。

内酯型结构％＝C₁/C₀×100％开环结构％＝1-内酯型结构％(公式1)

聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球中羟基喜树碱的开环百分率：取实施例1的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球样品，分别调节pH至5、6、7、8，测定内酯型羟基喜树碱的含量C_L。另取一份样品，用0.1mol/LHCL酸化后测定羟基喜树碱的总量C₀。按公式1计算开环百分率，结果见表3。

结果表明，在人体液环境中(pH7.0～7.4)羟基喜树碱内酯结构易开环，而在pH5～8的溶剂中，聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球含羟基喜树碱内酯型结构均占80％以上，其较羟基喜树碱药物粉末内酯环结构的稳定性有显著性提高。

表2羟基喜树碱原料药在pH5～8溶剂中内酯型结构及开环结构的百分含量

表3聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球在pH5～8的溶剂中内酯型结构及开环结构的百分含量

小鼠腹腔巨噬细胞(MPM)的体外摄取试验：

离心管中分别加入MPM悬液及样品(实施例2的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球及对比实施例1的羟基喜树碱普通乳剂)，于37±5℃水浴中孵育2小时，取出后置冰浴中终止吞噬，离心弃去上清液，用pH7.0 PBS分次洗涤，离心弃去上清液，加入内标(喜树碱甲醇溶液)、0.1mol/LHCL，涡漩离心后取上清液注入高效液相色谱仪，测定被吞噬的羟基喜树碱的含量，按公式2计算吞噬百分率，结果见图4。

吞噬百分率＝Wu/Wt×100％ (公式2)

Wt为样品中羟基喜树碱的总量，Wu为巨噬细胞摄取的羟基喜树碱的量。

结果表明，聚乙二醇对脂质纳米球的修饰使巨噬细胞对脂质纳米球的摄取量减小，增强了脂质纳米球的抗蛋白吸附能力。

聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球与羟基喜树碱普通乳剂在大鼠体内组织分布试验：

取实施例2的聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球与对比实施例1的羟基喜树碱普通乳剂，经大鼠尾静脉给药1h后测定大鼠体内血液、肝、脾、肺、肾组织中羟基喜树碱的含量，结果见图5。

结果表明，聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球在肝脾网状内皮系统的浓度小于羟基喜树碱普通乳剂，而在血浆内的浓度较高。说明聚乙二醇修饰的羟基喜树碱隐形脂质纳米球可避免网状内皮系统识别、吞噬，增加药物在中央室即血浆内的分布。

Claims

1.一种静脉注射用的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其按重量百分比含有以下成分：

羟基喜树碱 0.01～0.2％

聚乙二醇酯 1～10％

注射用油 5～25％

磷脂 2～10％

药学上可接受的辅料 0～10％

水余量；

其中，所述药学上可接受的辅料包括界面膜稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂和/或pH调节剂。

2.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其粒径范围为10～1000nm。

3.如权利要求2所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其粒径范围为10～200nm。

4.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述聚乙二醇酯选自PEG分子量为1000～10000的维生素E琥珀酸酯、硬脂酸酯；PEG硬脂酸酯与分子量为200～10000的PEG的混合物；PEG化磷脂；Myrj、Brij及其组合。

5.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述磷脂选自卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂及其组合。

6.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述注射用油选自大豆油、花生油、红花油、橄榄油、脂肪酸酯及其组合。

7.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述界面膜稳定剂选自丙三醇、丙二醇、甘露醇、油酸、油酸钠、胆固醇及其组合。

8.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述抗氧化剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、维生素C、维生素E及其组合。

9.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述渗透压调节剂选自氯化钠、葡萄糖、甘露醇、丙二醇、丙三醇及其组合。

10.如权利要求1所述的羟基喜树碱隐形脂质纳米球，其中所述pH调节剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠和磷酸盐缓冲盐系统。