CN103417984A - 靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域,涉及一种新型多肽修饰的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统及其制备方法。本发明使用新型多肽为靶向头基,高分子材料为基础载体,化疗药物通过pH敏感的腙键连接到高分子载体上,制成脑胶质瘤靶向的双载药纳米递释系统。本发明能避免内源性Tf的干扰,弥补经典头基Tf的不足,提高肿瘤细胞对化疗药物和基因药物的摄取和转染,增强提高T7修饰的双载药纳米递释系统的抗脑胶质瘤活性。本发明选用阿霉素和pORF-hTRAIL联合治疗脑胶质瘤,能有效地减少了阿霉素的给药剂量,减小毒性,并增加了抗脑胶质瘤活性。该给药系统具有靶向和治疗效率高,以及毒副作用小等特点,可以进一步开发应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及载药递释系统,具体涉及一种新型多肽修饰的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统及其制备方法。
背景技术
目前,临床治疗脑胶质瘤最常见的方法是采用化学药物治疗,然而化疗药物在抑制和杀伤肿瘤细胞的同时,对机体内正常细胞同样有杀伤作用,尤其是对增殖较为迅速的正常细胞,如骨髓造血细胞和胃肠道粘膜上皮细胞等。因此,化疗药物的毒副作用成为其提高疗效的主要障碍。近年来,基因治疗由于其低毒性和高选择性而备受关注。研究提示,化学药物与基因药物联合治疗,两药基于不同的机制作用于不同的靶点,有望实现化疗药物在亚毒性剂量水平与无毒的基因药物联合,在降低对正常组织的毒副作用的同时,可能有效地提高对肿瘤细胞的杀伤效果。因此,治疗基因和化疗药物联合给药将可能成为肿瘤治疗取得突破的一个关键手段。
然而,联合用药的发展却受制于多次给药和繁琐的药物系统构建,特别是基因药物和化疗药物联合用药,需要分别构建系统来进行包载药物,再按合适比例组合给药。但是两种单载药系统给药后,很难达到相同的在体内处置,也不能控制病灶部位的药物比例。因此,联合用药成功的一个关键手段就是设计简单高效、高载药量的双载药递释系统,同时递送基因药物和化疗药物,以确保两药在体内的相同分布,从而最大限度地增加两药联合的有效性和可控性。基于这些发现,本申请设想利用脑胶质瘤靶向非病毒载体同时携载基因药物和化疗药物,构建出肿瘤靶向性双载药纳米递释系统用于脑胶质瘤的联合治疗药物。
树枝状高分子是近年来新兴的一类药物递释载体。其中树枝状聚左旋赖氨酸(DGL)是近年来新开发的一种树枝状高分子,该分子除了具备树枝状高分子的共有特性,如双亲性、内部空腔和荷正电性,还易于降解成生物可利用的氨基酸,具有良好的生物相容性。DGL表面氨基丰富,既可修饰靶向头基,又可连载化疗药物,还可以进一步与带负电的基因药物复合,构成靶向性双载药纳米递释系统。研究发现,转铁蛋白(transferrin,Tf)受体在BBB和脑胶质瘤细胞表面都表现为高表达,显著高于正常脑细胞。目前Tf受体的配体Tf作为头基广泛用于构建肿瘤靶向、脑靶向纳米药物递释系统。但是机体的内源性Tf浓度高,竞争抑制Tf修饰的纳米药物递释系统的靶向转运。近年发现的靶向Tf受体的T7肽(HAIYPRH)对Tf受体的亲和性和Tf相当。而T7肽在Tf受体上的结合位点与Tf不同,不会与Tf竞争抑制且不影响Tf本身的生理功能,相反Tf与Tf受体的结合会促进T7肽的入胞效率。同时,T7肽是小分子多肽,具有可化学合成、稳定性好的优点,作为靶向头基空间位阻小,临床应用前景好。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术脑胶质瘤单一药物治疗的不足,提供一种新型靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统。
本发明采用主动靶向策略,利用特定的头基修饰系统,特异性结合特定细胞表面过度表达的受体以达到靶向输送的作用,以减小给药系统对正常组织毒副作用,并提高药物要肿瘤部位的蓄积。
具体而言,本发明的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统使用新型多肽为靶向头基,树枝状高分子材料为基础高分子载体,构建同时载化疗药物与治疗基因的靶向性双载药纳米递释系统。
更具体的,本发明的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统由多肽修饰的树枝状高分子连载化疗药物后,再与治疗基因通过静电作用复合制备而成,该系统以高分子材料、聚乙二醇、多肽、谷氨酸、化疗药物和治疗基因为组分,按下述分子比或质量配比为:
高分子材料与聚乙二醇的分子比是1∶2~1∶10,高分子材料与多肽的分子比是1∶1~1∶5,高分子材料与谷氨酸及化疗药物的分子比是:1∶2∶2~1∶10∶10,高分子材料与治疗基因的质量比是1∶3~1∶6,治疗基因与化疗药物的质量比是1∶300~10∶300。
本发明中,所述高分子材料选用下列高分子:树枝状聚左旋赖氨酸。
本发明中,所述聚乙二醇选自下列高分子:马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺(MAL-PEG3500-NHS)。
本发明中,所述多肽选自噬菌体展示技术筛选出的新型多肽,更有选的多肽(T7),序列为HAIYPRH。
本发明中,所述治疗基因包括编码人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白的基因以及其它所有具有抗肿瘤效果的基因。
本发明中,所述化疗药物选自可以通过pH敏感的腙键连接到载体高分子上的抗肿瘤化疗药物,更有选的化疗药物为阿霉素。
本发明中,肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统适用于靶向人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它肿瘤细胞。
本发明的肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统按下述方法制备:
称取适量的Boc-Glu(OBzl)溶于无水DMF,按照Boc-Glu(OBzl)∶NHS∶EDC∶:EA为1∶1.2∶1.5∶1.5(mol/mol)的比例依次加入NHS、EDC和TEA,氩气保护,0℃搅拌4小时,将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液,取适量于西林瓶中吹干,加无水DMSO复溶后加入到上述反应液中,高分子材料与Glu的比例为1∶2~1∶10,室温搅拌2天,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex HL-20柱进行纯化,制得Glu修饰的高分子材料,该材料溶于DMF,加入过量的水合肼,氩气保护,35℃搅拌2天,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex HL-20柱进行纯化,Glu修饰的高分子材料酰肼化后溶于甲醇,加入适量的盐酸阿霉素和乙酸,,高分子材料与阿霉素的比例为1∶2~1∶10,氩气保护,室温搅拌2天,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex LH-20柱进行纯化,纯水透析三次,每次6小时,最后冻干制得载阿霉素的高分子;称取适量的聚乙二醇溶解到pH值7.8~8.2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液,加入到载阿霉素的高分子材料中,聚乙二醇与高分子材料比例为1∶2~1∶10,一定温度下搅拌反应数小时,再将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里,配制成适当浓度的多肽溶液,加入到高分子-聚乙二醇溶液中,与高分子材料比例1∶1~1∶5,一定温度下反应24h,制得肿瘤靶向性单载药高分子载体,转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)和多肽(T7),pH值7.4的磷酸盐缓冲液复溶;治疗基因溶于50mM硫酸钠溶液,加入到上述磷酸盐中,室温条件下立即涡旋30s,即得肿瘤靶向性双载药纳米递释系统。
本发明中,选用通过噬菌体展示技术筛选出的新型多肽作为靶向头基,可有效避免内源性高浓度Tf的干扰,弥补经典头基Tf的不足,靶向和治疗效率高、制备简捷,并且可以应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。
本发明中,基于肿瘤细胞的旺盛生长伴随着大量酸性代谢产物的形成和外排,从而形成肿瘤酸性微环境;为了使药物到达肿瘤部位后,能有效地从给药系统中释放出来发挥药效,采用pH敏感的化学键连接阿霉素与载体DGL,选用谷氨酸作为linker通过pH敏感的腙键连接化疗药和载体高分子,构建双载药纳米递释系统,该系统靶向性到达肿瘤部位后,可有效地释放出化疗药物,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
本发明中,优选用阿霉素和pORF-hTRAIL构建肿瘤靶向双载药纳米递释系统,能达到协同治疗脑胶质瘤的效果,并有效地减少了阿霉素的给药剂量,减小毒性。
本发明构建的靶向Tf受体的T7肽修饰的脑胶质瘤靶向双载药纳米递释系统,具有血管给药后跨越BBB、进一步富集于胶质瘤部位的双重功能。
本发明的突出优点及特征在于;
利用单一载体同时包载化疗药物和治疗基因制备双载药纳米递释系统,具有协同治疗脑胶质瘤的特点,本发明系统修饰T7肽,可特异性结合BBB和脑胶质瘤细胞表面高表达的Tf受体,提高给药系统在脑胶质瘤部位的靶向性蓄积;
本发明的另一优点是在高分子载体与化疗药物之间设计pH敏感的腙键,使药物到达肿瘤部位后能够进行特异性释放,从而联合基因药物,发挥脑胶质瘤治疗效率。
附图说明
图1是DGL-Glu(A)与DGL-Glu-NHNH2(B)的氢谱。
图2A:凝胶电泳考察载体对基因药物的包封效果。M:DNA Marker;C:裸pDNA;1:DGLs/DNA,0.05:1(w/w);2:DGLs/DNA,0.1:1(w/w);3:DGLs/DNA,0.5:1(w/w);4:DGLs/DNA,1:1(w/w);5:DGLs/DNA,3:1(w/w);6:DGLs/DNA,6:1(w/w);7:DGLs/DNA,10:1(w/w);8:DGLs/DNA,15:1(w/w)。
图3是靶向性双载药纳米递释系统的粒径分布(A)和透射电镜结果(B)。
图4是单载药载体系统DGDPT(A)和双载药纳米递释系统DGDPT/pORF-hTRAIL(B)在PBS 5.0、6.0和7.4中阿霉素的体外释放。图中所给出数值为mean±SE (n=3)。***P<0.001。
图5DGDP/pORF-hTRAIL、DGDPT/pORF-hTRAIL、DGDP/pORF-hTRAIL(Tf,25μM)和DGDPT/pORF-hTRAIL(Tf,25μM)与U87细胞孵育30min后的细胞摄取情况。A、E和I:DGDP/pORF-hTRAIL;B、F和J:DGDPT/pORF-hTRAIL;C、G和K:DGDP/pORF-hTRAIL(Tf,25μM);D、H和L:DGDPT/pORF-hTRAIL(Tf,25μM)。绿色表示荧光探针(YOYO-1)标记的基因,红色表示阿霉素。I-L:红色信号和绿色信号的叠加。
图6是DGDP/pORF-hTRAIL和DGDPT/pORF-hTRAIL在4℃和37℃下的细胞摄取。A、E和I:DGDP/pORF-hTRAIL(4℃),B、F和J:DGDPT/pORF-hTRAIL(4℃),C、G和K:DGDP/pORF-hTRAIL(37℃),D、H和L:DGDPT/pORF-hTRAIL(37℃)。各组均共同孵育Tf(25μM)。绿色表示荧光探针(YOYO-1)标记的基因,红色表示阿霉素。I-L:红色信号和绿色信号的叠加。
图7荧光显微镜观察DGP/pEGFP-N2(A和C)、DGPT/pEGFP-N2(B和D)和Lipofectamine 2000/pEGFP-N2(E)在U87细胞中基因表达情况。C和D组加入Tf(25μM)共孵育。绿色为报告基因产物绿荧光蛋白。
图8是MTT法考察单载药系统(DGDPT/pGL-3,DGPT/pORF-hTRAIL)与双载药系统(DGDPT/pORF-hTRAIL)体外抑制U87细胞活性效率。pGL-3为阴性对照基因。
图9是TUNEL检测U87细胞的体外凋亡。A:DGPT/pORF-hTRAIL;B:DGDPT/pGL3;C:DGDPT/pORF-hTRAIL;D:DGPT/pORF-hTRAIL(Tf,25μM);E:DGDPT/pGL3(Tf,25μM);F:DGDPT/pORF-hTRAIL(Tf,25μM)。绿色表示FITC标记的凋亡细胞。
图10是非靶向双载药纳米递释系统DGDP/pORF-hTRAIL和靶向性双载药纳米递释系统DGDPT/pORF-hTRAIL在原位脑胶质瘤裸鼠模型上的体内分布。DGDP/pORF-hTRAIL和DGDPT/pORF-hTRAIL纳米粒均用NIR783标记。裸鼠经尾静脉给药1h(A)、2h(B)、3h(C)和4h(D)采用荧光活体成像系统拍照。4h后将裸鼠处死,大脑取出,采用荧光活体成像系统拍照(D),然后将大脑沿肿瘤部位横向切开并拍照(E)。
图11是TUNEL试剂盒检测原位脑胶质瘤细胞的凋亡。深褐色表示凋亡的细胞。虚线表示肿瘤边界。A:生理盐水;B:DGDPT/pGL-3;C:DGDP/pORF-hTRAIL;D:游离阿霉素;E:DGPT/pORF-hTRAIL;F:DGDPT/pORF-hTRAIL。
图12是原位脑胶质瘤裸鼠给药后的生存曲线(A)以及体重变化(B)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。给药系统的剂量是每次8μgDOX/鼠,或50μgDNA/鼠,市售组盐酸阿霉素剂量为5mg/kg;各给药系统给药3次,分别是第12、15和18天。
具体实施方式
实施例1.
称取1mg的Boc-Glu(OBzl)溶于1ml无水DMF,按照Boc-Glu(OBzl):NHS:EDC::EA为1:1.2:1.5:1.5(mol/mol)的比例依次加入NHS、EDC和TEA,氩气保护,0℃搅拌4小时。32.6mg DGL(10mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干,加1ml无水DMSO复溶后加入到上述反应液中,室温搅拌2天,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex HL-20柱进行纯化,制得DGL-Glu并进行核磁共振氢谱表征。
实施例2.
20mg DGL-Glu溶于2ml DMF,加入200μl的水合肼,氩气保护,35℃搅拌2天。反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex HL-20柱进行纯化。制得DGL-Glu-NHNH2并进行核磁共振氢谱表征。
实施例3.
14mg DGL-Glu-NHNH2溶于2ml甲醇,加入7.5mg盐酸阿霉素和200μl乙酸,氩气保护,室温搅拌2天,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex LH-20柱进行纯化。纯水透析三次,每次6小时,最后冻干制得DGL-Glu-DOX(DGD)。紫外分光光度计在480nm检测DGD中DOX的量。
实施例4.
取6mg DGD于西林瓶中,加入3.82mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS,1mg/ml 0.035M pH 8.0磷酸盐溶液),二者摩尔比例为1:2,于室温搅拌反应2h,NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应。MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500),制得PEG-DGL-Glu-DOX(DGDP)。
实施例5.
取6mg DGD于西林瓶中,加入3.82mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS,1mg/ml 0.035M pH 8.0磷酸盐溶液),二者摩尔比例为1∶2,于室温搅拌反应2h,NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应。MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500),制得PEG-DGL-Glu-DOX(DGDP)。pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶,加入0.27mg多肽(T7,2mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液),室温搅拌反应24h,MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应。MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的多肽(T7),制得T7-PEG-DGL-Glu-DOX(DGDPT)。
实施例6.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成100μg/ml,取DGDPT 0.4mg溶于400μl等渗PBS7.4中,pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT磷酸盐缓冲液以不同的比例混合(WDGL/WDNA,0.05∶1~15∶1),立即涡旋30s。称取0.14g琼脂糖于三角烧瓶中,加入电泳液1×TAE,加入10μl 500ug/ml溴乙啶,微波加热至沸,使琼脂糖完全溶解,室温放置约50度,倒入电泳槽中,置入梳子,冷凝成凝胶。将各组样品加入至凝胶中,开启电源,电压为100V,约25min停止,凝胶电泳观察不同比例的DGDPT/pORF-hTRAIL复合物中DNA的包封情况。
实施例7.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成100μg/ml,取DGDPT溶于等渗PBS7.4中(DGL,300μg/ml),pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s。粒度/zeta电位测定仪测定纳米粒的光散射粒径和zeta电位值。
实施例8.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成25μg/ml,取DGDPT溶于等渗PBS7.4中(DGL,25μg/ml),pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s。透射电镜下观察纳米粒的粒径和形态。
实施例9.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成500μg/ml,取DGDPT溶于等渗PBS7.4中(DGL,1.5mg/ml),pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s,制得DGDPT/pORF-hTRAIL双载药纳米粒。取DGDPT溶于等渗PBS7.4中(DGL,0.75mg/ml),制得单载药载体系统。取1ml DGDPT/pORF-hTRAI纳米粒于透析袋(MWCO 3500)中,并立即扎紧,分别置于40ml pH值为7.4、6.0和5.0的磷酸盐缓冲液中。取1ml DGDPT单载药载体系统于透析袋(MWCO 3500)中,并立即扎紧,分别置于装有40ml pH值为7.4、6.0和5.0磷酸盐缓冲液的碘量瓶中,将碘量瓶置于37℃摇床中,120r。于不同时间点取样,荧光分光光度计537nm激发,584nm发射测定不同时间阿霉素的释放情况。
实施例10.
人恶性胶质瘤U87细胞培养在DMEM培养基里,添加10%热灭活胎牛血清,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素,在37度5%二氧化碳的条件下培养。
实施例11.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)60μg,加9μl YOYO-1(0.1μg/μl),立即涡旋30s,避光静置8min,然后用50mM硫酸钠溶液中稀释成50μg/ml。各取DGDP和DGDPT 250μg于等渗PBS7.4中,制得浓度为150μg/ml。pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGDP)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),制得YOYO-1荧光标记的非靶向双载药纳米递释系统DGDP/pORF-hTRAIL和靶向性双载药纳米递释系统DGDPT/pORF-hTRAIL。U87细胞以5×104每孔的密度接种于24孔板上,48h后达到合适密度,给予上述荧光标记的双载药纳米递释系统孵育30min,以及双载药纳米递释系统与Tf的混合物(Tf,25μM)与细胞共孵育30min,每孔5μg DNA,用hanks液替换掉药液,荧光显微镜下观察各组治疗基因和阿霉素的摄取情况。
实施例12.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)60μg,加9μl YOYO-1(0.1μg/μl),立即涡旋30s,避光静置8min,然后用50mM硫酸钠溶液中稀释成50μg/ml。各取DGDP和DGDPT 250μg于等渗PBS7.4中,制得浓度为150μg/ml。pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGDP)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),制得YOYO-1荧光标记的非靶向双载药纳米递释系统DGDP/pORF-hTRAIL和靶向性双载药纳米递释系统DGDPT/pORF-hTRAIL。U87细胞以5×104每孔的密度接种于24孔板上,48h后达到合适密度,给予上述荧光标记的双载药纳米递释系统与Tf的混合物(Tf,25μM),每孔5μg DNA,分别在4℃和37℃与细胞共孵育30min,用hanks液替换掉药液,荧光显微镜下观察各组治疗基因和阿霉素的摄取情况。
实施例13.
取基因(pEGFP-N2,3.51mg/ml)50μg,加7.5μl YOYO-1(0.1μg/μl),立即涡旋30s,避光静置8min,然后用50mM硫酸钠溶液中稀释成50μg/ml。各取DGDP和DGDPT 150μg于等渗PBS7.4中,制得浓度为150μg/ml。pEGFP-N2的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGDP)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),制得YOYO-1荧光标记的非靶向纳米递释系统DGDP/pEGFP-N2和靶向性纳米递释系统DGDPT/pEGFP-N2。U87细胞以4×104每孔的密度接种于24孔板上,48h后达到合适密度,给予上述荧光标记的双载药纳米递释系统孵育2h,以及双载药纳米递释系统与Tf的混合物(Tf,25μM)与细胞共孵育2h,每孔5μgDNA。2h后用hanks洗去药液,加培养基继续孵育48h,荧光显微镜下观察各组绿荧光蛋白的表达情况。
实施例14.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)与对照基因(pGL-3,2.88mg/ml)分别溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成733μg/ml。取DGDPT(或DGPT)溶于等渗PBS7.4中(DGL,2.2mg/ml),pORF-hTRAIL(或pGL-3)的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGPT)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s。制得靶向性单载药纳米递释系统(DGPT/pORF-hTRAIL和DGDPT/pGL-3)和靶向性双载药纳米递释系统(DGDPT/pORF-hTRAIL)。单双药纳米递释系统均按DOX浓度0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10和100μg/ml(或按pORF-hTRAIL的浓度0.00003、0.0003、0.0033、0.033、0.166、0.33、1.66、3.33和33.3μg/ml)稀释成不同浓度。U87细胞以5000每孔的密度接种于96孔板上,48h后达到合适密度,依次加入不同浓度的各组纳米粒溶液。37℃孵育2h后,弃去药液,Hank’s液洗3次,重新加入DMEM继续孵育48h。每孔加入MTT 10μl(5μg/μl),37℃,5%CO2继续孵育2h,去除所有培养液。-80℃冻存超过0.5h,取出后放至室温,每孔加入DMSO100μl。培养板室温下置于振荡器上400rpm振荡30min,使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值(检测波长为570nm,校正波长为630nm)。以空白溶液作对照。每个样品做4个复孔。通过联合指数分析评价治疗基因(pORF-hTRAIL)和阿霉素之间是否存在协同抑瘤效果。
实施例15.
取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)与对照基因(pGL-3,2.88mg/ml)分别溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成50μg/ml。取DGDPT(或DGPT)溶于等渗PBS7.4中(DGL,150μg/ml),pORF-hTRAIL(或pGL-3)的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGPT)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s。制得靶向性单载药纳米递释系统(DGPT/pORF-hTRAIL和DGDPT/pGL-3)和靶向性双载药纳米递释系统(DGDPT/pORF-hTRAIL)。U87细胞以4×104每孔的密度接种于24孔板上,48h后达到合适密度,分别加入DGDPT/pGL-3,DGPT/pORF-hTRAIL,DGDPT/pORF-hTRAIL,DGDPT/pGL-3+Tf,DGPT/pORF-hTRAIL+Tf,DGDPT/pORF-hTRAIL+Tf,各组中DOX浓度为4μg/ml,pORF-hTRAIL浓度为25μg/ml,Tf浓度为25μM。给药后孵育24h。弃去药液,Hank’s液洗3次,4%的多聚甲醛室温固定20min,PBS漂洗三次,然后进入封闭液室温封闭10min,PBS漂洗三次,浸入通透液冰上孵育8min,PBS漂洗三次。每个样本滴加50μL新鲜配制的TdT酶反应液,加盖玻片37℃避光湿润反应60min。PBS漂洗三次。荧光显微镜下观察:激发波长450-500nm,发射波长515-565nm。
实施例16.
构建原位脑胶质瘤裸鼠模型,采用4周大的雄性裸鼠,体重在16~18g,培养于SPF级环境,裸鼠腹腔注射5ml/kg 10%水合氯醛麻醉,内眦连线与头部矢状中线交汇处纵向1cm长头皮切口,钝性分离暴露颅骨。于前囟旁开1.8mm处颅骨钻孔。10μl微量注射器吸入5μl上述细胞悬液(含50万U87细胞),固定于立体定位仪上,沿钻孔垂直进针深4mm,退针1mm(距硬脑膜,即大脑纹状体区),缓慢注射U87细胞悬液,驻针5min后缓慢拔针,术野以生理盐水清洗,切口用手术缝线缝合打结。
实施例17.
取2mg DGD,加入近红外荧光探针NIR783(MW 900,0.31mg),使DGL与荧光探针的摩尔比为1∶5,在0.1MpH值为8.3的HEPES缓冲液中室温反应1h,MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤15min去除未反应的NIR783,制得荧光标记的DGD;加入0.64mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS,1mg/ml0.035M pH 8.0磷酸盐溶液),DGL与PEG摩尔比例为1∶2,于室温搅拌反应2h,NHS基团与DGL表面的氨基特异性的反应,MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG,制得近红外荧光探针NIR783标记的DGDP。取一半的DGDP用pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶,加入45μg多肽(T7,2mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液),与DGL摩尔比例为1∶1,室温搅拌反应24h,MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应,MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的T7,制得近红外荧光探针NIR783标记的DGDPT。NIR783标记的DGDPT(或DGDP)用等渗PBS7.4稀释成3mg/ml(DGL),取基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成1mg/ml。pORF-hTRAIL的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGDP)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s,制得NIR783标记的非靶向双载药递释系统DGDP/pORF-hTRAIL和靶向性双载药递释系统DGDPT/pORF-hTRAIL。裸鼠脑胶质瘤模型建立后第20天,尾静脉注射NIR783标记的DGDP/pORF-hTRAIL或DGDPT/pORF-hTRAIL纳米粒,注射剂量为50μgDNA。裸鼠腹腔注射5ml/kg 10%水合氯醛麻醉,分别在给药后1h、2h、3h和4h进行荧光成像仪活体观察。4h后处死,取脑,荧光成像仪观察。然后大脑沿肿瘤部位横向切开,荧光成像仪观察拍照。
实施例18.
DGDPT、DGDP和DGPT分别用等渗PBS7.4稀释成3mg/ml(DGL);取治疗基因(pORF-hTRAIL,3.35mg/ml)与对照基因(pGL-3,2.88mg/ml)分别溶解在50mM硫酸钠溶液中,稀释成1mg/ml。基因pORF-hTRAIL或pGL-3)的硫酸钠溶液与DGDPT(或DGDP、DGPT)磷酸盐缓冲液等体积混合(WDGL/WDNA,3∶1),立即涡旋30s,分别制得DGDPT/pORF-hTRAIL、DGDP/pORF-hTRAIL、DGPT/pORF-hTRAIL和DGDPT/pGL-3。在裸鼠脑胶质瘤模型建立后第12、15、18天尾静脉注射给药,每次注射含50μgDNA或8μg DOX的纳米粒(纳米粒中DGL与DNA的质量比为3∶1),或同等体积的生理盐水;游离阿霉素组按照5mg/kg进行尾静脉给药。于给药结束后第3天(即脑胶质瘤模型建立后第21天)麻醉后,灌流,取出大脑,并制备胶质瘤部位的冠状冰冻切片,切片厚度15μm。使用TUNEL原位凋亡试剂盒标记凋亡的细胞,操作如下:冰冻切片浸入固定液,室温固定10min,PBS漂洗3次;浸入封闭液中,室温封闭10min,PBS漂洗3次;浸入通透液中,室温1min,PBS漂洗3次,漂洗完成后用滤纸轻轻吸取样本周围液体;每个样品滴加100μl TdT酶反应液,于37℃避光反应60min;用去离子水按1∶10稀释20×SSC,每个样品滴加100μl进行终止反应,室温反应15min,PBS漂洗3次;浸入封闭液中封闭内源性过氧化物酶活性,室温孵育5min,PBS漂洗3次,每次5min;滴加100μlStreptavidin-HRP工作液(按1:500稀释为工作液),37℃反应60min,PBS漂洗3次;滴加100μl DAB显色液(含5μl 20×DAB Substrate Buffer,5μl 20×DABChromogen,5μl 20×Hydrogen Peroxide,85μl dd H2O),室温反应至呈浅棕色背景;去离子水漂洗3次;苏木素复染细胞核,显微镜下观察。
实施例19.
DGDPT/pORF-hTRAIL、DGDP/pORF-hTRAIL、DGPT/pORF-hTRAIL、DGDPT/pGL-3、DOX和生理盐水按照上述给药方案进行给药。每组12只裸鼠。记录每只裸鼠的存活时间和体重变化。
上述实验结果显示:本发明利用单一载体同时包载化疗药物和治疗基因制备双载药纳米递释系统,具有协同治疗脑胶质瘤的特点,本发明系统修饰T7肽,可特异性结合BBB和脑胶质瘤细胞表面高表达的Tf受体,提高给药系统在脑胶质瘤部位的靶向性蓄积;本发明中,在高分子载体与化疗药物之间设计pH敏感的腙键,使药物到达肿瘤部位后能够进行特异性释放,从而联合基因药物,发挥良好地脑胶质瘤治疗效率。
Claims (9)
1.一种靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,由多肽修饰的树枝状高分子连载化疗药物后,再与治疗基因通过静电作用复合制备而成,该系统以高分子材料、聚乙二醇、多肽、谷氨酸、化疗药物和治疗基因为组分,按下述分子比或质量配比为:
高分子材料与聚乙二醇的分子比是1∶2~1∶10,高分子材料与多肽的分子比是1∶1~1∶5,高分子材料与谷氨酸及化疗药物的分子比是:1∶2∶2~1∶10∶10,高分子材料与治疗基因的质量比是1∶3~1∶6,治疗基因与化疗药物的质量比是1∶300~10∶300。
2.按权利要求1所述的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,所述高分子材料选用树枝状聚左旋赖氨酸。
3.按权利要求1所述的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,所述聚乙二醇选自马来酰亚胺—聚乙二醇3500—琥珀酰亚胺(MAL-PEG3500-NHS)。
4.按权利要求1所述的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,所述多肽是多肽(T7),序列为HAIYPRH。
5.按权利要求1所述的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,所述治疗基因包括编码人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白的基因以及其它所有具有抗肿瘤效果的基因。
6.按权利要求1所述的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,,所述化疗药物选自可以通过pH敏感的腙键连接到载体高分子上的抗肿瘤化疗药物。
7.按权利要求6所述的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统,其特征在于,所述化疗药物为阿霉素。
8.权利要求1的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统在制备靶向人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它肿瘤细胞药物中的用途。
9.权利要求1的靶向脑胶质瘤双载药纳米递释系统的制备方法,其特征在于,其包括步骤:
称取适量的Boc-Glu(OBzl)溶于无水DMF,按Boc-Glu(OBzl):NHS:EDC::EA为1:1.2:1.5:1.5(mol/mol)的比例依次加入NHS、EDC和TEA,氩气保护,0℃搅拌4小时,将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配成储备液;
取适量于西林瓶中吹干,加无水DMSO复溶后加入到上述反应液中,高分子材料与Glu的比例为1∶2~1∶10,室温搅拌,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex HL-20柱纯化,制得Glu修饰的高分子材料;
所制得材料溶于DMF,加入过量的水合肼,氩气保护,35℃搅拌,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex HL-20柱纯化,Glu修饰的高分子材料酰肼化后溶于甲醇,加入适量的盐酸阿霉素和乙酸,高分子材料与阿霉素的比例为1∶2~1∶10,氩气保护,室温搅拌,反应混合物以甲醇为洗脱液,过Sephadex LH-20柱纯化,纯水透析,冻干制得载阿霉素的高分子;
称取适量的聚乙二醇溶解到pH值7.8~8.2的磷酸盐缓冲液中配制溶液,加入到载阿霉素的高分子材料中,聚乙二醇与高分子材料比例为1∶2~1∶10,搅拌反应,再将多肽溶于磷酸盐缓冲液,配制成多肽溶液,加入到高分子—聚乙二醇溶液中,与高分子材料比例1∶1~1∶5,反应24h,制得肿瘤靶向性单载药高分子载体;
制得的载药高分子载体转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)和多肽(T7),pH值7.4的磷酸盐缓冲液复溶;
治疗基因溶于50mM硫酸钠溶液,加入到上述磷酸盐中,室温条件下涡旋30s,制得肿瘤靶向性双载药纳米递释系统。
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Cited By (3)
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BANERJEE SS,ET AL: "Multifunctional pH-sensitive magnetic nanoparticles for simultaneous imaging, sensing and targeted intracellular anticancer drug delivery", 《NANOTECHNOLOGY》 * |
FRANK AE.: "TRAIL and cancer therapy", 《CANCER LETT》 * |
KONO K,ET AL: "Preparation and cytotoxic activity of poly(ethylene glycol)-modified poly(amidoamine) dendrimers bearing adriamycin", 《BIOMATERIALS》 * |
SHUHUAN LIU,ET AL: "Gene and doxorubicin co-delivery system for targeting therapy of glioma", 《BIOMATERIALS》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103860468A (zh) * | 2014-02-12 | 2014-06-18 | 南京医科大学 | 一种t7肽修饰的zl006长循环脂质体及其制备方法 |
CN108126199A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-08 | 青岛大学 | 一种可降解双响应智能高分子/硫化钼药物载体的制备方法 |
CN116041531A (zh) * | 2022-05-31 | 2023-05-02 | 山东大学 | 一种脑靶向抗血管生成多肽及其纳米胶束材料 |
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