CN104984350A - 一种增加紫杉醇溶解度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增加紫杉醇溶解度的方法。本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法，在紫杉醇中加入功能性化合物和短链醇，调节溶液的酸碱度范围为pH2～7.4。具体地，包括以下步骤：将1～2份紫杉醇溶于0.5～3份短链醇，制备内相；将5～20份功能性化合物溶于7～10份去离子水，制备外相。将内相逐滴滴加至外相中，调节溶液的pH至2～7.4，超声处理30分钟，密封并放置于25℃～60℃孵育摇床中，摇晃1～48小时以达到溶解平衡。本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法利用具有表面活性剂特点的两亲性药用化合物直接作为增加药物溶解度载体，同时加入一定量的短链醇产生协同作用，紫杉醇的溶解度能有效提高，最终有望增加紫杉醇口服生物利用度。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种增加紫杉醇溶解度的方法，特别是涉及一种利用具有表面活性剂特点的两亲性药用化合物直接作为增加药物溶解度载体，同时加入一定量的短链醇产生协同作用，最终达到明显提高紫杉醇溶解度的方法。
背景技术
紫杉醇(paclitaxel，PTX)是从太平洋紫衫的树皮中提取出来的一种天然四环二萜类抗肿瘤药，紫杉醇对多种实体瘤具有抗肿瘤活性，包括卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。这种天然化合物由于缺少离子化基团表现出较差的水溶性(<1μg/mL)。紫杉醇具有较低的口服生物利用度(<2％)，因而在临床上常用静脉注射给药。导致紫杉醇口服生物利用度低的原因，一是较差的水溶性；二是作为P-糖蛋白(P-gp)的底物受到P-gp外排作用而导致肠道低透过性以及肠道中P450酶如CYP3A4对紫杉醇的代谢作用，从而降低紫杉醇体内血药浓度，进而导致生物利用度较低。
目前常用的紫杉醇注射剂(商品名为)是由聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇以50:50(v/v)的比例混合溶解。由于聚氧乙烯蓖麻油会引起严重的过敏反应、肾毒性、神经毒性以及心脏毒性等不良反应，故很大程度上限制了紫杉醇的应用。因此，有必要开发一种具有生物安全性和稳定性的增加紫杉醇溶解度的方法，以便充分发挥紫杉醇的临床治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种增加紫杉醇溶解度的方法，该方法可有效提高紫杉醇溶解度，因而能克服现有紫杉醇注射剂的一些缺点或者提高紫杉醇口服给药时的生物利用度，有利于紫杉醇制剂的开发。
本发明所述的一种增加紫杉醇溶解度的方法，在紫杉醇中加入功能性化合物和短链醇，调节溶液的酸碱度范围为pH 2～7.4。
根据本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法的进一步特征，所述方法包括以下步骤：将1～2份紫杉醇溶于0.5～3份短链醇，制备内相；将5～20份功能性化合物溶于7～10份去离子水，制备外相；将内相逐滴滴加至外相中，调节溶液的pH至2～7.4，超声处理30分钟，密封并放置于25℃～60℃孵育摇床中，摇晃1～48小时以达到溶解平衡。
根据本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法的进一步特征，所述的功能性化合物是甘草酸或其盐类衍生物。
根据本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法的进一步特征，所述甘草酸盐类衍生物是甘草酸铵盐或甘草酸钾。
根据本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法的进一步特征，所述的短链醇的加入量为溶液总体积的4％～30％。
根据本发明所述的增加紫杉醇溶解度的方法的进一步特征，所述的短链醇是选自：乙醇、甲醇、丙二醇的一种或一种以上的组合。
本发明比较不同浓度的功能性化合物和不同浓度短链醇对紫杉醇溶解度的影响，最终确定最佳配方从而显著地提高了紫杉醇溶解度。本发明利用功能性化合物和短链醇协同作用，提高了紫杉醇溶解度，达到823.38±14.41μg/mL，提高紫杉醇水中溶解度近1000倍，同时该溶解度较含7.5％短链醇条件时溶解度增加约100倍。根据溶解度研究结果，可以进一步利用最佳增溶的投料比例制备相关紫杉醇制剂。由于甘草酸具有的功能性和表明活性剂的性质，以及甘草酸本身可以注射给药的特点，因此，本发明可以在新的紫杉醇注射剂、紫杉醇口服制剂、经皮给药，皮肤局部用制剂，肿瘤局部用制剂和直肠给药制剂开发研究中的应用。
甘草酸是临床常用的一种药物，具有抗炎和解毒等作用。由于甘草酸具有两亲性表面活性剂的特点，甘草酸作为一种表面活性剂，其聚集体或者胶束能与疏水性药物形成“主-客”体的包合复合物，能有效地增加药物的溶解度和避免药物沉淀析出。有趣的是，紫杉醇和甘草酸都属于三萜类化合物，同时紫杉醇与甘草酸具有相似的相对分子质量。根据相似相溶的原理，甘草酸有可能与紫杉醇更容易互溶，从而大大增加紫杉醇溶解度。另一方面，由于甘草酸的功能性(如具有抑制P-gp的功能作用)，以及甘草酸在临床使用中的安全性，因此，以甘草酸及其衍生物(其盐)作为紫杉醇增溶体系的载体，除了可以克服已有紫杉醇注射剂的一些缺点外，而且可以用于口服给药来提高紫杉醇的生物利用度。此外，甘草酸为三萜类皂苷，如果作为口服吸收促进剂，不仅能有效地增加疏水性药物的溶解度，而且能增加疏水性药物的细胞膜透过性(约60％)和降低细胞膜的弹性系数。因此，本发明选择甘草酸作为一种增加紫杉醇药物溶解度的载体。
甘草酸铵盐和甘草酸钾盐的结构与甘草酸相类似，具有相似性质，因此本发明也可采用甘草酸铵盐(单铵盐、双铵盐)或甘草酸钾盐作为增加紫杉醇药物溶解度的载体。所选表面活性剂也包括甘草酸铵盐及甘草酸钾。
由于两亲性化合物甘草酸的这种独特的化学结构，在水溶液中能自组装形成具有核/壳结构的球形胶束，这种两亲性化合物可将疏水性的药物包裹在其核心，从而增加药物的溶解度，同时降低药物的毒副作用和提高药物的稳定性。
进一步，在甘草酸构建的胶束系统中引入短链醇(例如，乙醇、甲醇和丙二醇)有利于胶束形成和稳定。例如，乙醇的加入能显著地改变β-酪蛋白胶束的聚集方式。在乙醇和水二相混合溶剂中，当乙醇在溶液中体积比高于4％时，水和乙醇之间会产生连续的氢键网格，有利于β-酪蛋白胶束形成，同时能有效增溶。当乙醇在溶液中体积比约为10～30％时，这种氢键网格结构趋向稳定，对β-酪蛋白胶束有稳定作用。因而短链醇的体积百分比在4％～30％之间均有利于胶束的形成和稳定。在表面活性剂(甘草酸或甘草酸铵盐)和短链醇(乙醇或丙二醇)的协同作用下，紫杉醇的溶解度能有效提高，最终有望增加紫杉醇口服生物利用度。
附图说明
图1A是不同乙醇浓度下，紫杉醇溶解度随甘草酸浓度增加的变化趋势图。
图1B是在固定甘草酸浓度为10mM的条件下，紫杉醇溶解度随乙醇浓度增加的变化趋势图。
图2是本发明制备的紫杉醇-甘草酸纳米胶束扫描电镜和电镜照片。
图3是本发明制备的一种紫杉醇-甘草酸纳米胶束的体内药代动力学实验结果。
具体实施方式
本发明是一种紫杉醇溶解度增加方法，利用高效液相色谱法确认紫杉醇溶解度，通过配置不同比例表面活性剂和短链醇，达到溶解度增加的目的。包括以下步骤：
分别称取过量的紫杉醇至干净且干燥的离心管中，并加入含有不同浓度的功能化合物和不同浓度短链醇后，超声30min，密封。其中备用功能性化合物优选甘草酸铵盐，最优选甘草酸，而短链醇优选丙二醇，最优选无水乙醇。
将混合物溶液，放置于25℃孵育摇床中，摇晃以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，混合均匀，取一定量用高效液相色谱法对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度，所有样品重复三次测定，取平均值。
以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明并不限于这些特定例子。
实施例1
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.5ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例2
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例3
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇1000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例4
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇1500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于8.5ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例5
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇2500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于7.5ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例6
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇3000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于7ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例7
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸铵盐85mg，超声溶解于9.5ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例8
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸铵盐85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例9
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇1000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸铵盐85mg，超声溶解于9ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例10
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇2500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸铵盐85mg，超声溶解于7.5ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例11
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇3000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸铵盐85mg，超声溶解于7ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例12
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸170mg，超声溶解于9.5ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例13
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸170mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例14
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇1000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸170mg，超声溶解于9ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例15
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇1000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸170mg，超声溶解于9ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例16
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇2500μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸170mg，超声溶解于7.5ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例17
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇3000μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸170mg，超声溶解于7ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例18
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水丙二醇500μL，溶解形成紫杉醇丙二醇溶液；另外取甘草酸铵盐170mg，超声溶解于9.5ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇丙二醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例19
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水丙二醇750μL，溶解形成紫杉醇丙二醇溶液；另外取甘草酸铵盐170mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇丙二醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例20
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水丙二醇1000μL，溶解形成紫杉醇丙二醇溶液；另外取甘草酸铵盐170mg，超声溶解于9ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇丙二醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例21
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水丙二醇2500μL，溶解形成紫杉醇丙二醇溶液；另外取甘草酸铵盐170mg，超声溶解于7.5ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇丙二醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例22
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至2，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例23
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至3，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例24
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至5，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例25
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至6，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例26
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至7.4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例27
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于40℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例28
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于50℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例29
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于60℃孵育摇床中，摇晃48h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例30
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃24h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例31
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃12h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例32
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水乙醇750μL，溶解形成紫杉醇乙醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇乙醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃1h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例33
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水丙二醇750μL，溶解形成紫杉醇丙二醇溶液；另外取甘草酸85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇丙二醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃24h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实施例34
紫杉醇20mg(相对过量)，加入无水丙二醇750μL，溶解形成紫杉醇丙二醇溶液；另外取甘草酸铵盐85mg，超声溶解于9.25ml蒸馏水中制备甘草酸铵盐水溶液。在360W功率下超声条件下，将紫杉醇丙二醇溶液以针筒滴加的方式逐滴入到甘草酸铵盐水溶液中，形成类溶剂，调节溶液的pH至4，超声30min，密封并放置于25℃孵育摇床中，摇晃24h以达到溶解平衡。最后所得到的样品通过0.45μm微孔滤膜过滤后，取0.1mL并加入甲醇0.9mL，稀释10倍(以防出现沉淀)，取一定量进高效液相色谱对紫杉醇浓度进行检测，以确定其溶解度。
实验结果如下表1：
| 实施例 | 紫杉醇溶解度(μg/mL) | 粒径(nm) |
| 1 | 179.53 | 182.4 |
| 2 | 813.38 | 267.2 |
| 3 | 801.13 | 225.4 |
| 4 | 82.41 | 1282.43 |
| 5 | 77.64 | 2479.34 |
| 6 | 56.53 | 4272.46 |
| 7 | 165.32 | 199.43 |
| 8 | 793.27 | 278.34 |
| 9 | 774.26 | 258.42 |
| 10 | 67.24 | 4389.34 |
| 11 | 53.74 | 3287.62 |
| 12 | 225.22 | 183.4 |
| 13 | 863.21 | 285.63 |
| 14 | 843.74 | 276.53 |
| 15 | 89.46 | 1114.35 |
| 16 | 83.26 | 1105.25 |
| 17 | 61.71 | 3282.45 |
| 18 | 123.33 | 293.53 |
| 19 | 753.87 | 279.34 |
| 20 | 749.73 | 290.24 |
| 21 | 59.28 | 90.43 |
| 22 | 783.89 | 279.24 |
| 23 | 802.15 | 263.53 |
| 24 | 340.51 | 193.53 |
| 25 | 325.35 | 185.69 |
| 26 | 442.35 | 186.42 |
| 27 | 815.34 | 239.54 |
| 28 | 819.62 | 252.52 |
| 29 | 823.38 | 254.13 |
| 30 | 724.35 | 304.52 |
| 31 | 632.67 | 332.55 |
| 32 | 405.64 | 322.61 |
| 33 | 784.63 | 329.53 |
| 34 | 763.35 | 324.43 |
实验及结果分析
(1)由于乙醇常作为助溶剂用于制剂中，同时加入短链醇(如无水乙醇或丙二醇)有利于胶束形成和稳定。比较不同比例的乙醇(0％、5％、7.5％、10％和25％)对PTX溶解度的影响，对应实施例1～6以及12～17，结果如图1A所示。在不加入甘草酸而且乙醇比例达到25％的条件下，紫杉醇溶解度不超过30μg/mL。并不是乙醇比例越高，所得的混合介质中紫杉醇就会具有更高的溶解度(参见图1B)。当甘草酸浓度固定时，乙醇含量达到25％较7.5％和10％乙醇条件下紫杉醇溶解度出现明显的下降，如图1A中，25％乙醇量的曲线位于最下方。
(2)对比加入不同功能性化合物甘草酸铵盐和甘草酸的增加溶解度效果，如实施例1～11，可以看出甘草酸铵盐有一定增加溶解度效果，但增加溶解度的效果略低于甘草酸。因而，最终选用甘草酸作为功能化合物。同时，通过比较实施例2和实施例13，可以看出当甘草酸浓度增加为原来两倍时，其增加紫杉醇溶解度效果更佳。但当甘草酸浓度达到170mg时，溶液开始形成胶状结构,而且在室温放置会形成固体凝胶，违背增加溶解度的初衷，因而并未选用170mg的浓度，最终选择了85mg作为甘草酸使用浓度。
(3)固定甘草酸比例，加入不同比例乙醇，探究乙醇量对紫杉醇溶解度的影响，对应实施例1-6及12-21。最终确定在乙醇比例为7.5％时，达到最佳紫杉醇溶解度，具体最佳实施例为29，紫杉醇溶解度达到823.38±14.41μg/mL，较紫杉醇水中溶解度增加约1000倍(0.67→823μg/mL)，较7.5％乙醇条件时紫杉醇溶解度增加约100倍(8.51→823μg/mL)。
通过上述(1)～(3)的结果，证实本发明中紫杉醇在功能性化合物(甘草酸或甘草酸铵盐或甘草酸钾盐)和短链醇的协同作用下，非常显著地提高了紫杉醇溶解度，可根据临床需要进一步制备成新的紫杉醇口服和注射制剂用。经计算紫杉醇最终溶解质量与甘草酸质量比值约为1:5～1:20。
(4)取适量实施例29的上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤后得到紫杉醇-甘草酸胶束，并对其进行以下研究。获得如下结果：
所得的紫杉醇-甘草酸纳米胶束用Malvern-3000HSa激光散射粒径测定仪测定其粒径及多分散系数，激光的光源为633.0nm，测定温度为25±1℃，光散射度为90°。平均粒径约为254nm，多分散系数为0.192。用Hitachi S-4800扫描电子显微镜与HITACHI 7650透视电镜观察其所得的纳米胶束，粒径大小均匀，外观澄清，如图2所示的为实施例2所得的紫杉醇-甘草酸纳米胶束，其中左图为透射电镜观察结果，右图为扫描电镜观察结果。
(5)生物利用度的测定
取适量实施例29的上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤后得到紫杉醇-甘草酸胶束，并对其进行以下研究。
S.D.大鼠生物利用度研究：取S.D.大鼠，雄性，随机分成对照组(组)和实验组(紫杉醇-甘草酸胶束组)，每组均5只。实验前大鼠禁食16-18h，采用3﹪戊巴比妥钠(ip，32mg·kg-1)腹腔注射麻醉，根据大鼠的实际体重按20mg·kg-1分别灌胃给予药液，实验组所用药液为紫杉醇-甘草酸纳米胶束，对照组为紫杉醇溶液。给药后分别于20、40、60、80、120、180、240、360、480、600、720min于颈静脉取血采集血样(0.2mL)置于肝素化离心管中，血样立即经8000r·min-1离心5min后取上清于冰箱中-20℃保存，使用前在室温放置复温。取100μL的血样于离心管中，并加入100μL内标，加入1mL乙酸乙酯-二氯甲烷-乙腈(4:1:1)，涡旋2min后15000r/min离心20min，取上清液1mL用氮气挥干，残渣加入100μL流动相复溶，过0.45μm微孔滤膜后经高效液相色谱串联质谱检测，确定紫杉醇血药浓度。
由实验结果计算的药代动力学参数比较可知，进行单向方差分析(One-WayANOVA)，两组间AUCall之间有显著性差异，(p<0.05)，其中实验组(3.42±1.02μg·h/mL)高于对照组(0.573±0.12μg·h/mL)近6倍。两组间Cmax之间有显著性差异,(p<0.05)，其中实验组(0.460±0.10μg/mL)高于对照组(0.095±0.01μg/mL)。两组间Tmax之间无显著性差异,(P＝0.13>0.05)。两组间的Absolute bioavailability(％)之间存在显著性差异(p<0.05)，其中实验组的绝对口服生物利用度高于对照组的约6倍。所得结果见图3。
实验结果见下表2。
表2：紫杉醇在不同组在体给药后的药动学参数(n＝5)
其中与紫杉醇溶液相比，*代表p<0.05。
Claims (6)
1.一种增加紫杉醇溶解度的方法，其特征在于：在紫杉醇中加入功能性化合物和短链醇，调节溶液的酸碱度范围为pH 2～7.4。
2.根据权利要求1所述的增加紫杉醇溶解度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将1～2份紫杉醇溶于0.5～3份短链醇，制备内相；将5～20份功能性化合物溶于7～10份去离子水，制备外相；将内相逐滴滴加至外相中，调节溶液的pH至2～7.4，超声处理30分钟，密封并放置于25℃～60℃孵育摇床中，摇晃1～48小时以达到溶解平衡。
3.根据权利要求1或2所述的增加紫杉醇溶解度的方法，其特征在于：所述的功能性化合物是甘草酸或其盐类衍生物。
4.根据权利要求3所述的增加紫杉醇溶解度的方法，其特征在于：所述甘草酸盐类衍生物是甘草酸铵盐或甘草酸钾。
5.根据权利要求1所述的增加紫杉醇溶解度的方法，其特征在于，所述的短链醇的加入量为溶液总体积的5％～30％。
6.根据权利要求1或5所述的增加紫杉醇溶解度的方法，其特征在于，所述的短链醇是选自：乙醇、甲醇、丙二醇的一种或一种以上的组合。
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