CN100506208C - 蟾酥纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蟾酥纳米脂质体，其包括下列重量份的组分：0.01～1份蟾酥提取物，0.1～20份磷脂、0.05～10份胆固醇、0.1～10份乳化剂。本发明还公开了其采用薄膜分散法的制备方法。本发明蟾酥纳米脂质体的粒径在10～100nm之间，不仅药物包封率高，且药物渗漏率及氧化指数低，稳定性好；当用于静脉注射时，可减少现有蟾酥制剂对静脉的刺激性，且具有较高的血药浓度及一定的长效作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米脂质体及其制备方法，特别涉及一种蟾酥纳米脂质体及其制备方法。
背景技术
中药蟾酥(分类命名Venenum Bufonis)的有效成分主要包括蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等多种脂溶性成分。现有蟾酥注射液是蟾酥提取物的水制剂，具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫功能的作用，临床上已广泛应用于中、晚期肿瘤和慢性乙型肝炎病人。但在临床应用过程中常出现静脉输注不畅、输液部位红肿、静脉内疼痛等血管刺激性不良反应；而且脂溶性药物常存在给药后生物利用度过低和吸收不稳定等缺点。
目前，纳米技术应用于药剂学中，可明显的改善脂溶性药物给药后的不足，而且现代生物药剂学和药代动力学研究已证明，当给药体系的粒子在<200nm，特别是<100nm水平时，即纳米药物给药系统(Nanoparticle DrugDelivery System，NDDS)，给药体系的吸收和转运机制将发生质的改变，在提高疗效、实现靶向性给药、缓释药物、提高难溶性药物的生物利用度等方面表现出良好的应用前景。其中近年来研究较热的是纳米脂质体，其将药物包封于类脂质双分子(如磷脂、胆固醇)中，通过渗透或被吞噬细胞吞噬后，载体被酶类分解而释放药物。但目前各种方法制成的药物脂质体普遍存在包封率低，粒径不满足NDDS的要求或分布不均匀等缺点；且常用的脂质体均为液体状态，其在液体状态下稳定性差，存在着许多问题，如药物的渗漏、粒子的聚焦以及磷脂在液体状态下的氧化、水解等，这些也影响了脂质体的工业化大生产，更影响了脂质体在临床上的应用。
另一方面，纳米中药是采用纳米技术将中药有效成分、有效部位、原药或其复方多种中药制成小于100nm的纳米粒复方制剂。其不是简单的将中药材进行粉碎至纳米数量级，而是针对中药的有效部位/成分进行纳米技术加工处理，达到NDDS要求。不同于单一的西药成分，某种中药，如蟾酥的有效成分或有效部位往往不是单一的化合物，而是一种混合物。因而在制备中药纳米制剂，特别是载有中药的脂质体时，需考虑中药中不同活性成分/部位的装载及释放，以及其稳定性等。值得注意的是，既然纳米化后中药的性能有显著甚至质的变化，那么这种改变将不只是上述的正面效应，还需注意其可能产生的负面效应，如毒性反应或不良反应等。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一，是提供一种粒径小于100nm的蟾酥纳米脂质体。
本发明的技术方案为：一种蟾酥纳米脂质体，其包括下列重量份的组分：0.01～1份蟾酥提取物，0.1～20份磷脂、0.05～10份胆固醇、0.1～10份乳化剂。
本发明所说的蟾酥提取物是指蟾酥的乙醇提取物，其提取工艺照现有蟾酥注射液工艺(《卫生部药品标准中药成方制剂》第十七册蟾酥注射液质量标准)进行，将提取液回收乙醇蒸干即得。
而所述的磷脂可以是天然磷脂，如大豆磷脂、卵磷脂中的一种或二种。本发明优选天然磷脂：如大豆磷脂、卵磷脂，因其制得的脂质体粒径小、包封率高、安全性好。
其中，磷脂的含量与包封率有关，太低，则包封率低；反之，太高，则对包封率无明显改善，且因其容易氧化、水解而影响产品稳定性。
而所述的胆固醇含量与膜的通透性有关，太低，则通透性不好；反之，太高，则产生渗漏。
本发明所说的乳化剂是具有增溶、乳化、稳定作用的药物辅剂。本发明优选泊洛沙姆(Poloxamer)188或吐温80。当乳化剂的含量太低，则药物溶解不完全，脂质体不稳定；反之，太高，则作为静脉制剂时会带来溶血安全性问题。
本发明蟾酥纳米脂质体较佳地包括下列重量份的组分：0.05～0.2份蟾酥提取物，1～2份磷脂、0.1～0.5份胆固醇、0.4～2份乳化剂。
显然，根据需要，还可在蟾酥纳米脂质体中加入各种添加剂，如作为静脉注射用制剂或眼用制剂时需加入的等渗剂：甘油、葡萄糖等；如抗氧剂：维生素E、维生素C、亚硫酸氢钠等；如作为不灭菌的口服或外用制剂时需加入的抑菌剂：山梨酸及其盐、苯甲酸及其盐等。
为便于保存和运输，本发明还可通过常规干燥方法，如喷雾干燥或冷冻干燥将上述脂质体制成干粉剂的前体脂质体。
本发明要解决的另一技术问题是提供上述的蟾酥纳米脂质体的制备方法。
其采用的技术方案为：薄膜分散法，具体包括如下步骤：
1)将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中并在30-50℃下旋转蒸发成膜；
2)将乳化剂溶于pH为6.0-7.3的缓冲液中，再将蟾酥提取物溶于该缓冲液；
3)将步骤2)所得的溶液加入步骤1)制得的膜中，混合匀化得蟾酥纳米脂质体(混悬液形态)。
本发明上述方法的步骤1)为常规方法，其中的有机溶剂可以是甲醇、氯仿、乙醇、乙醚或其中两者的混合物。
步骤2)中的缓冲液采用常规的磷酸盐缓冲液(PBS)，该乳化剂溶于缓冲液中的浓度通常为0.1～10g/100ml。
而步骤3)中可以采用涡旋振荡混合，使瓶壁的薄膜完全脱落于缓冲液中形成混悬液；还可加以搅拌，如磁力搅拌，其时间视形成的混悬液的形态而定，一般不超过2小时。
本发明的积极进步效果在于：本发明的产品的粒径在10-100nm之间，药物包封率高，至少在80％以上，药物渗漏率低，未用抗氧剂情况下的氧化指数低，稳定性好；当用于静脉注射时，可减少现有蟾酥制剂对静脉的刺激性，且具有较高的血药浓度及一定的长效作用。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
其中，本发明蟾酥提取物的提取工艺照现有蟾酥注射液工艺(《卫生部药品标准中药成方制剂》第十七册蟾酥注射液质量标准)进行，取一定量的蟾酥，用10倍量注射用水浸泡，研磨，加乙醇使含醇量达75％，搅匀，静置，冷藏，滤过，滤液回收乙醇并蒸干即得。
制得的蟾酥纳米脂质体粒径采用Nicomp/Pss ZW380型粒度仪(美国PSS公司)测得，包封率用超滤离心法，释放量、渗漏率用膜透析法后根据常规公式算得，氧化指数采用中国药典2005年版二部附录来测得。
实施例1
将0.1g大豆磷脂，0.05g胆固醇溶于乙醇中，于50℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将0.3g泊洛沙姆188溶于100ml pH6.0的PBS缓冲液，再将蟾酥提取物0.01g溶于该溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，涡旋振荡得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在10-20nm之间，包封率为80％，0.5小时内释放量为35％，36小时渗漏率为2％，氧化指数为0.01。
实施例2
将1g大豆磷脂，0.1g胆固醇溶于乙醚中，于30℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将0.4g泊洛沙姆188溶于pH7.3的磷酸盐缓冲液98ml，将蟾酥提取物0.05g溶于该缓冲溶液中；再将制得的溶液加入上述膜中，涡旋混合后磁力搅拌匀化0.5小时，得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在20-30nm之间，包封率为95％，0.5小时内释放量为27％，36小时渗漏率为0.3％，氧化指数为0.03。
实施例3
将1.5g大豆磷脂，0.3g胆固醇溶于氯仿中，于40℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将1.5g泊洛沙姆188溶于pH6.5的磷酸盐缓冲液90ml，再将蟾酥提取物0.1g溶于上述溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，振荡分散后搅拌匀化1小时，得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在20-40nm之间，包封率为94％，0.5小时内释放量为28％，36小时渗漏率为0.3％，氧化指数为0.08。
实施例4
将2g大豆磷脂，0.5g胆固醇溶于乙醚中，于30℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将2g泊洛沙姆188溶于pH7.2的磷酸盐缓冲液85ml，将蟾酥提取物0.2g溶于上述缓冲溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，振荡分散后搅拌匀化1.5小时，得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在50-80m之间，包封率为96％，0.5小时内释放量为24％，36小时渗漏率为0.2％，氧化指数为0.1。
实施例5
将20g大豆磷脂，10g胆固醇溶于乙醇中，于50℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将10g泊洛沙姆188溶于pH6.0的PBS缓冲液98ml，再将蟾酥提取物1g溶于该溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，涡旋振荡分散得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在60-70nm之间，包封率为89％，0.5小时内释放量为34％，36小时渗漏率为2％，氧化指数为0.06。
实施例6
将0.3g卵磷脂，0.06g胆固醇溶于氯仿中，于40℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将0.1g吐温-80溶于pH6.5的磷酸盐缓冲液95ml，再将蟾酥提取物0.01g溶于上述溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，振荡分散后搅拌匀化1小时，得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在20-40nm之间，包封率为97％，0.5小时内释放量为26％，36小时渗漏率为0.5％，氧化指数为0.05。
实施例7
将4g卵磷脂，0.1g胆固醇溶于乙醚中，于30℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将2g吐温-80溶于pH7.2的磷酸盐缓冲液80ml，将蟾酥提取物0.1g溶于上述缓冲溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，振荡分散后搅拌匀化一个小时，得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在60-90nm之间，包封率为96％，0.5小时内释放量为22％，36小时渗漏率为1％，氧化指数为0.12。
实施例8
将18g卵磷脂，8g胆固醇溶于乙醚中，于30℃的水浴中通过旋转蒸发成膜；将5g吐温-80溶于pH7.2的磷酸盐缓冲液80ml，将蟾酥提取物1g溶于上述缓冲溶液中；将制得的溶液加入上述膜中，振荡分散后搅拌匀化一个小时，得脂质体混悬液100ml。
所得到的蟾酥纳米脂质体用上述方法测定，测得平均粒径在70-90nm之间，包封率为94％，0.5小时内释放量为21％，36小时渗漏率为1.2％，氧化指数为0.14。
上述实施例中的磷脂为上海太伟药业有限公司生产、胆固醇为上海源聚生物科技有限公司产品、泊洛沙姆188和吐温-80为南京威尔化工有限公司生产；磷酸盐缓冲液按中国药典自配；其余试剂均为常规市售产品。
应用实施例1 稳定性试验
以实施例3为例对蟾酥纳米脂质体进行影响因素和稳定性考察，结果表明本品在光照(4500Lux)、高温(40℃)、冷藏(4～8℃)条件下各10天的影响因素试验、加速试验(30℃、RH75％)6个月和室温留样(25℃、RH60％)6个月的稳定性考察，其外观和平均粒径与原始数据比较均无明显变化，结果见表1。
表1
| 外观 | 平均粒径(nm) | |
| 原始 | 乳白色半透明胶体 | 25 |
| 光照 | 乳白色半透明胶体 | 26 |
| 高温 | 乳白色半透明胶体 | 24 |
| 冷藏 | 乳白色半透明胶体 | 25 |
| 加速试验 | 乳白色半透明胶体 | 28 |
| 室温留样 | 乳白色半透明胶体 | 25 |
应用实施例2 血管刺激性试验
取家兔4只，分成两组，每日给家兔静脉注射(iv)1ml实施例3的本发明蟾酥纳米脂质体，连续三天后，解剖动物血管作病理切片观察。结果表明，两组动物的血管有轻度增生、充血、出血，但血管均无组织变性或坏死等显著刺激反应。
上述结果表明蟾酥提取物被脂质体包封后，可以有效地减小药物对血管的刺激性。
应用实施例3 大鼠体内药代动力学试验
取SD大鼠12只，随机分为二组，一组于尾静脉注射0.5ml实施例3的本发明蟾酥纳米脂质体试验组，另外一组于尾静脉注射0.5ml蟾酥提取物水溶液(用1％吐温-80溶液溶解，每ml含与脂质体相同剂量的蟾酥提取物)作为对照组，试验组和对照组分别于给药后0.17h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h眼眶静脉丛取血，全血置肝素化塑料离心管中，于6000rpm离心5min，分离血浆。
取血浆样品，精密吸取大鼠血浆0.2ml置5ml塑料离心管中，加入3.0ml乙酸乙酯，旋涡萃取5min，离心(10000rpm)10min，吸取上层有机相置5ml玻璃尖底试管中，40℃水浴氮气流挥干，残渣加入100μl甲醇溶解，静置，取上清液20μl进行HPLC(色谱柱：Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：0.5％磷酸二氢钾溶液-乙腈(50:50)；检测波长为296nm；流速：1.0ml/min)分析。
测定各组大鼠给药后每个时间点脂蟾毒配基浓度，结果见表2：
表2
| 时间(h) | 蟾酥水溶液(mg/L) | 蟾酥纳米脂质体(mg/L) |
| 0.17 | 7.0782 | 6.1894 |
| 0.5 | 1.4379 | 4.0621 |
| 1 | 0.2161 | 1.2737 |
| 1.5 | 0.0757 | 0.2492 |
| 2 | 0.032 | 0.326 |
| 3 | 0.0148 | 0.1293 |
| 4 | 0.0191 | 0.0648 |
| 5 | 0.009 | 0.0195 |
经统计分析，本发明蟾酥纳米脂质体与蟾酥水溶液相比，显著降低了药物最高浓度，可减少蟾酥提取物对血管刺激的不良作用；同时显著延缓了药物的释放，使本发明蟾酥纳米脂质体具一定长效作用。
Claims (7)
1、一种蟾酥纳米脂质体，其特征在于其包括下列重量份的组分：0.05～0.2份蟾酥提取物，1～2份磷脂、0.1～0.5份胆固醇、0.4～2份乳化剂。
2、如权利要求1所述的蟾酥纳米脂质体，其特征在于所述的磷脂是大豆磷脂或卵磷脂，所述的乳化剂是泊洛沙姆188或吐温80。
3、如权利要求1或2所述的蟾酥纳米脂质体的制备方法，其采用薄膜分散法，包括如下步骤：
1)将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中并在30-50℃下旋转蒸发成膜；
2)将乳化剂溶于pH为6.0-7.3的缓冲液中，再将蟾酥提取物溶于该缓冲液；
3)将步骤2)所得的溶液加入步骤1)制得的膜中，混合匀化得蟾酥纳米脂质体。
4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于该缓冲液为磷酸盐缓冲液。
5、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤2)中乳化剂溶于缓冲液中的浓度为0.1～10g/100ml。
6、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述混合匀化采用涡旋振荡。
7、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述混合匀化还采用磁力搅拌。
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