CN110327352B - 长链胆固醇酯在调控神经元神经突起生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及长链胆固醇酯在调控神经元神经突起生长中的应用。本发明发现长链胆固醇酯对神经元神经突起的生长具有抑制作用，并发现长链胆固醇酯对神经元神经突起生长的抑制作用通过激活Rho/ROCK信号通路，提高ROCK蛋白及其下游MLC的磷酸化水平实现。本发明提供的长链胆固醇酯对于Rho/ROCK信号通路的调控作用以及对神经元神经突起生长的抑制功能可为脊髓损伤等神经元神经突起生长受到抑制的疾病的治疗提供新的药物靶标和新的思路。

Description

长链胆固醇酯在调控神经元神经突起生长中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及长链胆固醇酯在调控神经元神经突起生长中的应用。
背景技术
脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，当脊髓损伤发生时，由于脊髓和韧带受到压迫，通常会导致轴突断裂及神经元死亡，同时由于脊髓损伤而引发的生化反应和血管机制变化还会进一步引起脊髓的继发性损伤。因此，脊髓损伤一旦发生，往往会造成病变机体下方永久性的感觉功能丧失及自主运动功能受损。值得注意的是，脊髓损伤往往发生于青壮年人群，这些作为社会价值创造的主要贡献者在脊髓损伤发生后，不仅会遭受全部或部分瘫痪、慢性疼痛和痉挛等伤害，还要承担巨额的脊髓损伤治疗费用。
哺乳动物脊髓损伤后形成的抑制性微环境通常会阻碍神经元神经突起的伸长和神经的发生。其中，包括Nogo、OMgp和MAG在内的多种髓鞘相关蛋白均已被证实可以抑制体内神经突起的生长。
脂质是髓鞘结构的重要组成部分，大约占髓鞘干重的75％。但是，在脊髓损伤后，损伤部位脂质含量的变化与神经元神经突起生长的相互作用关系目前尚未有报道。因此，研究脂质含量变化对于脊髓损伤后神经元神经突起生长的作用对于脊髓损伤后的再生修复具有重要意义。
根据文献报道可知，Rho/ROCK信号转导通路能够参与体内多种生理功能，如细胞骨架重组、细胞收缩和生长以及调控神经突起生长等，当体内平衡状态造到破坏时，大量的抑制因子与神经突起表面受体结合并激活Rho/ROCK信号传导途径，从而抑制神经突起的生长和发芽。目前，Rho/ROCK信号转导途径是推进中枢神经系统再生和恢复的潜在治疗靶标。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供长链胆固醇酯在调控神经元神经突起生长中的应用。
本发明通过对全横断脊髓损伤大鼠的脊髓组织进行全脂分析，发现长链胆固醇酯在脊髓损伤后含量显著升高。根据此发现，本发明分析了长链胆固醇酯对神经元神经突起生长的影响，筛选得到对神经元神经突起生长具有抑制作用的长链胆固醇酯，并解析了长链胆固醇酯对于脊髓损伤后神经突起生长抑制的作用机理(长链胆固醇酯对神经元神经突起生长的抑制作用通过激活Rho/ROCK信号通路，提高ROCK蛋白及其下游MLC的磷酸化水平实现)，提供了缓解或解除长链胆固醇酯对神经元神经突起生长抑制作用的方法。
具体地，本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供长链胆固醇酯在调控神经元神经突起生长中的应用。
本发明发现，长链胆固醇酯对于神经元神经突起生长具有明显抑制作用，并且抑制作用随长链胆固醇酯浓度提高而增强。上述调控神经元神经突起生长优选为神经元神经突起生长。
本发明还提供长链胆固醇酯在调控Rho/ROCK信号通路中的应用。
本发明发现长链胆固醇酯通过激活Rho/ROCK信号通路，提高ROCK蛋白的表达和下游MLC磷酸化水平，从而发挥抑制神经突起生长的作用。上述调控Rho/ROCK信号通路优选为激活Rho/ROCK信号通路。
基于上述长链胆固醇酯的作用机理，本发明提供降低或阻断长链胆固醇酯对于神经元神经突起抑制作用的方法，其为通过使用Rho/ROCK信号通路抑制剂或阻断剂实现。
作为优选，所述Rho/ROCK信号通路抑制剂包括但不限于Y-27632。
脊髓损伤后，神经元神经突起生长受到抑制，本发明发现，长链胆固醇酯可在损伤后的脊髓神经组织中积累，其含量显著高于损伤前，从而发挥对神经元神经突起生长的抑制作用。
长链胆固醇酯为以胆固醇和酰基辅酶A(Acyl-CoA)为底物在体内经酶催化合成。动物体内的长链胆固醇酯合成酶主要包括胆固醇酰基转移酶(ACAT)和卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)；细胞内游离胆固醇在胆固醇酰基转移酶(ACAT/SOAT)的催化下，生成胆固醇酯；血浆中游离胆固醇在卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)的催化下，生成胆固醇酯和溶血磷脂酰胆碱。长链胆固醇酯分解酶主要包括长链中性胆固醇酯分解酶，其功能为促进体内的胆固醇酯转化成胆固醇。基于上述长链胆固醇酯的功能，上述长链胆固醇酯的合成酶或分解酶可以作为药物靶标进行药物的筛选或制备。
本发明提供胆固醇酰基转移酶、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶或长链中性胆固醇酯水解酶在作为药物靶标筛选药物中的应用，所述药物具有如下任一种功能：
(1)促进神经元神经突起生长；
(2)治疗脊髓损伤；
(3)促进脊髓损伤后神经元神经突起的修复；
(4)促进脊髓损伤后的感觉或运动功能恢复。
本发明提供长链胆固醇酯清除剂在制备药物中的应用，所述长链胆固醇酯清除剂为能够减少细胞或组织中长链胆固醇酯的合成或积累的物质，所述药物具有如下任一种功能：
(1)促进神经元神经突起生长；
(2)治疗脊髓损伤；
(3)促进脊髓损伤后神经元神经突起的修复；
(4)促进脊髓损伤后的感觉或运动功能恢复。
以上应用的方式之一为：所述药物的有效成分包括所述长链胆固醇酯清除剂。
作为优选，所述长链胆固醇酯清除剂选自胆固醇酰基转移酶抑制剂、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶抑制剂、长链中性胆固醇酯水解酶激活剂中的一种或多种。
本发明中，所述长链中性胆固醇酯水解酶激活剂为能够从转录水平、翻译水平提高长链胆固醇酯分解酶的表达，或从酶活性水平增强长链胆固醇酯分解酶的活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白质、无机化合物或有机化合物。
所述胆固醇酰基转移酶抑制剂或卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶抑制剂为能够从转录水平、翻译水平抑制胆固醇酰基转移酶或卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶的表达，或从酶活性水平降低胆固醇酰基转移酶或卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶的活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白质、无机化合物或有机化合物。
作为优选，所述胆固醇酰基转移酶抑制剂包括Cyclandelate和/或Rubimaillin。
本发明中，所述长链胆固醇酯优选为碳原子数≥14的胆固醇酯。
本发明通过筛选发现胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)(CE 20:5)、胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)(CE 22:5)对于神经元的神经突起生长的抑制作用更为明显。
作为优选，本发明所述长链胆固醇酯为胆固醇二十碳五烯酸酯和/或胆固醇二十二碳五烯酸酯。
基于长链胆固醇酯的功能，本发明提供一种产品，其包含长链胆固醇酯，所述产品具有抑制神经元神经突起生长或延长的功能。
作为优选，所述长链胆固醇酯为胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)和/或胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)。
进一步地，本发明还提供一种产品，其包含长链胆固醇酯清除剂，所述长链胆固醇酯清除剂为能够减少细胞或组织中长链胆固醇酯的合成或积累的物质；所述产品具有如下任一种功能：
(1)促进神经元神经突起的生长；
(2)治疗脊髓损伤；
(3)促进脊髓损伤后神经元神经突起的修复；
(4)促进脊髓损伤后的感觉或运动功能恢复。
作为优选，上述产品中，所述长链胆固醇酯清除剂为选自胆固醇酰基转移酶抑制剂、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶抑制剂、长链中性胆固醇酯水解酶激活剂中的一种或多种。
所述长链中性胆固醇酯水解酶激活剂为能够从转录水平、翻译水平提高长链胆固醇酯分解酶的表达，或从酶活性水平增强长链胆固醇酯分解酶的活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白质、无机化合物或有机化合物。
所述胆固醇酰基转移酶抑制剂或卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶抑制剂为能够从转录水平、翻译水平抑制胆固醇酰基转移酶或卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶的表达，或从酶活性水平降低胆固醇酰基转移酶或卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶的活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白质、无机化合物或有机化合物。
作为优选，所述胆固醇酰基转移酶抑制剂、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶抑制剂、长链中性胆固醇酯水解酶激活剂调控胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)或胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)的合成或分解，进而能够降低胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)或胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)的含量。
进一步优选地，所述胆固醇酰基转移酶抑制剂包括Cyclandelate和/或Rubimaillin。
作为优选，所述产品为具有上述(1)～(4)任一功能的药物。
进一步优选地，所述药物的有效成分包括所述长链胆固醇酯清除剂或由所述长链胆固醇酯清除剂组成。
本发明还提供一种调控神经元神经突起生长的方法，包括：调控神经元体外培养环境中长链胆固醇酯的含量，或，调控体内神经元或神经组织中长链胆固醇酯的含量。
作为优选，所述调控神经元体外培养环境中长链胆固醇酯的含量为通过在体外培养体系中添加长链胆固醇酯实现。
进一步优选地，所述调控神经元神经突起生长的方法包括：在神经元的体外培养基中添加胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)和/或胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)。
作为本发明的优选方案，上述胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)的添加浓度为0.025μM-0.1μM，胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)的添加浓度为10μM-20μM浓度。
作为优选，所述调控体内神经元或神经组织中长链胆固醇酯的含量可通过增强或降低体内胆固醇酰基转移酶、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶或长链中性胆固醇酯水解酶的表达或活性实现。
本发明的有益效果在于：本发明发现长链胆固醇酯对神经元神经突起的生长具有抑制作用，并发现上述抑制作用通过激活Rho/ROCK信号通路实现。本发明通过筛选获得对神经元神经突起具有明显抑制作用的长链胆固醇酯胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)(CE 20:5)和胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)(CE 22:5)，并发现ROCK抑制剂Y-27632可以降低或阻断长链胆固醇酯对Rho/ROCK信号通路的激活，进而缓解长链胆固醇酯对神经元神经突起的生长抑制作用。本发明提供的长链胆固醇酯对于Rho/ROCK信号通路的调控作用以及对神经元神经突起生长的抑制功能可为脊髓损伤等神经元神经突起生长受到抑制的疾病的治疗提供新的药物靶标和新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同亚型长链胆固醇酯对神经元神经突起生长情况的影响，其中，A为CE 20:3；B为CE 20:4；C为CE20:5；D为CE 22:5；E为DMSO对照组。
图2为本发明实施例1中针对图1中添加不同浓度的不同亚型长链胆固醇酯培养条件下神经元神经突起伸长长度的统计，其中，A为CE 20:3；B为CE 20:4；C为CE 20:5；D为CE22:5。
图3为本发明实施例1中利用背根神经节分析CE 20:5和CE22:5对神经元神经突起生长情况的影响，其中，A为CE 20:5；B为DMSO对照；C为CE 22:5。
图4为本发明实施例1中针对图3中添加不同浓度的CE 20:5和CE 22:5培养条件下背跟神经节神经突起伸长长度的统计，其中，A为CE 20:5；B为CE 22:5。
图5为本发明实施例1中定量PCR分析不同亚型长链胆固醇酯在不同添加浓度下对神经元Tuj-1基因的表达，其中，A为CE 20:3；B为CE 20:4；C为CE 20:5；D为CE 22:5。
图6为本发明实施例2中添加不同亚型长链胆固醇酯的培养条件下以及同时添加长链胆固醇酯和Y-27632的培养条件下Western blot检测ROCK2蛋白和p-MLC表达情况，其中，A为ROCK2蛋白表达；B为p-MLC表达；C为A和B中Western blot检测结果的光密度统计结果。
图7为本发明实施例3中Y-27632缓解长链胆固醇酯CE 20:5和CE 22:5对神经元神经突起生长的抑制效果。
图8为本发明实施例3中针对图7中添加长链胆固醇酯CE 20:5和CE 22:5的培养条件下以及同时添加长链胆固醇酯CE 20:5和CE22:5以及Y-27632的培养条件下神经元神经突起伸长长度统计。
图9为本发明实施例3中荧光定量PCR分析添加长链胆固醇酯CE 20:5和CE 22:5的培养条件下以及同时添加长链胆固醇酯CE20:5和CE 22:5以及Y-27632的培养条件下的神经元Tuj-1基因的表达量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1对神经元神经突起生长具有抑制作用的长链胆固醇酯的筛选
本发明通过对全横断脊髓损伤大鼠的脊髓组织进行全脂分析，发现长链胆固醇酯在脊髓损伤后含量显著升高。在此基础上，通过细胞免疫荧光和实时定量PCR的方法筛选对神经元神经突起生长具有抑制作用的长链胆固醇酯，以下分别以胆固醇二十碳三烯酸酯(顺-8,11,14)(胆固醇HOMO-γ-亚麻酸酯，CE 20:3)、胆固醇二十碳四烯酸酯(顺-5,8,11,14)(胆固醇花生四烯酸酯，CE 20:4)、胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)(CE 20:5)、胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)(CE 22:5)为例对筛选过程进行示例性说明。
采用背根神经节神经元贴壁培养基和背根神经节神经元生长培养基，原代培养孕16d SD大鼠胚胎背根神经节神经元细胞，分别加入不同浓度的以下4种长链胆固醇酯：0.1～20μM的胆固醇二十碳三烯酸酯(顺-8,11,14)(胆固醇HOMO-γ-亚麻酸酯，CE 20:3)、0.1～20μM的胆固醇二十碳四烯酸酯(顺-5,8,11,14)(胆固醇花生四烯酸酯，CE 20:4)、0.025μM-10μM的胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)(CE 20:5)、0.1μM-20μM的胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)(CE22:5)，以添加等量的DMSO作为对照组，利用背根神经节神经元贴壁培养基在37℃、5％CO2的培养箱中贴壁培养过夜(或培养6h以上)后，贴壁后换背根神经节神经元生长培养基在37℃、5％CO2条件下培养12h后观察神经元神经突起生长情况，通过对细胞进行Tuj-1免疫荧光标记检测，观察并统计神经元神经突起伸长的情况，并且通过实时定量PCR检测Tuj-1基因的表达情况。
细胞免疫荧光实验结果和神经突起伸长长度统计结果表明，长链胆固醇酯CE 20:3和CE 20:4对神经元神经突起的生长没有明显影响；但CE 20:5在浓度为0.1μM的作用条件下对神经元神经突起的生长有抑制作用而CE 22:5在浓度为10μM的作用条件下对神经元神经突起的生长有抑制作用(图1和图2)。
根据上述结果，进一步利用背根神经节神经元和背根神经节对CE 20:5和CE 22:5设置更加细致的浓度梯度以分析其对神经突起生长的抑制作用，具体如下：用背根神经节贴壁培养基和背根神经节生长培养基，原代培养孕16d SD大鼠胚胎背根神经节神经元，将背根神经节神经元放在37℃、5％CO2的培养箱中进行贴壁培养3-4h。贴壁后，将旧培养基吸出，加入0.025μM-0.1μM的胆固醇二十碳五烯酸酯(顺-5,8,11,14,17)(CE 20:5)、10μM-20μM的胆固醇二十二碳五烯酸酯(顺-7,10,13,16,19)(CE 22:5)，以添加等量的DMSO作为对照组，37℃培养12h后观察背根神经节神经元神经突起的生长情况。细胞免疫荧光和神经突起伸长长度统计结果表明CE 20:5在0.025μM-0.1μM浓度范围内对神经元神经突起的生长有明显抑制作用，而CE 22:5在10μM-20μM浓度范围内对神经元神经突起的生长有明显抑制作用，并且随使用浓度的升高，对神经元神经突起伸长的抑制效果更明显(图1和图2)。实时荧光定量PCR结果也同样显示，当培养基中加入0.1～20μM的CE 20:3或者0.1～20μM的CE 20:4时，Tuj-1的表达量与对照组(添加DMSO)均未呈现显著性差异；而在添加0.025μM-0.1μM的CE 20:5或10μM-20μM的CE 22:5培养条件下，其Tuj-1的表达量均比对照组(添加DMSO)减少，并且Tuj-1的表达量下降水平随长链胆固醇酯浓度提高而提高(如图5所示)。
进一步以背根神经节作为实验对象验证CE 20:5和CE 22:5对神经突起生长的抑制作用，方法同上。实验结果表明，经过CE 20:5和CE22:5培养后的背根神经节神经突起的变化趋势与背根神经节神经元的神经突起生长变化趋势相似(图3和图4)，进一步证实了CE20:5和CE 22:5对神经元神经突起的生长具有抑制作用。
实施例2长链胆固醇酯通过激活Rho/ROCK信号转导通路抑制神经元神经突起生长
Y-27632是一种较为特异的ROCK抑制剂，可以通过与ROCK蛋白催化结构域中的GTP位点竞争性结合而特异靶向ROCK1和ROCK2蛋白，从而降低ROCK蛋白和下游MLC磷酸化的表达量。由于中枢神经系统中主要表达ROCK2蛋白，本实施例通过蛋白免疫印迹的方法，分别检测添加0.1μM的CE 20:5(CE 20:5 0.1μM组)、20μM的CE 22:5(CE22:5 20μM组)、添加0.1μM的CE 20:5以及5μM Y-27632、添加20μM的CE 22:5以及5μM Y-27632以及对照组(不添加任何长链胆固醇酯和Y-27632，添加等量的DMSO)中ROCK2蛋白表达量以及下游p-MLC的表达量的变化，分析长链胆固醇酯对于Rho/ROCK信号转导通路的调控作用以及抑制神经元神经突起生长的机制。
结果显示，CE 20:5 0.1μM组和CE22:5 20μM组中ROCK2的表达量较高且下游MLC磷酸化水平较高(p-MLC表达量较高)，而当加入Y-27632后(CE 20:5 0.1μM+Y-27632组和CE22:5 20μM+Y-27632组)，ROCK2蛋白和p-MLC的表达量明显下降(图6)。上述结果表明，长链胆固醇酯可以激活Rho/ROCK信号通路，提高ROCK2的表达以及下游MLC的磷酸化，而Y-27632可以阻断长链胆固醇酯对ROCK通路的激活，从而减少ROCK2蛋白和p-MLC的表达量。
实施例3 Y-27632通过抑制Rho/ROCK信号转导通路的激活而缓解长链胆固醇酯对神经突起生长的抑制作用
为进一步验证长链胆固醇酯通过激活Rho/ROCK信号通路发挥神经元神经突起的抑制作用，以及Y-27632能否有效缓解长链胆固醇酯造成的神经突起生长抑制，本实施例通过细胞免疫荧光检测实验，检测分别添加0.1μM的CE 20:5(CE 20:5 0.1μM组)、20μM的CE22:5(CE22:5 20μM组)、添加0.1μM的CE 20:5以及5μM Y-27632、添加0.1μM的CE 20:5以及5μM Y-27632以及对照组(不添加任何长链胆固醇酯和Y-27632，添加等量的DMSO)的对于神经元神经突起生长的影响。细胞免疫荧光结果表明，与对照组相比，CE 20:5 0.1μM组和CE22:5 20μM组中神经元神经突起生长受到明显抑制，而加入Y-27632(CE 20:5 0.1μM+Y-27632组和CE 22:5 0.1μM+Y-27632组)能够缓解CE 20:5和CE 22:5对神经突起的生长抑制现象(图7和图8)，显著提高神经突起的生长。
同时，检测上述各组中神经元Tuj-1基因的表达量，结果表明，与对照组相比，CE20:5 0.1μM组和CE22:5 20μM组的Tuj-1基因表达量显著下降，而加入Y-27632(CE 20:50.1μM+Y-27632组和CE 22:50.1μM+Y-27632组)也能够提升添加CE 20:5和CE 22:5的培养条件下神经元Tuj-1的表达量(图9)。
综上所述，本发明通过分析长链胆固醇酯对于背根神经节神经元神经突起生长情况的影响作用，筛选获得对神经突起生长具有抑制作用的长链胆固醇酯CE 20:5和CE 22:5；通过免疫蛋白印记分析证明，长链胆固醇酯是通过激活ROCK信号通路而抑制神经元神经突起的生长；并且通过细胞免疫荧光和实时定量PCR分析证明，Y-27632可以阻碍长链胆固醇酯对ROCK信号通路的激活，从而缓解长链胆固醇酯对神经元神经突起的生长抑制作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.长链胆固醇酯在制备用于体外抑制神经元神经突起生长的产品中的应用；
所述长链胆固醇酯为胆固醇二十碳五烯酸酯和/或胆固醇二十二碳五烯酸酯。
2.长链胆固醇酯在体外抑制神经元神经突起生长中的应用；
所述长链胆固醇酯为胆固醇二十碳五烯酸酯和/或胆固醇二十二碳五烯酸酯。
3.一种体外抑制神经元神经突起生长的方法，其特征在于，通过在体外培养体系中添加长链胆固醇酯实现神经元神经突起生长的抑制；
所述长链胆固醇酯为胆固醇二十碳五烯酸酯和/或胆固醇二十二碳五烯酸酯。
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