CN108138149A

CN108138149A - 重组溶瘤病毒及其用途

Info

Publication number: CN108138149A
Application number: CN201680041145.3A
Authority: CN
Inventors: 布拉德·纳尔逊; 夸梅·特瓦马西-博滕; 大卫·克勒格尔; 帕尔沃·查帕尼; 达科塔·皮科克
Original assignee: British Columbia Cancer Agency BCCA
Current assignee: British Columbia Cancer Agency BCCA
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2016-05-19
Publication date: 2018-06-08
Also published as: EP3298132A4; US20180133270A1; HK1255099A1; AU2016263147A1; JP2018519805A; EP3298132A1; CA3023817A1; BR112017024786A2; WO2016185414A1

Abstract

本发明涉及重组溶瘤病毒。更具体地说，本发明涉及表达异源B细胞引诱剂多肽或T细胞引诱剂多肽的重组溶瘤病毒。

Description

重组溶瘤病毒及其用途

技术领域

背景技术

免疫系统被认为在癌症患者的临床结果中起关键作用。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与人体防御癌症有关。例如，CD8+肿瘤浸润性T细胞与ER-乳腺癌和卵巢癌的显著提高的存活率有关(13,23)。此外，肿瘤浸润B细胞被认为是卵巢癌的一个积极的预后因素(16)。

除了肿瘤中TIL的绝对数量之外，肿瘤内淋巴细胞的组织被认为在抗肿瘤免疫应答中起重要作用。与次要淋巴器官类似的在原位聚集免疫细胞的三级淋巴结构(TLS)与包括乳腺癌，结肠直肠癌和其他人类癌症在内的多种癌症的患者存活率提高有关(6,20中综述)。

趋化因子CXCL10和CXCL13被证明与TLS相关(4,10,11,15)。CXCL10表达可以由I型或II型干扰素诱导，所述干扰素来源于例如病毒感染或T细胞的抗原特异性激活等过程。CXCL10充当活化的T细胞的化学引诱剂。CXCL13是B细胞和T滤泡辅助细胞(T_FH)的化学引诱剂。此外，在结肠直肠癌的小鼠模型中内镜注射重组的CXCL13导致80％的治疗小鼠发生肿瘤排斥(1)。

溶瘤病毒(OVs)是一种在癌细胞中选择性复制的病毒。活的复制的OV已经在各种人类癌症的临床试验中进行了测试(17中综述)。OV可以诱导抗肿瘤免疫应答，以及直接裂解肿瘤细胞。常见的OV包括水疱性口炎病毒(VSV)和痘苗病毒(VV)的减毒株。

发明内容

一方面，本发明提供了包含编码B细胞引诱剂多肽或T细胞引诱剂多肽的异源核酸序列的重组溶瘤病毒，其中异源核酸序列稳定整合到重组溶瘤病毒的基因组中。重组溶瘤病毒可以是减毒的。重组溶瘤病毒可以是溶瘤RNA病毒或溶瘤DNA病毒。

在一些实施方式中，重组溶瘤病毒可以是溶瘤RNA病毒，例如水泡性口炎病毒(VSV)，马拉巴病毒，新城疫病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒或呼肠孤病毒，并且异源核酸序列可以编码B细胞引诱剂多肽，如CXCL12或CXCL13多肽。

在一些实施方式中，重组溶瘤病毒可以是溶瘤DNA病毒，如痘苗病毒(VV)，单纯疱疹病毒(HSV)或腺病毒，并且异源核酸序列可以编码T细胞引诱剂多肽，例如CXCL10。

在一些实施方式中，重组溶瘤病毒可以是VSV-CXCL12，VV-CXCL12，VSV-CXCL13，VV-CXCL13，VSV-CXCL10或VV-CXCL10。

在一些方面，本发明提供了包含如本文所述的重组溶瘤病毒和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以包含与VV-CXCL12，VV-CXCL13或VV-CXCL10组合的VSV-CXCL13。药物组合物可以配制用于全身给药。

在一些方面，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的如本文所述的重组溶瘤病毒或药物组合物来治疗癌症的方法。所述癌症可以是乳腺癌，结直肠癌，肺癌，黑素瘤或卵巢癌。在另外的方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体癌症的如本文所述的重组溶瘤病毒或药物组合物。

在一些方面，本发明提供了通过使肿瘤与如本文所述的重组溶瘤病毒接触而将免疫细胞募集至肿瘤的方法。

在一些方面，本发明提供了通过使肿瘤细胞与如本文所述的重组溶瘤病毒接触来抑制肿瘤细胞的生长或促进杀死肿瘤细胞的方法。重组溶瘤病毒可以以足以引起肿瘤细胞死亡的剂量进行提供。

以上内容可能未包括本发明的所有特征。

附图说明

结合以下附图说明以及参考附图，进一步说明本发明的特点，其中：

图1A显示的是对重组溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV)和痘苗病毒(VV)产生的趋化因子CXCL10进行确认的图。

图1B显示的是对重组溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV)和痘苗病毒(VV)产生的趋化因子CXCL13进行确认的图。

图2A显示的是用于确定小鼠乳腺肿瘤细胞中VSV-CXCL13的免疫细胞募集和群集形成的实验方法的示意图。

图2B显示了注射PBS，VSV-GFP和VSV-CXCL13之后，在小鼠乳腺肿瘤细胞中含有B细胞的淋巴簇的数量。

图3A显示的是用于确定VSV-CXCL13在乳腺癌小鼠模型中的治疗功效的实验方法的示意图。

图3B显示的是响应于肿瘤内PBS的肿瘤大小。

图3C显示的是响应于肿瘤内VSV-GFP的肿瘤大小。

图3D显示的是响应于肿瘤内VSV-CXCL13的肿瘤大小。

图3E显示的是用瘤内PBS，VSV-GFP或VSV-CXCL13注射处理的小鼠存活比较图。

图4A是用于确定VSV-CXCL10在小鼠乳腺肿瘤细胞中的治疗功效的实验方法的示意图。

图4B显示的是响应于肿瘤内PBS的肿瘤大小。

图4C显示的是响应于肿瘤内VSV-GFP的肿瘤大小。

图4D显示的是响应于肿瘤内VSV-CXCL10的肿瘤大小。

图4E显示的是用肿瘤内PBS，VSV-GFP或VSV-CXCL10处理的小鼠存活的比较图。

图5A显示缺失3'UTR的鼠CXCL10的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。将该序列克隆到VSV-d51质粒中以产生VSV-CXCL10。

图5B显示的是鼠CXCL10的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图5C显示的是人CXCL10cDNA的核苷酸序列，NCBI参考序列：NM_001565.1(SEQ IDNO：3)。

图5D显示的是人CXCL10的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_001556.2(SEQ ID NO：4)。

图5E显示的是缺失3'UTR的鼠CXCL13的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。将该序列克隆到VSV-d51质粒中以产生VSV-CXCL13。

图5F显示的是鼠CXCL13的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图5G显示的是人CXCL13cDNA的核苷酸序列，NCBI参考序列：NM_006419.2(SEQ IDNO：7)。

图5H显示的是人CXCL13的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_006410.1(SEQ ID NO：8)。

图5I显示的是鼠CXCL12cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

图5J显示的是鼠CXCL12的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

图5K显示的是人CXCL12变体2cDNA的核苷酸序列，NCBI参考序列：NM_000609.6(SEQ ID NO：11)。

图5L显示的是人CXCL12变体1cDNA的核苷酸序列，NCBI参考序列：NM_000609.3(SEQ ID NO：12)。

图5M显示的是人CXCL12-β多肽的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_000600.1(SEQID NO：13)。

图5N显示的是人CXCL12-α多肽的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_954637.1(SEQID NO：14)。

图5O显示的是人CXCL12-γ多肽的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_001029058.1(SEQ ID NO：15)。

图5P显示的是人CXCL12-δ多肽的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_001171605.1(SEQ ID NO：16)。

图5Q显示的是人CXCL12-同种型5多肽的氨基酸序列，NCBI参考序列：NP_001264919.1(SEQ ID NO：17)。

具体实施方式

本发明涉及重组溶瘤病毒。更具体而言，本发明公开部分涉及表达异源B细胞和/或T细胞引诱剂多肽的重组溶瘤病毒及其用途。

B细胞引诱剂多肽

本发明中，“B细胞引诱剂多肽”是指能够将B细胞募集至特定位置的多肽。在一些实施方式中，所述位置可以是能够支持溶瘤病毒复制的位置。在一些实施方式中，所述位置可以是实体瘤。

在一些实施方式中，与不存在B细胞引诱剂多肽的特定位置例如实体瘤的B细胞数量相比，由溶瘤病毒编码的B细胞引诱剂多肽可以使该特定位置的B细胞总数增加至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％或更多。在一些实施方式中，与不存在B细胞引诱剂多肽的特定位置例如实体瘤的B细胞数量相比，由溶瘤病毒编码的B细胞引诱剂多肽可以使该特定位置的B细胞总数增加至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或更多。在一些实施方式中，如本文中公开的B细胞引诱剂多肽可以诱导在特定位置例如实体瘤中形成B细胞簇(“B细胞簇”)。本发明中，“B细胞簇”是指在特定位置(例如实体瘤)中的淋巴细胞(主要是B细胞)的聚集体。应该理解的是，在一些实施方式中，B细胞簇可以包括少量的T细胞或其他细胞。在一些实施方式中，B细胞簇可以包含少于10％的T细胞。在一些实施方式中，B细胞簇可能缺乏三级淋巴结构(TLS)例如结构组织方面的特征。因此，在一些实施方式中，如本文中公开的B细胞引诱剂多肽可以诱导B细胞簇而不是TLS的形成。B细胞簇的存在可以通过使用例如免疫组织化学技术来确定免疫细胞(诸如实体瘤中的T细胞或B细胞)的存在来确定。在一些实施方式中，B细胞簇的存在可以通过与可能已经或未曾暴露于B细胞引诱剂多肽的样品(例如实体肿瘤样品)进行对比来确定。

在一些实施方式中，如本文中公开的B细胞引诱剂多肽可以是生物活性片段。本发明中，“生物活性片段”是指B细胞引诱剂多肽的一部分，其比全长多肽短一个或多个残基，并且能够将B细胞募集至特定位置，如固体瘤。

如本文所公开的，B细胞引诱剂多肽可以是趋化因子，例如稳态趋化因子(homeostatic chemokine)。在一些实施方式中，如本文中公开的B细胞引诱剂多肽可以是CXCL12或CXCL13或其生物活性片段。在一些实施方式中，如本文中公开的B细胞引诱剂多肽可以包括但不限于是具有与CXCL12或CXCL13序列基本上相同序列的多肽。

在一些实施方式中，CXCL12多肽可以具有与SEQ ID NO.10、13-17所示的一个或多个序列，或MGI OTTMUSP00000026114或NCBI参考编号NP_000600.1，NP_954637.1，NP_001029058.1，NP_001171605.1或NP_001264919.1中所述的一个或多个序列相同或基本上相同的序列。

在可选的实施方式中，CXCL12多肽可以具有如SEQ ID NO.9、11或12所示的一个或多个序列，或MGI OTTMUST00000054664或NCBI参考编号NM_000609.6或NM_000609.3中所述的序列编码的序列，或与其基本相同的序列。

在可选的实施方式中，CXCL12核酸分子可以具有与SEQ ID NO.9、11或12所示的一个或多个核酸序列，或MGI OTTMUST00000054664或NCBI参考编号NM_000609.6或NM_000609.3所示的序列或其片段(例如缺失3'UTR的cDNA片段)相同或基本相同的序列。

在一些实施方式中，CXCL13多肽可以具有与SEQ ID NO 6或8所示的序列，或MGIOTTMUSP00000072614或NCBI参考编号NP_006410.1中所述的序列相同或基本相同的序列。

在可选的实施方式中，CXCL13多肽可以具有由SEQ ID NO.5或7所示的一个或多个序列，或OTTMUST00000138021或NCBI参考编号NM_006419.2中所述的序列，或其片段(例如缺失3'UTR的cDNA片段)编码的序列，或与其基本上相同的序列。

在可选的实施方式中，CXCL13核酸分子可以具有由SEQ ID NO.5或7所示的一个或多个核酸序列，或OTTMUST00000138021或NCBI参考编号NM_006419.2中所述的序列，或其片段(例如缺失3'UTR的cDNA片段)编码的序列，或与其基本上相同的序列。

T细胞引诱剂多肽

本发明中，“T细胞引诱剂多肽”是指能够将T细胞募集至特定位置的多肽。在一些实施方式中，所述位置可以是能够支持溶瘤病毒复制的位置。在一些实施方式中，该位置可以是实体瘤。

在一些实施方式中，与不存在T细胞引诱剂多肽的特定位置例如实体瘤的T细胞数量相比，由溶瘤病毒编码的T细胞引诱剂多肽可以使该特定位置的T细胞总数增加至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％或以上。在一些实施方式中，与不存在T细胞引诱剂多肽的特定位置例如实体瘤的T细胞数量相比，由溶瘤病毒编码的T细胞引诱剂多肽可以使特定位置中的T细胞总数增加至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或更多。在一些实施方式中，如本文中公开的T细胞引诱剂多肽可以诱导在特定位置例如实体瘤中形成B细胞簇(“T细胞簇”)。本发明中，“T细胞簇”是指在特定位置(例如实体瘤)中的淋巴细胞(主要是T细胞)的聚集体。应该理解的是，在一些实施方式中，T细胞簇可以包括少量的B细胞或其他细胞。在一些实施方式中，T细胞簇可以包含少于10％的B细胞。在一些实施方式中，T细胞簇可能缺乏三级淋巴结构(TLS)例如结构组织方面的特征。因此，在一些实施方式中，如本文中公开的T细胞引诱剂多肽可以诱导T细胞簇而不是TLS的形成。T细胞簇的存在可以通过使用例如免疫组织化学技术来确定免疫细胞(诸如实体瘤中的T细胞或B细胞)的存在来确定。在一些实施方式中，T细胞簇的存在可以通过与可能已经或未曾暴露于T细胞引诱剂多肽的样品(例如实体肿瘤样品)进行对比来确定。

在一些实施方式中，如本文中公开的T细胞引诱剂多肽可以是生物活性片段。本发明中，“生物活性片段”是指T细胞引诱剂多肽的一部分，其比全长多肽短一个或多个残基，并且能够将T细胞募集至特定位置，例如固体瘤。

如本文所公开的T细胞引诱剂多肽可以是趋化因子，例如CXCL10多肽。

在一些实施方式中，CXCL10多肽可以具有与SEQ ID NO.2或4所示的序列，或如OTTMUSP00000036424或NCBI参考编号NP_001556.2中所述的序列相同或基本相同的序列。

在可选的实施方式中，CXCL10多肽可以具有由SEQ ID NO.1或3所示的一个或多个序列，或如OTTMUSG00000028740或NCBI参考编号NM_001565.1所示的序列，或其片段(例如缺失3'UTR的cDNA片段)编码的序列，或与其基本上相同的序列。

在可选的实施方式中，CXCL10核酸分子可以具有由SEQ ID NO.1或3所示的一个或多个核酸序列，或OTTMUSG00000028740或NCBI参考编号NM_001565.1中所述的序列，或其片段(例如缺失3'UTR的cDNA片段)编码的序列，或与其基本上相同的序列。

基本上相同的序列

本发明中“基本上相同”是指不同于参考序列(例如CXCL10，CXCL12或CXCL13序列)的氨基酸或核苷酸序列，序列差异仅在于一个或多个保守替换、或在序列中不破坏氨基酸或核酸分子的生物学功能的位置处的一个或多个非保守取代，缺失或插入。例如采用Align程序(Myers和Miller，CABIOS，1989，4：11-17)或FASTA，对这一序列在氨基酸或核苷酸水平上进行最优比对，该序列可与用于比较的序列约45％至约99％中的任意值，或一般至少为45％，48％，50％，52％，55％，57％或60％，或至少63％，65％，68％，70％，70％，75％，77％，80％，85％，90％或95％，或高达96％，97％，98％或99％相同。对于多肽，比较序列的长度可以是至少10，15，20，25或30个氨基酸。在可替代的实施方式中，比较序列的长度可以是至少35，40或50个氨基酸，或者超过60，80或100个氨基酸。对于核酸分子，比较序列的长度可以是至少15，20，25，30，40或50个核苷酸。在可替代的实施方式中，比较序列的长度可以是至少60，70，80或90个核苷酸，或者超过100，200或500个核苷酸。利用公知的可获得的序列分析软件(例如威斯康星大学生物技术中心Genetics Computer Group提供的序列分析软件包，大学路1710，麦迪逊，威斯康星洲53705，或美国国家医学图书馆提供的BLAST软件，或如本文所述的软件)可容易地对序列同一性进行测定。有用的软件的例子包括Pile-up和PrettyBox程序。这种软件通过为各种取代，缺失，取代和其他修饰分配同源性程度来匹配相似的序列。

或者，或另外地，如果两个核酸序列在高严格条件下杂交，则它们可以是“基本上相同的”。在一些实施方式中，高严格条件是例如允许与在下述条件中进行的杂交具有杂交可比性的条件，即在含有0.5M NaHPO₄，pH7.2，7％SDS，1mM EDTA，和1％BSA(第五组分(fraction V))的缓冲液中使用至少500个核苷酸长度的DNA探针在65℃下发生的杂交，或在含有48％甲酰胺，4.8×SSC，0.2M Tris-Cl，pH 7.6，1×Denhardt's溶液，10％葡聚糖硫酸酯/盐和0.1％SDS的缓冲液中使用至少500个核苷酸长度的DNA探针在42℃下发生的杂交(这些是高严格度Northern或Southern杂交的典型条件)。杂交可以进行约20至30分钟，或约2至6小时，或约10至15小时，或超过24小时或更长的时间。高严格杂交也依赖于分子生物学家常规进行的大量技术的成功，例如高严格PCR，DNA测序，单链构象多态性分析和原位杂交。与Northern杂交和Southern杂交相反，这些技术通常采用相对较短的探针(例如对于PCR或测序来说通常约为16个核苷酸或更长，对于原位杂交来说约为40个核苷酸或更长)进行。这些技术中使用的高严格条件是分子生物学领域技术人员熟知的，有关例子可以在例如Ausubel等人(24)中找到。

例如，基本上相同的序列可以是与本文所述的小鼠或人CXCL10，CXCL12或CXCL13序列或与在任何哺乳动物物种中发现的同源序列基本上相同的序列。

溶瘤病毒

溶瘤病毒(OVs)是在癌细胞中选择性复制的病毒。因此，OVs可能能够诱导癌细胞的死亡，而对非癌细胞不产生显著影响。

本发明中，“溶瘤RNA病毒”是指具有核糖核酸(RNA)作为其遗传物质，并通过例如刺激干扰素的产生来诱导发炎的溶瘤病毒。在一些实施方式中，溶瘤RNA病毒在肿瘤或癌细胞中不持续相当长的时间，即短暂存在。例如，在一些实施方式中，溶瘤RNA病毒可以以比最后一次接种后约24小时至约72小时的接种物的量少3至5个数量级的水平存在于肿瘤或癌细胞中。在一些实施方式中，溶瘤RNA病毒可以以比最后一次接种后约24小时至约72小时的接种物的量低1，2，3，4或5个数量级的水平存在于肿瘤或癌细胞中。在一些实施方式中，溶瘤RNA病毒可以以比最后一次接种后约24小时至约72小时的接种物的量低大于5个数量级的水平存在于肿瘤或癌细胞中。应当理解的是，在最后一次接种后7天，肿瘤或癌细胞中可能存在微量的溶瘤RNA病毒(例如，与感染后1天存在的量相比少于10％)。在一些实施方式中，在最后一次接种后约14天后检测肿瘤或癌细胞中的溶瘤RNA病毒，可以是完全清除，即使用标准检测技术是检测不到的。

溶瘤RNA病毒包括但不限于水泡性口炎病毒(VSV)，马拉巴病毒，呼肠孤病毒，麻疹病毒，脊髓灰质炎病毒或新城疫病毒。

在一些实施方式中，溶瘤RNA病毒经过减毒的，即不致病或不能引起疾病，但保留其感染癌细胞和刺激免疫应答的能力。

在一些实施方式中，VSV可以包括但不限于VSV印第安纳株(Indiana strain)。

在一些实施方式中，VSV可以包括但不限于在M蛋白中包含突变的VSV。

在一些实施方式中，VSV可包括但不限于在M蛋白中包含δ-51突变的VSV，例如Stojdl，DF等人(21)所描述的。在一些实施方式中，VSV可以包括但不限于具有NCBI参考序列NC_001560.1中所述序列，并且还进一步包括M蛋白中甲硫氨酸51的缺失的VSV。

在一些实施方式中，马拉巴病毒可以包括但不限于具有NCBI参考序列：NC_025255.1中所述序列的马拉巴病毒。在一些实施方式中，马拉巴病毒可以包括但不限于分别在NCBI参考序列NC_025255.1中所述序列的M蛋白和G蛋白中具有L123W和Q242R突变的马拉巴病毒(2)。

在一些实施方式中，溶瘤病毒包括溶瘤DNA病毒。本发明中，“溶瘤DNA病毒”是指具有脱氧核糖核酸(DNA)作为其遗传物质的溶瘤病毒。在一些实施方式中，溶瘤DNA病毒可以比溶瘤RNA病毒复制更慢。在一些实施方式中，溶瘤DNA病毒可以比溶瘤RNA病毒在肿瘤中持续时间更长。在一些实施方式中，溶瘤DNA病毒可能不是I型干扰素的有效刺激物。

溶瘤DNA病毒包括但不限于痘苗病毒(VV)，单纯疱疹病毒(HSV)或腺病毒。

在一些实施方式中，VV可以包括但不限于痘苗病毒Western Reserve菌株(GenBank：AY243312.1)，痘苗病毒Acambis 2000(GenBank：AY313847.1)。在一些实施方式中，VV可以包括但不限于在胸苷激酶(TK)基因座中由于插入异源序列而在该基因座处具有减毒突变的痘苗病毒。

本文所述的“重组溶瘤病毒”是指表达异源B细胞引诱剂多肽或异源T细胞引诱剂多肽的溶瘤RNA病毒或溶瘤DNA病毒。

本文所述的“重组”是指核酸或氨基酸序列的修饰，产生天然不存在的产物。当涉及核酸构建体时，该术语是指由连接在一起的核酸序列组成的或通过分子生物学技术产生的分子。当涉及蛋白质或多肽时，术语“重组”是指使用通过分子生物学技术设计的重组核酸构建体表达的蛋白质或多肽分子。重组核酸构建体可以包括与天然不连接的、或者天然在不同位置连接的核酸序列连接的或通过被操控而连接的核苷酸序列。因此，将核酸构建体称作“重组”，表示该核酸分子已经通过基因工程，即通过人为干预来进行操控。重组核酸构建体可以例如通过本文描述的或本领域已知的任何合适手段引入宿主细胞。这样的重组核酸构建体可以包括来自相同宿主细胞物种或来自不同宿主细胞物种的序列，所述序列被分离并重新引入宿主物种的细胞中。重组核酸构建体序列可整合(“稳定整合”)到宿主细胞基因组中。例如由于宿主细胞的原始转化或作为随后发生的重组和/或修复的结果而形成的溶瘤病毒基因组。

“异源”是指通过人为干预而被操控的核酸或多肽分子，以使其位于天然发现的位置以外的位置。例如，来自一个物种的核酸序列可以被引入到另一个物种的基因组中，或者来自一个基因组位点的核酸序列可以被移到相同物种的另一个基因组位点。异源蛋白质包括，例如，由异源编码序列表达的蛋白质，或者在不会天然表达蛋白质的细胞中由重组基因表达的蛋白质。

当与溶瘤病毒联合使用时，术语“重组”表示所述溶瘤病毒已经通过引入异源核酸序列进行修饰，从而使得到的重组溶瘤病毒表达无论是野生型还是减毒的溶瘤病毒通常不表达的蛋白或多肽。在一些实施方式中，重组溶瘤病毒可被设计以表达多于一种异源核酸序列。

例如，可以通过在VSV基因组中的G蛋白和L蛋白之间或在任何两个相邻的VSV基因之间插入异源核酸序列来产生重组VSV。在一些实施方式中，VSV可以在M蛋白中具有突变，或在VSV蛋白中具有可以赋予肿瘤选择性的其他突变。在一些实施方式中，M蛋白上的突变可以是例如在甲硫氨酸51位的缺失。

例如，可以通过将异源核酸序列插入胸苷激酶基因座、或痘苗生长因子(VGF)基因座、或基因破坏将赋予肿瘤选择性的任何其他基因座中来产生减毒重组VV。

在一些实施方式中，异源核酸序列可以包括cDNA的5'UTR，完整的编码序列和终止密码子。在一些实施方式中，如果缺失3'UTR能够改善异源核酸序列的表达，则该异源核酸序列可以不含3'UTR。在一些实施方式中，可将另外的异源3'UTR序列引入异源核酸序列cDNA中以改善mRNA的翻译。在一些实施方式中，另外的异源3'UTR序列可以是合成序列，如在Levitt，N等人(9)中所描述的。

当溶瘤病毒是VV时，可以将异源核酸序列置于VV合成早期/晚期启动子的控制下，其序列为：

AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA(SEQ ID NO：18)。

因此，在一些实施方式中，本发明的重组溶瘤病毒是指已被修饰以表达B细胞引诱剂多肽的溶瘤RNA或DNA病毒，包括但不限于VSV-CXCL12，VV-CXCL12，VSV-CXCL13或VV-CXCL13。

在一些实施方式中，本发明的重组溶瘤病毒是指已被修饰以表达T细胞引诱剂多肽的溶瘤RNA或DNA病毒，包括但不限于所述的VSV-CXCL10或VV-CXCL10病毒。

应该理解的是，虽然在特定位置接种一段时间后，可能检测不到表达异源多肽的重组溶瘤病毒，但异源多肽可以由例如经该重组溶瘤病毒募集至该特定位置的免疫细胞持续地表达，因此可以检测到异源多肽。

癌症

本发明所述的重组溶瘤病毒可用于将B细胞和/或T细胞募集至实体癌症，肿瘤或赘生物(neoplasm)。“癌症”，“肿瘤”或“赘生物”是指不起任何生理功能的不希望的细胞生长。一般来说，赘生物(即肿瘤)的细胞已经从其正常的细胞分裂控制中释放出来，即其生长不受细胞环境中普通的生化和物理影响调控。在大多数情况下，赘生物细胞增殖形成良性或恶性细胞的克隆。癌症或赘生物的例子包括但不限于转化的和无限增殖化细胞，肿瘤和癌，例如乳腺癌和前列腺癌。术语癌症包括技术上良性但具有恶化风险的细胞生长。

“恶性”是指任何细胞类型或组织的异常生长。术语恶性包括技术上良性但具有恶变风险的细胞生长。该术语还包括任何癌症，癌(carcinoma)，赘生物(neoplasm)，瘤形成(neoplasia)或肿瘤。大多数癌症属于三个广泛的组织学分类：癌(carcinoma)，其是主要的癌症，且是覆盖器官，腺体或其他身体结构(例如皮肤，子宫，肺，乳腺，前列腺，胃，肠)的外表面或内表面的上皮细胞或细胞的癌症，并且倾向于转移；肉瘤，其来源于结缔组织或支持组织(例如，骨，软骨，肌腱，韧带，脂肪，肌肉)；以及来自骨髓和淋巴组织的血液肿瘤。癌可以是腺癌(一般在能够分泌的器官或腺体中发展，如乳腺，肺，结肠，前列腺或膀胱)，或者可以是鳞状细胞癌(起源于鳞状上皮并且通常在身体大部分区域发展)。肉瘤可以是骨肉瘤或成骨性肉瘤(骨)，软骨肉瘤(软骨)，平滑肌肉瘤(平滑肌)，横纹肌肉瘤(骨骼肌)，间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜内衬(membranous lining))，纤维肉瘤(纤维组织)，血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)，脂肪肉瘤(脂肪组织)，神经胶质瘤或星形细胞瘤(发现于脑中的神经原性结缔组织)，粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)，或间充质瘤(mesenchymous)或混合性中胚叶肿瘤(混合结缔组织类型)。此外，还存在混合型癌症，如腺鳞癌，混合中胚叶肿瘤，癌肉瘤或畸胎瘤。

癌症还可以基于它们起源的器官命名，即“原发部位”，例如乳腺癌，脑癌，肺癌，肝癌，皮肤癌，前列腺癌，睾丸癌，膀胱癌，结直肠癌，宫颈癌，子宫癌等等。即使癌症转移到身体的另一个不同于原发部位的部分，这个命名依然存在。根据原发部位进行命名的癌症可能与组织学分类相关。例如，肺癌通常是小细胞肺癌或非小细胞肺癌，其可以是鳞状细胞癌，腺癌或大细胞癌；皮肤癌通常是基底细胞癌，鳞状细胞癌或黑素瘤。淋巴瘤可能出现在与头，颈和胸部相关的淋巴结，以及腹部淋巴结或腋窝或腹股沟淋巴结中。癌症的类型和阶段的鉴定和分类可以通过使用例如国家癌症研究所(http://seer.cancer.gov/publicdata/access.html)的监测、流行病学和最终结果(SEER)计划提供的信息，这是美国癌症发病率和生存率信息的权威来源，在全世界范围得到公认。SEER计划目前收集和发布了14个基于人口的癌症登记处和3个补充登记处的癌症发病率和生存率数据，覆盖了美国约26％的人口。该计划定期收集病人的人口统计资料，原发肿瘤部位，形态学，诊断阶段，治疗的第一个疗程和生存状态的后续跟踪，是美国唯一基于人口信息的综合来源，包括诊断时的癌症阶段和每个阶段的生存率。SEER数据库包含超过300万个原位癌和浸润性癌症病例的信息，SEER覆盖的区域每年新增约17万个病例。SEER计划的发病率和生存率数据可用于获取特定癌症部位和阶段的标准生存期。例如，为了确保最佳对照组，可以从数据库中选择特定标准，包括诊断日期和准确阶段。

以下列出了原发癌及其二次传播(转移)的常见部位的一些非限制性例子：

在一些实施方式中，本公开内容包括受益于B细胞募集的癌症，如乳腺癌，结直肠癌，肺癌，黑素瘤或卵巢癌。在一些实施方式中，本公开包括受益于T细胞募集的癌症。不受任何特定理论的束缚，由溶瘤病毒产生的外源CXCL10可能特别适用于CXCL10表达已通过遗传或表观遗传手段沉默的癌症。

药物和兽用组合物，剂量和给药

如本文所述的重组溶瘤病毒可以以适合向个体给药的形式与载体(如药学上可接受的载体)配制而成。在一些实施方式中，可以使用离体技术(ex vivo techniques)。例如，在一些实施方式中，载体可以是离体感染的自体肿瘤细胞，如在Lemay CG等人(8)中所描述的。

本发明所述的个体可以是人，非人灵长类，大鼠，小鼠，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫等。个体可以是临床患者，临床试验志愿者，实验动物等。个体可以是有患癌症或赘生物的风险，或可以是被诊断为患有癌症或赘生物，或者可以是被确认为不患癌症或赘生物的对照个体。癌症或赘生物的诊断方法和这种诊断的临床描述对于本领域的普通技术人员是已知的。

表达异源多肽(例如CXCL10，CXCL12或CXCL13)的重组溶瘤病毒可以施用于个体。例如，个体可被施用一种或多种重组溶瘤病毒，例如VSV或VV，每种病毒表达CXCL10，CXCL12或CXCL13中的一种或多种。

在一些实施方式中，如本文所述的重组溶瘤RNA病毒，如VSV-CXCL12或VSV-CXCL13病毒，可以单独提供或与其他化合物(例如，核酸分子，小分子，肽，肽类似物或重组溶瘤DNA病毒)联合提供。例如，VSV-CXCL12或VSV-CXCL13病毒可以与VV-CXCL12，VV-CXCL13病毒，VSV-CXCL10病毒和/或VV-CXCL10病毒组合提供。

如果需要，利用本发明所述的重组溶瘤RNA病毒进行的治疗可以与用于癌症或赘生物的更传统的和现有的治疗方法相结合。本发明所述的重组溶瘤RNA病毒可以长期或间歇性地提供。“长期”给药是指以与急性模式相反的方式连续给药，从而维持最初的治疗效果(活性)至很长一段时间。“间歇性”给药是指治疗并非连续不间断地进行，而实际上是循环性的。

可以采用常规制药方法来提供合适的制剂或组合物，以通过例如注射或吸入的方式给患有或疑似患有癌症或肿瘤的个体施用重组溶瘤RNA病毒。可以使用任何适当的给药途径，例如肠胃外，静脉内，皮下，颅内，眼眶内，眼，心室内，囊内，脊柱内，鞘内，脑池内，腹膜内，鼻内，气雾剂，局部或给药。治疗制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；用于鼻内的制剂，可以是滴鼻剂或气雾剂的形式。

本领域公知的用于制备制剂的方法见例如“Remington's PharmaceuticalSciences”(第19版)，ed.A.Gennaro，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa。用于肠胃外给药的制剂可以例如含有赋形剂，无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物来源的油或氢化萘。可以使用生物相容的，可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯醚共聚物来控制化合物的释放。其他可能有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚，甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是以滴鼻剂形式给药的油性溶液。对于治疗组合物，化合物以足以阻止或减缓癌症或赘生物的量施用于个体。

“治疗有效量”是指以必要的剂量和时间内达到所需治疗结果的有效量，例如阻止或减缓癌症或赘生物的量。化合物的治疗有效量可以根据多种因素调整，诸如个体的疾病状态，年龄，性别和体重，化合物在个体中引起期望反应的能力。可以调整给药方案以获得最佳治疗反应。治疗有效量也是化合物的治疗有益效果超过任何毒性或有害作用情况下的量。在一些实施方式中，治疗有效量可以是每千克个体中本发明重组溶瘤病毒为1e4，1e5，1e6，1e7，1e8，1e9，1e10，1e11，1e12，1e13，1e14，1e15或更多蚀斑形成单位(pfu)。

应当指出的是，剂量值可以随待缓解的病症的严重程度或特定的重组溶瘤病毒而变化。对于任何特定的个体，可根据个体需要和给药或监督给药的人的专业判断，随着时间的推移调整具体的给药方案。本文中给出的剂量范围仅是示例性的，并不限制医师可以选择的剂量范围。组合物中活性的重组溶瘤病毒的量可以根据诸如个体的疾病状态，年龄，性别和体重等因素而变化。可以调整给药方案以获得最佳的治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以随着时间的推移施用数个分开的剂量，或者可以按照治疗情况的紧急程度所指示的成比例地减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物，对方便施用和剂量的均匀性可能是有利的。

使用方法

如本文所述的重组溶瘤病毒可用于抑制肿瘤的生长，促进杀死肿瘤细胞，或将免疫细胞(例如T细胞或B细胞)募集至肿瘤。

所述“抑制肿瘤生长”是指与不存在重组溶瘤病毒的肿瘤相比，在如本文所述的重组溶瘤病毒的存在下，将相似肿瘤的大小降低10％至90％之间的任意值，或30％至60％之间的任意值，或超过100％，或降低1倍，2倍，5倍，10倍或更多。应该理解的是，抑制不需要完全抑制。

所述“促进杀死肿瘤细胞”是指与不存在重组溶瘤病毒的肿瘤相比，在如本文所述的重组溶瘤病毒的存在下，致使肿瘤细胞的死亡量增加10％至90％之间的任意值，或增加30％至60％之间的任意值，或超过100％，或增加1倍，2倍，5倍，10倍，15倍，25倍，50倍，100倍或更多。应该理解的是，杀死并不需要所有的肿瘤细胞都被杀死。

所述“募集免疫细胞至肿瘤”是指与不存在重组溶瘤病毒的情况相比，在如本文所述的重组溶瘤病毒的存在下，免疫细胞(例如T细胞或B细胞)的数量增加10％至90％之间的任意值，或30％至60％之间的任意值，或超过100％，或增加1倍，2倍，5倍，10倍，15倍，25倍，50倍，100倍或更多。

如本文所述的或本领域已知的任何合适的测定方法都可以使用。例如，Westernblotting可以用来检测被感染的细胞产生的异源蛋白质；B细胞的运动可以通过transwell迁移测定来确定，并且使用特异性单克隆抗体来阻止迁移来评估迁移的特异性。NOP乳腺癌动物模型可用于通过向小鼠注射病毒并监测肿瘤的生长，来评估重组病毒增强抗肿瘤功效的能力。可以在连续的时间点处死小鼠，以比较肿瘤浸润B细胞的数量和活化状态，并使用流式细胞术和/或多色免疫组织化学监测淋巴簇的形成。

通过以下实施例对本发明进行进一步说明。

实施例

重组病毒的制备

我们将趋化因子CXCL10和CXCL13构建进VSV和VV的减毒株。在VSV重组病毒中，趋化因子插入VSV基因组中的G蛋白和L蛋白之间。对于VV重组病毒，趋化因子插入胸苷激酶基因座。对于这两种病毒，转基因包括cDNA的5'UTR，完整的编码序列和终止密码子，缺失3'UTR。我们使用PCR克隆技术将鼠CXCL13(mCXCL13)基因插入到VSV中。我们从由小鼠脾细胞提取的mRNA制备的cDNA来进行扩增。扩增的引物包括允许插入VSV病毒基因组的限制性酶切位点。在获得重组VSV克隆后，通过Sanger测序证实了mCXCL13的成功插入。由DNA构建体产生重组VSV-mCXCL13病毒。对于VV，我们也从对来自小鼠脾细胞cDNA采用PCR扩增DNA，用于产生mCXCL13。在这种情况下，设计PCR引物使得它们允许将mCXCL13插入VV病毒基因组中。另外，VV的左引物被设计为含有合成启动子，以促使在被重组病毒感染的靶细胞中mCXCL13的高表达。

将趋化因子基因克隆到重组溶瘤病毒质粒中

更具体地，为了从活化的小鼠脾细胞中分离cDNA，将新鲜获得的小鼠脾脏用注射器柱塞的钝端捣碎，然后通过100μm筛网过滤。将脾细胞沉淀(pelleted)并重悬于ACK裂解缓冲液中。在室温孵育5分钟后，洗涤细胞，重悬于完全RPMI培养基中，然后通过40μm过滤器过滤。在完全RPMI培养基中以1-2×10⁶个细胞/mL的浓度生长脾细胞。使用ConcavalinA(Sigma-Aldrich)以1μg/mL的浓度刺激细胞。将细胞孵育48小时，然后通过离心沉淀，并以含有的1％β-巯基乙醇的RLT Plus(Qiagen)缓冲液重悬，再进行均质化。按照制造商的方案，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)从匀浆中提取RNA。按照制造商的方案使用qScript ^TM cDNA SuperMix(Quanta Biosciences)由RNA制备cDNA。

表1中的引物用于从小鼠总cDNA扩增缺失3'UTR的CXCL10和CXCL13cDNA。对于VSV克隆，设计引物以包含xhol和Nhel限制性位点。对于痘苗病毒克隆，设计引物以包含spel限制性位点。另外，痘苗病毒左引物含有合成的痘苗病毒早期/晚期启动子：AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA(SEQ ID NO：18；3)以促使趋化因子基因的高表达。所有引物均购自Integrated DNATechnologies。使用高保真Q5聚合酶(NEB)进行PCR。

表1

使用标准克隆技术将VSV构建体克隆到VSV-d51质粒中(21)，将痘苗病毒构建体克隆到pSEM-1质粒中(19)。VSV-d51质粒允许在G和L基因之间插入转基因，pSEM-1质粒允许胸苷激酶(TK)基因座中插入转基因。一旦趋化因子表达构建体被克隆到它们各自的重组病毒质粒中，对趋化因子构建体进行测序(Genscript)以确保在继续产生重组病毒之前没有错误。

趋化因子构建体经确定至少具有以下序列：

缺失3'UTR的mCXCL10cDNA：

GAGAAGCGCTTCATCCACCGCTGAGAGACATCCCGAGCCAACCTTCCGGAAGCCTCCCCATCAGCACCATGAACCCAAGTGCTGCCGTCATTTTCTGCCTCATCCTGCTGGGTCTGAGTGGGACTCAAGGGATCCCTCTCGCAAGGACGGTCCGCTGCAACTGCATCCATATCGATGACGGGCCAGTGAGAATGAGGGCCATAGGGAAGCTTGAAATCATCCCTGCGAGCCTATCCTGCCCACGTGTTGAGATCATTGCCACGATGAAAAAGAATGATGAGCAGAGATGTCTGAATCCGGAATCTAAGACCATCAAGAATTTAATGAAAGCGTTTAGCCAAAAAAGGTCTAAAAGGGCTCCTTAA(SEQ ID NO:1)

缺失3'UTR的mCXCL13cDNA：

GAGCTAAAGGTTGAACTCCACCTCCAGGCAGAATGAGGCTCAGCACAGCAACGCTGCTTCTCCTCCTGGCCAGCTGCCTCTCTCCAGGCCACGGTATTCTGGAAGCCCATTACACAAACTTAAAATGTAGGTGTTCTGGAGTGATTTCAACTGTTGTCGGTCTAAACATCATAGATCGGATTCAAGTTACGCCCCCTGGGAATGGCTGCCCCAAAACTGAAGTTGTGATCTGGACCAAGATGAAGAAAGTTATATGTGTGAATCCTCGTGCCAAATGGTTACAAAGATTATTAAGACATGTCCAAAGCAAAAGTCTGTCTTCAACTCCCCAAGCTCCAGTGAGTAAGAGAAGAGCTGCCTGA(SEQ ID NO:5)

重组VSV的制备

为了产生重组VSV，我们使用了现有的重组病毒拯救方案(7)。将在2ml完全培养基(500ml高葡萄糖(4500mg/L)DMEM，50ml热灭活的胎牛血清，青霉素/链霉素各5ml，2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific)中的5e5 Vero(ATCC CCL-81)细胞/孔接种在6孔组织培养板中。24小时后细胞形成汇合单层，除去培养基，每孔加入含有MOI为5(5e6pfu)的表达T7的牛痘(VV-T7)的100μl无血清高葡萄糖DMEM培养基，进行感染。感染2小时后，制备含有如下成分的转染混合物：1μg/孔的VSV-N质粒，VSV-P质粒1.25μg/孔，VSV-L质粒0.25μg/孔，重组VSV基因组质粒4μg/孔。在Opti-MEM低血清培养基(Thermo FisherScientific)中，将每孔中的转染物最终体积补足至250μl。

在另一个试管中，将5μl lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)加入到250μl Opti-MEM中。将质粒和lipofectamine溶液混合在一起，在室温下孵育10-20分钟。

将经VV-T7感染的孔中的上清液通过吸出接种物去除，并将500μl/孔的转染混合物直接滴加到细胞上。一个VV-T7感染的孔未转染，作为阴性对照。将板在转染溶液中在37℃下孵育4-5小时。孵育后，将转染溶液吸出，加入2ml/孔的完全培养基。将板孵育2天。

孵育2天后，收集培养物，并以1600RPM离心10分钟以沉淀细胞碎片。然后使上清液通过0.2μm过滤器以除去任何痘苗病毒污染物。

将1ml澄清上清液加到6孔组织培养板的6e5Vero细胞/孔的新鲜融合层上，并在37℃下孵育24-48小时。24-48小时内细胞死亡表明成功的重组病毒拯救。

将成功拯救的孔汇集在一起，并在-80℃冷冻。这些库存被用来产生实验中随后使用的病毒。

重组VSV中趋化因子表达的确认

将每孔2mL完全培养基中含有的6e5Vero细胞铺在6孔组织培养板中。第二天，除去培养基，用含有拯救的重组VSV-CXCL13的上清液感染细胞。用不含血清的高葡萄糖DMEM(Thermo Fisher Scientific)补足到500μL的不同量的上清液进行感染。将病毒加入到Vero细胞中，然后将细胞在37℃孵育1小时，每15分钟轻轻摇动板。然后用1.5mL的2％FBS高葡萄糖DMEM培养基将孔充满并在37℃孵育。第二天，使用细胞刮刀(Sarstedt)收集细胞，然后以1500rpm离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于含有β-巯基乙醇(Thermo FisherScientific)的350μL RLT裂解缓冲液(Qiagen)中。然后，使用RNEasy试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用qScript cDNA试剂盒(Quanta Biosciences)将RNA转化为cDNA。然后，通过PCR筛选来自VSV基因组的趋化因子基因的表达。使用用于产生重组病毒的克隆引物和Taq聚合酶(Thermo Fisher Scientific)进行PCR。PCR循环条件为：预变性95℃30秒，然后95℃30秒，退火54.5℃30秒，延伸72℃35秒，进行35个循环，最后在72℃进行2分钟的最终延伸。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上可见。对于CXCL10和CXCL13重组VSV，我们都能够检测到预期大小的条带，表明转基因被转录。

重组痘苗病毒的制备

为了产生重组痘苗病毒株，我们采用了Rintoul等人(19)以前描述的方法。简言之，将9e5U-2OS细胞(ATCC HTB-96)置于6孔组织培养板中的2ml完全培养基(含有500ml高葡萄糖(4500mg/L)DMEM，50ml热灭活的胎牛血清，青霉素/链霉素各5ml，2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠)(Thermo Fisher Scientific)中，在37℃下孵育。

第二天，将辅助病毒(野生型痘苗病毒Western Reserve菌株)用无血清培养基进行稀释。从孔中吸出培养基，以每孔体积为300-500μl MOI为3-5感染细胞，于37℃孵育1小时，每隔15分钟轻轻摇动板。

当细胞被感染时，将10μl lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)加入250μl低血清Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中。将4μg重组质粒DNA加入到等体积(250μl)Opti-MEM中，然后与lipofectamine混合物混合。将lipofectamine/质粒混合物在室温下孵育10-20分钟。

病毒感染1小时后，从孔中吸出培养基，并将转染混合物滴加到孔中。作为阴性对照，一个孔以辅助病毒感染，但未进行转染。板在37℃孵育3-4小时。孵育后，将转染混合物吸出，并加入2ml/孔的高葡萄糖DMEM培养基。然后将板在37℃孵育24-48小时。

孵育后，使用细胞刮刀(Sarstedt)收集孔中的内容物，并以3000RPM旋转10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于200μl 1mM Tris，pH9中(6孔板中每个原来的孔)。将该病毒混合物转移至冷冻管并进行3次冻-融循环(-80℃和37℃)。

接下来，在含有汇合的U2-OS细胞的6孔板中，除去培养基，将5-20μl的冻融病毒与无血清培养基混合，使总体积达到500μl，并铺板1小时。孵育1小时后，除去病毒混合物，按照2ml/孔将GPT选择完全高葡萄糖DMEM培养基(含有250μg/mL黄嘌呤，15μg/mL次黄嘌呤(Sigma)和25μg/mL麦考酚酸(MPA，MerckMillipore))加入到每个孔中。板在37℃孵育24-96小时。

在荧光显微镜下每天检查板中是否存在YFP选择性标记。当YFP+ve菌落达到可观测的大小时，在荧光显微镜下直接挑取至100-150μl 1mM Tris，pH9。如上所述，将通过该方法挑取的病毒冻融3次(-80℃至37℃)，然后在GPT选择的存在的6孔板中铺于新鲜的U2-OS细胞上。

总的来说，病毒经过4-5轮GPT选择/菌斑挑选。最终的病毒粗产物储存在-80℃，用于产生随后的病毒。

重组痘苗病毒纯度的确认

为了证实在我们的重组病毒制剂中没有野生型病毒污染物，我们首先用重组病毒感染U2-OS细胞，然后采用如Meyer等人所述(12)的方法从得到的细胞/病毒混合物中提取DNA。.我们将Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)与退火至痘苗病毒胸苷激酶(TK)基因座的引物组合，以筛选野生型污染物。在野生型病毒中，TK引物组扩增～500bp的条带。在由于TK基因座中的插入而获得的重组病毒中，TK引物组扩增～5kb的区域。因此，～500bp条带的缺失(但存在～5kb条带)表明重组病毒的纯度。PCR循环条件如下：94℃2分钟，1个循环；94℃30秒，58℃30秒，68℃5.5分钟，40个循环；68℃10分钟，1个循环，在4℃保温。PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上可见。实验结果发现CXCL10和CXCL13重组痘苗病毒都是纯的。

病毒的生产

VSV

在150mm培养皿上生长出Vero细胞的汇合单层细胞。病毒在无血清培养基中稀释至5mL，每个皿以MOI为约0.02的VSV感染。每隔15分钟摇动板，孵育1小时后，将20mL 2％含血清培养基添加至每个板中，并孵育24小时。收获感染培养物的上清液，并以1400rpm离心10分钟，然后通过0.2μm过滤器(Thermo Fisher Scientific)过滤。然后使用具有JA-25.5转子的Avanti J-20XP离心机(Beckman Coulter)，在4℃以16000rpm对经过滤的上清液离心90分钟。离心后，弃去上清液，收集病毒沉淀物并重悬于PBS中，每10块板1mLPBS。然后将病毒等分并在-80℃保存。在Vero细胞上使用标准空斑试验(standard plaque assay)对病毒进行滴定。

牛痘病毒

汇合U2-OS单层细胞生长在150mm培养皿上。按照每板2e6pfu感染痘苗病毒，在无血清培养基中稀释至5mL。每隔15分钟摇动板，孵育1小时后，将20mL含2％血清的培养基加入到每块板中，并孵育～72小时。刮下感染的细胞并以3000rpm离心10分钟。将沉淀物重悬于1mM Tris-HCl pH 9(每块板4mL)中并且冻融三次。将管以3000rpm离心10分钟以除去细胞碎片。澄清的上清液覆盖在10mL 36％蔗糖溶液(每管20mL澄清的上清液)上。然后在使用JS-13.1浮桶式转头(swinging bucket rotor)的Avanti J-20XP离心机(BeckmanCoulter，Pasadena，CA)上以11500rpm转速对试管离心1.5小时。倒出上清液，用移液管除去过量的蔗糖。将沉淀重悬于1mM Tris-HCl pH 9(每10块板1ml)中。将病毒等分，并在-80℃保存。在U2-OS细胞上使用标准空斑试验对病毒进行滴定。

由重组病毒产生趋化因子蛋白的确认

为了证实重组病毒在感染肿瘤细胞后产生趋化因子蛋白，将3e4NOP23小鼠乳腺肿瘤细胞(22)铺于96孔板上，并孵育24小时。然后用重组或亲代(表达GFP)病毒以MOI＝1感染NOP23肿瘤细胞，然后孵育48小时。收集培养基，离心，并根据制造商的方案，使用小鼠CXCL10/IP-10/CRG-2或CXCL13/BLC/BCA-1 Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)通过ELISA方法对培养上清液中的趋化因子进行定量测定。使用VersaMax酶标仪(MolecularDevices)分析孔的颜色强度。

ELISA显示亲代VSV能刺激肿瘤细胞中CXCL10的产生，并且该表达可以通过CXCL10转基因进一步加强。相比之下，VV-GFP不能刺激肿瘤细胞中CXCL10的产生，然而重组的VV-CXCL10能刺激CXCL10的大量产生(图1A)。

VSV-GFP和VV-GFP的感染都不能诱导来自肿瘤细胞的CXCL13表达。相反，VSV-CXCL13和VV-CXCL13都能诱导肿瘤细胞中CXCL13的强烈表达(图1B)。

VSV-CXCL13功效的体内评估

使用小鼠乳腺癌模型(22)来确定VSV-CXCL13的治疗功效，以及其募集B细胞的能力。采用的实验方法如图2A的示意图所示。

更具体地，将在100μl PBS中的1e6 NOP23乳腺肿瘤细胞植入到乳房脂肪垫中。大致3周后，当肿瘤达到～30-50mm²大小时，使动物接受6-8次肿瘤内(每隔一天一次)注射PBS或5e8 pfu的VSVd51-GFP或VSV-d51-CXCL13。使用数字卡钳监测肿瘤大小。在第1次病毒/PBS处理14天后对一些小鼠实施安乐死，将它们的肿瘤收集到福尔马林中，并通过免疫组织化学评估T和B细胞浸润的情况。用苏木精，带有棕色3,3'-二氨基联苯胺(DAB)发色团的抗小鼠CD3和具有Fast Red发色团的抗小鼠Pax5抗体对肿瘤切片进行染色。

对整个肿瘤切片中的免疫细胞和淋巴簇(CD3+T细胞和Pax5+B细胞的大聚集体)进行计数(图2B)。用PBS处理过的小鼠的肿瘤缺乏免疫细胞，而VSV-GFP处理的小鼠具有高密度的T细胞，但含有少量的B细胞。用VSV-CXCL13处理的小鼠含有T细胞浸润物，其中小鼠的一个子集也含有B细胞浸润物。我们在模拟(PBS)或VSV-GFP处理的动物中没有检测到任何淋巴簇。相反，VSV-CXCL13处理能诱导动物的一个子集产生淋巴簇，在一些情况下，单个肿瘤包含多个淋巴簇，表明用VSV-CXCL13治疗的肿瘤可将B细胞募集至肿瘤，并且这些B细胞通常能形成淋巴簇。数据由3个独立实验组合得到。PBS组N＝12，VSV-GFP和VSV-CXCL13组，N＝13。

为了确定VSV-CXCL13的治疗功效，使动物接受6次肿瘤内(每隔一天一次)注射PBS，5e8pfu的VSVd51-GFP或VSV-d51-CXCL13(图3A)。使用数字卡钳监测肿瘤大小。当达到终点时对动物实施安乐死，终点的定义为肿瘤大小大于或等于150mm²。与模拟处理(PBS)的动物相比，VSV-GFP处理能降低肿瘤生长的速率(图3B、C)。VSV-CXCL13处理甚至比VSV-GFP处理更有效，导致肿瘤生长和存活率的统计意义上的显著差异(p<0.0001)(图3D、E)。在一些情况下，VSV-CXCL13处理的动物表现出完全的、持久的肿瘤消退(图D、E)。数据表明VSV-CXCL13在治疗上优于亲代(VSV-GFP)处理。数据由3个独立实验组合得到。

采用NOP23小鼠乳腺癌模型(22)来确定VSV-CXCL10的治疗功效。对于VSV-CXCL13，将在100μl PBS中的1e6NOP23乳腺肿瘤细胞植入到乳房脂肪垫中。大约3周后，当肿瘤达到～30-50mm²大小时，使动物接受6次肿瘤内(每隔一天一次)注射PBS，5e8pfu的VSVd51-GFP或VSV-d51-CXCL10(图4A)。使用数字卡钳监测肿瘤大小。当达到终点时对动物实施安乐死，终点定义为肿瘤大小大于或等于150mm²。与模拟处理(PBS)的动物相比，VSV-GFP处理能降低肿瘤生长的速率(图4B、C)。VSV-CXCL10处理甚至比VSV-GFP处理更有效，导致肿瘤生长和存活率的统计意义上的显著差异(P＝0.0073)(图4D、E)。在一些情况下，VSV-CXCL10处理的动物具有完全的、持久的肿瘤消退(图4D、E)。数据表明VSV-CXCL10在治疗上优于亲代处理(VSV-GFP)。数据还表明，尽管亲代(VSV-GFP)病毒诱导CXCL10的表达，但用CXCL10转基因进一步增加该表达可能具有治疗益处。数据由2个独立实验组合得到。

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所有引文在此通过引用一并纳入本文中。

说明书中已经就一个或多个实施方式对本发明进行了描述。然而，在不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的前提下，可以进行多种变化和修改，这对于本领域技术人员是显而易见的。

Claims

1.一种重组溶瘤病毒，其包含编码B细胞引诱剂多肽或T细胞引诱剂多肽的异源核酸序列，其中，异源核酸序列被稳定地整合到重组溶瘤病毒的基因组中。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒是减毒的。

3.根据权利要求1或2所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒是溶瘤RNA病毒或溶瘤DNA病毒。

4.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒是溶瘤RNA病毒，并且所述异源核酸序列编码B细胞引诱剂多肽。

5.根据权利要求3或4所述的重组溶瘤RNA病毒，其中，所述溶瘤RNA病毒是水泡性口炎病毒(VSV)，马拉巴病毒，新城疫病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒或呼肠孤病毒。

6.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒是溶瘤DNA病毒，并且所述异源核酸序列编码T细胞引诱剂多肽。

7.根据权利要求3或6所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤DNA病毒是痘苗病毒(VV)，单纯疱疹病毒(HSV)或腺病毒。

8.根据权利要求1或4所述的重组溶瘤病毒，其中，编码B细胞引诱剂多肽的异源核酸序列是CXCL12或CXCL13。

9.根据权利要求1或6所述的重组溶瘤病毒，其中，编码T细胞引诱剂多肽的异源核酸序列是CXCL10。

10.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒是VSV-CXCL12，VV-CXCL12，VSV-CXCL13，VV-CXCL13，VSV-CXCL10或VV-CXCL10。

11.一种药物组合物，其含有权利要求1至10之任一项所述的重组溶瘤病毒和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述重组溶瘤病毒包含与VV-CXCL12、VV-CXCL13或VV-CXCL10组合的VSV-CXCL13。

13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制用于全身给药。

14.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的权利要求1至10中所述的重组溶瘤病毒，或权利要求11至13所述的药物组合物给予有需要的个体。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌，结直肠癌，肺癌，黑素瘤或卵巢癌。

16.一种将免疫细胞募集至肿瘤的方法，其包括使所述肿瘤与权利要求1至10之任一项所述的重组溶瘤病毒接触。

17.一种抑制肿瘤细胞生长或促进杀死肿瘤细胞的方法，其包括使所述肿瘤细胞与权利要求1至10之任一项所述的重组溶瘤病毒接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述重组溶瘤病毒以足以引起所述肿瘤细胞的细胞死亡的剂量来提供。

19.根据权利要求1至10所述的重组溶瘤病毒或权利要求11至13所述的药物组合物用于治疗有需要的个体的癌症。