CN116041531A - 一种脑靶向抗血管生成多肽及其纳米胶束材料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脑靶向抗血管生成多肽及其纳米胶束材料。针对现有多肽活性药物缺乏靶向穿透血脑屏障及半衰期较短的技术问题，本发明首先提供了一种HT12和T7融合的功能多肽HH19，该多肽HH19表现出良好的抗血管新生及脑靶向功能。为了增加上述功能多肽HH19的纳米胶束材料，将Nap‑Br与多肽CPHH通过硫醚键进行连接得到肽两亲物，该肽两亲物可在水溶液中自组装成纳米胶束，具有较强的脑靶向性、血脑屏障穿透性和肿瘤血管靶向性，应用于脑胶质瘤的治疗具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于脑靶向纳米制剂技术领域，具体涉及一种脑靶向抗血管生成多肽、所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料及制备方法及所述多肽及纳米胶束材料在脑胶质瘤治疗领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脑胶质瘤是起源于神经胶质细胞的原发性脑肿瘤之一，具有复发率高、死亡率高以及治愈率低的特点。目前，脑胶质瘤的常用治疗策略主要包括手术切除、放射治疗和化学药物疗法，但这些治疗手段都有其缺点。由于肿瘤细胞浸润入正常脑组织中，手术切除难以完全，且术后易复发；放射治疗受本身有效性和放射性损伤的限制；由于血脑屏障(bloodbrain barrier,BBB)的存在，大部分化疗药无法在瘤区达到有效的治疗浓度，致使它们均未能很好地提高患者的生存期。脑胶质瘤部位可高表达促血管生长因子及相关受体，进而促进新生血管的大量生成，为脑胶质瘤的生长提供营养物质。血管内皮细胞增殖和高度血管化已经成为了恶性胶质瘤的主要的生理组织特征之一。靶向和阻断促血管生成通路的多肽类药物由于其较好的生物相容性以及对正常组织和细胞较低的毒性而受到研究者的关注。然而，多肽通常表现出较短的循环半衰期以及被血脑屏障(blood brain barrier,BBB)所阻碍，使它们在脑胶质瘤的治疗中受到限制。目前，化学修饰是提高多肽类药物稳定性的常用策略。多肽进行脂质化如采用脂肪酸、胆固醇、萘环等疏水基团对其进行修饰是多肽最常用的化学修饰方法，主要是通过该种修饰稳定其结构、增加其半衰期，同时由于用疏水基团修饰多肽可使修饰物成为两亲性分子，在水溶液体系中可自聚形成纳米胶束，更能赋予多肽新的特性如体内不易被酶降解、易于通过生物膜等。此外，基于血脑屏障(blood brainbarrier,BBB)高表达的转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)，利用TfR的靶向肽HAIYPRH介导内吞的作用实现血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的穿透，到达脑组织。
实体肿瘤的生长总是伴随着毛细血管的新生，这种新的毛细血管的生长甚至比在新伤口或炎症中观察到的毛细血管芽的生长更加活跃。然而，在没有新生血管形成的情况下，大多数实体肿瘤生长至厚度为2-3mm时，如果肿瘤细胞缺乏血液供应将导致肿瘤细胞停止生长，并进入休眠状态。此时，肿瘤细胞处在缺氧环境中，缺氧诱导因子(hypoxiainducible factor,HIF)的表达就会刺激肿瘤细胞表达血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)等生长因子，这些生长因子会与构成血管的内皮细胞中表达的受体结合，触发一系列细胞内反应，以刺激内皮细胞的迁移、增殖和分化。目前，靶向涉及VEGF的细胞信号转导途径一直是开发抗血管生成药物的主要策略之一。VEGF至少有四种亚型(A，B，C和D)，其中VEGFA是诱导血管生成的关键血管生成因子。VEGF主要的相关受体是VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGFR-2是一种蛋白酪氨酸激酶受体，其在胶质瘤新生血管部位高表达，当它被VEGF165刺激后，能促进血管生成。因此，VEGFR-2可作为肿瘤新生血管及肿瘤血管的重要靶标。
发明内容
为解决多肽缺乏靶向穿透BBB的问题，本发明提供了一种多功能HH19多肽(SEQ IDNO.1)，其包含氨基酸序列HTMYYHHYQHHL(SEQ ID NO.3)和氨基酸序列HAIYPRH(SEQ IDNO.4)。HH19多肽具备脑靶向穿透血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的能力，通过转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)介导的内吞作用实现脑内的运输，又能与血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)有更强的靶向结合能力，抑制内皮细胞的增殖、迁移、血管生成等活性。
HTMYYHHYQHHL(HT12)是从噬菌体展示库中筛选出来的一种小肽，能够靶向于VEGFR-2受体高表达的新生血管及肿瘤等部位。但是HT12对BBB的穿透性较弱，阻碍了其对脑部肿瘤及新生血管的靶向治疗作用的发挥。
HAIYPRH(T7)是从噬菌体展示库中筛选出来的一种小肽，它是TfR的配体。TfR是一种跨膜糖蛋白，由两个90kD的亚基组成，通过分子间二硫键连接，每个亚基与一个Tf分子结合。TfR在脑内皮细胞(brain endothelial cells,BEC)和肿瘤细胞中高度表达，用以介导铁向大脑的运输。T7作为TfR的配体，可通过TfR介导的内吞作用实现脑内的运输，具备脑靶向穿透BBB的能力。
本发明将HT12与T7共价连接构建了一种新型多功能多肽HTMYYHHYQHHLHAIYPRH(即HH19)。经本发明验证，上述功能多肽对细胞增殖、迁移和管状结构形成能力的抑制效果超过单独HT12、单独T7以及HT12和T7的混合，对脑血管内皮细胞具有更好的亲和性。
多肽类药物由于其自身易被蛋白酶水解使其半衰期较短的问题，限制了其在临床上更广泛地应用与发展。目前，化学修饰是提高多肽类药物稳定性的常用策略。多肽进行脂质化如采用脂肪酸、胆固醇、萘环等疏水基团对其进行修饰是多肽最常用的化学修饰方法，主要是通过该种修饰稳定其结构、增加其半衰期，同时由于用疏水基团修饰多肽可使修饰物成为两亲性分子，在水溶液体系中可自聚形成纳米胶束，更能赋予多肽新的特性如体内不易被酶降解、易于通过生物膜等。
因此，本发明第二方面，提供了上述HH19多肽构建的脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)材料及其制备方法。
由于考虑到在融合后的肽到达肿瘤后受肿瘤环境高表达的MMP-2水解释放出完整的多肽HH19以发挥其作用，设计将MMP-2酶切肽CPLGVRK连接在HH19的N-端，形成的融合肽CPHH(SEQ ID NO.2)。期望构建的纳米胶束在到达胶质瘤部位后可通过在肿瘤微环境高表达的MMP-2下特异性裂解、释放出活性肽段，发挥抗肿瘤作用，达到主动靶向的目的。进行修饰时CPHH的半胱氨酸的巯基与疏水基团的相应基团连接。
经测定，本发明提供的脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的粒径约为158.4±1.76nm，PDI为0.134±0.04，zeta电位为11.5±0.14mV，透射电子显微镜下纳米胶束均呈现分散性良好、大小均一的球型结构。
另外，本发明还提供上述脑靶向抗血管生成多肽HH19及纳米胶束材料在脑胶质瘤治疗方面的应用。
在体外实验中，脑靶向抗血管生成肽纳米胶束具有更强的抑制内皮增殖、迁移、侵袭及管状结构形成的能力。在体内实验中，脑靶向抗血管生成肽纳米胶束具有更强的脑靶向和穿透BBB的能力。同时，脑靶向抗血管生成肽纳米胶束在体内能够通过有效地抑制肿瘤血管生成，从而起到抗脑胶质瘤生长的作用。本发明提供的脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束解决了多肽较短的循环半衰期以及被BBB所阻碍的问题，为临床上脑胶质瘤的抗血管生成治疗提供一种有前景的治疗策略。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
与现有技术相比，将具有抗血管生成活性的VEGFR2靶向肽HT12与TfR靶向肽T7共价连接形成一种新的抗血管生成肽HH19，该HH19不仅具备更强地抑制内皮细胞增殖、迁移、管状结构形成的作用，且具有较好的脑靶向穿透性。
构建了一种脑主动靶向抗血管生成肽纳米胶束N-CPHH，与现有技术相比，多肽具有良好的生物可降解性和生物相容性，能够赋予材料独特的生物学功能，易于合成和化学修饰也是多肽分子的突出优势。其中，双亲肽既含有疏水基团，又含有亲水基团，疏水基团通过疏水作用形成疏水性内核，可包裹疏水性材料，在水中自组装成稳定的胶束。脑主动靶向抗血管生成肽纳米胶束N-CPHH具有较强的脑靶向性、BBB穿透性和肿瘤血管靶向性，并能够通过抑制肿瘤血管生成作用达到抗脑胶质瘤的生长，为临床上脑胶质瘤的抗血管生成治疗提供一种有前景的治疗策略。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为五种抗血管生成肽的体外抗血管生成活性评价与筛选；
图1A.使用MTT法检测WHLPFKC(WH7)、NLLMAAS(NL7)、RLYE、HT12和LHHQYHHYYMTH(LH12)对HUVECs增殖的影响；
图1B.使用划痕实验检测WH7、NL7、RLYE、HT12和LH12对HUVECs迁移的影响；
图1C.考察WH7、NL7、RLYE、HT12和LH12对HUVECs管状结构形成的影响。
图1D.考察NLLMAASHAIYPRH(NH14)、HQYHHYYMTHLHHAIYPRH(LH19)和HH19对HUVECs增殖的影响。
图2为实施例1中HH19对人脐静脉内皮细胞HUVECs增殖的影响(与HT12比较,***p<0.001)。
图3为实施例1中HH19对人脐静脉内皮细胞HUVECs迁移的影响(与HT12比较,**p<0.01，***p<0.001)。
图4为实施例1中HH19对人脐静脉内皮细胞HUVECs管状结构形成的影响(与HT12比较,***p<0.001)。
图5为实施例2中高速转盘共聚焦显微镜检测脑微血管内皮细胞(bEnd.3)和HUVECs对HH19的摄取情；
图5A.高速转盘共聚焦显微镜拍摄bEnd.3细胞对HH19的摄取情况；
图5B.高速转盘共聚焦显微镜拍摄HUVECs对HH19的摄取情况。
图6为实施例2中流式细胞术测定bEnd.3细胞和HUVECs对HH19的摄取情况；
图6A.流式细胞技术定量测定bEnd.3细胞对HH19的摄取情况；
图6B.流式细胞技术定量测定HUVECs对HH19的摄取情况(与FITC-HT12比较，***p<0.001；与FITC-T7比较，###p<0.001；与FITC-HH19+T7比较，&p<0.05，&&&p<0.001)。
图7为实施例3中中间产物Nap-Br的1H-NMR结果图。
图8为实施例3中肽两亲物N-CPHH的1H-NMR结果图。
图9为实施例3中肽两亲物N-CPHH的MALDI-TOF-MS结果图。
图10为实施例4中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的粒径分布图和透射电镜图。
图11为实施例5中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对人脐静脉内皮细胞HUVECs增殖的影响(与HH19比较，**p<0.01，***p<0.001；与N-CPHH比较，##p<0.01)。
图12为实施例5中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对人脐静脉内皮细胞HUVECs迁移的影响(与HH19比较，**p<0.01，***p<0.001；与N-CPHH比较，##p<0.01)。
图13为实施例5中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对人脐静脉内皮细胞HUVECs侵袭的影响(与HH19比较，***p<0.001；与N-CPHH比较，#p<0.05)。
图14为实施例5中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对人脐静脉内皮细胞HUVECs管状结构形成的影响(与HH19比较，***p<0.001；与N-CPHH比较，###p<0.001)。
图15为实施例6中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的在裸鼠脑原位胶质瘤组织内的分布。
图16为实施例7中脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的体内抗裸鼠原位脑胶质瘤药效学研究；
图16A为在不同的时间点检测的裸鼠脑原位胶质瘤生物发光照片；
图16B为裸鼠脑原位胶质瘤生物发光强度随时间变化统计折线图(与对照组比较，**p<0.01)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明第一方面，提供一种脑靶向抗血管生成多肽，所述多肽为下列情形中的一种：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽；
(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO.1所示多肽具有相同或基本相同的功能；
(3)对(1)或(2)中所述多肽进行化学或遗传修饰后的衍生多肽。
上述(1)方面提供的氨基酸序列，是一种活性小肽HT12(SEQ ID NO.3所示)与跨膜肽T7(SEQ ID NO.4所示)的融合多肽，称为HH19；将跨膜肽T7部分替换为其他具有脑靶向穿透能力的跨膜肽或对HH19进行少量氨基酸的增加或替换，也有望发挥与HH19相似的生理活性。因此，上述(2)方面中，所述衍生多肽的序列与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列应当具有90％及以上的相似性；进一步的，所述相似性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；所述氨基酸序列的相似性可采用本领域常用方式进行比对，例如Blast方法。
本发明进一步的方案中，将MMP-2酶切肽CPLGVRK连接在HH19的N-端，得到SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的多肽，即CPHH。
上述第(3)方面中，所述化学或遗传修饰物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、链霉亲和素、各种分子(例如生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂等)。
优选的，上述第一方面所述脑靶向抗血管生成多肽还包括所述多肽的制剂形式，或固定化产品，包括但不限于采用物理吸附剂、载体、交联试剂等形式对脑靶向抗血管生成多肽进行封锁或固定的产品。
本发明第二方面，提供第一方面所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料，所述纳米胶束材料具有如下式Ⅰ所示的结构：
上述式Ⅰ所示的纳米胶束材料(N-CPHH)，分子量为3536.667。
本发明第三方面，提供第二方面所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料的制备方法，包括以下步骤：2-(1-羟乙基)-6-甲氧基萘(Nap-OH)与溴乙酸通过酯基连接形成中间产物(Nap-Br)，再与SEQ ID NO.2所示序列的多肽通过硫醚键进行连接得到肽两亲物(N-CPHH)，后者可在水溶液中自组装形成纳米胶束；所述中间产物的结构如下式Ⅱ所示：
优选的，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)将Nap-OH与溴乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCI)和4-二甲氧基吡啶(DMAP)溶于5mL二氯甲烷中，冰浴反应一段时间后室温条件下继续进行反应；反应结束后对反应产物进行洗涤、干燥并通过柱层析纯化，得到Nap-Br；
(2)将Nap-Br与SEQ ID NO.2所示序列的多肽溶于DMSO中，滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)室温反应一段时间，反应结束后对反应产物进行分离纯化得到所述肽两亲物；
(3)将所述肽两亲物分散至水中，搅拌均匀后超声处理，得到所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料。
优选的，步骤(1)中，所述Nap-OH、溴乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氧基吡啶的浓度比为45～55μmol/L：55～65μmol/L：95～105μmol/L：95～105μmol/L。
优选的，步骤(1)中，所述冰浴反应的时间为25～35min，所述室温反应时间为20～25h。
优选的，步骤(1)中，所述柱层析纯化的流动相为石油醚：乙酸乙酯＝100：1～8。
优选的，步骤(2)中，所述Nap-Br与SEQ ID NO.2所示序列的多肽的浓度比为4～5μmol/L:3μmol/L。
优选的，步骤(2)中，所述室温反应的时间为2.5～3.5h。
优选的，步骤(2)中，所述分离纯化的方式为高效液相色谱纯化，采用C18反相柱，流动相如下：A相：水和三氟乙酸(0.1％)，B相：乙腈和三氟乙酸(0.1％)。
优选的，步骤(3)中，所述超声功率为35～45W，超声时间为3～8min。
本发明第四方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物第一方面所述脑靶向抗血管生成多肽和/或第二方面所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料。
上述第四方面所述药物组合物中，所述脑靶向抗血管生成多肽和/或第二方面所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料应当是有效剂量的，具体剂量可依据药物组合物的用药目的采用本领域常规方式确定。
本发明第五方面，提供一种抗脑胶质瘤药物，所述药物中包括活性剂量的第一方面所述脑靶向抗血管生成多肽、第二方面所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料和/或第四方面所述药物组合物。
优选的，所述抗脑胶质瘤药物为液体制剂，进一步的，为注射剂，除上述活性成分，所述抗脑胶质瘤药物中还可以包括药学上可接受的其他载体，如增溶剂、悬浮剂、张力剂、缓冲剂、舒缓剂，或防腐剂、抗氧化剂等添加剂。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1脑靶向抗血管生成肽HH19的体外活性评价。
(1)MTT法测定HH19对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。
收集处于对数生长期的HUVECs，消化分散成单细胞悬液，细胞计数并调整细悬液胞密度为5×104/mL，取细胞悬液100μL均匀接种于96孔板中，每孔含有5×103个细胞，同时设置空白组(不含细胞)。将96孔板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后，加入F12K基础培养基配制的不同多肽药物溶液，同时设置对照组(不含药液)，继续培养48h。从培养箱取出96孔板，每孔加入5mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液20μL，避光继续培养4h。然后将96孔板离心5min(1000r/min)，再用1mL注射器将各孔中液体吸尽，每孔加入DMSO 150μL，放置于摇床中摇晃10min。随后置于酶标仪中检测吸光度OD值(检测波长：570nm)。结果如图1所示，综合上述实验结果，抗血管生成肽HH19各方面活性均较强，继续开展后续的研究。同一浓度下，HH19对内皮细胞生长的抑制活性高于其余各组。同时，与混合组HT12+T7相比，HH19的抑制活性并不是简单的HT12与T7物理混合。此外，随着给药浓度的增加，HH19表现出越来越强的抑制细胞增殖的能力。当HH19的给药浓度为160μmol/L时其抑制率可达到(42.47％±4.82％)，而其余各组随着浓度不断地增加对HUVECs的抑制作用没有明显的变化。
(2)细胞划痕法测定HH19对HUVECs迁移的影响。
首先用记号笔在6孔板的背面画3条平行的直线，备用。收集处于对数生长期的HUVECs，消化分散成单细胞悬液，取细胞悬液2mL均匀接种于6孔板中，每孔含有5×105个细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜培养至细胞完全融合。用黄枪头在每个孔中平行地划3条痕(垂直于背后记号笔横线)，弃去旧培养基，加入PBS缓冲液1mL轻轻清洗2遍，每个孔中加入用F12K基础培养基配制的不同多肽药物溶液2mL，同时设置对照组(不含药液)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。在0、24、48h使用倒置荧光显微镜明场拍照，观察细胞迁移的情况，然后使用Image J软件进行数据分析并计算细胞迁移率。结果如图2所示，在同一浓度(40μmol/L)下，相比于其余各组多肽，融合肽HH19对HUVECs起到更好的抑制其迁移的效果。表现为HH19在24h和48h迁移率分别为(46.03％±4.12％)和(63.42％±4.88％)，而多肽HT12在24h和48h迁移率分别为(61.48％±0.86％)和(78.19％±4.50％)。
(3)成管实验测定HH19对HUVECs体外血管形成的影响。
提前将Matrigel基质胶转至4℃冰箱中融化，同时将96孔板和灭菌过的黄枪头置于-20℃冰箱中预冷，备用。用预冷过的黄枪头将完全融化的Matrigel基质胶以每孔50μL迅速加入到96孔板中，轻轻摇晃96孔板使基质胶平铺于板底，整个铺胶过程在冰上操作，随后放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中静置培养1h至基质胶凝固。收集处于对数生长期的HUVECs，消化分散成单细胞悬液，取细胞悬液50μL均匀接种于含有Matrigel基质胶的96孔板中，每孔含有2.5×104个细胞，同时加入用F12K基础培养基配制的不同多肽药液和VEGF165共150μL，设置对照组。在37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养4-6h，使用倒置荧光显微镜明场拍照，观察形成管状结构的情况，然后使用Image J软件进行数据分析。结果如图3所示，在促血管生长因子VEGF165存在的情况下，HH19(40μmol/L)对HUVECs微管形成的抑制率达到(31.69％±9.42％)，可观察到管状结构间距较大且有些管状结构不太完整。
实施例2抗血管生成肽HH19的体外脑靶向穿透性评价。
(1)定性摄取实验
收集处于对数生长期的脑微血管内皮细胞(bEnd.3)或HUVECs，消化分散成单细胞悬液，取细胞悬液1mL接种于共聚焦小皿中，每孔含有1×105个细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。弃去旧培养基，用PBS缓冲液洗涤2遍，加入用DMEM基础培养基或F12K基础培养基配制的不同FITC标记的多肽药液(10μmol/L)各1mL，设置对照组，继续将共聚焦小皿置于37℃、5％CO2细胞培养箱中避光继续培养1h。随后弃去含药液培养基，用PBS洗涤3次，加入4％多聚甲醛固定液500μL，静置固定25min，用PBS洗涤3次。弃去上清液，避光加入DAPI染色液400μL，染色7min，用PBS洗涤3次。洗涤结束后，加入PBS缓冲液500μL浸润细胞，使用高速转盘共聚焦显微镜进行观察并拍照，结果如图4所示。
(2)定量摄取实验
bEnd.3细胞或HUVECs接种和加药操作同上。弃去含药液培养基，用PBS缓冲液洗涤3遍，每孔加入不含EDTA的胰蛋白酶400μL消化细胞，待显微镜下观察到细胞变圆时加入完全培养基1mL终止消化并收集细胞至离心管中，离心3min(1000r/min)；弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，离心3min(1000r/min)，重复2遍。弃去上清，用PBS缓冲液400μL轻轻重悬细胞，细胞过70μm细胞筛并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光强度。结果如图5所示，不同的多肽药物处理bEnd.3细胞和HUVECs 1h后，定性和定量结果结果均显示FITC-HH19的荧光强度最高；而在竞争性抑制结合的实验中我们考察了TfR靶向肽T7是否能竞争性抑制HH19与TfR的结合，结果表明T7加入后细胞对HH19的摄取能力明显下降，进一步证实了HH19是在T7的介导下对bEnd.3细胞和HUVECs具有更好的亲和性。另外，与HUVECs的摄取情况相比，bEnd.3细胞对HH19的摄取更多，说明HH19对bEnd.3细胞的亲和性更强，可能与bEnd.3表面高表达TfR相关。
实施例3肽两亲物N-CPHH的合成和表征。
(1)中间产物Nap-Br的合成和表征
将Nap-OH(50μmol/L)与溴乙酸(60μmol/L)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCI)(100μmol/L)和4-二甲氧基吡啶(DMAP)(100μmol/L)溶于5mL二氯甲烷中，冰浴条件下低速搅拌反应30min，随后继续在室温下低速搅拌反应24h。反应停止后依次用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠水溶液各洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100：1～8)并使用1H-NMR进行结构鉴定，如图6所示。
(2)肽两亲物N-CPHH的合成和表征
将Nap-Br(4.5μmol/L)与多肽CPHH(3μmol/L)溶于0.5mL二甲亚砜(DMSO)，再滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)5μL，室温低速搅拌反应3h，制备型高效液相色谱纯化(C18反相柱，流动相：A相＝水和三氟乙酸(0.1％))；B＝乙腈和三氟乙酸(0.1％))，旋蒸浓缩，冻干并使用1H-NMR和MALDI-TOF-MS进行结构及分子量的鉴定，如图7和图8所示。
实施例4脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的制备和表征。
称取肽两亲物N-CPHH 2mg分别分散到去离子水中，室温低速搅拌30min，再用40W超声处理5min得到脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束。随后，采用透射电子显微镜观察所制备的纳米胶束N-CPHH的形态；同时，采用马尔文粒径仪分别对N-CPHH纳米胶束的粒径分布及zeta电位进行测定。如图9所示，靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束的粒径约为150纳米左右，透射电子显微镜下纳米胶束均呈现分散性良好、大小均一的球型结构。
实施例5脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的体外活性评价。
(1)MTT法测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs增殖的影响。
按照实施例1(1)方法测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs增殖作用的影响。结果如图10所示，随着浓度的增加，HH19和CPHH对HUVECs生长的抑制作用逐渐增强，最大抑制率分别为(42.47％±4.82％)和(43.87％±2.08％)，说明HH19连接上MMP-2酶切肽CPLGVRK后基本不影响其活性。N-CPHH在低浓度(<80μmol/L)时，抑制活性高于HH19，但随着浓度(≥80μmol/L)增加，抑制细胞存活率上升缓慢甚至下降，抑制细胞增殖的活性低于肽HH19，而加入MMP-2之后抑制细胞增殖的活性有所提高。
(2)细胞划痕法测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs迁移的影响。
按照实施例1(2)方法测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs迁移能力的影响。结果如图11所示，加入MMP-2的N-CPHH(20μmol/L)在24h和48h抑制迁移率分别为(60.36％±6.93％)和(73.09％±3.64％)，保留了HH19抑制细胞迁移的能力，同时显示出比未修饰的HH19具有更好的抑制HUVECs迁移的能力。此外，浓度(20μmol/L)较低时，修饰后的N-CPHH的活性受到影响的程度不大，所以抑制HUVECs的迁移活性仍高于HH19，而加入MMP-2之后活性有些提高，这与抑制HUVECs增殖实验的结果是一致的。
(3)Transwell细胞侵袭法测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs侵袭的影响。
首先，提前将Matrigel基质胶转至4℃冰箱中融化，同时灭菌过的黄枪头置于-20℃冰箱中预冷，备用。用预冷过的黄枪头将完全融化的Matrigel基质胶和F12K基础培养基以1：6稀释比稀释，随后将稀释后的Matrigel基质胶以每孔50μL迅速加入到Transwell上室中，轻轻摇晃24孔板使基质胶平铺于板底，随后放置于细胞培养箱中静置培养3h至基质胶凝固。收集处于对数生长期的HUVECs，消化分散成单细胞悬液，将细胞悬液50μL均匀接种于含有Matrigel基质胶的Transwell上室中，每孔含有3×104个细胞，同时向Transwell下室加入含20％血清的F12K培养基600μL，排除气泡，将24孔板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。然后，加入用F12K基础培养基配制的不同药液各100μL，设置对照组，继续培养24h。取出Transwell上室，用预冷的PBS浸洗3次，将小室放置于一个洁净的24孔板中，加入细胞固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)600μL，室温固定30min。用PBS缓冲液浸洗3次，加入0.1％结晶紫染料600μL，室温染色30min，再用PBS缓冲液浸洗3次，用棉棒小心擦去小室内膜表面未发生迁移的细胞，倒置荧光显微镜明场拍照，对穿过小室半透膜的HUVECs进行细胞计数，并计算细胞迁移率。结果如图12所示，HH19、N-CPHH和加入MMP-2后的N-CPHH(20μmol/L)对HUVECs侵袭能力的抑制率分别为(23.12％±2.93％)、(48.24％±6.15％)和(55.30％±2.39％)，可观察侵袭到小室外膜的HUVECs数量明显减少，说明修饰后的多肽对HUVECs的侵袭起到持续的抑制作用。
(4)成管实验测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs体外血管形成的影响。
按照实施例1(3)方法测定脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)对HUVECs管状结构形成能力的影响。结果如图13所示，HH19、N-CPHH和加入MMP-2后的N-CPHH(20μmol/L)对HUVECs形成管状结构的抑制率分别为(20.39％±4.28％)、(45.3％±7.81％)和(63.42％±6.95％)。可观察到N-CPHH和加入MMP-2后的N-CPHH两组形成管状结构的数目明显减少，管状结构的间距增大且管状结构不太完整。
实施例6脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)跨血脑屏障和脑肿瘤靶向性评价。
收集处于对数生长期的U87-mCherry-luc细胞，胰蛋白酶消化30s，DMEM完全培养基停止消化，离心5min(1000r/min)后弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤细胞2遍，用适量PBS缓冲液配制成一定浓度的单细胞悬液，置于冰上备用。裸鼠接种细胞前用小动物麻醉机进行麻醉。随后将已麻醉的裸鼠头部固定在脑立体定位仪上，使裸鼠头部保持不动。用棉棒蘸取碘伏，对裸鼠头部皮肤的手术区域进行消毒，用手术剪刀沿脑中线剪开约1cm左右的皮肤开口，用镊子轻轻地破坏头骨表面粘膜，定位于中线旁右侧2mm，卤门前1mm处，用钻头轻微钻孔，形成注射孔。将5μL微量注射器固定在脑定位仪上，反复吸取PBS缓冲液冲洗注射器，吸取细胞悬液(每只裸鼠接种约1.5×105个细胞，分散于PBS缓冲液中)5μL，垂直进针穿刺进入脑组织，进针深度为3mm(进3.5mm，退0.5mm)，形成注射腔，平稳缓慢地注入细胞，约用时3min并停留1min，随后缓慢将微量注射器退出，用可吸收性外科缝合线缝合，伤口用少量碘伏消毒。待造模裸鼠恢复意识后转移到鼠笼中，时刻观察裸鼠的状态。为了确认成功造模，使用小动物活体成像系统检测裸鼠脑部肿瘤细胞的生物发光情况。待原位脑胶质瘤模型裸鼠建立的第10d，肿瘤长到一定体积时，用于检测不同药物在裸鼠脑内的分布积累情况。模型裸鼠通过尾静脉注射FITC-HT12、FITC-T7、FITC-HH19、FITC-CPHH、FITC-N-CPHH和生理盐水(FITC-N-CPHH剂量为60mg/kg，其余组剂量按等摩尔浓度换算)。在给药1h后剥取裸鼠脑组织，用生理盐水洗涤2遍，固定于4％多聚甲醛中，制作脑组织的冰冻切片并进行全景扫描，观察FITC标记的不同药物在脑组织中的分布积累情况，结果如图14所示。其中，FITC-HH19和FITC-CPHH组可以清楚地观察到积累在脑组织中的绿色荧光，且荧光强度基本一致，说明HH19和CPHH组均具有较好的靶向BBB穿透性和肿瘤血管靶向性。此外，FITC-N-CPHH组在肿瘤组织部位的荧光最亮，药物累积量达到最高。结果进一步说明，脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束更有利于靶向BBB和靶向肿瘤血管以及在脑肿瘤部位积累。
实施例7脑靶向抗血管生成肽HH19纳米胶束(N-CPHH)的体内药效学评价。
按照实施例6方法构建脑原位胶质瘤U87-Luc-mCherry荷瘤裸鼠动物模型，在原位脑胶质瘤模型裸鼠建立的第4d(造模当天为第1d)，使用小动物活体成像系统检测裸鼠脑部肿瘤的生物发光情况，根据生物发光测量值和体重进行随机分组为4个组(n＝6)，并开始每天通过尾静脉注射HH19，CPHH，N-CPHH和生理盐水(N-CPHH剂量为50mg/kg，其余组剂量按等摩比浓度换算)，并定期对各实验组的胶质瘤模型裸鼠进行小动物活体成像系统检测，以监测裸鼠脑胶质瘤的生长情况，并每天观察和记录裸鼠的体重变化。结果如图15所示，N-CPHH组的胶质瘤生物发光强度和发光面积明显小于其它组。统计结果表明在给药第9d，与生理盐水组相比，N-CPHH能够有效抑制胶质瘤的生长。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种脑靶向抗血管生成多肽及其纳米胶束材料
<130> 2010
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
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<400> 1
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1 5 10 15
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<211> 26
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 5
Cys Pro Leu Gly Val Arg Lys
1 5
Claims (10)
1.一种脑靶向抗血管生成多肽，其特征在于，所述多肽为下列情形中的一种：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽；
(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO.1所示多肽具有相同或基本相同的功能；
(3)对(1)或(2)中所述多肽进行化学或遗传修饰后的衍生多肽。
2.如权利要求1所述脑靶向抗血管生成多肽，其特征在于，第(2)方面中，所述衍生多肽的序列与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列应当具有90％及以上的相似性；进一步的，所述相似性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；
优选的，所述衍生多肽为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述脑靶向抗血管生成多肽，其特征在于，第(3)方面中，所述化学或遗传修饰物包括但不限于聚乙二醇、链霉亲和素、生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂；
或，所述脑靶向抗血管生成多肽还包括所述多肽的制剂形式或固定化产品，包括但不限于采用物理吸附剂、载体、交联试剂形式对脑靶向抗血管生成多肽进行封锁或固定的产品。
4.权利要求1-3任一项所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料，其特征在于，所述纳米胶束材料具有如下式Ⅰ所示的结构：
5.权利要求4所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：2-(1-羟乙基)-6-甲氧基萘与溴乙酸通过酯基连接形成中间产物，再与SEQ IDNO.2所示序列的多肽通过硫醚键进行连接得到肽两亲物，后者可在水溶液中自组装形成纳米胶束；所述中间产物的结构如下式Ⅱ所示：
6.权利要求4所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)将Nap-OH与溴乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCI)和4-二甲氧基吡啶溶于二氯甲烷中，冰浴反应一段时间后室温条件下继续进行反应；反应结束后对反应产物进行洗涤、干燥并通过柱层析纯化，得到Nap-Br；
(2)将Nap-Br与SEQ ID NO.2所示序列的多肽溶于DMSO中，滴加N,N-二异丙基乙胺室温反应一段时间，反应结束后对反应产物进行分离纯化得到所述肽两亲物；
(3)将所述肽两亲物分散至水中，搅拌均匀后超声处理，得到所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料。
7.权利要求6所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Nap-OH、溴乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氧基吡啶的浓度比为45～55μmol/L：55～65μmol/L：95～105μmol/L：95～105μmol/L；
或，步骤(1)中，所述冰浴反应的时间为25～35min，所述室温反应时间为20～25h；
或，步骤(1)中，所述柱层析纯化，的流动相为石油醚：乙酸乙酯＝100：1～8。
8.权利要求6所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Nap-Br与SEQ ID NO.2所示序列的多肽的浓度比为4～5μmol/L:3μmol/L；
或，步骤(2)中，所述室温反应的时间为2.5～3.5h；
或，步骤(2)中，所述分离纯化的方式为高效液相色谱纯化，采用C18反相柱，流动相如下：A相：水和0.1％三氟乙酸，B相：乙腈和0.1％三氟乙酸；
或，步骤(3)中，所述超声功率为35～45W，超声时间为3～8min。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述脑靶向抗血管生成多肽和/或权利要求4所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料。
10.一种抗脑胶质瘤药物，其特征在于，所述药物中包括活性剂量的权利要求1-3任一项所述脑靶向抗血管生成多肽和/或权利要求4所述脑靶向抗血管生成多肽的纳米胶束材料和/或权利要求9所述药物组合物；
优选的，所述抗脑胶质瘤药物为液体制剂，进一步的，为注射剂，除上述活性成分，所述抗脑胶质瘤药物中还可以包括药学上可接受的其他载体，包括增溶剂、悬浮剂、张力剂、缓冲剂、舒缓剂、防腐剂、抗氧化剂。
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