CN104479024A - 新型抗瘤融合肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“新型抗瘤融合肽及其用途”，属于生物医药技术领域。新型抗瘤融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。该融合肽加入到细胞后，可以明显抑制核转录因子NF-κB的活性及MAPK信号通路ERK和JNK的磷酸化水平，下调促炎细胞因子(如TNF-a、IL-1β)的表达，关闭细胞的炎症反应应答；同时，对PC-3M肿瘤细胞的凋亡有明显促进作用，ARP注射入成瘤裸鼠体内后，可以显著抑制肿瘤的生长，可以单独或作为一种组分用于临床肿瘤与炎症相关性疾病的治疗。

Description

新型抗瘤融合肽及其用途

技术领域

本发明通过基因工程技术合成一种新型抗瘤融合肽，以及该抗瘤融合肽在临床抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是仅次于心血管疾病危害人类健康的第二大杀手，据统计全国肿瘤发病率:每10万人中有286人患癌，肿瘤死亡率：每10万人中有181人患癌死亡，面对如此严峻的肿瘤发病形势，肿瘤治疗新措施研究仍然是人类当前的重大课题之一。

大部分肿瘤细胞是正常细胞经过一定的变异、获得某些特性后转化而来的。这些“获得特性”包括自主增殖的能力、侵袭外围组织的能力、向远端组织转移的能力，以及引起血管生成、逃避凋亡、逃避机体免疫监视的能力。正常细胞向瘤细胞的转化，源于正常细胞有关增殖、活力和生死控制的细胞信号转导途径的某些改变。业已证实，涉及细胞存活和增殖的信号转导途径包括MAPK、PI3K-Akt和NF-κB三条，其中NF-κB途径的异常在肿瘤的发生发展、浸润转移、对放化疗的耐受性中起重要作用，并被公认为是极具潜力的新型抗瘤靶点。

NF-κB活化在肿瘤中的作用主要表现在以下六个方面：①NF-κB活化与肿瘤的发生密切相关。在淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、食管癌和宫颈癌等肿瘤细胞中，NF-κB呈现组成性高表达和高活化状态，并被作为这些肿瘤的诊断标志之一。另外，瘤细胞常常伴随在炎症和低氧状态下出现，此时肿瘤细胞、间质细胞、炎症细胞分泌大量促炎细胞因子，建立起正反馈性质的“NF-κB活化环”，使NF-κB不仅在炎症中发挥重要作用，在肿瘤发生发展中也起重要作用。应用NF-κB抑制剂可以阻滞癌蛋白诱导的细胞瘤化，抑制肿瘤细胞的生长。②NF-κB促使细胞转化和瘤细胞的生长与增殖。致瘤性转化是肿瘤发生的第一步。有证据表明，NF-κB活化引起结肠癌、肝癌和淋巴瘤的发生并在这些肿瘤的早期进程中起重要作用。NF-κB通过抑制凋亡，保护细胞免于发生DNA损伤，并引起细胞的疯狂生长与增殖，其具体机制是通过上调抗凋亡蛋白(如Bcl-XL、存活素)、增殖调节蛋白P21^WAF1、细胞周期调节蛋白D和c-myc，以及生长因子(如TNFα、IL-1β、IL-6、EGF等)的表达来实现的。③NF-κB介导了肿瘤的侵袭与转移。研究证实，NF-κB活化可以上调涉及癌细胞迁徙和侵袭的多种基因的表达，如Twist、细胞粘附分子1(ICAM-1)、内皮白细胞粘附分子1(ELAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM)、基质金属蛋白酶(MMPs)、IL-8和IL-6等。相反，应用抑制剂抑制NF-κB的活性，可大大降低肿瘤的转移率。④NF-κB促进肿瘤组织血管生成，加速肿瘤生长。恶性实体瘤由于瘤细胞的快速生长，瘤细胞常处于一种缺氧/再灌注的状态，而缺氧/再灌注可活化NF-κB，上调血管内皮细胞生长因子(VEGF)、环氧合酶-2(Cox-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和生长相关基因α(grg-α)等与新生血管生成相关基因的表达，进而加速肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞生长。⑤NF-κB介导了瘤细胞对临床治疗的抵抗。无论是NF-κB的组成性活化，还是抗癌治疗诱导的NF-κB活化，两者均能削弱了临床抗癌药物的疗效。其机制涉及NF-κB对抗凋亡基因表达的上调，如凋亡抑制因子c-IAP1、c-IAP2和IXAP，以及Bcl-2、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等。⑥杀死癌细胞需要NF-κB的参与。临床上使用的一些抗肿瘤药物，如黄酮类化合物、姜黄素、白藜芦醇和曲古柳菌素A等，是通过抑制NF-κB活化介导了杀瘤作用。阿司匹林等非甾体类传统抗炎药也是通过抑制NF-κB活化，预防某些癌症的发生或延缓其进程的，并且在结肠癌最为显著。因此，靶向NF-κB的肿瘤治疗十分重要。

目前靶向NF-κB的肿瘤治疗研究已经取得了一些可喜的进展，人们主要是集中研发了一系列以NF-κB信号转导途径为靶点的各种NF-κB阻断剂，包括天然的或合成的一些物质：①抑制IKK的形成及活性：应用IKKα的反义核酸、表达IKKα显性失活突变体以及应用干扰IKK复合物形成的干扰肽等抑制IKK的形成及活化；②蛋白酶抑制策略，减少IκB的降解：某些蛋白酶小体抑制剂如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近来发现的epoxomicin等均可通过抑制IκB的降解，达到拮抗NF-κB活性的目的。③促进IκB的生成：应用IκBα的腺病毒表达载体，使IκBα显型失活突变体过量表达，可明显抑制NF-κB的核移位及其后续效应。④抑制NF-κB的合成：设计P⁵⁰和P⁶⁵的反义核酸和siRNA阻滞NF-κB的合成；⑤使用抗氧化剂直接抑制NF-κB转录：如使用吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)等非特异抑制NF-κB的转录活性。⑤竞争性抑制活化NF-κB与靶蛋白基因上κB基序的结合：主要是研发一些能够与活化NF-κB竞争性结合到靶蛋白基因κB基序上的拮抗多肽，干扰NF-κB对靶蛋白表达的调节。⑥传统非甾体类抗炎症药物的使用抑制NF-κB的活化：如姜黄素、黄酮类化合物和白藜芦醇等。总之，上述靶向NF-κB信号转导途径的治疗策略，在细胞实验和动物实验阶段均表现出了不同程度的疗效，部分已进入临床试用阶段，但是这些措施仍然面临许多问题，如蛋白酶小体，它除了可降解IκB外，还具有其他许多重要的功能，因此抑制蛋白酶小体活性将导致潜在的毒副作用。抗氧化剂的作用范围更加广泛，毒副作用更大。靶向IKK、IκB的措施对NF-κB活性的干预也不完全特异，如干扰IKK复合物形成的干扰肽已被证实，其不仅可抑制NF-κB的活性，还可抑制转录因子AP-1和NFAT的活性。非甾体类抗炎药物、姜黄素、黄酮类化合物和白藜芦醇等化合物除了抑制NF-κB信号通路外，还对其它信号通路具有调控作用。而直接抑制NF-κB的合成策略虽然对于NF-κB是特异性的，但反义核酸和siRNA策略进入临床应用也还存在许多问题。NF-κB拮抗多肽解决了特异性问题，却存在量效方面的担忧和需要两次跨膜(细胞膜和核膜)的难度。因此，继续研究新型NF-κB抑制措施仍然很有必要。

研究发现NF-κB不仅是一个新型抗炎靶点，也是一个具有巨大潜力的抗瘤靶点，并且肿瘤生物治疗的靶向性目前也基本上有策略应对，为此，我们拟将已经获得的NF-κB高效特异性抑制肽的设计方案，用于开发新型抗肿瘤药物的研究中，使前期研究取得的阶段性成果具有实际意义上的应用价值。外源性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽已被人们发展成为一种靶向肿瘤的新载体！RGD三肽1984年被发现，是纤维连接蛋白(FN)与其受体的特异性结合的结合位点，在多种生物细胞外基质中的很多糖蛋白和去整和素中均存在RGD三肽序列。并且，RGD三肽也是去整合素特异地识别细胞表面整和素αvβ3，并与之高亲和力结合的结合位点。由于实体瘤中存在大量的新生血管，新生血管的内皮细胞表面又高表达整和素αvβ3，因此经静脉给予含有RGD三肽结构的生物工程类药物，经过血液循环，通过药物上融合的RGD三肽与肿瘤新生血管内皮细胞的结合，抗瘤药物被集中于实体瘤病灶，达到靶向给药的效果。相关研究还表明，外源性给予的RGD三肽能够竞争性抑制体内RGD肽类物质与肿瘤细胞表面整和素的结合，进而抑制肿瘤细胞的黏附与迁移以及血管形成。因此，我们设想：将RGD三肽融合到以天然A20蛋白最小NF-κB活性抑制结构域为基础，以4分子Cys结合一个Zn为特征结构的NF-κB抑制肽的氨基端，使融合多肽既有靶向肿瘤细胞的特性，又能进入细胞，高效特异地抑制肿瘤细胞NF-κB活化。

发明内容

本发明的目的是提供一种既有靶向肿瘤细胞的特性，又能进入细胞，高效特异地抑制肿瘤细胞NF-κB活化的抗瘤融合多肽。

新型抗瘤融合肽，其特征在于：以天然炎症内源性保护蛋白A20最小NF-κB信号通路抑制域为基础、改构获得的一个N端含有跨膜引导序列、以4分子Cys结合一个Zn为特征锌指结构的NF-κB抑制肽为先导物，将富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性连接肽之与具有肿瘤靶向性的RGD三肽融合的人造抗瘤融合肽(ARP)。

新型抗瘤融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。

编码上述新型抗瘤融合肽的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

上述新型抗瘤融合肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述药物是以新型抗瘤融合肽作为单一药效组分或以新型抗瘤融合肽作为多药效组分中的其中一个药效组分。

所述多药效组分为上述新型抗瘤融合肽与盐酸伊立替康的组合物。

所述肿瘤为与炎症相关的疾病肿瘤疾病。

本发明提供一种新型抗瘤融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。以申请前期基于天然炎症内源性保护蛋白A20最小NF-κB信号通路抑制域为基础、改构获得的一个N端含有跨膜引导序列、以4分子Cys结合一个Zn为特征锌指结构的NF-κB抑制肽为先导物，将富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性连接肽之与具有肿瘤靶向性的RGD三肽融合，获得了人造抗瘤活性肽(ARP)的基因序列和蛋白质序列。本发明以已获得并证实既具有穿膜功能，又能高效抑制NF-κB活性的NF-κB高效特异性抑制肽为先导物，将RGD三肽插入其氨基端，并在两个分子间插入一个富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性连接肽(linker)以消除RGD三肽与NF-κB高效特异性抑制肽之间空间上和功能上的相互影响。另外，在RGD三肽的R前面加入一个半胱氨酸(C)，D后加入色氨酸-谷氨酸-半胱氨酸(WEC)序列，组成CRGDWEC序列，两个C之间可形成一个分子内的二硫键，使RGD成一个环化肽，进而增加RGD结构的稳定性以及与整合素间的亲和力，最终获得具有知识产权肿瘤靶向特性、自由穿透细胞膜，高效特异地抑制NF-κB活性的新型抗肿瘤多肽药物。

该融合肽加入到细胞后，可以明显抑制核转录因子NF-κB的活性及MAPK信号通路ERK和JNK的磷酸化水平，下调促炎细胞因子(如TNFα、IL-1β)的表达，关闭细胞的炎症反应应答；同时，对PC-3M肿瘤细胞的凋亡有明显促进作用，ARP注射入成瘤裸鼠体内后，可以显著抑制肿瘤的生长，可以单独或作为一种组分用于临床肿瘤与炎症相关性疾病的治疗。

附图说明

图1pUC57-ARP、pEGFR-C1-ARP质粒载体双酶切PCR电泳，

A：pUC57-ARP质粒，B：pEGFR-C1-ARP质粒，

A中：M1:Marker(100bp,300bp,500bp,800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp)；1:pUC57质粒双酶切(XbaⅠ/BamHⅠ)，

B中：M2:KBLadder(500bp,1000bp,2000bp,3000bp,4000bp,5000bp,6000bp,8000bp,10000bp)；2:pEGFP-C1质粒双酶切(BamHⅠ/BglⅡ)，

图2.ARP表达质粒插入序列的基因测序结果1，

图3ARP表达质粒插入序列的基因测序结果2，

图4ARP转染COS7细胞上清液SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果，

其中：M是蛋白Marker，N是未转染ARP的正常COS7细胞,1、2是获得稳定表达ARP的COS7细胞上清，

图5ARP转染COS7细胞上清液Western Blot结果，

其中：N是未转染ARP的正常COS7细胞，1、2是获得稳定表达ARP的COS7细胞上清，

图6PC-3M细胞CCND1和Bcl2水平的检测结果(Western Blot)，

图7PC-3M细胞IκB-a水平的检测结果(Western Blot)，

图8PC-3M细胞pERK1/ERK2,pJNK的检测结果(Western Blot)，

图9PC-3M细胞IκB-a、CCND1、Bcl2、pERK和pJNK变化半定量分析结果，

其中：a:P<0.05VS LPS组；b:P<0.01VS LPS组，

图10裸鼠成瘤结果，

其中：1：正常裸鼠；2：ARP对照组；3,4:生理盐水治疗组；5,6:CPT-11治疗组；7,8:ARP治疗组；9,10:CPT-11+ARP联合治疗组，

图11裸鼠成瘤治疗后结果，

其中：1：正常裸鼠；2：ARP对照组；3,4:生理盐水治疗组；5,6:CPT-11治疗组；7,8:ARP治疗组；9,10:CPT-11+ARP联合治疗组，

图12裸鼠各治疗组HE染色结果，其中：A1：生理盐水治疗7天组(40X)；A2：生理盐水治疗7天组(100X)；A3：生理盐水治疗7天组(200X)；B1：CPT-11治疗7天组(40X)；B2：CPT-11治疗7天组(100X)；B3：CPT-11治疗7天组(200X)；C1：ARP治疗7天组(40X)；C2：ARP治疗7天组(100X)；C3：ARP治疗7天组(200X)；D1：:CPT-11+ARP联合治疗7天组(40X)；D2：:CPT-11+ARP联合治疗7天组(100X)；D3：:CPT-11+ARP联合治疗7天组(200X)；E1：生理盐水治疗14天组(40X)；E2：生理盐水治疗14天组(100X)；E3：生理盐水治疗14天组(200X)；F1：CPT-11治疗14天组(40X)；F2：CPT-11治疗14天组(100X)；F3：CPT-11治疗14天组(200X)；G1：ARP治疗14天组(40X)；G2：ARP治疗14天组(100X)；G3：ARP治疗14天组(200X)；H1：:CPT-11+ARP联合治疗14天组(40X)；H2：:CPT-11+ARP联合治疗14天组(100X)；H3：:CPT-11+ARP联合治疗14天组(200X)；

图13裸鼠各治疗组免疫组化结果，其中：A1：生理盐水治疗7天组(100X)；A2：生理盐水治疗7天组(200X)；B1：CPT-11治疗7天组(100X)；B2：CPT-11治疗7天组(200X)；C1：ARP治疗7天组(100X)；C2：ARP治疗7天组(200X)；D1：:CPT-11+ARP联合治疗7天组(100X)；D2：:CPT-11+ARP联合治疗7天组(200X)；E1：生理盐水治疗14天组(100X)；E2：生理盐水治疗14天组(200X)；F1：CPT-11治疗14天组(100X)；F2：CPT-11治疗14天组(200X)；G1：ARP治疗14天组(100X)；G2：ARP治疗14天组(200X)；H1：CPT-11+ARP联合治疗14天组(100X)；H2:CPT-11+ARP联合治疗14天组(200X)；

具体实施方式

下面涉及的实验细胞和材料均已公开，或是市售产品。

实施例1

新型抗瘤融合肽ARP分子设计

利用计算机工作站，以课题组前期基于天然炎症内源性保护蛋白A20最小NF-κB信号通路抑制域为基础、改构获得的一个N端含有跨膜引导序列、以4分子Cys结合一个Zn为特征锌指结构的NF-κB抑制肽为先导物，设计一个柔性linker将之与具有肿瘤靶向性的RGD三肽融合，获得了人造抗瘤活性肽(ARP)的基因序列和蛋白质序列。

ARP结构：穿膜肽－linker－锌指单体－linker－锌指单体－linker－锌指单体－linker－锌指单体-linker-RGD

氨基酸序列(139aa)：见SEQ ID NO1

RKKRRQRRRGGGSSGSKCQACLQDVTRTFNGICSTCFGGGGGGSSGGGG

SKCQACLQDVTRTFNGICSTCFGGGGGGSSGGGGSKCQACLQDVTRTFNGICSTCFGGGGGGSSGGGGSKCQACLQDVTRTFNGICSTCF

基因序列(429bp)：见SEQ ID NO2

agg aag aag cgg aga cag cga cga aga GGC GGG GGC AGC AGC GGC AGC aag tgc agg agc cccggc tgc ccc ttc aca ctg aat gtg cag cac aac gga ttt tgt gaa cgt tgc GGA GGT GGT GGA GGT GGAAGC AGC GGA GGA GGC GGT AGC aaa tgt aga agt cct gga tgt cca ttc aca cta aat gta cag cac aacgga ttt tgt gaa cgt tgc GGT GGA GGA GGT GGA GGT AGT AGC GGT GGT GGC GGA AGC aagtgt agg agt ccc gga tgc ccg ttc act ctc aat gtc cag cat aac ggt ttc tgc gaa cgc tgc GGG GGA GGTGGC GGA GGA AGT AGT GGG GGA GGT GGT AGT aaa tgc aga agc ccg ggc tgt ccc ttt aca ctcaat gtt cag cat aac ggt ttt tgc gaa cga tgc

实施例2

2.1人工合成ARP的基因序列，构建重组质粒pEGFP-C1-ARP：

根据人A20基因的序列，设计出以天然炎症内源性保护蛋白A20最小NF-κB活性抑制结构域为基础，以4分子半胱氨酸(Cys)结合一个Zn为特征结构的、含有4分子C2C2锌指的NF-κB抑制肽,利用引物设计软件Primer5.0设计带酶切位点的引物，上游引物为5-TCTAGATGCTGTACAAGTCCGGACTC-3’(XbaⅠ酶切位点)，下游引物为5’-ACCGGATCTAGATAACTGATATCGGATCC-3’(BamH I的酶切位点)。通过PCR进行扩增,反应条件为：94℃预变性10min，然后93℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 105s，循环35次后72℃延伸10min。4℃保存PCR产物。取1μl用1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行结果分析。

PCR产物与pUC57载体连接

载体序列：M13F/pUC上游引物为5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’；下游引物为5’-CAGGAAACAGCTATG-3’,将目的基因与pUC57载体16℃过夜连接,将连接产物pUC57-A20mutant转化大肠杆菌DH5α，于选择性LB固体平板(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长，37℃过夜培养，第2天随机选取1个单菌落进行PCR反应检菌，扫描结果见附图1A，提示Lane1是我们希望得到的573bp的扩增片段。挑取少许Lane1对应的菌落于25ml的LB液体培养基中，37℃摇床上震荡培养过夜，取0.5ml菌液送金瑞斯公司生物技术公司测序，其余菌液用Omega Co.质粒提取试剂盒提取质粒DNA备用。测序结果见附图2，证实插入序列与设计序列完全一致。

2.2重组质粒pEGFP-C1-ARP构建与鉴定

将pUC57-ARP质粒用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后获取ARP基因片段。将其与BamHⅠ/BglⅡ双酶切的真核表达质粒pEGFP-C116℃过夜连接(载体序列为PEGFP-C-5：CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG)，连接液转化大肠杆菌DH5α于选择性LB(含50μg/ml氨苄青霉素)固体平板上筛选阳性菌落菌检，扫描结果见附图1B，提示Lane2是我们希望得到的429bp的扩增片段。挑取少许Lane2对应的菌落于25ml的LB液体培养基中，37℃摇床上震荡培养过夜，取0.5ml菌液送南京金瑞斯公司测序，其余菌液用Omega Co.质粒提取试剂盒提取质粒DNA备用。测序结果见附图3，证实插入序列与设计序列完全一致扩增后抽提质粒，并取少量重组质粒pEGFP-C1-ARP进行BamHⅠ/BglⅡ双酶切鉴定。

实施例3

3.1ARP在COS7细胞中的表达与鉴定

3.1.1质粒转染：

具体方法详见说明书，采用基因转染技术，将ARP表达质粒导入COS7细胞，通过G418的筛选，获得了稳定表达ARP细胞株

3.1.2 10％SDS-PAGE电泳：

具体方法及试剂配制详见说明书，选择5％浓缩胶/10％分离胶。将样品与上样缓冲液按照4：1的比例进行混合，沸水浴中加热10分钟，立即插入冰浴冷却。点样时，每孔加入的总体积20～30μl。电泳时积层胶电压80v，时间约10min，待染料前沿进入分离胶后，电压改为120v，电泳约40min，直至溴酚蓝到达分离胶底部后关闭电源。电泳结束后，取下电泳玻璃板和凝胶，用蒸水洗涤凝胶表面，将一块凝胶用于考马斯亮蓝染色，另一块用于WesternBot。

3.1.3考马斯亮蓝染色：

约20ml考马斯亮蓝染液，摇床染色5-10min，弃去染液，水中漂洗数次，加入考马斯亮蓝脱色液约50ml，摇床脱色约1h，可更换脱色液数次并振荡过夜，直到条带满意为止。将脱色后的凝胶扫描，结果见附图4，在Lane1，295kD附近有A20蛋白条带。

3.1.4蛋白质的Westerb Blot：

转膜后,封闭液浸泡1h,按比例用封闭液稀释一抗为5ml，塑封4℃旋转孵育过夜。洗涤后结合按相应比例用封闭液稀释的二抗，室温轻摇孵育1-2h。洗涤后，将发光液A和B等体积混匀制成工作液，滴于膜上，作用5分钟，用凝胶成像系统扫描NC膜，结果见附图5，在95kD附近有目标A20蛋白条带。

3.1.5ARP表达量测算：

参照课题组前期研究结果：全长重组人A20蛋白表达量＝用全长重组人A20蛋白表达的百分含量×相应上清液的总蛋白含量。上清液的总蛋白含量用BCA蛋白质定量法进行测定。(BCA蛋白质定量试剂盒购于上海申能博彩生物科技公司，详细方法参见试剂盒说明书。)结果ARP的分泌量为16.71±1.13μg/ml。

实施例4

4.1ARP炎症应答对前列腺癌PC-3M细胞NF-κB活性及细胞因子谱的干预作用：

实验前一天对稳定培养的人前列腺癌细胞株PC-3M细胞进行一次换液传代，调整细胞悬液浓度为5×10⁵/ml，取200ul于96孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养过夜。并次日更换新鲜RPMI1640培养液。实验分阴性对照组、空载体组、ARP组、LPS处理对照组、空载体+LPS组和ARP+LPS组进行,每组三复孔。向ARP组和ARP+LPS组加入终浓度为1ug/ml的ARP，向LPS处理对照组、空载体+LPS组、ARP+LPS组中加入终浓度为100ng/ml的LPS。37℃5％CO₂条件培养24h，离心收集上清液和细胞。

4.1.1蛋白的提取：

采用胞浆蛋白和核蛋白提取试剂盒(PIERCE公司产品)提取细胞样品中的蛋白，详细方法参见试剂盒说明书。

4.1.2NF-κB活性测定(ELISA)：(lipopolysaccharide)脂多糖

采用NFκB p50检测试剂盒(Active Motif公司产品)测定NF-κB活性，详细方法参见试剂盒说明书，实验结果见表1。阴性对照组、空载体组、1μg/ml ARP组、LPS处理对照组、空载体+LPS组和ARP+LPS组，反映PC-3M细胞NF-κB活性水平的OD₄₅₀值分别为0.618±0.024、0.496±0.009、0.553±0.022、1.486±0.032、1.289±0.093和0.783±0.039，可见加入ARP后，PC-3M细胞NF-κB活性有所降低。将阴性对照组、空载体组、ARP组、空载体+LPS组和ARP+LPS组依次与LPS处理对照组进行比较，t检验结果显示：在阴性对照组、空载体组、ARP组与LPS处理对照组之间NF-κB活性存在极显著性差别，P＜0.01，说明细胞功能状态满意；加入1μg/ml ARP后，PC-3M细胞NF-κB活性下降程度与LPS处理对照组之间存在极显著性差别，P＜0.01。上述结果表明：ARP对LPS激活PC-3M细胞NF-κB有抑制效果。

表1.ARP+LPS刺激PC-3M细胞24小时NF-κB及炎症反应因子表达测定(ELISA)

说明：与LPS组比较，a表示p≤0.05；b表示p≤0.01

4.1.3TNF-a水平的ELISA分析：

采用TNF-a ELISA试剂盒(R&D公司产品)测定上清液中的TNFα水平，具体方法按说明书进行，实验结果见表1。阴性对照组、空载体组、1μg/ml ARP组、LPS处理对照组、空载体+LPS组和ARP+LPS组，PC-3M细胞合成并分泌到培养液中的TNF-a分别为11.89±0.95、12.23±0.27、11.90±0.43、28.64±2.1、28.72±1.95和17.37±1.81ng/ml，提示加入ARP后，PC-3M细胞合成和分泌的TNFα有所降低。将阴性对照组、空载体组、ARP组、空载体+LPS组和ARP+LPS组依次与LPS处理对照组进行比较，检验结果显示：在阴性对照组、空载体组、ARP组与LPS处理对照组之间TNF-a水平存在极显著性差别，P＜0.01，说明细胞功能状态满意；1μg/ml ARP干预组与LPS处理对照组之间TNF-a水平存在极显著性差别，P＜0.01。上述结果表明：ARP对PC-3M细胞合成并分泌TNF-a有干预作用。

4.1.4IL-1β水平的ELISA分析：

采用IL-1βELISA试剂盒(R&D产品)测定上清液中的IL-β水平，具体方法按说明书进行，实验结果见表1。阴性对照组、空载体组、1μg/ml ARP组、LPS处理对照组、空载体+LPS组和ARP+LPS组，PC-3M细胞合成并分泌到培养液中的TNFα分别为IL-β分别为559.2±24.8、582.5±11.、593.5±15.7、909.4±89.8、842.6±32.1、和703.6±30.4pg/ml，提示加入ARP后，PC-3M细胞合成和分泌的IL-1β有所降低。将阴性对照组、空载体组、ARP组、空载体+LPS组和ARP+LPS组依次与LPS处理对照组进行比较，检验结果显示：在阴性对照组、空载体组、ARP组与LPS处理对照组之间IL-1β水平存在显著性差别，P<0.01，说明细胞功能状态佳；1μg/ml ARP组与LPS处理对照组之间IL-1β水平存在显著性差别，P＜0.05。上述结果表明：ARP对PC-3M细胞合成并分泌IL-1β有干预作用。

因此，可以认为ARP具有抑制PC-3M细胞NF-κB活化、下调细胞生成TNFα、IL-1β的能力，对实验细胞的炎症应答具有明显的调节作用。

实施例5

5.1ARP对肿瘤细胞PC-3M增殖的抑制和凋亡的诱导作用的影响

实验前一天对稳定培养的人前列腺癌细胞株PC-3M细胞进行一次换液传代，调整细胞悬液浓度为5×10⁵/ml，取2ml于6孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养过夜。并次日更换新鲜RPMI1640培养液。实验分阴性对照组、LPS处理对照组、A20+LPS组和ARP+LPS组进行。向A20+LPS组加入终浓度为1ug/ml的A20，向ARP+LPS组加入终浓度为1ug/ml的ARP，向LPS处理对照组、A20+LPS组、ARP+LPS组中加入终浓度为100ng/ml的LPS。向阴性对照组加入等体积的生理盐水，37℃5％CO₂条件培养24h，离心收集上清液和细胞。

5.1.1蛋白的提取：

采用胞浆蛋白和核蛋白提取试剂盒(PIERCE公司产品)提取细胞样品中的蛋白，详细方法参见试剂盒说明书。

以瘤细胞内细胞周期蛋白1(CCND1)和凋亡抑制因子Bcl2的表达水平作为瘤细胞增殖凋亡的观察指标，通过ARP对LPS刺激PC-3M细胞24小时，细胞内CCND1和Bcl2水平的检测(Western Blot，附图6)，发现ARP可显著抑制Bcl2表达(灰度值扫描(灰度值扫描半定量分析结果见附图9)，提示ARP对PC-3M凋亡有明显促进作用，但对PC-3M的增殖抑制作用无统计学意义。

实施例6

6.1ARP抗瘤的分子机制

6.1.1ARP对PC-3M细胞IκB-a降解抑制作用

采用Western Blot，测定ARP+LPS刺激PC-3M细胞24h时，细胞内的IκB-a水平，详细结果见附图7(Western Blot结果)和附图9(灰度值扫描半定量分析结果)。与LPS组比较，结果提示ARP+LPS组IκB-a含量明显高于LPS组，说明ARP对PC-3M细胞细胞内IκB-a的降解有明显抑制作用。

ARP对PC-3M细胞MAPK通路的影响为了进一步掌握ARP对瘤细胞增殖和凋亡影响的机制，课题组选择了细胞增殖、凋亡和应激等多种生理和病理过程中起重要作用的MAPK通路，通过ARP对该通路关键分子ERKs、JNK表达变化的调查，发现ARP可抑制pERK1/ERK2和pJNK的表达(Western Blot，见附图8)，提示ARP可抑制pERK1/ERK2和pJNK的磷酸化，在抗瘤细胞增殖、凋亡方面具有重要作用(见附图9)。

ARP对瘤细胞细胞因子谱表达的影响

采用流式液相芯片技术对ARP+LPS刺激24小时PC-3M分泌的细胞因子谱进行了调查，结果见表2(液相芯片结果)。为了减少不同批次培养的PC-3M细胞对LPS反应性之间的差别，以A20+LPS组、ARP+LPS组结果分别除以其同批次的LPS组结果，获得的两组数据(比值)见表2。可见，ARP与A20一样，能够抑制PC-3M细胞LPS应答时产生TNFα、IL-3、IL-7、IL-8、IL-17、IFNγ、MIP-1、GM-CSF，并且在抑制能力上，ARP的抑制作用强过野生A20；同时，ARP对IFNa2和Eotaxin的产生也具有抑制作用，但野生A20无明显抑制作用；另外，对VEGF和IP-10的产生，野生A20有轻微抑制作用，而ARP具有促进作用。

上述机制研究结果，进一步证明，ARP是通过对瘤细胞NF-KB表达的抑制、IKB-α降解的抑制，实现对瘤细胞分泌炎症细胞因子的抑制；ARP通过对瘤细胞细胞因子表达谱的调节机制，以及对瘤细胞MAPK信号通路关键分子ERKs、JNK磷酸化的抑制机制，最终实现了其抗瘤活性。

实施例7

新型抗瘤融合肽(ARP)的抗瘤疗效鉴定

动物实验：(CPT-11的药物名称：盐酸伊立替康)

裸鼠，雄性10只，4周龄，适应喂养1周。对稳定培养的人前列腺癌细胞株PC-3M细胞进行换液传代，调整细胞悬液浓度为1×10⁷/ml，每只裸鼠皮下接种100ul，观察肿瘤生成情况，待肿瘤生成直径达1cm左右，随机将其分成生理盐水治疗组、CPT-11治疗组、ARP治疗组、和CPT-11+ARP联合治疗组(共四组)，CPT-11治疗组2只，腹腔注射10mg/kg的CPT-11，ARP治疗组2只，腹腔注射30ug/kg的ARP；CPT-11+ARP联合治疗组2只，腹腔注射30ug/kg的ARP和10mg/kg的CPT-11，生理盐水治疗组2只，腹腔注射与CPT-11等体积的生理盐水，分别于治疗后的第7天和14天杀动物，取肿瘤组织，通过计算肿瘤组织的体积，HE染色，观察ARP治疗组和CPT-11+ARP联合治疗组对肿瘤的消除效应明显，而生理盐水治疗组肿瘤继续生长，并发生肿瘤转移现象(附图10、附图11)。HE染色结果显示，ARP治疗组和CPT-11+ARP联合治疗组治疗后的第7天，炎症细胞侵润明显，其可能通过调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞，ARP治疗组和CPT-11+ARP联合治疗组治疗后的第14天，肿瘤坏死明显，炎症细胞明显减少(附图12)。VEGF免疫组织化学结果显示，VEGF在胞浆中表达，呈黄色或棕褐色，ARP治疗组和CPT-11+ARP联合治疗组治疗后的第7天，血管分布明显增加，炎症细胞经血管侵润周围肿瘤组织；ARP治疗组和CPT-11+ARP联合治疗组治疗后的第14天，血管分布减少，炎症细胞也明显减少，肿瘤坏死明显(附图13)。

上述结果表明，ARP能显著提高机体免疫系统大量释放中性粒细胞等炎症细胞至肿瘤组织，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，对肿瘤细胞具有明显的消除效应，可以单独或作为一种组分用于临床肿瘤与炎症相关性疾病的治疗。

Claims (7)

1.新型抗瘤融合肽，命名为ARP，其特征在于：以天然炎症内源性保护蛋白A20最小NF-κB信号通路抑制域为基础、改构获得的一个N端含有跨膜引导序列、以4分子Cys结合一个Zn为特征锌指结构的NF-κB抑制肽为先导物，将富含甘氨酸和丝氨酸的柔性连接肽之与具有肿瘤靶向性的RGD三肽融合的人造抗瘤融合肽。

2.根据权利要求1所述的新型抗瘤融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。

3.编码权利要求2所述的新型抗瘤融合肽基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

4.权利要求1或2所述的新型抗瘤融合肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述药物是以权利要求1或2所述的新型抗瘤融合肽作为单一药效组分或以新型抗瘤融合肽作为多药效组分中的其中一个药效组分。

6.根据权利要求5所述的应用，所述多药效组分为权利要求1或2所述的新型抗瘤融合肽与盐酸伊立替康的组合物。

7.根据权利要求4所述的应用，所述肿瘤为与炎症相关的肿瘤疾病。