CN103505722B - 干扰素在治疗/预防对常规抗肿瘤疗法有抗性的肿瘤中的用途及相关的产品和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤（特别是癌症）的治疗和预防，具体而言，本发明提供了干扰素(IFN)在治疗和/或预防对于常规抗肿瘤疗法有抗性的肿瘤中的用途和/或其与其它抗肿瘤疗法联合应用的用途，以及相关的产品和方法。

Description

干扰素在治疗/预防对常规抗肿瘤疗法有抗性的肿瘤中的用途及相关的产品和方法

技术领域

本发明涉及肿瘤（特别是癌症）的治疗和预防，具体而言，本发明提供了干扰素(IFN)在治疗和/或预防对于常规抗肿瘤疗法有抗性的肿瘤中的用途和/或其与其它抗肿瘤疗法联合应用的用途，以及相关的产品和方法。

背景技术

许多常规使用的癌症疗法对于癌细胞的细胞毒性是通过诱导致死的DNA损伤而产生的。这些常用的癌症疗法为，例如放射疗法(RT)、某些化学疗法（例如使用针对肿瘤细胞的抗体）等。然而，人们发现许多肿瘤对于这些常规的抗肿瘤疗法没有响应或响应不佳。目前，仍然缺乏有效的手段来治疗/预防对于常规的抗肿瘤疗法（例如放射疗法、化学疗法等）有抗性的肿瘤。

I型干扰素是细胞因子的家族，其通常以在抗病毒应答中的功能而被人们所熟知。然而，在肿瘤系统中，I型IFN的功能是被较少研究和表征的。一些证据显示，I型IFN可能在控制肿瘤生长方面起某些作用。特别地，利用IFN-α/β中和抗血清的早期研究显示出，I型IFN可限制可移植性肿瘤的生长(Gresser等人，1983)。此外，在数种协同的可移植肿瘤模型（包括B16黑素瘤）中显示，完全缺失I型IFN信号传导引起了更快的肿瘤生长和增加的死亡率(Picaud等人，2002)。这些研究表明了I型IFN的重要性，然而，并没有人研究过I型IFN对于肿瘤生长的抑制是否是免疫介导的。最近，显示了内源性I型IFN的产生在肿瘤免疫编辑中起关键性作用，并且这种作用不同于被很好地表征的、II型IFN(IFNγ)在对于肿瘤的免疫应答中的作用(Dunn等人，2005;Dunn等人，2006)。与I型IFN在介导对于可移植性肿瘤的“天然”免疫中所显现的作用相反，对于I型IFN在已建立的肿瘤（例如癌症）的治疗中的作用所知甚少，特别是那些被显示诱导肿瘤特异性的适应性免疫应答的治疗（例如局部烧灼辐射或某些化学疗法）(Ma等人，2010)。

癌症免疫编辑是这样的过程，其中免疫系统抑制肿瘤生长并塑造肿瘤免疫原性。最近的研究显示出，需要I型IFN来引起抗肿瘤应答并且在癌症免疫编辑的过程中，I型IFN的作用在时间上区别于II型IFN(即IFN-γ)的作用。在淋巴细胞介导的肿瘤排斥中，树突细胞（DC），特别是CD8α(+)DC，是内源性I型IFN的功能相关靶标(Diamond等人，2011)。响应于生长中的肿瘤，常常发生自发的T细胞引发。然而，未确定促进天然抗肿瘤T细胞应答的内在免疫机制。在人转移性黑素瘤中，转移性肿瘤组织中的I型干扰素(IFN)的转录特征谱和T细胞标记物之间存在关联。在小鼠中，肿瘤移植后，IFN-β由CD11c(+)细胞产生，而肿瘤诱导的T细胞引发在缺少IFN-α/βR或Stat1的小鼠中是有缺陷的。因此，宿主I型IFN通过在CD8α(+)DC上的信号传导而对生长的肿瘤的内在免疫识别是关键性的(Fuertes等人，2011)。

因此，迄今为止，人们仍然不清楚对于已产生并建立的肿瘤而言，如何能够克服肿瘤对于目前的常规的抗肿瘤疗法(例如放射疗法)的抗性。

发明内容

如上文所讨论的，许多常规使用的抗肿瘤疗法对于癌细胞的细胞毒性是通过诱导致死的DNA损伤而产生的。本发明的发明人发现，过量的宿主DNA可以诱导IFN的产生，其激发内在免疫以及适应性免疫的级联，从而使肿瘤消退。在缺乏IFN或与其相关的信号传导的肿瘤细胞或肿瘤中（或者宿主中），使肿瘤消退所需的免疫级联不能产生，从而产生了对于常规抗肿瘤免疫疗法的抗性。因此，本申请中描述了干扰素（例如I型干扰素(IFN)）在局部肿瘤控制中的关键作用，特别是当将其与常规抗肿瘤疗法联合施用时，可产生协同效应而强化所述常规抗肿瘤疗法的效果或治疗和/或预防肿瘤对于所述常规疗法的抗性。本发明的发明人还发现，需要IFN来交叉引发T细胞，从而可通过施用IFN来使对于常规放射疗法或化学疗法有抗性的肿瘤消退。利用腺病毒介导的IFN-β的表达，发明人表明了将外源I型IFN(例如IFN-β)递送到肿瘤组织中也足以选择性地扩增抗原特异性T细胞，这引起肿瘤完全消退。申请人现在还进一步开发了基于抗体的系统，来将I型IFN靶向递送到肿瘤组织中，这从而引起内在免疫和适应性免疫的级联，以攻击所述肿瘤。

因此，在一个方面，本申请中描述了I型IFN在肿瘤生长控制中的关键性作用，在一个具体实施方案中，这是以T细胞依赖性的方式由基于抗体的IFN融合蛋白递送介导的。肿瘤浸润性DC的增强的交叉引发能力不可归因于成熟的状态或常规共刺激性分子的升高的表达，而是取决于I型IFN的局部产生。此外，在另一个具体实施方案中，利用临床上相关的、编码IFNβ的腺病毒载体的局部I型IFN递送能够以CD8⁺T细胞依赖性的方式介导完全的肿瘤排斥。本发明的结果支持了I型IFN在产生由连接抗肿瘤抗体的IFN(即Ab-IFN)产生的肿瘤特异性CD8+T细胞应答中的正面作用。

本发明的一个方面涉及干扰素(优选I型干扰素，特别是IFN-β)、其片段或其功能性变体用于制备药物的用途，其中所述药物

－用于治疗和/或预防对于常规抗肿瘤疗法（例如放射疗法、化学疗法）有抗性的肿瘤；和/或

－用于与其它抗肿瘤疗法（例如放射疗法、化学疗法）联合应用而治疗和/或预防肿瘤；

其中所述常规疗法诱导肿瘤特异性的适应性免疫应答；并且

其中所述干扰素、其片段或其功能性变体能够刺激产生抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞。

在一个具体的实施方案中，所述常规抗肿瘤疗法为放射疗法。更具体而言，其为X射线辐射，辐射的剂量可以是，例如1－5Gy（例如1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy）、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy或更高；可连续进行所述辐射1天或至少两天，例如3天、4天、5天或更长。

在一个具体的实施方案中，所述干扰素、其片段或其功能性变体被包含在病毒载体中，所述病毒载体为例如，腺病毒;腺伴随病毒;逆转录病毒,例如鼠莫洛尼白血病毒;鼠哈维肉瘤病毒;鼠乳腺肿瘤病毒;劳斯肉瘤病毒;SV40-型病毒;多瘤病毒;EB病毒;乳头状瘤病毒;疱疹病毒;牛痘病毒;脊髓灰质炎病毒;和RNA病毒例如逆转录病毒；优选地，所述病毒载体为腺病毒载体。

在有一个具体实施方案中，所述干扰素、其片段或其功能性变体与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如抗体）相连，其中所述靶向部分与所述干扰素、其片段或其功能性变体直接相连（例如作为融合蛋白）或通过连接子相连。

在一个具体实施方案中，所述肿瘤相关抗原为EGFR,所述靶向部分为抗EGFR抗体，且所述肿瘤为表达EGFR的肿瘤。

在其它的具体实施方案中，所述肿瘤为恶性肿瘤，例如恶性的固体肿瘤，其包括但不限于例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤。

在其它的具体实施方案中，本发明的所述药物用于与至少一种其它的抗肿瘤疗法联合施用，所述至少一种其它抗肿瘤疗法为例如放射疗法（例如上文所述的X射线辐射）、化学疗法等。特别地，所述化学疗法可以为施用抗体的疗法，所述抗体针对的是肿瘤相关抗原；所述化学疗法还可以是例如施用化疗剂，所述化疗剂为例如但不限于：烷基化试剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、阿霉素、放线菌素D、丝裂霉素、洋红霉素、正定霉素、多柔比星、他莫西芬、泰素、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷（VP-16）、5-氟尿嘧啶（5FU）、阿糖胞苷、环磷酰胺、塞替派、氨甲蝶呤、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂（CDDP）、氨蝶呤、考布他汀、其它长春花生物碱及其衍生物或前药等。

在具体的实施方案中，所述常规抗肿瘤疗法为放射疗法，并且所述肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多项中有缺陷：1）干扰素（例如I型干扰素，优选干扰素α或β）的表达和/或功能，特别是CD45+造血细胞表达的干扰素；2）干扰素受体的表达和/或功能，其中所述干扰素受体为例如IFNα受体和/或IFNβ受体。

本发明的另一个方面涉及组合物（例如药物组合物），其含有：－干扰素、其片段或其功能性变体，所述干扰素、其片段或其功能性变体与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如抗体）相连，其中所述靶向部分与所述干扰素、其片段或其功能性变体直接相连（例如作为融合蛋白）或通过连接子相连；和

－任选地药学上可接受的载体。

在本发明的一个具体实施方案中，所述肿瘤相关抗原为EGFR,所述靶向部分为抗EGFR抗体，并且优选地，所述肿瘤为表达EGFR的肿瘤。在具体的实施方案中，所述靶向部分（例如抗EGFR抗体）与所述干扰素、其片段或其功能性变体（例如IFNβ）形成融合蛋白（例如通过直接连接）。

在又一个方面中，本发明涉及上文所定义的本发明的组合物用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防肿瘤，例如恶性肿瘤（特别是恶性的固体肿瘤），其包括例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤等。在一个具体的实施方案中，所述肿瘤为黑色素瘤。

在另外的方面，本发明涉及试剂盒，其含有：

a)如上文中所限定的干扰素、其片段或其功能性变体；或者如上文中所限定的本发明的组合物；和

b)使用说明书，其中记载了所述试剂盒用于治疗和/或预防对于常规抗肿瘤疗法（例如放射疗法、化学疗法）有抗性的肿瘤；或者用于与其它抗肿瘤疗法（例如放射疗法、化学疗法）联合应用而治疗和/或预防肿瘤。

在其它的方面，本发明涉及一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用：治疗和/或预防有效量的如上文中所限定的干扰素、其片段或其功能性变体；或者如上文中所限定的本发明的组合物。

在具体的实施方案中，所述患者对于常规的抗肿瘤疗法（例如放射疗法）没有响应。在其它的实施方案中，所述患者还在下列一项或多项中有缺陷：1）干扰素（例如I型干扰素，优选干扰素α或β）的表达和/或功能，特别是CD45+造血细胞表达的干扰素；2）干扰素受体的表达和/或功能，其中所述干扰素受体为例如IFNα受体和/或IFNβ受体。

在另外的实施方案中，所述预防和/或治疗方法还包括同时、顺次（以任何顺序）或分别向所述患者施用至少一种其它的抗肿瘤疗法（例如放射疗法、施用抗体的化学疗法、施用其它化学治疗剂等）。

附图说明

图1.辐射疗法增加了肿瘤微环境内的IFN-β。

a).对于已建立的B16F10肿瘤(16-20天)的全部肿瘤RNA中的IFN-βmRNA水平进行的实时PCR分析，其中所述肿瘤未经处理或接受了20Gy的局部RT处理。所显示的数据来自RT后6小时提取的RNA(*p=0.0123)。

b).利用全肿瘤匀浆，通过ELISA检测RT后48小时的IFNβ蛋白水平(*p=0.0375)。

c).通过RT-PCR，在所示的时间点处对IFN-βmRNA的水平进行时间进程分析。在所显示的时间点从已建立的B16F10肿瘤中分选出CD45⁺和CD45^-细胞（所述肿瘤经20Gy的局部RT处理），然后提取RNA并进行RT-PCR。所显示的数据是具有相似结果的三个实验的代表性数据。

图2.对于RT的治疗性应答取决于宿主对于I型IFN的应答。

a).携带已建立的B16F10肿瘤的WT和IFNαR1KO小鼠的肿瘤生长曲线，所述小鼠未经处理或接受了局部RT(15Gy，连续处理三天)。从RT的起始剂量开始，对肿瘤生长作图(n=6-9只小鼠，汇集的数据)(**p=0.0012，在第14天)。

b).对WT小鼠进行致死辐射并用WT或IFNαR1KO骨髓(BM)进行重构。重构之后，用B16F10刺激嵌合小鼠并允许肿瘤建立14天或者允许肿瘤的平均体积达到100mm³。已建立的肿瘤在第14、15和16天接受了局部烧灼RT(15Gy)(n=7-8/组，**p=0.0011，对于RT组WT→WTvs.IFNARKO→WT，在处理后第20天)。

c).除了下述外与b)相同：IFNαR1KO小鼠还被用作WTBM的接受者。(***p<0.0001，对于WT→WT和WT→IFNARKO二者均是，在RT后第21天)。所显示的数据是具有相似结果的两个实验的代表性数据。

E).根据材料和方法部分所详细描述的程序，用来自WT或IFNαR1KO小鼠的纯化的多克隆T细胞重构B6/RAG1^-/-小鼠。允许T细胞重构7天，然后用5x10⁵B16-SIY（其中SIY为2CT细胞所识别的SIYRYYGL-K(b)的简称）细胞通过皮下对其进行肿瘤刺激。在肿瘤刺激后的第7天，用25Gy的总RT处理肿瘤，此时肿瘤的体积大约为80-100mm³。监测肿瘤生长并根据材料与方法中所示的程序来计算肿瘤的体积。n=4只小鼠/组，并且数据代表具有相似结果的两个实验之一。

图3.局部烧蚀RT在WT小鼠中赋予TIDC以T细胞刺激能力但是在IFNARKO小鼠中不能产生有功能的TIDC。

a)用5x10⁵B16-SIY肿瘤细胞接种C57Bl/6小鼠或IFNRKO小鼠。建立了15天的肿瘤接受了25Gy的局部RT辐射或未受处理。从每组3只小鼠的肿瘤(a)和引流淋巴结(d)中分离CD11c⁺细胞，并将它们汇集用于分析。在不同的条件下，将所分离的CD11c⁺细胞与幼稚2CTCR转基因细胞共培养并通过掺入含氚的-胸苷来评估T细胞增殖。误差条代表一式三份的孔之间的标准偏差(*p=0.0167)。

b,c)在72hr时分离来自TIDC(c,d)和淋巴结DC(f)的体外培养物的上清液，这刚好在加入含氚的-胸苷之前，使所述上清液经受多重细胞因子珠阵列(CBA)以测量细胞因子浓度。显示了来自培养物上清液的IFNγ(b)和TNFα(c)的水平(*p=0.0192)。所显示的数据是具有相似结果的两个实验的代表性数据。(除非另外指明，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05;如上文所示，可获得单独的p值)。

图4.ad-IFN-β的抗肿瘤效应是免疫介导的并且取决于T细胞。

a).通过肿瘤内注射2x10¹⁰vpad-null或ad-IFN-β来处理已建立的B16-SIY肿瘤，并且监测肿瘤的生长(n=4，**p=0.0064)。

b).用WT外周T细胞或PBS继受转移RagKO宿主，随后用B16-SIY刺激所述宿主。

c）通过肿瘤内注射，用2x10¹⁰vpad-null或ad-IFN-β处理已建立的肿瘤。经ad-IFN-β处理的小鼠亚组还接受了抗CD4或抗CD8耗竭抗体(n=4，**p=0.0069，对于ad-IFN-β处理的vsad-IFN-β和抗CD8处理的小鼠，在第32天)。所显示的数据是具有相似结果的三个实验的代表性数据。

图5.Ad-IFN-β促进肿瘤抗原特异性细胞的优先扩增。

用经CFSE标记的2CTgT细胞和OTI/Thy1⁺TgT细胞的混合物继受转移带有12天建立的B16-SIY肿瘤的WT小鼠。在第13天和第15天用3x10¹⁰vp的ad-null或ad-IFN-β处理所述肿瘤。三天后收集DLN和脾脏。

a).代表性的FACS图，其中显示了抗原特异性2C细胞相对于非特异性OT-1TCRTgT细胞的频率。

b).汇集的数据，其中显示了ad-IFN-β处理之后，2C细胞相对于OT-1TCRTgT细胞在频率方面的显著增加(n=5-7，**p=0.0075)。

c).汇集的数据，其中显示了当使用对照ad-null处理时，2C与OT-1TCRTgT细胞的比率大致相等，但是在ad-IFN-β处理之后，其显著增加(n=5-7)，(*p=0.0128)。

d).代表性直方图，其中显示了以增殖稀释CFSE。

e).小鼠携带有12天建立的B16-SIY肿瘤，所述肿瘤经ad-null或ad-IFN-β处理，所述小鼠在最后一次肿瘤内腺病毒注射后3－5天，通过静脉内注射而接受了加载了SIY肽的靶细胞。转移后18－24小时，在脾脏中评估了靶细胞的特异性裂解(**p=0.0015)。所显示的数据是具有相似结果的两个实验的代表性数据。

图6.用表达IFN的腺病毒靶向肿瘤可降低肿瘤的生长。用5*10⁵个TUBO-EGFR细胞接种WTBalb/C小鼠。注射后两周，通过在第14、17和20天进行肿瘤内注射而用PBS，Ad-null或Ad-IFNβ(1*10¹⁰vp)处理小鼠。每周两次测量肿瘤生长。

图7.抗EGFR-IFNβ融合蛋白对于控制原发肿瘤生长是有效的。

用5*10⁵个TUBO-EGFR细胞接种WTBalb/C小鼠。注射后两周，通过在第14、17和20天进行肿瘤内注射而用25μg的抗EGFR或抗EGFR-IFNβ处理小鼠。每周两次测量肿瘤生长。

图8.抗EGFR-IFNβ对于控制EGFR-B16肿瘤生长是有效的。

用5*10⁵B16-EGFR-SIY细胞接种WTB6小鼠。注射后10天，通过在第10、13和16天进行肿瘤内注射而用25μg的hIg，抗EGFR或抗EGFR-IFNβ处理小鼠。每周两次测量肿瘤生长。

图9.抗EGFR-IFNβ的抗肿瘤效果需要CD8+T细胞。用5*10⁵B16-EGFR-SIY细胞接种WTB6小鼠。注射后10天，在第10、13和16天通过肿瘤内注射而用25μg的hIg、抗EGFR或抗EGFR-IFNβ处理小鼠。在第9、14和19天，通过腹膜内施用耗竭抗体抗CD4和抗CD8(200μg)。每周两次测量肿瘤生长。

具体实施方案

术语及定义

除非特别说明，本申请中所使用的术语和定义均是本领域中惯常使用的含义并且为本领域技术人员所知晓。

如本申请中所使用的，术语“继受性转移”是指将T细胞转移到接受者中。

如本申请中所使用的，术语“肿瘤位点”是指含有或被怀疑含有肿瘤细胞的体内或离体位置。所述肿瘤位点包括固体肿瘤以及接近或邻近肿瘤生长处的位置。

如本申请中所使用的，术语“施用”是指全身性和/或局部施用。术语“全身性施用”是指非局部地施用，从而所施用的物质可能影响整个身体中的若干器官或组织；或者从而所施用的物质可能穿越整个身体中的数个器官或组织而到达靶位点。例如，向受试者的循环系统施用可引起治疗性产物在多于一个组织或器官中从所施用的载体表达，或者可引起治疗性产物在特异性位点处由所施用的载体表达，例如，这是由于天然的趋向性或由于与组织特异性启动子元件的可操作连接。本领域技术人员将理解，所述全身性施用涵盖各种形式的施用，这包括但不限于：肠胃外施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经皮施用、口服等。

术语“局部施用”是指在特异性位点处或其周围施用。本领域技术人员将理解，局部施用涵盖各种形式的施用，例如直接注射到特定位点处或注射到其周围（例如肿瘤内施用）。

如本文中所使用的，术语“治疗和/或预防有效量”是指达到治疗和/或预防目的疾病或病况（例如肿瘤/癌症，例如用于使肿瘤消退或减小肿瘤的大小）所需的本发明的干扰素、其片段或功能性变体，或者本发明的组合物的量。可以通过实践、按照常规的方式来关于特定的目的而确定所述有效量。特别地，所述治疗有效量可以是达到下述目的所需的量：减少癌细胞的数目;减少肿瘤大小;抑制(即减缓或停止)癌细胞浸润到外周器官中;抑制(即减缓或停止)肿瘤转移;抑制肿瘤生长;和/或缓解与癌症相关的一种或多种症状。

术语“抗体”涵盖例如，单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗体片段（其显示出所需的生物学或免疫学活性）。在本申请中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与抗体可互换地使用。所述抗体可特异性地靶向肿瘤抗原，例如表面肿瘤抗原，例如EGFR，CD4，CD8等。

术语“片段”（例如干扰素的片段）是指生物学分子（例如蛋白质，如干扰素或其编码核酸）的一部分，其能够实现所需的生物学功能，例如诱导肿瘤特异性T细胞的扩增。

术语“功能性变体”是指，经过修饰（例如突变、插入、删除。融合、缀合、交联等）而与亲本分子（例如干扰素）不同，但是保留了所需的其生物学活性的变体。

可通过本领域已知的各种常规的方法来使干扰素、其片段或其功能性变体与所述靶向部分向连接。所述连接可以是直接或间接的（例如通过连接子），在直接连接的情形中，可以通过形成融合蛋白、缀合或化学连接而实现。当所述连接形成融合蛋白时，其可通过例如重组技术或肽合成技术而实现。在某些实施方案中，所述融合蛋白也可包含连接子，所述连接子不破坏所形成的产物的目的特性（例如诱导肿瘤特异性T细胞的扩增）。

本领域技术人员能够根据具体的病况、疾病类型（例如肿瘤类型、肿瘤的发展阶段等）、严重程度、患者体质、可能联合施用的其它疗法、之前曾施用过的疗法等而选择适当的剂型和施用方式。

术语“癌症”是指通常被表征为不受调节的细胞生长的病况（例如在哺乳动物、例如人中）。所述癌症包括但不限于，例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤等。

术语“常规抗肿瘤疗法”是指迄今为止，本领域中普遍用来治疗和/或预防肿瘤的产生、发展、转移等的疗法，这包括但不限于，放射疗法（例如通过使用X射线辐射、放射性同位素等）、使用化学治疗剂、使用肿瘤特异性抗体等。

术语“放射疗法抗性”（或RT抗性）是指肿瘤或肿瘤细胞对于常规剂量和/或致死剂量（例如，15Gy的X射线辐射，连续施用3天）的放射性处理没有响应，即例如与未进行所述放射性处理的相同形状的肿瘤相比，接受了所述放射性处理的肿瘤的大小没有显著减小，肿瘤细胞的数目没有显著减少，肿瘤复发的倾向没有得到抑制，肿瘤的转移没有得到控制等。

“I型IFN”是指I型干扰素，其包括例如IFNα、IFNβ、IFNw、IFNt、IFNd、IFNk等。

在本申请中，术语“病毒载体”是指用于将目的蛋白（例如干扰素）递送到靶细胞或组织中的任何适当的病毒载体，这包括但不限于例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、鼠哈维肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、SV40-型病毒载体、多瘤病毒载体、EB病毒载体、乳头状瘤病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体和RNA病毒载体；优选地，所述病毒载体为腺病毒载体。

在本申请中，术语“肿瘤相关抗原”包括例如肿瘤表面抗原，这包括但不限于例如表皮生长因子受体家族(EGFR)的成员，这包括EGFR，HER1，HER2，HER4和HER8等(Nam，N.H.，&Parang，K.(2003)，Currenttargetsforanticancerdrugdiscovery.CurrentDrugTargets，4(2)，159-179)，STEAP(six-transmembraneepithelialantigenoftheprostate;Hubert等人，STEAP:aprostate-specificcell-surfaceantigenhighlyexpressedinhumanprostatetumors.，ProcNatlAcadSciUSA.1999;96(25):14523-8.)，CD55(Hsu等人，Generationandcharacterizationofmonoclonalantibodiesdirectedagainstthesurfaceantigensofcervicalcancercells.，HybridHybridomics.2004;23(2):121-5)。

能用于本发明的其它合适的抗体包括利妥昔单抗(RituxanTM，嵌合的抗CD20抗体)，Campath-1H(抗CD52抗体)，和任何癌症特异性细胞表面抗原的抗体。下列示例性地列出了针对特定癌症类型的、适于与干扰素结合而用于本发明的目的的抗体:阿仑珠单抗(CampathTM)用于慢性白血病;贝伐珠单抗(AvastinTM)用于结肠癌和肺癌;西妥昔单抗(ErbituxTM)用于结肠癌和头颈癌;吉妥珠单抗(MylotargTM)用于急性髓性白血病;Ibritumomab(ZevalinTM)用于非霍奇金淋巴瘤;帕木单抗(VectibixTM)用于结肠癌;利妥昔单抗(RituxanTM)非霍奇金淋巴瘤;托西莫单抗(BexxarTM)用于非霍奇金淋巴瘤;和曲妥珠单抗(HerceptinTM)用于乳腺癌。

在本发明中，“药学上可接受的载体”是指不会在所施用的细胞或受试者中引发过敏反应或其他不适影响，并且不会影响药物活性的载体。合适的可药用载体包括但不限于，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。药学上可接受的载体还可进一步包括能提高核酸、多肽、病毒颗粒或细胞的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

在本申请中，在干扰素和/或其受体中“有缺陷”是指所述干扰素或干扰素受体的表达不能达到实现其生物学功能所需的水平，或者所表达的干扰素或干扰素受体不能发挥所需的生物学功能（例如以突变的形式存在），或者干扰素（或干扰素受体）不能够与其受体（配体）相互作用而引起下游的信号传导。

下面的实施例仅仅是为了更好地阐释本发明，而不意在以任何方式限制本发明。

实施例

材料和方法

小鼠

C57BL/6小鼠，裸鼠，B6/OTITCR转基因小鼠，Ly5.1小鼠和B6/Rag-1KO小鼠购自JacksonLaboratory，为6-7周龄。2CTCR-转基因小鼠是由JianzhuChen，MIT，Cambridge，MA提供的，并被保存在芝加哥大学的无特定病原体(SPF)设施中。B6/IFNA1RKO小鼠是由芝加哥大学的AnitaChong慷慨地提供的。对于所有的实验，小鼠均为6-16周龄，在SPF条件下培育小鼠并且根据动物照料和使用委员会研究所设定的动物实验指南(IACUC)来使用小鼠。

细胞系

B16-F10小鼠黑素瘤细胞是从美国典型培养物保藏中心获得的。B16-SIY黑素瘤细胞和抗2CTCR(1B2)抗体是从TomGajewski(芝加哥大学)获得的。在含有L-谷氨酸盐的RPMI1640培养基中、在37℃和5%CO₂中培养细胞，在所述RPMI1640中补充了10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸和HEPES。在含有G418(1mg/ml)的培养基中维持B16-SIY细胞系。

RNA纯化和基因阵列分析

对B16F1肿瘤进行辐射(20Gy)或不对其进行处理。在辐射后5小时，将肿瘤切除，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至进一步处理。将经冷冻的肿瘤切为大小约5mm³的片，并在RNAlater-ICE溶液(AppliedBiosystems-Ambion)中浸泡过夜。将样品离心、在RLT缓冲液(QIAGEN)中清洗，并使用设置为3000rpm的机械玻璃-Teflon匀浆器在冰上将所述样品均质化。使用RNeasy离心柱和TRIzol试剂的组合而进行进一步的纯化，如之前所描述的(Khodarev等人，2004)。使用凝胶电泳（1.8%琼脂糖）和分光光度法来评估样品的质量。相对于1mg/ml的浓度而使RNA样品归一化，以相等的量将来自至少三个肿瘤/组的样品汇集起来，且将所汇集的样品转移到芝加哥大学的功能性基因组学设施中，用于以小鼠基因组4302.0阵列(Affymetrix)进行标记和杂交。对于在经辐射vs.未处理的肿瘤中差异表达的基因的选择和分析是基于之前所详细描述的过程(Khodarev等人，2004;Kimchi等人，2005;Pitroda等人，2009)。简要地，使每个阵列与汇集的总RNA样品杂交。在获取数据后，使用“整体中值归一化”(Kimchi等人，2005)在整个数据集中重新调节数据并如所描述的对数据进行过滤(Khodarev等人，2004)。随后的分析是基于重复阵列的成对比较，其中使用了微阵列的显著性分析(Tusher等人，2001)版本3.02，将误发现率设置为<1%。对所选的探针组ID进行基因注释并使用Netaffx分析中心(https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/index.affx)对其进行功能性分析。

产生骨髓嵌合体

用单一剂量的1000rad对野生型(WT)或IFNARKO小鼠进行致死辐射。次日，将2-3x10⁶个供体骨髓(BM)细胞静脉内继受性转移到经辐射的小鼠中。重构后，将小鼠维持在经在饮用水中稀释的磺胺甲恶唑和甲氧苄氨嘧啶(复方新诺明)抗生素上4周。重构后5－6周，将肿瘤细胞注射到小鼠中。

T细胞的继受性转移

淋巴结(LN)细胞和脾细胞是从2C或OT1Tg小鼠分离的。然后，将以羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的共2x10⁶个2C或OT1T细胞静脉内继受转移到带有B16-SIY肿瘤的C57BL/6小鼠中。在所示的时间点从引流淋巴结(DLN)、脾脏或肿瘤中分离细胞。如之前所描述地评价CFSE稀释(Yu等人，2004;Yu等人，2007)。对于RAGKO接受者的重构，从供体小鼠收集脾细胞和淋巴结细胞，并使用PanT细胞分离试剂盒和自动化磁性细胞分选(autoMACS^TMMiltenyiBiotec)来分选T细胞。

流式细胞术分析

从小鼠上切除肿瘤、DLN和脾脏（SP），将其切碎并用1.5mg/ml胶原酶，1U/mL分散酶和0.4mg/mlDNA酶I在37℃下消化40min，然后加入EDTA至终浓度为6mM，以将所述酶灭活。用抗CD16/32(抗Fc/III/II受体，克隆2.4G2)将所述细胞的单细胞悬浮液在室温下孵育20min，随后用下列缀合的抗体进行染色:抗CD45.2(克隆104)，抗CD90.1(抗Thy-1.1，克隆OX-7)，抗CD8a(克隆53-6.7)，抗CD11c(克隆HL3)，抗CD11b(克隆M1/70)，抗Ly6C(克隆AL-21)，抗I-A/I-E(克隆M5/114.15.2)，抗CD80(B7-1，克隆16-10A1)，抗CD86(B7-2，克隆GL1)，抗CCR7(克隆4B12)或抗CD4(克隆GK1.5)。所有纯化的和经荧光标记的单克隆抗体都是从BDPharmingen购买的。在FACSCanto流式细胞仪(BDBiosciences)上分析样品，并用FlowJo软件(TreeStar，Inc.)对数据进行分析。

肿瘤生长和治疗

用胰蛋白酶消化经培养的癌细胞，用培养基进行清洗，并在背部将其皮下注射到相应的小鼠中。以3-4天的间隔确定肿瘤大小。沿着三个正交轴(a，b和c)测量肿瘤体积并将肿瘤体积计算为等于abc/2。用所示量的Ad-IFN-β或Ad-null病毒肿瘤内地接种肿瘤结节。通过与BiogenIdec的合作来获得Ad-IFN-β。为了进行抗体介导的细胞耗竭，在原始肿瘤接种后的第9天，第11天和第13天，向小鼠腹膜内给予200μg/小鼠的抗CD4或抗CD8(YTS.169.4.2)抗体。使用GEMaxitronx射线产生器，以各个实验所示的剂量使小鼠接受局部的X射线辐射。每只小鼠都用铅盖进行保护，仅暴露出肿瘤，从而允许了局部IR（ionizingradiation）辐射。

实时PCR

在以20Gy进行局部RT后，在所示的时间点收集肿瘤。使用由经DNA酶I处理的RNA制备的cDNA来进行实时PCR,所述RNA是从整个肿瘤提取的，或者是由通过BDFACSAria细胞分选仪分选为CD45.2⁺和CD45.2^-群体的单细胞悬浮物提取的。所使用的引物和探针如下面所述。对于IFNβ:正向5'-ATGAGTGGTGGTTGCAGGC-3'(SEQIDNO:1)，反向5'-TGACCTTTCAAATGCAGTAGATTCA-3'(SEQIDNO:2)。对于GAPDH:正向5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3'(SEQIDNO:3)，反向5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'(SEQIDNO:4)。在ABI/Prism7300(AppliedBiosystems)上进行实时PCR反应，终体积为25μl，其中含有2.5μM的正向和反向引物，使用2xTaqmanMasterMix(AppliedBiosystems)（其中含有AmpliTaqGold聚合酶）。循环条件为：单一变性步骤，95℃进行15min；随后进行45个循环，每个循环中在94℃进行15s，且在60℃进行1min。利用标准曲线来分析Infβ1和Gapdh基因的表达，然后使样品相对于Gapdh进行归一化。所述标准曲线具有的R²值>0.99。

ELISA

进行局部X射线辐射之后，在所示的时间点收集肿瘤并对其进行称重，在1X磷酸盐缓冲液(PBS)以及1XHalt蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisherScientific)中，在冰上进行均质化。收集上清液并且使用VeriKine小鼠IFN-βELISA试剂盒（PBLIFNSource)，按照生产商的指导来检测IFN-β。

体内特异性裂解测定

用0.5x10⁶B16-SIY细胞皮下注射小鼠。在注射后的第12天和第14天，用2x10¹⁰ad-IFN-β或ad-null肿瘤内处理小鼠。进行所述处理3-5天后，将相等数目的经CFSE标记的供体脾细胞静脉内地转移到小鼠中，所述供体脾细胞中被补充以SIY肽(1μg/ml)或OT-1肽(1μg/ml)。补充了SIY的细胞经CFSE^高(10μM)标记，而补充了OT-1的细胞经CFSE^低(1.0μM)标记。还将加载了所述肽的脾细胞转移到幼稚的、不携带肿瘤的小鼠中作为对照。18-24小时后，收集接受者小鼠的脾，并通过FACS进行分析。如下计算特异性裂解:

%特异性裂解=[(%CFSE^低xA-%CFSE^高)/(%CFSE ^低 xA)]x100

其中A=%CFSE^高(特异性肽-SIY)除以%CFSE^低(非特异性肽-OT-1)（在幼稚对照小鼠中，对于多个对照的结果进行了平均）。

DC交叉引发测定和细胞因子检测

将5x10⁵个B16-SIY肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的下背部。在肿瘤被建立起来之后，小鼠接受了肿瘤处的局部RT(20Gy)，并且3天后收集肿瘤用于DC纯化。用剪刀将肿瘤细细地剪碎并使用含有1.5mg/mL胶原酶(Sigma)，1U/mL分散酶(BDBiosciences)和0.4mg/mLDNA酶I(Sigma)的溶液在37°C下、在设置为低速的旋转培养箱中消化40分钟。使来自所产生的单细胞悬浮液的活细胞经受Ficoll-PaquePlus(GEHealthcare)离心，并将所分离的细胞用于DC纯化，其中使用了CD11c+磁珠试剂盒和自动化磁性细胞分选(autoMACSMiltenyiBiotec)。对于体外培养，用2x10⁵幼稚2C细胞铺板1x10⁵个DC，其中添加或不添加外源性SIY肽(1μg/ml)，3天后收集上清液，用于按照生产商的指导通过细胞流式珠阵列(CBA)(BDBiosciences)来进行分析。按照与体外培养条件相似的条件来评估细胞增殖，这是通过下列过程进行的：在72小时时补充³H-胸苷、在96小时的时候收获细胞用于分析、并在液体闪烁计数器上进行读板。

产生表达IFNβ的腺病毒(Ad-IFNβ)

为了构建重组腺病毒-mIFNβ，通过PCR扩增小鼠IFNβcDNA并将其克隆到pAdenoVator-CMV5(CuO)的NotI/EcoRV位点中，使其处于CMV5启动子的控制之下。通过PacI消化使pAdenoVator-mIFNβ线性化并以2.5kV将其电穿孔到电感受态细胞BJ5183中，用于与含有腺病毒基因组的骨架载体进行重组。在卡那霉素LB琼脂板上选择杂合粘粒。使用PacI消化来进一步鉴别含有插入物mIFNβ的重组粘粒。通过PacI消化使Ad-mIFNβDNA线性化，不经进一步纯化而将PacI消化的混合物转染到293细胞中用于产生重组腺病毒。腺病毒-mIFNβ被称作Ad-IFNβ。

统计学分析

使用非配对双尾t检测来进行统计学分析。误差条代表标准偏差。

除非特别另行说明，否则下面的实施例中所使用的材料和方法均是根据上文中“材料与方法”部分的介绍而进行的。

实施例1辐射疗法增加肿瘤内IFN-β的产生

由于DC成熟不被局部的RT可测量地影响并且单独的肿瘤抗原交叉呈递不能解释来自接受局部RT的肿瘤的DC中增加功能性，发明人提出局部的RT可能通过局部细胞因子环境的变化而提升局部肿瘤微环境以及相应的DC功能。就细胞因子基因表达的显著不同来查看所获得的基因阵列数据，得到了很少的符合检测阈值的令人感兴趣的候选者（数据未显示)。然而，发明人观察到了经处理的肿瘤中IFNβ表达的小的、但是一致的增加。对肿瘤样品进行的RT-PCR和ELISA证实了局部RT之后，IFNβ的确被上调了，在RNA(图1a)和蛋白质水平(图1b)均是如此。通过细胞分选进行的进一步分析显示，I型IFN主要是由浸润肿瘤的CD45+造血细胞产生的(图1c)。为了证实在CD45-级分中产生的少量IFN-β不是来自肿瘤细胞，发明人测试了辐射是否能在体外直接诱导来自B16肿瘤细胞的IFN-β。体外X射线辐射肿瘤细胞之后，在蛋白质和mRNA水平上都检测不到IFN-β转录物，这表明CD45^-级分中少量的IFN-β信号有可能是来自非造血间质细胞(数据未显示)。这些数据表明，局部RT之后，IFNβ在肿瘤内被上调并且这些数据还支持了造血细胞是经辐射的肿瘤内IFN-β的主要来源。

实施例2IFN-α/β响应对于RT的治疗效果是关键性的

为了首先测试I型IFN对于RT介导的肿瘤减小是否是关键性的，申请人在野生型(WT)和IFN受体1α敲除(IFNαR1KO)小鼠两者中建立了亲本B16F10肿瘤。这些小鼠缺乏IFN-α/β受体的α亚基，因此它们对于allI型IFN没有应答(Muller等人，1994)。连续三天，每天用15格雷(Gy)的局部RT处理带有肿瘤的小鼠(15Gyx3)，并且监测肿瘤生长。发明人之前确立了，这种治疗方案能够在用B16F10刺激的野生型小鼠中成功地控制肿瘤的生长(Lee，2009)。在WT和IFNαR1KO组中，未处理的肿瘤快速地发展(图2a)。与未经处理的小鼠中的肿瘤相比，接受了15Gyx3的WT小鼠显示出强的肿瘤生长抑制。相反，IFNαR1KO小鼠中的肿瘤以与未经处理的肿瘤相似的动力学生长，并且显示出对于甚至是高剂量RT的几乎完全的抗性。因此，对于RT的应答的确是依赖于宿主对于I型IFN的应答。

I型IFN发挥多效的效果，这包括例如抗病毒，抗增殖，免疫调节和抗血管生成的应答等。常见的杂合二聚IFN-α/β受体是普遍表达的但是IFN受体作用的效果可根据细胞类型而变化(Uddin和Platanias，2004;vanBoxel-Dezaire等人，2006)。由于IFN-α/β受体的普遍表达，肿瘤细胞是I型IFN的潜在靶标，其中肿瘤细胞上的直接信号传导能够介导抗增殖效果(图2)。因此，IFNαR1KO宿主中缺乏对于RT的应答可能是由于非造血肿瘤相关间质细胞、免疫细胞或其组合中的受体缺陷。为了检测这些群体中对于I型IFN应答的需求，发明人制备了相互骨髓(BM)嵌合体。用1000rad（即致死剂量）对WT或IFNαR1KO宿主进行辐射，并用WT或IFNαR1KO骨髓重构。用局部烧蚀RT(15Gyx3)处理携带肿瘤的小鼠，如所预期的，肿瘤在两个未经处理的组中都逐步生长(图2b)。以WT骨髓重构的小鼠中的肿瘤以与野生型小鼠类似的方式应答。然而，在IFNαR1KOBM接受者中，尽管在所有其它组织（包括肿瘤细胞本身）中都存在对于IFN-α/β的敏感性，在仅仅在BM细胞上缺少IFNαR1的小鼠中，肿瘤对于RT不再有应答(图2b)。通过用WT供体骨髓重构WT或IFNαR1KO接受者，测试了源自骨髓的细胞上I型IFN信号传导是否充分。如所预期的，接受了WTBM的WT接受者中的肿瘤对于RT的响应与野生型动物相似(图2)。有趣地，一旦恢复了造血细胞对于IFN-α/β的敏感性，IFNαR1KO小鼠就对RT有应答了(图2c)。因此，在非肿瘤细胞中，需要造血系统中的IFN-α/β应答来实现RT的治疗效果。

为了特异性地研究T细胞对于I型IFN的响应，发明人利用了继受性转移方式。用从WT或IFNαR1KO小鼠中纯化的总的T细胞重构敲除了重组酶活化基因(RAG^-/-)的小鼠，并且在T细胞转移后一周用肿瘤细胞接种这些T细胞嵌合的小鼠，在接种的时候，经转移的T细胞的稳态扩增已经停止了(数据未显示)。用局部烧蚀RT处理在T细胞嵌合的小鼠中所建立的肿瘤并监测肿瘤生长。如所预期的，接受了WTT细胞的经处理的小鼠能够控制肿瘤生长(图2e)。令人惊讶地，接受了IFNαR1KOT细胞的小鼠在局部RT之后仍然能够介导同等的肿瘤控制。因此，不需要对于I型IFN的直接T细胞应答来实现RT介导的肿瘤控制。

实施例3局部RT恢复了肿瘤浸润性DC以IFN依赖性的方式引发T细胞的能力

本发明的发明人的数据凸显了造血细胞的I型IFN响应在局部RT的治疗效力方面的关键性作用，然而，发明人想了解所述系统中的I型IFN信号传导与DC功能之间是否有联系。发明人希望确定对于I型干扰素的应答是否能够解释他们所观察到的、未处理的肿瘤和经局部辐射的肿瘤的DC之间的功能性差异。当分析IFNαR1KO小鼠中来自未处理的B16-SIY肿瘤的肿瘤浸润性树突细胞的功能时，发现它们刺激幼稚2CT细胞增殖的能力严重下降了(图3a)，当使用来自未处理的肿瘤的WTDC时类似地观察到了这一缺陷(图3a)。有趣地，在IFNαR1KO小鼠中对肿瘤进行局部辐射没有能够恢复TIDC（即肿瘤浸润性树突细胞）刺激T细胞的能力，这与从接受了局部RT的肿瘤中分离的WTDC的增加的能力形成了鲜明的对比(图3a)。此外，由WTTIDC驱使的T细胞增殖在培养物上清中诱导了稳健的IFNγ生产，这表明T细胞刺激引起获得了极化的效应子T细胞表型(图3b)。从经辐射的肿瘤中纯化的IFNαR1KODC不能刺激T细胞增殖的能力，这不能通过加入外源性SIY肽而被恢复，此外，与提供外源性SIY肽一起在体外共培养过程中用细菌脂多糖(LPS)肽刺激TLR不能恢复TIDC刺激T细胞增殖的能力(图3a)，这些结果也进一步证实了发明人之前在野生型小鼠中获得的结果。另外，通过用I类MHC，II类MHC，B7-1，B7-2和CCR7进行表面染色而评估了IFNαR1KODC的成熟，这显示出与WTTIDC等同的表达，其中在来自经处理和未经处理的肿瘤的DC之间没有观察到显著的差异(数据未显示)。此外，因为与来自经辐射的肿瘤的WTTIDC相比，响应于LPS的TNFα生产是等同的（如果没有增加的话），IFNαR1KOTIDC不太可能在功能上全面受损(图3c)。为了证实在IFNαR1KO小鼠中，DC的功能没有全面受损，发明人分析了从WT和IFNαR1KO小鼠的肿瘤引流淋巴结中分离的DC。在其驱动T细胞增殖和效应子细胞因子产生的能力方面，WT和IFNαR1KO小鼠之间的淋巴结DC在功能上是没有区别的(图3d以及未显示的数据)。来自WT和IFNαR1KO小鼠淋巴结的DC还显示出了对于LPS等同的应答，如通过TNFα的产生所测量的(数据未显示)。因此，需要RT-介导的I型IFN用于在肿瘤的微环境中获得DC交叉引发能力。

实施例4通过外源局部递送I型IFN而产生的肿瘤减小依赖于CD8⁺T细胞

发明人的结果显示了I型IFN是局部RT的关键性下游介导因子，然而，局部RT有可能诱导影响肿瘤控制和排斥的许多因子。为了研究在没有RT的情况下，I型IFN是否能够起到充分的作用，发明人测试了通过重组腺病毒载体(ad-IFNβ)向肿瘤中局部递送I型IFN是否能够引起肿瘤排斥。发明人用ad-null（空白载体对照）或ad-IFN-β处理已建立的B16-SIY肿瘤并监测肿瘤生长。令人惊讶地，甚至对于这种侵略性的肿瘤，ad-IFN-β也显示出了非常强的抗肿瘤效果(图4a)。

由于ad-IFN-β对于B16-SIY肿瘤细胞可能有多种抑制性作用，为了测试所述抑制需要T细胞，发明人使用了B6/RAGKO小鼠（这些小鼠在淋巴细胞中有缺陷），并比较了未经转移的宿主和以从野生型供体收集的T细胞重构的那些宿主。有趣地，在Rag-1^-/-小鼠中不能检测到对于ad-IFN-β的肿瘤应答，但是通过转移外周T细胞而使其得到了恢复(图4b)。因此，与用RT处理的情况相同，用ad-IFN-β进行的处理是免疫介导的并且依赖于T细胞。

由于意识到了RAG-1KO小鼠有可能带有可影响治疗应答的其它缺陷，并且为了进一步区分CD4⁺与CD8⁺T细胞亚群的功能，发明人利用了WT小鼠和抗体介导的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞耗竭。令人惊讶地，CD4⁺T细胞的耗竭对于ad-IFN-β处理几乎没有任何影响，因为肿瘤在进行和不进行CD4耗竭时同等地应答(图4c)。然而，CD8⁺T细胞的耗竭严重降低了治疗效力并且肿瘤快速发展(图4c)。NK细胞似乎对于肿瘤消退不是关键性的(数据未显示)。因此，CD8⁺T细胞对于ad-IFN-β的抗肿瘤效果是关键的。

实施例5IFN-β引起抗原特异性T细胞的优选扩增

因为发明人确定了ad-IFN-β的治疗效果取决于CD8⁺T细胞(图4b,c)，发明人假设了像辐射疗法一样，ad-IFN-β能够诱导抗原特异性T细胞引发和扩增。为了测试这一点，发明人将识别SIY抗原的幼稚2C转基因T细胞转移到带有B16-SIY肿瘤的小鼠中。用ad-IFN-β治疗之后，发明人收集了引流淋巴结(DLN)并使用克隆型抗体1B2(抗2CTCR)来定量抗原特异性CD8⁺T细胞扩增。与ad-null相比，用ad-IFN-β进行处理引起抗原特异性细胞大约6倍的增加(数据未显示)。这一显著增加有可能是由于抗原驱动的增殖，然而，也存在下述可能性：ad-IFN-β能够通过逆转抑制性的细胞因子环境或通过经IFN-α/β介导的T细胞凋亡创造出的空间而一般性地促进细胞的非特异性扩增。I型IFN也被显示参与介导旁观者T细胞增殖(Tough等人，1996)。I型IFN对于病毒感染是关键的,并且已显示I型IFN对于一些细菌（例如，产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)）感染是决定性的(Auerbuch等人，2004;Carrero等人，2004;O'Connell等人，2004)。因此，还不清楚的是，处理之后从肿瘤组织释放的IFNβ对于抗原特异性T细胞免疫应答将有什么作用。为了测试这种扩增是否限于抗原特异性细胞和/或增加的增殖，发明人用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记了2C(抗原特异性)和OT-1(非特异性)细胞，然后将它们继受转移到带有B16-SIY肿瘤的小鼠中。为了帮助鉴别所转移的细胞群，发明人利用了含有同类系标记物(Thy1.1)的OT-1细胞。第一次ad-null或ad-IFN-β处理后5天，确定了DLN和脾脏中的1B2⁺CD8⁺(抗原特异性细胞)相对于Thy1.1⁺CD8⁺(非特异性)的CFSE稀释程度。与非特异性OT-1细胞相比，Ad-IFN-β诱导了抗原特异性2C细胞的优选扩增(图5a-c)。当使用ad-null对照组时，2C与OT-1TCR转基因细胞的比例大致相等，这证实了相似数目的转基因T细胞被转移到了接受者中，但ad-IFN-β的治疗效果却显著增加了(图5c)。此外，2C细胞显示出旺盛的增殖，这被几乎完全的CFSE稀释所证实(图5d)。相反，非特异性细胞不能够增殖(数据未显示)。综上所述，这些数据表明了ad-IFN-β诱导的抗原特异性CD8⁺T细胞的扩增是相对有选择性的并且是由增加的增殖介导的。

实施例6IFN-β增加了体内的抗原特异性细胞溶解活性

虽然增殖是产生有效的免疫应答的良好指示，其并不总是转化为强有力的效应子功能。因此，发明人研究了ad-IFN-β疗法是否引起增加的体内特异性裂解。用ad-null或ad-IFN-β处理带有肿瘤的小鼠，然后向其中转移加载了经CFSE标记的肽的靶细胞。作为阴性对照，还将加载了经CFSE标记的肽的靶细胞转移到幼稚小鼠中，而如预期的，这些小鼠显示出正常的特异性裂解。通过比较发现，与经ad-null处理的小鼠相比，经ad-IFN-β处理的小鼠显示出显著更高的特异性裂解（图5e)。这些数据表明，在经ad-IFNβ处理的小鼠中观察到的抗原特异性细胞的扩增引起了强有力的效应子CTL活性。

为了确定用IFNβ靶向肿瘤是否可引起肿瘤消退，接种了TUBO-EGFR细胞并且在第14、17和20天肿瘤内注射表达IFN的腺病毒。ad-null对于肿瘤生长有温和的效果，而ad-IFNβ引起肿瘤的消退(图6)。这表明，在TUBO上局部递送ad-IFNβ也可诱导强的应答，从而引起肿瘤消退。

为了测试由CHO细胞制备的实际融合蛋白是否能够诱导快速的肿瘤消退，用编码抗体-IFN（对于抗EGFR-IFNβ，将Cetuximab的3’端与IFNβ相连，然后将其引入到载体pcDNA中，亚克隆均采用标准的分子生物学技术进行，简要地，1）将HC-Fc-IFN克隆到载体Abvec-hIgG1中；2）将抗体的轻链克隆到载体Abvec-lamda中；3）从1）中得到的产物中剪切HC-Fc-IFN，并通过平末端连接将其克隆到lonza的载体pEE6.4中；4）从步骤2）中获得的产物中剪切出轻链并通过平末端连接将其克隆到lonza的载体pEE12.4中；5）从步骤4）的产物中切出表达盒并将其克隆到步骤3）的产物中，从而得到最终的质粒pEE12.4-抗-EGFR-IFNβ）的质粒转染CHO细胞并且选择大量表达所述融合蛋白的细胞。收集含有这种质粒的CHO的上清液并且通过蛋白A柱子纯化融合蛋白，所述蛋白A柱子以高亲合力结合融合蛋白的Fc部分。用低剂量的抗体或者所述抗体-IFN处理带有TUBO-EGFR的小鼠。仅仅是融合蛋白引起了肿瘤的快速消退(图7)。从带有B16-EGFR肿瘤的小鼠也获得了类似的结果(图8)。因此，与单独的抗体相比，这种融合蛋白也可被用于更好地清除肿瘤表达EGFR的肿瘤。

为了确定这种显著的效果是否是由T细胞免疫引起的，用低剂量的所述融合蛋白和T细胞耗竭抗体处理带有EGFR-TUBO肿瘤的小鼠。虽然大幅延迟了EGFR-TUBO的生长，CD8+T细胞的耗竭引起了快速复发，而CD4+T细胞的耗竭则不会引起肿瘤复发(图9)。

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Claims (6)

1.I型干扰素用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗对于常规抗肿瘤放射疗法、化学疗法有抗性的肿瘤，其中所述I型干扰素与结合表皮生长因子受体的抗体相连且所述肿瘤为表达表皮生长因子受体的肿瘤。

2.根据权利要求1的用途，其中所述I型干扰素选自IFN-α和IFN-β。

3.根据权利要求1或2的用途，其中所述抗体与所述I型干扰素作为融合蛋白直接相连或通过连接子相连。

4.根据权利要求1－2中任一项的用途，其中所述肿瘤为乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌，皮肤癌，头颈癌，淋巴瘤或黑色素瘤。

5.根据权利要求1－2中任一项的用途，其中所述药物用于与至少一种其它抗肿瘤疗法联合施用，所述至少一种其它抗肿瘤疗法为放射疗法或化学疗法。

6.根据权利要求1－2中任一项的用途，其中所述常规抗肿瘤疗法为放射疗法，并且所述肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多项中有缺陷：1)I型干扰素的表达和/或功能；2)干扰素受体的表达和/或功能，其中所述干扰素受体为IFNα受体和/或IFNβ受体。