CN109568271B - 一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，含如下重量份组分：1～5份抗肿瘤药物，15～35份磷脂，15～60份白蛋白，1～10份胆固醇衍生物，2～6份亚油酸。组分中pH敏感的胆固醇衍生物有效保证了rHDL在血液循环输送过程中的结构稳定性，提高了抗肿瘤药物向肿瘤组织靶向输送的效率，rHDL被肿瘤细胞摄取后，pH敏感的胆固醇衍生物中的缩醛键水解为原本的胆固醇，满足了胞内ACAT酶的催化条件，借由脂蛋白结构发生变化进而实现了抗肿瘤药物在肿瘤细胞内部的快速释放，有效地杀伤肿瘤细胞，是一种发展潜力巨大的肿瘤靶向载体，解决了现有技术抗肿瘤药物的生物利用度低和肿瘤杀伤选择性低的问题。

Description

一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白、制备方法及 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白及制备方法。
背景技术
目前，抗肿瘤药物特别是脂溶性抗肿瘤药物普遍存在生物利用度低和肿瘤杀伤选择性低等问题，例如，紫杉醇和阿霉素，尽管其具有良好的抗肿瘤活性，但在水中的溶解度低(＜0.03g/L)，作用面广，特异性弱，毒副作用较强，故而其口服制剂和注射制剂在临床应用中遇到了生物利用度低和肿瘤杀伤选择性低等问题，所以临床治疗急需一种有效方法提高脂溶性抗肿瘤药物溶解度并减少抗肿瘤药物的毒副作用，增加抗肿瘤药物的肿瘤杀伤效果。
高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)是由载脂蛋白、游离胆固醇、磷脂以及非极性的脂质组成的天然生物活性物质，基于仿生学设计的重组高密度脂蛋白(reconstituted high density lipoprotein，rHDL)是采用天然HDL的脂质与蛋白成分和接近的比例重组的载药系统，其在克服天然HDL来源稀缺、制备繁琐、无法大规模应用等缺点的同时，更是因为其独特的亲水-疏水结构、较大的脂质核心(可作为脂溶性药物的贮存空间)、内源性可完全降解以及不被网状内皮系统识别和清除，并可借助其主要载脂蛋白-载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)为肿瘤细胞所摄取等特性，在提高药物向肿瘤组织靶向分布、增加药效等方面显示出独特的优势。
天然HDL在体内具有新生盘状和成熟球状两种形态，其脂核结构恰好与药剂学中脂质体和脂质纳米粒相似，在脂核表面孵育载脂蛋白制备的rHDL即可重现天然HDL相似的结构和生理功能。考虑apoA-I受体在人体内广泛分布，靶向特异性较差，且来源稀少，获取较难，因此采用了肿瘤靶向性(通过增加跨内皮gp-60介导的转运和增加与富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的相互作用)更为突出的白蛋白代替apoA-I构建rHDL。
新生盘状HDL在进入血液循环后，会被血液中大量存在的卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(Lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)催化变构为成熟球状的HDL，这一次过程称之为天然HDL的变构过程。如果盘状rHDL经历相同变构过程，其脂核包载的药物则会大量泄漏，降低rHDL向肿瘤部位靶向输送的效率。变构过程导致药物泄露主要涉及两个反应底物，其中之一即为胆固醇上的羟基，为避免rHDL在血液巡行过程中遭受LCAT酶的催化解构，可以通过化学修饰手段，使用胆固醇和正丁醛(或正己醛、PEG2000醛)反应生成的胆固醇缩醛化衍生物代替胆固醇构建载体，由于缩醛键的保护作用，盘状rHDL在血液循环时程中能够抵御LCAT酶对原本胆固醇羟基的催化进攻，切实提高载体的酶促变构稳定性，一定程度降低载体靶向输送至肿瘤组织之前的药物泄露。
细胞内脂质代谢则是由酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(Acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，ACAT)调节的，当盘状rHDL完成在血液中的巡行过程输送至肿瘤组织微酸性环境(酸性条件pH5.0～6.5)后缩醛键可以水解释放出胆固醇，此时肿瘤细胞内ACAT酶可对盘状rHDL产生类似于血浆中LCAT酶的催化变构过程，伴随变构过程发生的药物泄漏现象，则成为有效肿瘤细胞内部药物释放。另外，肿瘤组织微环境为弱酸性(pH5.0-6.5)，因此，利用其比正常组织低的特性，可以构建pH敏感的rHDL，使得其可以在中性及碱性环境下稳定，而在偏酸性的环境下完成突释，实现智能的药物的控制释放。现有技术中目前没有这方面的报道。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种智能化的pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，有效的保证了其在输送至肿瘤组织前的血液循环中结构稳定性，以及被肿瘤细胞摄取后借由脂蛋白结构发生变化进而加速的抗肿瘤药物的胞内释放，可有效地杀伤肿瘤细胞，提高抗肿瘤功效。
本发明的另一目的是提供上述pH敏感的肿瘤靶向的高密度脂蛋白的制备方法，工艺简单。
本发明将apoA-I替换为靶向能力更为突出的白蛋白，共同构建pH敏感型rHDL，在增加载体在血液巡行中稳定性的同时，利用“pH敏感”与“ACAT酶敏感”的智能转换实现了rHDL在肿瘤靶部位的药物释放，提高抗肿瘤药物的功效。具体方案如下：
一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其包含如下重量份的组分：1～5份抗肿瘤药物，15～35份磷脂，15～60份白蛋白，1～10份胆固醇衍生物，2～6份亚油酸。本发明的配方中加入亚油酸，增强载体对于肿瘤组织环境的pH敏感性，并满足肿瘤细胞内ACAT酶对胆固醇的催化酯化反应条件，促进载体变构，加速抗肿瘤药物的胞内释放。
所述抗肿瘤药物为紫杉醇或阿霉素等脂溶性抗肿瘤药物。
进一步，所述磷脂选自大豆磷脂、蛋磷脂、脑或脊髓中的天然磷脂。
进一步，所述白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白，白蛋白取代载脂蛋白后可以协助形成高密度脂蛋白盘状结构，其可通过增加跨内皮gp-60介导的转运和增加与富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的相互作用来提高肿瘤靶向性，肿瘤靶向输送特异性更高，来源更为广泛，成本较低。
进一步，所述胆固醇衍生物选自正丁醛缩二胆固醇、正己醛缩二胆固醇或PEG2000醛缩二胆固醇中的任意一种。本发明采用缩醛化胆固醇衍生物，通过正丁醛/正己醛/PEG2000醛与胆固醇的羟基反应，提高了rHDL在血液循环中被LCAT酶催化降解的变构稳定性，大大降低了药物的泄漏。
进一步，所述胆固醇衍生物的合成方法：在棕色瓶中加入摩尔比为2～3:1的胆固醇和醛(正丁醛、正己醛或PEG2000醛)，然后加入二氯甲烷溶解，边搅拌边通入干燥的氯化氢气体20～30min，最后盖塞并继续搅拌反应4～8h，将产物真空干燥，即得。
上述pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：
a)将抗肿瘤药物、磷脂、胆固醇衍生物、亚油酸混合溶解于有机溶剂中，然后减压蒸发除去有机溶剂，得到脂质薄膜混合物；
b)向pH8.0的Tris-HCL缓冲液中加入表面活性剂，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜混合物中，形成脂质悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到脂质体；
c)向脂质体中加入白蛋白，4℃孵育5～10h，然后透析除去表面活性剂，即得pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白。
本发明制备的rHDL在与白蛋白孵育前为磷脂双分子层结构，与蛋白孵育后，脂核周围均匀围绕“云雾状”蛋白包覆层使得rHDL边界变得模糊，若干个盘状rHDL堆叠在一起类似“云卷状”结构，且分散很均匀。
进一步，步骤a)中，所述有机溶剂为甲醇和二氯甲烷任意比例的混合物。
进一步，步骤b)中，所述表面活性剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠或泊洛沙姆中的任意一种。
进一步，步骤b)中，所述表面活性剂与胆固醇衍生物的重量比为1～5:1。
本发明的有益效果：本发明提供了一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，由于保护了胆固醇结构中被血浆LCAT酶进攻催化的基团，有效的保证了rHDL在血液循环输送过程中的结构稳定性，提高了抗肿瘤药物向肿瘤组织靶向输送的效率，rHDL输送肿瘤组织并被肿瘤细胞摄取后，pH敏感的胆固醇衍生物结构中的缩醛键水解为原本的胆固醇，满足了胞内ACAT酶的催化条件，借由脂蛋白结构发生变化进而实现了抗肿瘤药物在肿瘤细胞内部的快速释放，有效地杀伤肿瘤细胞，提高抗肿瘤功效。本发明利用“pH敏感”与“ACAT酶敏感”的智能转换实现了rHDL在肿瘤靶部位的药物释放，提高抗肿瘤药物的功效，是一种发展潜力巨大的pH敏感性肿瘤纳米靶向给药载体。
附图说明
图1为实施例1制备的正丁醛缩二胆固醇的质谱图；
图2为实施例1制备的正丁醛缩二胆固醇的核磁氢谱图；
图3为实施例1制得的rHDL的透射电镜图；
图4为实施例1与对比例制得的rHDL在pH7.4的释放介质中的药物释放率；
图5为实施例1制得的rHDL在pH7.4和pH6.5下的药物释放率；
图6为实施例1制得的rHDL在pH6.5时的透射电镜图；
图7为实施例1与对比例制得的rHDL在H22荷瘤小鼠体内肿瘤靶向性对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明，下述实施例仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1
一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其包含如下组分：10mg紫杉醇，150mg大豆磷脂，150mg牛血清白蛋白，25mg正丁醛缩二胆固醇，25mg亚油酸。
正丁醛缩二胆固醇的制备方法：在棕色瓶中加入摩尔比为2.5:1的胆固醇和正丁醛，然后加入二氯甲烷溶解，边搅拌边通入干燥的氯化氢气体20min，最后盖塞并继续搅拌反应6h，将产物真空干燥，即得。产物的质谱图见图1，核磁氢谱图见图2，综合图1质谱反应的化合物分子量以及图2核磁氢谱反应的缩醛键特征性的化学位移值，可以证明合成产物为预期缩醛物质，即为正丁醛缩二胆固醇。
pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将紫杉醇、大豆磷脂、正丁醛缩二胆固醇、亚油酸混合溶解于有机溶剂(甲醇和二氯甲烷体积比为8:2的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去有机溶剂，得到脂质薄膜混合物；
b)往15mLpH8.0的Tris-HCL缓冲液中加入75mg表面活性剂胆酸钠，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜混合物中，形成脂质悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到脂质体；
c)往脂质体中加牛血清入白蛋白，4℃孵育6h，然后用2L含有NaCl和EDTA钠的Tris-HCl缓冲液透析除去表面活性剂，即得pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白rHDL。rHDL的平均粒径250nm，包封率>90％，载药量>4％，Zeta电位<-25mV。
实施例1制得的rHDL的透射电镜图见图3，可以看出，采用白蛋白孵育后，脂核周围均匀围绕“云雾状”蛋白包覆层，使得rHDL边界变得模糊，若干个盘状rHDL堆叠在一起类似“云卷状”结构，且分散很均匀。
实施例2
一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其包含如下组分：5mg紫杉醇，150mg蛋磷脂，150mg牛血清白蛋白，25mg正己醛缩二胆固醇，25mg亚油酸。
正己醛缩二胆固醇的制备方法：在棕色瓶中加入摩尔比为2.5:1的胆固醇和正己醛，然后加入二氯甲烷溶解，边搅拌边通入干燥的氯化氢气体20min，最后盖塞并继续搅拌反应6h，将产物真空干燥，即得。
pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法同实施例1。
实施例3
一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其包含如下组分：5mg紫杉醇，150mg大豆磷脂，150mg牛血清白蛋白，25mg正丁醛缩二胆固醇，25mg亚油酸。
正丁醛缩二胆固醇的制备方法同实施例1。
pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将紫杉醇、大豆磷脂、正丁醛缩二胆固醇、亚油酸混合溶解于有机溶剂(甲醇和二氯甲烷体积比为8:2的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去有机溶剂，得到脂质薄膜混合物；
b)往15mLpH8.0的Tris-HCL缓冲液中加入75mg表面活性剂泊洛沙姆，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜混合物中，形成脂质悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到脂质体；
c)往脂质体中加牛血清入白蛋白，4℃孵育6h，然后用2L含有NaCl和EDTA钠的Tris-HCl缓冲液透析除去表面活性剂，即得pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白。
实施例4
一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其包含如下组分：5mg紫杉醇，150mg蛋磷脂，150mg人血清白蛋白，25mg正丁醛缩二胆固醇，25mg份亚油酸。
正丁醛缩二胆固醇的制备方法同实施例1。
pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将紫杉醇、蛋磷脂、正丁醛缩二胆固醇、亚油酸混合溶解于有机溶剂(甲醇和二氯甲烷体积比为9:1的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去有机溶剂，得到脂质薄膜混合物；
b)往15mLpH8.0的Tris-HCL缓冲液中加入75mg表面活性剂胆酸钠，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜混合物中，形成脂质悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到脂质体；
c)往脂质体中加人血清入白蛋白，4℃孵育6h，然后用2L含有NaCl和EDTA钠的Tris-HCl缓冲液透析除去表面活性剂，即得pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白rHDL。
对比例
一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其包含如下组分：10mg紫杉醇，150mg大豆磷脂，150mg牛血清白蛋白，25mg胆固醇，25mg份亚油酸。
pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法，除了将正丁醛缩二胆固醇改为胆固醇，其余与实施例1相同。
性能测试：
1.酶促变构稳定性测试
将实施例1与对比例制得rHDL进行血浆LCAT酶催化下载体稳定性考察。
测试方法：通过透析袋动态释放考察方法，在释放介质加入LCAT酶的情况下对比实施例1与对比例释放行为的差别，考察缩醛产物对胆固醇羟基的保护作用，进而评价pH敏感性rHDL在LCAT酶存在时的变构稳定性。具体方法如下：在透析袋(MWCO:8000-14000)中加入2mL实例1制得的rHDL和1mL LCAT酶，另一份中加入2mL对比例制得的rHDL和1mL LCAT酶，两端封口，置于100mL 1mol/L水杨酸钠的PBS(pH7.4)溶液中，保鲜膜封口，各平行三份。将装有透析袋的烧杯置于恒温振荡箱中，37℃，100r/min，分别于0.5h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h吸取1mL溶液，同时补充等体积的透析介质；将2mL二氯甲烷加入取出的透析液中，涡旋3min，收集有机相，并用氮气吹干，用甲醇复溶，并定量至1mL，高效液相进样20μL测定药物浓度，计算累积释放百分率，绘制释放曲线。实施例1与对比例制得的rHDL在pH7.4的释放介质中的药物释放率见图4。
由图4可以看出，释放介质中加入LCAT酶后，对比例胆固醇参与构建的rHDL药物释放较快，而正丁醛缩二胆固醇参与构建的rHDL在24h内匀速缓慢释放药物，其释放速度和程度远低于胆固醇构建的rHDL，可见在缩醛键保护胆固醇羟基的情况下，LCAT酶对rHDL解构的催化破坏速度及程度明显得到改善。
2.pH敏感性测试
1)通过动态释放行为考察对比实施例1制得的rHDL在ACAT酶参与的情况下分别于pH7.4和pH6.5条件下的释放行为，考察结果见图5。释放行为考察采用性能测试1项下相同的释放行为考察方法，释放介质分别为pH6.5的磷酸盐缓冲液和pH7.4的磷酸盐缓冲液。
图5为实施例1制得的rHDL在pH7.4和pH6.5下的药物释放率，可以看出，rHDL在pH6.5缓冲液中药物释放较快，在4h、8h和12h的累积释放百分率分别为26.35±6.67％、46.87±6.50％和64.27±10.18％，24h时已释放了接近100％；而在pH7.4缓冲液中对应时间点的累积释放百分率分别为10.82±1.68％、19.27±0.24％和29.69±1.26％，其在24h累积释放率仅为47.29％±4.95，可见在中性释放介质中，由于缩醛化胆固醇衍生物和亚油酸两方面pH敏感性均不发挥作用，故而ACAT酶对载体的变构催化作用较小，pH敏感的rHDL释放明显减慢；而在pH值为6.5的情况下，缩醛化胆固醇衍生物和亚油酸两方面均发挥各自的pH敏感性作用，使rHDL接触ACAT酶之前转变为胆固醇组成的rHDL，当酶促反应条件充分具备以后，药物释放速度和程度明显提升。
2)实施例1制得的rHDL在pH6.5时的透射电镜图见图6，可以看出，当pH值为6.5时，rHDL脂核原本较为完整光滑的结构边缘变得凹凸不平，呈现出亚油酸在酸性条件下向六角晶像转变的过程，故而使rHDL整体呈现“花瓣盛开”形貌，此时药物可通过酸性条件亚油酸发生的晶像转变在rHDL表面打开的释药通道加速释放，呈现pH敏感性。
3.pH敏感的rHDL小动物活体成像体内肿瘤靶向性测试
测试方法：
1)建立H22荷瘤小鼠模型动物模型
培养H22小鼠肝癌细胞，采用含10％胎牛血清，1％双抗的RPMI-1640培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。在显微镜下观察，待瓶中细胞数量为80％～90％时即可进行传代。首先1000r/min离心2min，弃去上层培养基，加入新的完全培养基轻轻吹打均匀后转移到新的培养瓶中，继续放回培养箱中培养。收集处于指数生长期的H22细胞，1000r/min离心2min，弃去上层液体，加入生理盐水稀释，吹打均匀使得细胞浓度约为2×107个/mL，取健康雌性昆明小鼠4只，无菌条件下每只腹腔接种细胞悬液0.5mL，以长成腹水的小鼠为种鼠，进行腹水传代备用。无菌条件下，抽取造模7天的H22腹水小鼠的腹水在每只小鼠背部皮下接种0.3mL细胞悬液。接种后正常饲养，待到第一周左右，可以在接种部位触摸到硬块，即可以确定H22荷瘤小鼠模型成功建立。
2)活体成像肿瘤靶向性观察
24只雌性H22荷瘤小鼠随机分为3组，每组12只，分别尾静脉注射花青素Cy5.5荧光标记的实施例1制得的rHDL和对比例rHDL，于注射后的2h、4h、12h和24h后对小鼠注射5％的水合氯醛0.2ml，麻醉小鼠，然后放入小动物活体成像仪下观察并拍照，采用cy5.5的激发波长和发射波长(激发波长673nm，滤光片693nm)。
测试结果如图7所示，从2h到12h对比例rHDL组小鼠肿瘤部位有微弱的荧光，且强度随时间延长降低，24h荧光基本消失，表明其小鼠体内循环时间较短，肿瘤靶向性较差。对比之下，实施例1制得的pH敏感的rHDL组则呈现出良好的肿瘤靶向性，其在小鼠肿瘤部位从2h到24h均呈现高强度荧光分布，且随着时间的延长肿瘤部位荧光逐步增强，时至24h也未见明显的荧光衰减。表明实施例1制得的rHDL在pH敏感性胆固醇衍生物的保护下体内循环时间长，对于肿瘤组织具有高选择性、高强度的靶向驻留作用。

Claims (8)

1.一种pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其特征在于，包含如下重量份的组分：1～5份抗肿瘤药物，15～35份磷脂，15～60份白蛋白，1～10份胆固醇衍生物，2～6份亚油酸；
所述抗肿瘤药物为紫杉醇或阿霉素；
所述胆固醇衍生物选自正丁醛缩二胆固醇、正己醛缩二胆固醇或PEG2000醛缩二胆固醇中的任意一种。
2.如权利要求1所述pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其特征在于，所述磷脂选自大豆磷脂、蛋磷脂、脑或脊髓中的天然磷脂。
3.如权利要求1所述pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其特征在于，所述白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
4.如权利要求1或2或3所述pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白，其特征在于，所述胆固醇衍生物的合成方法：在棕色瓶中加入摩尔比为2～3:1的胆固醇和醛，然后加入二氯甲烷溶解，边搅拌边通入干燥的氯化氢气体20～30min，最后盖塞并继续搅拌反应4～8h，将产物真空干燥，即得。
5.权利要求1至4任一项所述pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将抗肿瘤药物、磷脂、胆固醇衍生物、亚油酸混合溶解于有机溶剂中，然后减压蒸发除去有机溶剂，得到脂质薄膜混合物；
b)向pH8.0的Tris-HCL缓冲液中加入表面活性剂，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜混合物中，形成脂质悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到脂质体；
c)向脂质体中加入白蛋白，4℃孵育5～10h，然后透析除去表面活性剂，即得pH敏感的肿瘤靶向的重组高密度脂蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中，所述有机溶剂为甲醇和二氯甲烷任意比例的混合物。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述表面活性剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠或泊洛沙姆中的任意一种。
8.如权利要求5或6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述表面活性剂与胆固醇衍生物的重量比为1～5:1。
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