CN101569607B - 一种双脱甲氧基姜黄素的前体脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种含双脱甲氧基姜黄素的前体脂质体及可工业化应用的制备方法，双脱甲氧基姜黄素与磷脂及磷脂衍生物的重量比为1∶5～65，胆固醇及其衍生物3～20份，表面活性剂0.5～5份；按1份磷脂加入0.25～4份冻干保护剂制成冻干粉针剂。本发明涉及一种高效喷射混合法制备前体脂质体的新技术和设备，具有工艺重现性好、技术参数可控等优势，可提供脂溶性药物被稳定包裹在磷脂双分子层的单室脂质体，其平均粒径为80nm～300nm，且粒径分布范围窄，包峰率大于85％和渗漏率低，制剂贮存过程稳定性显著提高。该新制剂静脉注射给药体内循环时间明显延长，AUC是普通注射剂的2.67倍。

Description

一种双脱甲氧基姜黄素的前体脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药和靶向制剂领域，涉及一种双脱甲氧基姜黄素的前体脂质体及其制备方法，提供一种高效喷射混合法生产前体脂质体的装置和新技术，具体为供静脉注射的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体冻干粉针剂的制备方法。

技术背景

姜黄素类(curcuminoids)是中药姜黄的主要有效活性成分，三种单体为姜黄素(curcumin，姜黄素1)、脱甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin，姜黄素2)和双脱甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin，姜黄素3)。研究表明，姜黄素类具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗病毒多种药理活性，在癌症治疗中具有潜在优势[陈敏娟等.姜黄素研究进展及应用前景.2003，15(1)：4-6.]。Mazumder等研究发现姜黄素具有多方面抗肿瘤机制，能抑制HIV-1整合酶活性，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长和增值，双重抗氧化作用；能阻止细胞周期、诱导细胞分化和抑制肿瘤组织的侵袭，期望临床用于抗肝癌和保肝的治疗。三种姜黄素单体以双脱甲氧基姜黄素的抗肿瘤活性最强，由于脱去两个甲氧基，化学稳定性增加，其抗肿瘤和抗氧化作用明显提高[Ramsewak RS，De Witt DL，Nair MG.Cytotoxicity，antioxidant andanti-inflammatory activities of curcumins I-III from Curcumalonga[J].Phytomedicine，2000，7(4)：303.]。

姜黄素类结构中含羟基(-OH)、酮基(C＝O)和双键活性基团，药物难溶于水，碱性溶液中稳定性较差，易被氧化而光解，水溶液4℃存放3天，体外抗癌活性明显下降[许建华等.姜黄素的体外抗癌作用及其水溶液的稳定性.中国药理学通报，1998，5(41)：5-7]。姜黄素类体内生物半衰期短，大鼠口服给予姜黄素1大部分被肠道消化酶和肝脏微粒体酶代谢，检测血浆药物浓度和胆道排泄物量，发现姜黄素1在肠道内易被分解，吸收很少，生物利用度极低，严重影响了姜黄素口服制剂的临床疗效，也限制静脉注射新制剂的开发[韦晓瑜，陈世忠.姜黄素注射液在大鼠体内的药代动力学.北京大学学报(医学版)，2003，35(3)：230]。开发具有广阔市场前景的姜黄素类新制剂意义重大，至今未见有关双脱甲氧基姜黄素制剂研究的文献和专利报道。

国内外学者期望通过改善药物的溶解度以增加体内吸收，CN 1883497A公开了一种环糊精包合技术姜黄素1制备冻干粉针的方法，采用氯仿和甲醇的溶剂法进行环糊精包合，会导致有机溶媒残留的毒性问题。CN1709228A公开了一种姜黄素1固体分散体的制备方法，将姜黄素1与聚乙烯吡咯烷酮溶于丙醇或异丙醇，经减压蒸馏除溶剂，药物溶解性有一定增加，但没有公开固体分散体制剂的体内数据。CN1657040公开一种姜黄素类用于治疗恶性肿瘤耐药逆转的应用，所述耐药恶性肿瘤包括肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及恶性淋巴癌等。有效活性成分姜黄素1、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素，该类药物通过减少化疗用药剂量，降低化疗药副作用，具有安全、高效和剂量小可逆转的优点。CN 1943566A公开了一种采用薄膜分散法制备姜黄素1前体脂质体的方法，该工艺难以完全除去有机溶剂氯仿和甲醇残留。

传统脂质体制备方法，一般脂溶性药物包载脂质双层而水溶性药物装载在内水相中。将含药脂质膜材的乙醇相搅拌下滴入水溶性介质中，由于乙醇注入法装置简单，脂质膜材液或水性溶液的滴制速度难以恒定控制，通常形成的囊泡大小不一，含有单室和多室囊泡的混合物，脂质体粒径分布较宽，尤其受容器的限制，无法中试和连续化生产。高压乳匀法由于需高压力和较高温度，常涉及磷脂双分子层酯键的水解和脂质链中不饱和位点的氧化，易使脂质膜稳定性降低，需加入抗氧剂和其他保护剂。仍存在脂质体储存过程部分药物在脂质膜中氧化降解，易聚集、融合等物理稳定性问题，而冻干产物复溶后也会出现渗漏、包封率变低和粒径变大等现象。

发明内容

为解决传统脂质体制备设备不足和工艺缺陷，使双脱甲氧基姜黄素前体脂质体新制剂的药效学和药动学指标优于普通注射剂，本发明涉及一种高效喷射混合法制备前体脂质体的自动化装置，提供了一种双脱甲氧基姜黄素前体脂质体的新型制备方法，以获得平均粒径在80～300nm单室脂质体，具有粒径分布窄、包封率大于85％，脂质体的渗漏率低的独特优势；尤其可革出丙酮、氯仿和乙醚等有机溶剂，减少环境污染，解决静脉注射给药制剂的溶血难题。本发明提供一项重现性好的脂质体生产工艺，其技术参数容易控制，保持了脂质体膜结构的完整性，能避免制剂中药物和磷脂的水解氧化，保证了制剂灭菌后各项质量指标稳定。

一种高效喷射混合法制备前体脂质体的装置，主要包括：(1)主要部件：由脂质液罐、水合液罐、混合液灌、脂质体接收灌和有机溶剂回收灌组成；(2)喷射混合器：由脂质液流入管、水合液流入管、密封垫圈、喷射管路和喷头组成；(3)辅助部分：高压气体罐、高压泵、真空泵、阀门、气压阀和过滤器等；(4)高效混合循环管路：由高压气循环管路、脂质体混合循环管路、挥发溶剂管路和接收脂质体管路构成。一种前体脂质体冻干粉针剂的自动生产装置，包括：无菌自动分装系统和冷冻干燥设备。

一种高效喷射混合法制备前体脂质体的新技术，适于难溶性药物稳定包裹于脂质双分子层制备单室脂质体，也可应用于水溶性药物稳定装载于内水相的单室泡囊。利用两相高效喷射混合的原理，具体为含药脂质膜材的醇液(脂质相)在氮气流作用下通过喷射混合器喷头呈喷射细流状，表面活性剂分散于10倍脂质相量的水合介质中形成极性(水相)。由于水相呈湍流状态产生高剪切力与具有高表面能的脂质相喷射混合，而乙醇液随喷射流不断快速移除，以增大脂质液充分喷射到高速流动水合介质的表面积；再利用循环混合管路的双重功能，使两相自动多次高效循环混合，完成含药脂质相与极性水相的高度分散，防止单次喷射过程产生局部脂质液浓度过大，易形成大单室或多室脂质体混合物，导致脂质体粒径分布过宽现象，通过调节两相混合液各技术参数，自动回收乙醇溶剂，从而在混合液灌内连续完成脂质体混悬液的制备。

本发明提出如下的技术方案：一种双脱甲氧基姜黄素的前体脂质体，其特征在于：由药物、磷脂及磷脂衍生物、胆固醇及其衍生物和表面活性剂组成，各组分按重量份计，含双脱甲氧基姜黄素1份、磷脂及磷脂衍生物5～65份、胆固醇及其衍生物3～20份和表面活性剂0.5～5份。

上述各组分较好的重量份比为：双脱甲氧基姜黄素1份、磷脂及磷脂衍生物12～50份、胆固醇及其衍生物5～12份和表面活性剂0.8～2.5份。

上述前体脂质体，所述磷脂及磷脂衍生物选自大豆磷脂、氢化大豆磷脂(HSPC)、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂(HEPC)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、双饱和磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、甲氧基聚乙二醇1000磷脂酰胆碱、心磷脂、脑磷脂及其他合成或天然的不饱和磷脂的一种或多种。磷脂中磷脂酰胆碱含量为75～98％。

上述胆固醇及其衍生物选自胆固醇、聚乙二醇600-胆固醇、甲氧基聚乙二醇1000-胆固醇、甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇及其他合成胆固醇的一种或多种。

表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油类、聚氧乙烯氢化蓖麻油类、大豆磷脂、卵磷脂、去氧胆酸钠及甘氨胆酸钠中的一种或它们的混合物。

本发明的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体，为增加药物在脂质体中的稳定性，其特征在于：前体脂质体混悬液的渗透压调节剂选自氯化钠、葡萄糖、甘露醇和乳糖。pH调节剂选自酒石酸、枸橼酸、磷酸，硼酸、马来酸、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、枸橼酸钠及其他无机酸调节剂或由该类调节剂构成的缓冲溶液，缓冲溶液pH5.0～7.0。

一种双脱甲氧基姜黄素前体脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤制备：

(1)称取处方量双脱甲氧基姜黄素、磷脂及磷脂衍生物和胆固醇及其衍生物，用适量乙醇超声溶解后置脂质液灌2，另将表面活性剂用水合介质溶解置水合液灌4中。将含药脂质液通高压N₂泵入喷射混合器3，经喷头呈细流状液滴。同时调节水合介质以高流速通过喷射混合器3，呈湍流状态与脂质液滴连续高效喷射混合，经循环管路流入混合液灌6，开启搅拌器5自动混合形成脂质泡囊。待水相全部从水合液灌4泵出时，再开启混合液灌6循环管路，继续高速循环混合使两相高度分散，连续形成稳定的脂质泡囊，即得循环混合液。

(2)打开有机溶剂回收灌8的阀门7和真空泵9，减压除去循环混合液中乙醇，转入脂质体接收室10，调节脂质体的渗透压和pH，经0.22μm膜滤器11过滤除菌，即得前体脂质体混悬液。

上述水合介质选自注射用水和缓冲盐溶液，其中缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、硼砂-氯化钙缓冲液和硼酸-氯化钾缓冲液(pH5.0～7.0)，优选注射用水或磷酸盐缓冲液(pH5.0～7.0)。

所述的脂质液流入喷头孔径较好为50～800μm，优选100～500μm，流速为5～50mL/min；水合介质流速控制在50～500mL/min，较好脂质液与水合介质流速比为1∶8～35，优选比例为1∶10～30；高压N₂压力为0.05～0.5MPa。

一种双脱甲氧基姜黄素前体脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于：由前体脂质体混悬液和冻干保护剂组成，按磷脂重量份计：1份磷脂加入0.25～4.0份冻干保护剂；较好的比例为1份磷脂加入0.5～2.0份冻干保护剂。

上述冻干保护剂选自甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、环糊精、果糖、右旋糖苷、氯化钠或其它糖类保护剂中一种或它们的混合物。优选甘露醇、山梨醇、乳糖的一种或它们的混合物。

一种双脱甲氧基姜黄素前体脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于：将脂质体收集灌10中脂质体混悬液，加入上述冻干保护剂，经0.22μm滤器过滤除菌，开启自动分装系统12阀门将脂质体预冻液分装于西林瓶中，于设备13冷冻干燥，即得前体脂质体冻干粉针剂。

所述双脱甲氧基姜黄素前体脂质体冻干粉针剂，其特征在于：在加入注射用水重新分散后，能以任意比例与5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液水合重建或自组装为液体前体脂质体，其平均粒径为80nm～300nm，包封率为85％～95％。

脂质体包封率测定：HPLC色谱条件：色谱柱ODS C₁₈，250mm×4.6mm，5μm(北京迪马公司)；流动相：甲醇-水溶液(75∶25)；流速：1.0mL/min；检测波长：418nm，进样量20μL。标准曲线为：A＝1.75×10⁵C-5.83×10³，r＝0.99997，线性范围：0.2～20.0μg/mL。

称取脂质体冻干粉适量，注射用水复溶得脂质体混悬液，依次采用0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，甲醇适量稀释，吸取20μL注入HPLC测定峰面积，代入标准曲线计算药物浓度(Ci)。另取未过滤的脂质体混悬液适量，甲醇稀释，测定药物浓度(C₀)，按公式计算：包封率(％)＝Ci×100％/C₀。

脂质体粒径的测定：称取脂质体冻干粉末适量，加注射用水分散溶解，再稀释10倍，采用Zetasizer 3000HSA光子关联光谱仪(英国马尔文公司)，测定脂质体粒径和Zeta电位。

脂质体渗漏率测定：称取贮存一定时间后的脂质体冻干粉末适量，加注射用水分散溶解，吸取脂质体混悬液0.2mL于离心管，加入纯净水10mL混匀，5000r·min^-1离心30min，吸取上清液加甲醇破乳测定游离药物(W_始游)。另吸取脂质体混悬液0.2mL，加甲醇10mL破乳，采用HPLC法分别测定游离药物和总药量(W_总)。同法测定游离药物量(W_总游)，计算渗漏率公式：渗漏率(％)＝(W_总游-W_始游)/W_包×100％。

1.本发明单因素处方筛选

(1)药物与磷脂比例的影响：固定处方其他各成分，研究药物与磷脂比例对脂质体物理特性如粒径、包封率和膜稳定性的影响(见表1)。

表1药物与磷脂比例对脂质体物理特性的影响(n＝6)

研究表明，磷脂比例小于10，所形成的脂质双分子膜不稳定导致包封率较低，脂质体贮存过程易产生渗漏现象，药物与磷脂较好比例为1∶5～65，优选比例为1∶12～50。

(2)胆固醇与磷脂比例的影响(见表2)

表2磷脂与胆固醇与比例对脂质体物理特性的影响(n＝6)

结果表明，胆固醇可调节脂质膜的刚性，提高脂质膜的稳定性，但用量过多将使脂质膜流动性增加导致包峰率下降，磷脂与胆固醇较好比例为1∶0.04～0.8，优选比例为1∶0.2～0.6。

(3)表面活性剂与水合介质种类的影响(见表3和表4)

表3表面活性剂的比例对脂质体包封率及粒径影响(n＝6)

表面活性剂可保护磷脂双分子层结构封闭状态，增加药物在脂质层中的稳定性，适当降低脂质体粒径；但超过临界浓度会溶解在磷脂中转变为混合胶团，贮存过程随囊泡破裂导致药物渗漏，药物与表面活性剂较好比例为1∶0.5～5.0，优选比例为1∶0.8～2.5。

表4水合介质对脂质体包封率及粒径的影响(n＝6)

双脱甲氧基姜黄素呈弱酸性，pH6.5磷酸盐缓冲液使药物呈游离态有利包封于脂质双层内，提高包峰率，减少粒径和粒径分布窄，随pH增加药物稳定性降低，贮存过程渗漏率增加，较好水合介质为注射用水或pH5.0～7.0的缓冲盐溶液，优选注射用水或pH5.0～7.0磷酸盐缓冲液。

2.工艺筛选和技术参数研究采用五种方法进行工艺优化，结果见表5。

研究发现乙醇注入法较易操作，仅适于小量生产，而薄膜分散和逆向蒸发法产品乳光不明显，粒径偏大、包峰率低，乙醚注入法由于乙醚熔点低难控制且制备的脂质体包峰率较低。高效喷射混合法外观物理性状好，呈淡黄色乳状混悬液，稀释后有明显的乳光；工艺稳定、重现性好，尤其是技术参数容易控制，可获得粒径在80～300nm，粒径分布范围窄和高包峰率的产品。

表5制备工艺对脂质体物理特性的影响(n＝6)

选择冻干保护剂甘露醇、山梨醇、乳糖和蔗糖等，制备脂质体冻干粉针剂，其中甘露醇为最佳冻干保护剂，可获得外观蓬松均匀，经注射用水分散后脂质体粒径基本无变化，甘露醇的比例对脂质体各项指标影响结果见表6：

表6冻干保护剂与磷脂比例对脂质体冻干粉的影响(n＝6)

冻干保护剂的用量对产品物理特性和贮存稳定性影响较大，按1份磷脂加入冻干保护剂(w/w)重量比小于1∶0.25，冻干粉针剂的外观成形差，易出现喷瓶异常现象，水合介质分散后粒径易变大，故较好比例按1份磷脂加入冻干保护剂0.25～4.0份，优选按1份磷脂加入冻干保护剂0.5～2.0份。

本发明的明显优势是应用新颖的高效喷射混合技术和设备，解决传统乙醇注入法制备脂质体时间长，由于滴注过程脂质膜材分散不均匀，易聚集，导致脂质体粒径变大和粒径分布较宽的问题；解决了双脱甲氧基姜黄素难溶于水、易被氧化和制备注射剂困难，且液体脂质体长期贮存仍存在粒径变大的稳定性问题。本发明的特点是实现了生产脂质体过程技术参数可控性，工艺重现性好，保证了制剂灭菌后各项指标恒定，尤其是磷脂的稳定性好，大大提高了制剂贮存过程的稳定性，本发明提供适于临床应用的静脉注射脂质体冻干粉针，在加入注射用水重新溶散后，能以任意比例与5％葡萄糖注射液和0.9％氯化钠注射液稀释而不改变脂质体粒径，药物未产生沉淀和降解，显著提高了中药注射剂临床用药的安全性。

更进一步本发明技术能革除有机溶剂，生产时间缩短而效率大大提高，适于实验室脂质体中试制备，也可满足前体脂质体的连续化生产需要。本发明的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体，通过注射给药在体内可缓慢释放药物，避免了药物的降解，显著提高药物吸收，延长了药物在血液中的循环时间，可达到向肝实质细胞靶向的治疗作用。

附图说明

图1是本发明高效喷射混合法制备前体脂质体装置的结构示意图

1.高压气罐(N₂)  2.脂质液罐  3.喷射混合器  4.水合液罐  5.搅拌器

6.混合液灌  7.气压阀  8.有机溶剂回收灌  9.真空泵  10.脂质体收集灌

11.过滤器  12.自动分装系统  13.冷冻干燥设备

图2是本发明喷射混合器的结构示意图

1.脂质液流入管  2.水合介质流入管  3.密封垫圈  4.喷射管路  5.喷头

图3是本发明高效喷射混合法制备前体脂质体循环管路装置示意图

1.高压气循环管路  2.混合脂质体循环管路

3.挥发溶剂管路    4.接收脂质体管路

图4是本发明双脱甲氧基姜黄素脂质体冻干粉与注射剂体内血药浓度曲线(n＝6)

具体实施方式

一、原辅料来源：双脱甲氧基姜黄素(印度进口，含量99.3％)；大豆磷脂(注射级，磷脂酰胆碱含量92％，上海太伟磷脂有限公司)；氢化大豆磷脂(磷脂酰胆碱含量为99％，上海东尚德国lipid公司代理)；甘露醇(注射级，法国罗盖特辅料公司赠送)；乳糖(Flowlac100，德国美剂乐公司赠送)。

仪器：高效喷射混合法装置(自制，图1～图3)；冷冻干燥设备(alpha-2，Christ公司)。

二、高效喷射混合法装置和原理

1.主要部件与连接：装置见图1

(1)脂质液罐2分别与高压N₂罐1和喷射混合器3通过管路连接；

(2)水合液灌4通过高压泵与喷射混合器3相通；喷射混合器3的一端通过循环管路与混合液灌6连接，另一端连高压泵与水合液灌2相通，提供循环管路系统(两端各有阀门控制)；

(3)混合液灌6(含气压阀7和搅拌器5)与有机溶剂回收灌8相通，真空泵用于提供挥发除去有机溶剂的动力；

(4)脂质体收集灌10一端与混合液灌6相通(主要用于调节脂质体注射液的渗透压和pH，与冻干保护剂混合)；另一端与脂质体预冻液自动分装系统12相连，经过滤器11除菌后分装于西林瓶中，自动分装系统12与冷冻干燥设备13连接(用于制备脂质体冻干粉针)。

2.喷射混合器的作用原理，见图2

含药脂质液通过高压N₂气保护下泵入喷射混合器3，其中的脂质醇液以极细的液滴由喷头喷射于管路中，液滴产生较大的表面能，而水合介质通过高压泵高速流入喷射混合器，以湍流形式和高剪切力的极性水相与脂质相高效喷射混合，初步形成脂质泡囊并移除乙醇液。

3.循环混合过程及原理，见图3

含药脂质液在高压N₂保护下流向喷射混合器3喷头，以高表面能与高速流过的水合介质喷射混合后，流入混合液灌6(其中搅拌器5恒速辅助混合)，两相充分混匀，为提高剪切效果，水合介质的喷射流速远大于含药脂质醇液，待水合液罐4中水合介质泵完时，开启混合循环管路，使管路中的混合液快速流经喷头，在混合液灌6中原两相初次形成的脂质泡囊再通过该循环系统进行多次自动循环，带走喷头附近脂质液中的乙醇，连续完成脂质泡囊的高效喷射混合制备。

实施例1

本发明提供的高效喷射混合法具体内容如下：

(1)脂质液与水合介质流速的影响：按优选处方量称取药物和脂质膜材(磷脂及磷脂衍生物、胆固醇及其衍生物)溶于乙醇，固定脂质液流速为10mL/min，调节水合介质流速，测定脂质体的包封率与粒径，结果见表7：

表7脂质液与水合介质流速比对脂质体的影响(n＝6)

结果表明，水合介质流速为脂质液10倍以上，形成脂质泡囊粒径较小，由于增大极性水相流速，可使含药脂质液充分均匀分散，有利于小单室脂质体的形成，故本发明较好的脂质液与水合介质流速比例为1∶8～35，优选比例为1∶10～30。

(2)脂质液喷头孔径的影响：按优化处方量称取药物和脂质膜材溶于乙醇，固定脂质液流速为10mL/min，水合介质流速为300mL/min，调节喷头孔径大小，考察喷射脂质液滴对形成的脂质体物理特性的影响，结果见表8。

表8脂质液喷头孔径对脂质体粒径和包封率的影响(n＝6)

结果表明，在相同流速下，脂质液喷射管口径越小，使喷头射出脂质液的液滴表面产生较大的动能，有利于与湍流水合介质的高效分散混合，制备的脂质体粒径越小，粒径分布窄，故脂质液喷头孔径较好为50～800μm，优选100～500μm。

实施例2

称取16.0g大豆磷脂、6.0g胆固醇和0.75g双脱甲氧基姜黄素超声溶于85mL乙醇，装入脂质液罐2中，另将1.0g泊洛沙姆188溶解于980mL的pH6.5磷酸缓冲液(水合介质)，装入水合液罐4中。开启高压灌1氮气，将含药脂质液流入喷射混合器3，设流速为10mL/min，经250μm喷头小孔呈细流状液滴；同时开启水合液灌4的高压泵，流速为280mL/min，将水合介质与脂质醇液连续高效喷射混合，流入混合液灌6，自动搅拌混合形成脂质泡囊。开启循环管路，继续高速循环混合至两相完全分散，打开有机溶剂回收灌阀门和真空泵，除去乙醇，即得前体脂质体混悬液。将该脂质体混悬液导入脂质体收集灌10内，以磷酸调节pH6.0，甘露糖调节渗透压，加入25.0g甘露醇，混合均匀，经0.22μm膜滤器过滤除菌，将预冻液自动分装在西林瓶中，经冷冻干燥，即得前体脂质体冻干粉针剂。

取上述脂质体冻干粉用注射用水复溶，测定其平均粒径为165.4nm，Zeta电位为-26.5mV。采用HPLC分析，测定脂质体包封率为92.71％，载药量为2.57％。

实施例3

称取15.0g氢化大豆磷脂、5.0g胆固醇和0.7g双脱甲氧基姜黄素超声溶于80mL乙醇，装入脂质液罐2中；另称取1.2g去氧胆酸钠溶解于850mL注射用水，装入水合液罐4中。开启高压灌1氮气，将含药脂质液流入喷射混合器3，流速为20mL/min，经250μm喷头小孔呈细流状液滴射入循环管路，同时开启水合液灌4的高压泵，流速为280mL/min，将水合介质与脂质醇液连续高效喷射混合，流入混合液灌6，自动搅拌混合形成脂质泡囊。开启循环管路，继续高速循环混合至两相完全分散，打开有机溶剂回收灌阀门和真空泵，除去乙醇，即得前体脂质体混悬液。将该脂质体混悬液导入脂质体收集灌10内，以酒石酸调节pH6.5，葡萄糖调节渗透压，加入26g山梨醇，混合均匀，经0.22μm膜滤器过滤除菌，将预冻液自动分装在西林瓶中，经冷冻干燥，即得前体脂质体冻干粉针剂。

取上述脂质体冻干粉用注射用水复溶，马尔文粒径仪测得其平均粒径为159.7nm，Zeta电位为-22.2mV，HPLC测得脂质体包封率为94.28％，载药量为2.42％。

实施例4

称取16.5g磷脂酰胆碱，4.5g聚乙二醇600-胆固醇，0.8g双脱甲氧基姜黄素溶于75mL乙醇装入脂质液罐2中，另称取1.2g CremophorRH40溶于950mL注射用水中装入水合液罐4中。开启高压灌氮气，将含药脂质液流入喷射混合器，喷头孔径为200μm，流速为15mL/min，经喷头呈细流状液滴射入循环管路，同时开启水合液灌4前的高压泵，流速为260mL/min，将水合介质与脂质醇液连续高效喷射混合，流入混合液灌6，自动搅拌混合形成脂质泡囊，开启循环管路，继续高速循环混合至两相完全分散，打开有机溶剂回收灌阀门和真空泵，除去乙醇，即得脂质体混悬液。将该脂质体混悬液导入脂质体收集灌10中，以氯化钠调节至等渗，柠檬酸调节pH5.8，加入22g乳糖，混合均匀，经0.22μm膜滤器过滤除菌，将预冻液自动分装在西林瓶中，经冷冻干燥，即得前体脂质体冻干粉针剂。

取上述制剂用注射用水分散，采用透射电镜观察脂质体为均匀的椭球体，马尔文粒径仪测得其平均粒径为182.4nm，Zeta电位为-24.32mV。HPLC法测得脂质体的包封率为93.64％，载药量为2.6％。

实施例5

称取12g甲氧基聚乙二醇1000磷脂酰胆碱，5.0g胆固醇，0.85g双脱甲氧基姜黄素溶于80mL乙醇装入脂质液罐2中；另取0.8g泊洛沙姆188溶于pH6.5磷酸盐缓冲液850mL装入水合液罐4中，开启高压灌氮气，将含药脂质液流入喷射混合器3，喷头孔径为300μm，流速为10mL/min，经喷头呈细流状液滴射入循环管路，同时开启水合液灌4的高压泵，流速为250mL/min，将水合介质与脂质醇液高效喷射混合，流入混合液灌6，搅拌自动混合形成脂质泡囊。开启循环管路，继续高速循环混合至两相完全分散，打开有机溶剂回收灌阀门和真空泵，除去乙醇，即得前体脂质体混悬液。将该脂质体混悬液导入脂质体收集灌10中，用氯化钠调节至等渗，硼酸调节pH5.8，加入24g甘露醇，混合均匀，经0.22μm膜滤器过滤除菌，将预冻液自动分装在西林瓶中，冷冻干燥，即得前体脂质体冻干粉针剂。

取脂质体冻干粉针剂用注射用水分散，马尔文粒径仪测得粒径为158.3nm，Zeta电位为-25.51mV；HPLC法测得包封率为95.15％，载药量为2.5％。

实施例6

稳定性试验：

(1)脂质体混悬液：按实施例2制备双脱甲氧基姜黄素脂质体混悬液，市售避光包装于2～6℃冰箱贮存6个月，分别于0天、3天、5天、7天、1月、3月和6月取样，检查脂质体混悬液的外观，测定粒径和包封率，稳定性研究结果见表10。

(2)前体脂质体冻干粉针剂：按照实施例2处方制备双脱甲氧基姜黄素脂质体冻干粉，按市售避光包装于2～6℃冰箱贮存6个月，分别于0天、3天、5天、7天、1月、3月、6月取样，检查脂质体冻干粉的外观，注射用水重建后的测定粒径，采用HPLC法测得脂质体包封率和渗漏率，结果见表9。

表9脂质体混悬液和冻干粉的稳定性数据(n＝6)

脂质体混悬液2～6℃冰箱放置6个月，外观基本无变化，粒径逐渐变大，而包封率降低、渗漏率增加，故低温避光密闭保存混悬液仍不太稳定。双脱甲氧基姜黄素前体脂质体冻干制剂，经2～6℃冰箱贮存6个月，其外观仍疏松、均匀、饱满，采用注射用水轻摇重建即可分散均匀，脂质体冻干粉的粒径、包封率基本无变化，渗漏率较低，故前体脂质体冻干粉针剂稳定较好。

实施例7

体内药动学研究：取清洁级大鼠12只，体重210±30g，雌雄各半，随机分成两组，禁食20h，分别以尾静脉注射双脱甲氧基姜黄素注射剂(自制，给药剂量5mg·kg^-1)和脂质体冻干粉针剂(按实施例2处方制备，给药剂量5mg·kg^-1)，于0.08，0.17，0.25，0.50，0.75，1，2，3，4，6，8h眼眶静脉丛取血约0.3mL置加肝素离心管，5000r/min离心20min，吸取血浆置-29℃冰箱保存。

HPLC色谱条件：色谱柱ODS C₁₈，250mm×4.6mm，5μm(北京迪马公司)；流动相：甲醇-水溶液(75∶25)；流速：1.0mL/min；检测波长：418nm，进样量20μL。

吸取血浆100μL，加2mol/LHCL溶液20μL，涡旋1min，加入乙醚5mL，涡旋1min，5000r/min离心20min，吸上层乙醚液于45℃水浴N₂流下挥干，残渣用100μL流动相溶解，吸20μL进样。采用HPLC法测定药物峰面积，代入标准曲线计算血药浓度。脂质体冻干粉针剂与注射剂的血药浓度曲线见图4，采用DAS2.0软件处理血药浓度数据，药动学参数结果见表10。

表10脂质体冻干粉针剂与注射剂的药动学参数(n＝6)

结果表明，脂质体冻干粉针剂的峰浓度为0.93μg/mL，是注射剂的1.9倍；AUC_0-∞是注射剂的2.67倍；MRT_0-∞明显延长为注射剂的4.05倍，清除率(CL_z)减慢为注射剂的0.43倍。结果显示，本发明双脱甲氧基姜黄素脂质体冻干粉针剂的体内AUC明显增大，循环时间明显延长，具有长循环脂质体作用，达到了药物向肝实质细胞靶向作用的设计目的。

Claims (9)

1.一种双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，其特征在于：按重量份计，含双脱甲氧基姜黄素1份、磷脂及磷脂衍生物5～65份、胆固醇及其衍生物3～20份、表面活性剂0.5～5份；其中磷脂及磷脂衍生物选自大豆磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、双饱和磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000磷脂酰胆碱、心磷脂及脑磷脂的一种或它们的混合物；胆固醇衍生物选自聚乙二醇600胆固醇、甲氧基聚乙二醇1000-胆固醇及甲氧基聚乙二醇2000胆固醇的一种或它们的混合物；所述前体脂质体中还含有渗透压调节剂和pH调节剂；具体制备方法如下：

(1)称取处方量双脱甲氧基姜黄素、磷脂及磷脂衍生物和胆固醇及其衍生物，用适量乙醇超声溶解后置脂质液罐(2)，另将表面活性剂用水合介质溶解置水合液罐(4)中，将含药脂质液通高压N₂泵入喷射混合器(3)，经喷头呈细流状液滴，同时调节水合介质以较高流速通过喷射混合器(3)，呈湍流状态与脂质液滴连续高效喷射混合，经循环管路流入混合液罐(6)，开启搅拌器(5)自动混合形成脂质泡囊，待水相全部从水合液罐(4)泵出时，再开启混合液罐(6)循环管路，继续高速循环混合使两相高度分散，连续形成稳定的脂质泡囊，即得循环混合液；

(2)打开有机溶剂回收罐(8)的阀门(7)和真空泵(9)，减压除去循环混合液中乙醇，转入脂质体接收室(10)，调节脂质体的渗透压和pH，经0.22μm膜滤器过滤除菌，即得。

2.权利要求1的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，其特征在于所述各组分重量份比为：双脱甲氧基姜黄素1份、磷脂及磷脂衍生物12～50份、胆固醇及其衍生物5～12份、表面活性剂0.8～2.5份。

3.权利要求1或2的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，其特征在于：表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、大豆磷脂、卵磷脂、去氧胆酸钠及甘氨胆酸钠中的一种或它们的混合物。

4.权利要求1或2的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，其特征在于：所述的渗透压调节剂选自氯化钠、葡萄糖、甘露醇和乳糖；pH调节剂选自酒石酸、枸橼酸、磷酸，硼酸、马来酸、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、枸橼酸钠及其他无机酸调节剂或由该类调节剂构成的缓冲溶液，缓冲溶液pH5.0～7.0。

5.权利要求1或2的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，其特征在于：所述的水合介质选自注射用水和缓冲盐溶液，其中缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、硼砂-氯化钙缓冲液和pH5.0～7.0硼酸-氯化钾缓冲液；所述的脂质液流入喷头孔径为50～800μm，流速为5～50mL/min；水合介质流速控制在50～500mL/min，脂质液与水合介质流速比为1∶8～35；高压N₂压力为0.05～0.5MPa。

6.权利要求5的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，其特征在于：所述水合介质选自pH5.0～7.0磷酸盐缓冲液；所述的脂质液流入喷头孔径为100～500μm，脂质液与水合介质流速比为1∶10～30。

7.权利要求1至4之一项的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液的冻干粉针剂，其特征在于：由前体脂质体混悬液和冻干保护剂组成，按磷脂重量份计：1份磷脂加入冻干保护剂0.25～4.0份；冻干保护剂选自甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、环糊精、果糖、右旋糖苷、氯化钠中一种或它们的混合物。

8.权利要求7的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液的冻干粉针剂，其特征在于：按重量份计，1份磷脂加入冻干保护剂0.5～2.0份，冻干保护剂选自甘露醇、山梨醇或乳糖的一种或它们的混合物。

9.权利要求8的双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液的冻干粉针剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1至4之一项所述双脱甲氧基姜黄素前体脂质体混悬液，于脂质体收集罐(10)中加入冻干保护剂，其量按磷脂的重量比计，1份磷脂加入冻干保护剂0.25～4.0份，经0.22μm膜滤器过滤除菌，开启自动分装系统(12)阀门将脂质体预冻液分装于西林瓶中，于设备(13)冷冻干燥，即得冻干粉针剂。

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