ES2233967T3 - Antagnositas del factor de crecimiento de celulas del endotelio vascular. - Google Patents
Antagnositas del factor de crecimiento de celulas del endotelio vascular.Info
- Publication number
- ES2233967T3 ES2233967T3 ES96910651T ES96910651T ES2233967T3 ES 2233967 T3 ES2233967 T3 ES 2233967T3 ES 96910651 T ES96910651 T ES 96910651T ES 96910651 T ES96910651 T ES 96910651T ES 2233967 T3 ES2233967 T3 ES 2233967T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hvegf
- antibody
- cells
- antibodies
- monoclonal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA ANTAGONISTAS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO CELULAR ENDOTELIAL VASCULAR HUMANO (HVEGF), INCLUYENDO ANTICUERPOS MONOCLONALES, RECEPTORES DE HVEGF, Y VARIANTES DE HVEGF QUE SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE DEGENERACION MACULAR RELACIONADA CON LA EDAD, ASI COMO OTRAS ENFERMEDADES Y TRASTORNOS CARACTERIZADOS POR UNA NEOVASCULARIZACION INDESEABLE O EXCESIVA.
Description
Antagonistas del factor de crecimiento de células
del endotelio vascular.
La presente invención se refiere a usos médicos
de anticuerpos antagonistas del factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF).
Los dos principales componentes celulares de la
vasculatura son las células endoteliales y las células del músculo
liso. Las células endoteliales forman el recubrimiento de la
superficie interna de todos los vasos sanguíneos, y constituyen una
interfaz no trombogénica entre la sangre y el tejido. Además, las
células endoteliales son un componente importante para el desarrollo
de nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las células
endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o
neovascularización, asociada con el crecimiento tumoral y la
metástasis, y con una variedad de enfermedades o trastornos no
neoplásicos.
Según se informa, varios polipéptidos, que
ocurren de forma natural, inducen la proliferación de las células
endoteliales. Entre esos polipéptidos se hallan los factores de
crecimiento de fibroblastos básico y ácido (FGF), Burgess y Maciag,
Annual Rev. Biochem., 58:575 (1989), el factor de crecimiento
celular derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa,
et al., Nature, 338:557 (1989), y el factor de
endotelial vascular (VEGF), Leung, et al., Science,
246:1306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 161:851 (1989); Tischer, et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 165:1198 (1989); Ferrara, et al.,
Patente PCT con nº de publicación WO 90/13649 (publicada el 15 de
noviembre de 1990).
El VEGF se identificó primero en medio
condicionado por células foliculares o foliculoestrelladas de la
pituitaria bovina. Los análisis bioquímicos indican que el VEGF
bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de
aproximadamente 45.000 daltones, y con una especificidad mitogénica
aparente por las células endoteliales vasculares. El ADN que
codificaba el VEGF bovino se aisló examinando una biblioteca de cADN
preparada a partir de tales células, usando oligonucleótidos basados
en la secuencia de aminoácidos amino-terminal de la
proteína como sondas de hibridación.
El VEGF humano se obtuvo examinando primero una
biblioteca de cADN preparada a partir de células humanas, usando el
cADN del VEGF bovino como una sonda de hibridación. Un cADN
identificado de ese modo codifica una proteína de
165-aminoácidos que tiene más del 95% de homología
con el VEGF bovino, proteína que es conocida como VEGF humano
(hVEGF). La actividad mitogénica del VEGF humano se confirmó
expresando el cADN del VEGF humano en células huésped de mamífero.
El medio condicionado por las células tratadas con el cADN del VEGF
humano promovió la proliferación de las células endoteliales
capilares, mientras que las células control no lo hicieron. Leung,
et al., Science, 246:1306 (1989).
Se identificaron varios cADN en bibliotecas de
cADN humanas que codifican isoformas de 121-, 189-, y
206-aminoácidos del hVEGF (denominadas también de
forma conjunta como proteínas relacionadas con el hVEGF). La
proteína de 121 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la
supresión de los 44 aminoácidos entre los residuos 116 y 159 del
hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de
la inserción de 24 aminoácidos en el residuo 116 del hVEGF, y
aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad vascular
(hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de
una inserción de 44 aminoácidos en el residuo 116 del hVEGF. Houck,
et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991); Ferrara et
al., J. Cell Biochem., 47:221 (1991); Ferrara et al.,
Endocrine Reviews, 13:18 (1992); Keck, et al.,
Science, 246:1309 (1989); Connolly, et al., J.
Biol. Chem., 264:20017 (1989); Keck, et al., Patente EPO
Nº de publicación 0.370.989 (publicada el 30 de mayo de 1990).
El VEGF no sólo estimula la proliferación de las
células endoteliales vasculares, sino que también induce la
permeabilidad vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que
implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de
endotelio preexistente, es un componente importante de una variedad
de enfermedades y trastornos, incluyendo la degeneración macular
relacionada con la edad.
Una revisión por D'Amore en Investigative
Ophthalmology & Visual Science,
35(12):3974-3979 (1994) discute los posibles
mecanismos de neovascularización retinal y coroidal.
La presente invención se refiere a antagonistas
del VEGF, los cuales son anticuerpos y variantes de los mismos que
son capaces de unirse específicamente al hVEGF. Los antagonistas
inhiben la actividad mitogénica, angiogénica, u otras actividades
biológicas del hVEGF, y, por tanto, son útiles para el tratamiento
de la degeneración macular relacionada con la edad, la cual se
caracteriza por una neovascularización excesiva y no deseable.
Los antagonistas del VEGF podrían ser anticuerpos
monoclonales poliespecíficos, los cuales son capaces de unirse a (a)
un epítopo que no es del hVEGF, por ejemplo, un epítopo de una
proteína implicada en la trombogénesis o trombolisis, o un antígeno
de superficie de célula tumoral, y (b) al hVEGF.
Los antagonistas del VEGF podrían estar
conjugados con un grupo citotóxico.
En consecuencia, la presente invención
proporciona usos, acordes con la reivindicación adjunta, de
antagonistas del VEGF, en donde los antagonistas son anticuerpos
anti-hVEGF.
Si se desea, el antagonista del VEGF podría
co-administrarse, bien simultánea o secuencialmente,
con uno o más de otros antagonistas del VEGF o sustancias
anti-angiogénicas.
La Figura 1 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o de un
anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos
(anti-HGF) irrelevante, sobre la unión de los
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF al hVEGF.
La Figura 2 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o de un
anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos
(anti-HGF) irrelevante, sobre la actividad biológica
del hVEGF en cultivos de células endoteliales capilares (ACE) del
córtex adrenal bovino.
La Figura 3 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1)
sobre la unión del hVEGF a células ACE bovinas.
La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 sobre la
velocidad de crecimiento del crecimiento de los tumores de NEG55 en
ratones.
La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el
tamaño de los tumores de NEG55 en ratones después de cinco semanas
de tratamiento.
La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab)
sobre el crecimiento de tumores de
SK-LMS-1 en ratones.
La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento con
diferentes dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores de A673 en
ratones.
La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el
crecimiento y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55)
en cultivo.
La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y
supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.
La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de
las células endoteliales humanas inducida por el fluido sinovial
humano.
El término "hVEGF" tal como se usa en ésta,
se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales
vasculares humano, y a los factores de crecimiento de células
endoteliales vasculares relacionados de 121, 189, y
206-aminoácidos, tal como describieron Leung, et
al., Science, 246:1306 (1989), y Houck, et al.,
Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto con las formas alélicas
y procesadas que ocurren de forma natural de estos factores de
crecimiento.
La presente invención se refiere a antagonistas
del hVEGF que son capaces de inhibir una o más de las actividades
biológicas del hVEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o
angiogénica. Los antagonistas del hVEGF actúan interfiriendo con la
unión del hVEGF a un receptor celular, incapacitando o matando las
células que han sido activadas por el hVEGF, o interfiriendo con la
activación de la célula endotelial vascular después de la unión del
hVEGF a un receptor celular. La totalidad de tales puntos de
intervención por parte de un antagonista del hVEGF deberían
considerarse equivalentes para los propósitos de esta invención.
Dentro del ámbito de la invención, se hallan incluidos los
anticuerpos, y preferiblemente los anticuerpos monoclonales, o
fragmentos de los mismos, que se unen al
hVEGF.
hVEGF.
El término "receptor del hVEGF" o
"hVEGFr", tal como se usa en ésta, se refiere a un receptor
celular para el hVEGF, ordinariamente un receptor de la superficie
celular hallado sobre células endoteliales vasculares, así como a
variantes del mismo que retienen la capacidad de unirse al
hVEGF.
Un ejemplo de receptor del hVEGF es la quinasa de
tirosina parecida a fms (flt), un receptor
transmembrana en la familia de quinasas de tirosina. De Vries et
al., Science, 255:989 (1992); Shibuya et al.,
Oncogene, 5:519 (1990). El receptor flt comprende un
dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio
intracelular con actividad quinasa de tirosina. El dominio
extracelular está implicado en la unión del hVEGF, mientras que el
dominio intracelular está implicado en la transducción de la
señal.
Otro ejemplo de un receptor del hVEGF es el
receptor flk-1 (también denominado como KDR).
Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026
(1991); Terman et al., Oncogene, 6:1677 (1991);
Terman, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
187:1579 (1992).
La unión del hVEGF al receptor flt resulta
en la formación de al menos dos complejos de peso molecular elevado,
que tiene un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 daltones.
Se cree que el complejo de 300.000 daltones es un dímero que
comprende dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de
hVEGF.
El término "recombinante", usando en
referencia al hVEGF, receptor del hVEGF, anticuerpos monoclonales, u
otras proteínas, se refiere a proteínas que se producen mediante la
expresión de ADN recombinante en una célula huésped. La célula
huésped podría ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana
tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una levadura o
una células de mamífero).
El término "anticuerpo monoclonal", tal como
se usa en ésta, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una
población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos
en especificidad y afinidad, excepto por posibles mutaciones, que
ocurren de forma natural, que podrían estar presentes en pequeñas
cantidades. Debería apreciarse que, como un resultado de tales
mutaciones que ocurren de forma natural y similares, una composición
de anticuerpo monoclonal de la invención, que predominantemente
contendrá anticuerpos capaces de unirse específicamente al hVEGF,
también podría contener pequeñas cantidades de otros
anticuerpos.
Por tanto, el modificador "monoclonal"
indica el carácter del anticuerpo, como habiéndose obtenido a partir
de una tal población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no
debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo
mediante cualquier procedimiento concreto. Por ejemplo, los
anticuerpos monoclonales de la invención podrían prepararse usando
el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler
y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o podrían prepararse
mediante procedimientos de ADN recombinante. Cabilly et al.,
patente estadounidense nº 4.816.567.
En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un
ratón, u otro animal huésped apropiado, con el hVEGF o una proteína
relacionada con el hVEGF mediante las vías subcutánea,
intraperitoneal, o intramuscular, para elicitar linfocitos que
producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente a la proteína usada en la inmunización.
Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in
vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de
mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como el
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
59-103 (Academic Press, 1986).
El antígeno podría se el hVEGF. El antígeno
opcionalmente es un fragmento o porción del hVEGF que tiene uno o
más residuos aminoácidos que participan en la unión del hVEGF a uno
de sus receptores.
Las células de hibridoma preparadas de este modo
se siembran y cultivan en un medio de cultivo apropiado, que
preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras
carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente
incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT),
sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en
HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquéllas
que se fusionan eficientemente, permiten un nivel de expresión
elevado y estable del anticuerpo por parte de las células
productoras del anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio
tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas de células de mieloma
preferidas son las líneas de mieloma de ratón, tales como las
derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y
MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell
Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células
SP-2 disponibles de la American Type Culture
Collection, Rockville, Md. EE.UU., y las células P3X63Ag8U.1
descritas por Yelton et al., Curr. Top. Microbiol.
Immunol. 81:1 (1978). También se han descrito líneas celulares
de mieloma humanas y de heteromielomas de
ratón-humanas para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984).
Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques
and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker,
Inc., Nueva York, 1987).
El medio de cultivo en el que crecen las células
de hibridoma se ensaya en busca de la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por las células de hibridoma se determina mediante
inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro,
tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente
unido a enzima (ELISA). Los anticuerpos monoclonales de la invención
son aquéllos que preferentemente inmunoprecipitan el hVEGF, o que
preferentemente se unen al hVEGF en un ensayo de unión, y que son
capaces de inhibir la actividad biológica del hVEGF.
Una vez se han identificado las células de
hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad,
y/o actividad de neutralización deseada, los clones podrían
subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante, y
cultivarse mediante procedimiento estándar. Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104
(Academic Press, 1986). Los medios de cultivo apropiados para este
propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por
Dulbecco o el medio RPMI-1640. Además, las células
de hibridoma podrían cultivarse in vivo como tumores
ascíticos en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido
ascítico, o suero, mediante procedimientos convencionales de
purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, la
proteína A-Sepharose, la cromatografía con
hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la
cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
de la invención se aisla y secuencia fácilmente usando
procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los
genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos
de ratón). Las células de hibridoma de la invención sirven como un
fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría
colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan a
continuación al interior de células huéspedes, tales como las
células COS de simio, las células ováricas de hámster chino (CHO), o
células de mieloma que de otro modo no producen proteína
inmunoglobulina, para obtener las síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células huéspedes recombinantes.
El ADN podría modificarse opcionalmente con
objeto de cambiar el carácter de la inmunoglobulina producida por su
expresión. Por ejemplo, se producen formas humanizadas de
anticuerpos de ratón sustituyendo una región determinante de
complementariedad (CDR) del dominio variable del anticuerpo de ratón
por la región correspondiente de un anticuerpo humano. En algunas
realizaciones, también se sustituyen residuos aminoácidos
seleccionados de la región estructural (FR) del anticuerpo de ratón
por los residuos aminoácidos correspondientes en el anticuerpo
humano. Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4285 (1992); Carter, et al., BioTechnology 10:163
(1992). Las formas quiméricas de los anticuerpos también se producen
remplazando con la secuencia codificante de dominios constantes de
las cadenas pesada y ligera humanas las secuencias de ratón
homólogas. Cabilly, et al., patente estadounidense nº
4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:6851 (1984).
Los anticuerpos incluidos dentro del ámbito de la
invención incluyen variantes de anticuerpos, tales como los
anticuerpos quiméricos (incluyendo los "humanizados") y
anticuerpos que comprenden cadenas de inmunoglobulina capaces de
unir el hVEGF y un epítopo que no es del hVEGF.
Los anticuerpos en ésta incluyen todas las
especies de origen, y las clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e
IgM) y subclases de inmunoglobulinas, así como los fragmentos de
anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), a
condición de que sean capaces de unir el hVEGF, y de que sean
capaces de antagonizar una actividad biológica del hVEGF.
En una realización preferida de la invención, el
anticuerpo monoclonal tendrá una afinidad por el antígeno
inmunizador de al menos aproximadamente 10^{9} litros/mol, tal
como se determina, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de
Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980). También, el
anticuerpo monoclonal típicamente inhibirá la actividad mitogénica o
angiogénica del hVEGF en al menos el 50%, preferiblemente en más del
80%, y lo más preferiblemente en más del 90%, según se determina,
por ejemplo, mediante ensayo de supervivencia o proliferación
celular in vitro, tal como se describe en el EJEMPLO 2.
Para algunas aplicaciones terapéuticas y
diagnósticas, es deseable que el anticuerpo monoclonal reaccione con
menos de la totalidad de formas moleculares diferentes del hVEGF.
Por ejemplo, podría ser deseable tener un anticuerpo monoclonal que
es capaz de unirse específicamente a la secuencia de 165 aminoácidos
del hVEGF, pero no a la secuencia de 121 ó 189 aminoácidos de los
polipéptidos del hVEGF. Tales anticuerpos se identifican fácilmente
mediante ensayos de ELISA comparativos o mediante
inmunoprecipitación comparativa de los diferentes polipéptidos del
hVEGF.
En algunas realizaciones es deseable proporcionar
un grupo citotóxico conjugado a un anticuerpo monoclonal específico
contra el hVEGF. En estas realizaciones, la citotoxina sirve para
incapacitar o matar células que están expresando o uniendo el hVEGF.
El conjugado es dirigido hacia la célula por el dominio que es capaz
de unirse al hVEGF. Por tanto, los anticuerpos monoclonales que son
capaces de unir el hVEGF se conjugan a citotoxinas. Mientras que
óptimamente los anticuerpos monoclonales son capaces de neutralizar
la actividad del hVEGF solo (sin la citotoxina), no es necesario en
esta realización que el anticuerpo monoclonal sea capaz de nada más
que unirse al hVEGF.
Típicamente, la citotoxina es una citotoxina
proteica, por ejemplo, la toxina de la difteria, ricina, o la toxina
de Pseudomonas, aunque en el caso de ciertas clases de
inmunoglobulinas, el dominio Fc del anticuerpo monoclonal podría
servir por sí mismo para proporcionar una citotoxina (por ejemplo,
en el caso de los anticuerpos IgG2, los cuales son capaces de fijar
el complemento y participar en la citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo (ADCC)). Sin embargo, no es necesario que la
citotoxina sea proteica, y podría incluir agentes quimioterapéuticos
usados hasta la fecha, por ejemplo, en el tratamiento de
tumores.
La citotoxina típicamente está unida a un
anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, mediante un enlace
amida con el esqueleto, dentro (o en lugar de parte o de la
totalidad) del dominio Fc del anticuerpo. El sitio óptimo de
sustitución se determinará mediante experimentación rutinaria, y se
halla dentro de la formación ordinaria.
Los conjugados que son fusión de proteínas se
construyen fácilmente en cultivos de células recombinantes
expresando un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los
conjugados se construyen entrecruzando de forma covalente el grupo
citotóxico con una cadena lateral de residuo aminoácido o carboxilo
C-terminal del anticuerpo, usando procedimientos
conocidos per se, tales como el intercambio de disulfuro, o
el anclaje a través de un enlace tioéster usando, por ejemplo,
iminotiotato y
metil-4-mercaptobutirimadato.
Los anticuerpos monoclonales que son antagonistas
del hVEGF se conjugan también con sustancias que podrían no
clasificarse fácilmente como citotoxinas por sus propios méritos,
pero que aumentan la actividad de las composiciones en ésta. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales capaces de unirse al hVEGF se
fusionan con polipéptidos heterólogos, tales como secuencias
virales, con receptores celulares, con citoquinas tales como el TNF,
interferones, o interleuquinas, con polipéptidos que tienen
actividad pro-coagulante, y con otros polipéptidos
biológica o inmunológicamente activos. Tales fusiones se realizan
fácilmente mediante procedimientos recombinantes. Típicamente, tales
polipéptidos que no son de inmunoglobulina sustituyen el(los)
dominio(s) constante(s) de un anticuerpo
anti-hVEGF.
Alternativamente, sustituyen un dominio variable
de un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo
anti-hVEGF descrito en ésta.
En las realizaciones preferidas, tales
polipéptidos que no son de inmunoglobulina, se unen a o sustituyen
los dominios constantes de un anticuerpo descrito en ésta. Bennett,
et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067
(1991). Alternativamente, sustituyen el Fv de un anticuerpo en ésta
para crear un anticuerpo polivalente quimérico que comprende al
menos un sitio de unión a antígeno restante que tiene especificidad
por el hVEGF, y un sitio de unión a antígeno suplente que tiene una
función o especificidad distinta de la del anticuerpo de
partida.
Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse al
hVEGF sólo tienen que contener un único sitio de unión para los
epítopos enumerados, típicamente un único complejo de cadena
pesada-ligera o fragmento del mismo. No obstante,
tales anticuerpos opcionalmente son también portadores de dominios
de unión a antígeno que son capaces de unir un epítopo que no se
halla en el hVEGF. Por ejemplo, la sustitución de la secuencia de
aminoácidos o de los residuos aminoácidos correspondientes de un
anticuerpo anti-hVEGF nativo, con los residuos
determinantes de complementariedad y, si es preciso, con los
estructurales de un anticuerpo que tiene especificidad por un
antígeno distinto del hVEGF, creará un anticuerpo poliespecífico que
comprenderá un sitio de unión a antígeno que tiene especificidad por
el hVEGF, y otro sitio de unión a antígeno que tiene especificidad
por el antígeno que no es el hVEGF. Estos anticuerpos son al menos
bivalentes, pero podrían ser polivalentes, dependiendo del número de
sitios de unión a antígeno poseídos por la clase de anticuerpo
elegida. Por ejemplo, los anticuerpos de la clase IgM serán
polivalentes.
En las realizaciones preferidas de la invención,
tales anticuerpos son capaces de unir un epítopo del hVEGF y, o (a)
un polipéptido activo en la coagulación de la sangre, tal como la
proteína C o el factor de tejido, o (b) una proteína citotóxica, tal
como el factor de necrosis del tumor (TNF), o (c) un receptor de
superficie celular, que no es el hVEGFr, tal como el CD4 o el
receptor HER-2 (Maddon, et al., Cell
42:39 (1985); Coussens, et al., Science 230:1137
(1985)). Los anticuerpos heteroespecíficos, multivalentes, se
construyen de forma conveniente cotransformando una célula huésped
con ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de ambos
anticuerpos, y recuperando a continuación, mediante cromatografía de
inmunoafinidad o similar, la proporción de anticuerpos expresados
que tienen las propiedades de unión a antígeno deseadas.
Alternativamente, tales anticuerpos se construyen in vitro
mediante la recombinación de anticuerpos monoespecíficos.
Los dominios unidores en el hVEGF se determinan
mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los
estudios de rayos X, los análisis de mutaciones, y los estudios de
unión al anticuerpo. Las estrategias de mutaciones incluyen las
técnicas de mutagénesis de saturación aleatoria acoplada con la
selección de mutantes de escape, y la mutagénesis por inserción.
Cunningham, et al., Science
244:1081-1085 (1989). Este procedimiento implica la
identificación de regiones que contienen cadenas laterales de
aminoácidos cargadas. Los residuos cargados en cada región
identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son remplazados
(una región por molécula mutante) con Ala, y se ensaya la unión al
receptor de los ligandos obtenidos, para verificar la importancia de
la región concreta en la unión al receptor. Un potente procedimiento
adicional para la localización de los dominios de unión al receptor
es a través del uso de anticuerpos anti-hVEGF
neutralizantes. Kim et al., Growth Factors 7:53
(1992). Habitualmente se usa una combinación de éstos y similares
procedimientos para localizar los dominios implicados en la unión al
receptor.
Los fragmentos y las variantes de la secuencia de
aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante procedimientos
conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a un sitio
del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en
un vector de expresión apropiado, y a continuación se transfectan
las células huéspedes con el vector recombinante. Las células
huéspedes recombinantes se cultivan en medios de cultivo apropiados,
y el fragmento deseado o la variante de la secuencia de aminoácidos
expresados en las células huéspedes se recuperan entonces del
cultivo de células recombinantes mediante procedimientos
cromatográficos u otros procedimientos de purificación.
Alternativamente, los fragmentos y variantes de
aminoácidos del hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo,
mediante proteolisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis usando
procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida,
tal como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149
(1963)), aunque podrían usarse otras síntesis químicas equivalentes
conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a
partir del extremo C-terminal del péptido, acoplando
un \alpha-aminoácido protegido a una resina
apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando
técnicas bien conocidas en el campo para la formación de enlaces
peptídicos.
Para las aplicaciones terapéuticas, los
antagonistas de la invención podrían administrarse a un mamífero,
preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación
farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquéllas que podrían
administrarse a un humano intravenosamente como un bolo o mediante
infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante rutas
intramusculares, subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales,
intratecales, orales, tópicas, o de inhalación. Los antagonistas
también se administran convenientemente mediante rutas
intralesionales o perilesionales, para ejercer efectos terapéuticos
locales así como sistémicos.
Tales formas de dosificación abarcan los
portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no
tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen
los intercambiadores de iones, la alúmina, el estearato de aluminio,
la lecitina, las proteínas del suero, tales como la albúmina de
suero humana, las sustancias tamponantes tales como los fosfatos,
glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de
glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o
electrólitos tales como el sulfato de protamina, el fosfato de
hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno potasio, el cloruro sódico,
las sales de zinc, el sílica coloidal, el trisilicato de magnesio,
la polivinilpirrolidona, sustancias basadas en la celulosa, y
polietilenglicol. Los portadores para formas tópicas o basadas en
gel del antagonista incluyen los polisacáridos, tales como la
carboximetilcelulosa de sodio o la metilcelulosa, la
polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros del bloque
polioxietilén-polioxipropilén, el polietilenglicol,
y los alcoholes de ceras de madera. En todas las administraciones se
usan convenientemente formas de almacenamiento convencionales. Tales
formas incluyen, por ejemplo, las microcápsulas, las nanocápsulas,
los liposomas, los parches, las formas para inhalación, los
aerosoles nasales, y las tabletas sublinguales, y las preparaciones
de liberación continua. El antagonista típicamente se formulará en
tales vehículos en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml
hasta 100 mg/ml.
Los ejemplos apropiados de preparaciones de
liberación continua incluyen las matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista,
matrices que se hallan en forma de artículos moldeados, por ejemplo,
películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación
continua incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
tal como describen Langer et al., J. Biomed. Mater.
Res. 15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech.
12:98-105 (1982), o los poli(vinilalcohol),
poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros
de ácido L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato
(Sidman et al., Biolpolymers 22:547 (1983), el
etilen-vinil-acetato no degradable
(Langer et al., ver más arriba), los copolímeros degradables
de ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Depot^{TM}
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que los polímeros tales como el
etilen-vinil acetato y el ácido láctico-ácido
glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100
días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de
tiempo más breves. Cuando los antagonistas polipeptídicos
encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período prolongado,
podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la humedad a
37ºC, resultando en la pérdida de actividad biológica y en posibles
cambios en su inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias
racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo
implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de
agregación es la formación de enlaces S-S
intermoleculares a través del intercambio tiodisulfuro, la
estabilización podrían conseguirse modificando los residuos
sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando
el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando
composiciones de matriz de polímero específicas.
Las composiciones de liberación continua de
antagonista del hVEGF incluyen también los anticuerpos antagonistas
atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen el antagonista
se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales
como los descritos por Epstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); la patente estadounidense nº
4.485.045; la patente estadounidense nº 4.544.545. Ordinariamente
los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente
200-800 angstroms), en los cuales el contenido en
lípido es superior a aproximadamente el 30 mol. % de colesterol,
ajustándose la proporción seleccionada para la óptima terapia HRG.
Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la
patente estadounidense nº 5.013.556.
Otro uso de la presente invención comprende la
incorporación de un antagonista del hVEGF en artículos moldeados.
Tales artículos pueden usarse para modular el crecimiento de las
células endoteliales y la angiogénesis.
Para la prevención y tratamiento de la
enfermedad, la dosis apropiada del antagonista dependerá del tipo de
enfermedad a tratarse, tal como se definió más arriba, la gravedad
del curso de la enfermedad, de si los anticuerpos se administran con
propósito preventivo o terapéutico, de la terapia previa, del
historial clínico del paciente, y de la respuesta al antagonista, y
del criterio del médico responsable. El antagonista se administra
convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de
tratamientos.
La degeneración macular asociada a la edad (AMD)
es una causa principal de pérdida visual grave en la población
anciana. La forma exudativa de la AMD se caracteriza por la
neovascularización coroidal y el desprendimiento del epitelio
retinal pigmentado. Puesto que la neovascularización coroidal está
asociada con un empeoramiento dramático en la prognosis, se espera
que los antagonistas del VEGF de la presente invención sean
especialmente útiles para reducir la gravedad de la ADM.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad,
aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg de antagonistas es una
dosis candidata inicial para su administración a un paciente, sea,
por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o
mediante infusion continua. Una dosis diaria típica podría oscilar
entre desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más,
dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para
administraciones repetidas a los largo de varios días o más,
dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que
ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No
obstante, podrían ser útiles otros regímenes de dosificación. El
progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas
y ensayos convencionales.
De acuerdo con otra realización de la invención,
la efectividad del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad
podría mejorarse administrando el antagonista en serie o en
combinación con otro agentes que es efectivo para esos propósitos,
tal como el factor de necrosis del tumor (TNF), un anticuerpo capaz
de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de
crecimiento de fibroblastos ácido o básico (FGF) o del factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o
neutralizar las actividades coagulantes del factor de tejido, de la
proteína C, o de la proteína S (ver Esmon, et al.,
Publicación de Patente PCT nº WO 91/01.753, publicada el 21 de
febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2
(ver Hudziak et al., Publicación de Patente PCT nº WO
89/06.692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes
terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, los agentes
alquilantes, los antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del
metabolismo de los ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de la
pirimidina, el 5-fluorouracilo, el cisplatino, los
nucleósidos de purina, la aminas, los aminoácidos, los triazol
nucleósidos, o los corticoesteroides. Tales otros agentes podrían
estar presentes en la composición que se está administrando, o
podrían administrarse.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo a modo de
ilustración, y no se pretende que limiten la invención en modo
alguno.
Para obtener hVEGF conjugado con hemocianina de
lapa con forma de agujero de cerradura (KLH) para la inmunización,
se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung, et
al., Science 246:1306 (1989), con KLH en una proporción
de 4:1 en presencia de 0,05% de glutaraldehído, y se incubó la
mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas, con agitación suave.
A continuación se dializó la mezcla frente a solución salina
tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC, durante la noche. Se inmunizaron
ratones BALB/C cuatro veces cada dos semanas mediante inyecciones
intraperitoneales de 5 \mug de KLH, y se inmunizaron
secundariamente (boosted) con la misma dosis de hVEGF
conjugado con KLH cuatro días antes de la fusión celular.
Se fusionaron células del bazo, procedentes de
ratones inmunizados, con células de mieloma P3X63Ag8U.1,
Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), usando polietilenglicol (PEG) al 35%, tal como se ha descrito. Yarmush, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77:2899 (1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.
Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), usando polietilenglicol (PEG) al 35%, tal como se ha descrito. Yarmush, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77:2899 (1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.
Los sobrenadantes procedentes de cultivos
celulares de hibridomas se examinaron en busca de producción de
anticuerpo anti-hVEGF mediante un ensayo ELISA
usando placas de microvaloración recubiertas con hVEGF. El
anticuerpo que estaba unido al hVEGF en cada uno de los pocillos se
determinó usando inmunoglobulina IgG anti-ratón de
cabra conjugada con fosfatasa alcalina, y el sustrato cromogénico
p-nitrofenilfosfato. Harlow y Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Las células de hibridoma identificadas de este modo como productoras
de anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron mediante
dilución limitante, y se escogieron dos de esos clones, denominados
A4.6.1 y B2.6.2, para ulteriores estudios.
Las especificidades de unión de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los
anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de
microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF, FGF,
HGF o factor de crecimiento epidérmico (EGF). El anticuerpo unido se
detectó con inmunoglobulinas IgG de cabra anti-ratón
conjugadas con peroxidasa. Los resultados de esos ensayos
confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al hVEGF, pero no detectablemente
a ésos otros factores de crecimiento proteicos.
Se usó un ELISA de unión competitiva para
determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al mismo o diferentes epítopos
(sitios) en el hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun.
57:944 (1989). Se añadieron anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF sin marcar (A4.6.1 o B2.6.2), o
anticuerpo anti-HGF irrelevante (isotipo IgG1) a los
pocillos de las placas de microvaloración que previamente se habían
recubierto con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1
o BIO-B2.6.2) se añadieron a continuación. La
proporción de anticuerpo biotinilado respecto anticuerpo sin marcar
fue de 1:1000. La unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó
mediante la adición de avidina conjugada con peroxidasa, seguida por
o-fenilenediamina dihidrocloruro y peróxido de
hidrógeno. El color de la reacción, indicando la cantidad de
anticuerpo biotinilado unido, se determinó midiendo la densidad
óptica (O.D) a una longitud de onda de 495 nm.
Tal como se muestra en la Figura 1, en cada caso,
la unión del anticuerpo anti-hVEGF biotinilado fue
inhibida por el correspondiente anticuerpo sin marcar, pero no por
los otros anticuerpos anti-hVEGF no marcados o por
el anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que
los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se unen a diferentes epítopos del hVEGF.
Los isotipos de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras de
medio de cultivo (sobrenadante), en los cuales estaban creciendo
cada uno de los hibridomas, a los pocillos de placas de
microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF. Los
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF capturados se
incubaron con diferentes inmunoglobulinas de cabra
anti-ratón, conjugadas con fosfatasa alcalina, y
específicas para diferentes isotipos, y la unión de los anticuerpos
conjugados a los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF
se determinó mediante la adición de
p-nitrofenilfosfato. El color de la reacción se
midió a 405 nm con un lector de placas de ELISA.
Mediante ése procedimiento, se determinó que el
isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por ambos
hibridomas, A4.6.1 y B2.6.2, era el IgG1.
Las afinidades por el hVEGF de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante un ensayo de
unión competitiva. Se añadió una concentración predeterminada
subóptima de anticuerpo monoclonal a muestras que contenían
20.000-40.000 c.p.m. de
^{125}I-hVEGF (1-2 ng) y varias
cantidades conocidas de hVEGF sin marcar (1-1000
ng). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100
\mul de antisuero de cabra anti Ig de ratón
(Pel-Freez, Rogers, AR, EE.UU.), y las mezclas se
incubaron otra hora a temperatura ambiente. Los complejos de
anticuerpo y proteína unida (complejos immunes) se precipitaron
mediante la adición de 500 \mul de polietilenglicol al 6% (PEG,
peso molecular: 8000), a 40ºC, seguida por la centrifugación a
2000\timesg, durante 20 minutos, a 4ºC. La cantidad de
^{125}I-hVEGF unido al anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el
material precipitado en un contador gamma.
Las constantes de afinidad se calcularon a partir
de los datos mediante análisis Scatchard. Se calculó que la afinidad
del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por
el hibridoma A4.6.1 era de 1,2 \times 10^{9} litros/mol. Se
calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma B2.6.2 era de
2,5 \times 10^{9} litros/mol.
Se sembraron células endoteliales capilares (ACE)
del córtex adrenal bovino, Ferrara, et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml
en placas de 12 multipocillos, y se añadieron 2,5 ng/ml de hVEGF a
cada pocillo en presencia o ausencia de varias concentraciones de
los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos
por los hibridomas A4.6.1 o B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal
anti-HGF irrelevante. Después de cultivarlas durante
5 días, las células en cada pocillo se contaron en un contador
Coulter. Como control, se cultivaron células ACE en ausencia de
hVEGF añadido.
Tal como se muestra en la Figura 2, ambos
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF inhibieron la
capacidad del hVEGF añadido para apoyar el crecimiento o
supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad
mitogénica del hVEGF (más de aproximadamente el 90% de inhibición),
mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma
B2.6.2 inhibió sólo parcialmente la actividad mitogénica del
hVEGF.
Se sembraron células ACE bovina a una densidad de
2,5 \times 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas de
microvaloración de 24 pocillos, en medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero fetal bovino, glutamina
2 mM, y 1 n/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico.
Después de cultivarlas durante la noche, se lavaron las células una
vez en tampón unidor (iguales volúmenes de DMEM y medio F21 más
HEPES 25 mM y 1% de albúmina de suero bovino) a 4ºC.
Se preincubaron 12.000 c.p.m. de
^{125}I-hVEGF (aprox. 5 \times 10^{4}
c.p.m./ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF producido por los hibridomas
A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1 (250 \mul de volumen total), y a
continuación se añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en
las placas de microvaloración. Después de incubar las células
durante 3 horas a 4ºC, se lavaron las células 3 veces con tampón
unidor a 4ºC, se solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH
0,2 N, y se contaron en un contador gamma.
Tal como se muestra en la Figura 3 (superior),
los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos
por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a
las células ACE bovinas. Por contra, el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no
tenía un efecto evidente sobre la unión del hVEGF a las células ACE
bovinas. De forma consistente con los resultados obtenidos en el
ensayo de proliferación descrito más arriba, el anticuerpo
monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión del
hVEGF con mayor alcance que el anticuerpo monoclonal producido por
el hibridoma B2.6.2.
Tal como se muestra en la Figura 3 (inferior), el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió
completamente la unión del hVEGF a las células ACE bovinas en un
proporción molar de 1:250 del hVEGF respecto el anticuerpo.
Para determinar si el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1
reacciona con las formas de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, se
ensayó la capacidad del anticuerpo para inmunoprecipitar esos
polipéptidos.
Se transfectaron células 293 humanas con vectores
que comprendían la secuencia codificante de nucleótidos de los
polipéptidos de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, tal como se
describió. Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dos
días después de la transfección, se transfirieron las células a
medio que carecía de cisteína y metionina. Se incubaron las células
30 minutos en cada medio, a continuación se añadieron al medio 100
\muCi/ml de cada una de ^{35}S-metionina y
^{35}S-cisteína, y se incubaron las células otras
dos horas. El marcaje se capturó transfiriendo las células a medio
carente de suero e incubándolas durante tres horas. Se recolectaron
los medios de cultivos de las células, y las células se lisaron
incubándolas durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM, 1%
de NP40, 0,5% de deoxicolato, 0,1% de sodio dodecil sulfato (SDS),
Tris 50 mM, pH 8,0). Los restos celulares se retiraron de los
lisados mediante centrifugación a 200 \timesg durante 30
minutos.
Se incubaron 500 \mul de las muestras de medios
de cultivo de las células y lisados de las células con 2 \mul del
anticuerpo del hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora, a 4ºC, y
a continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG
anti-ratón de conejo durante 1 hora, a 4ºC. Los
complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF se precipitaron con proteína
A-Sepharose (Pharmacia), entonces se sometieron a
electroforesis el gel de poliacrilamida-SDS al 12%
en condiciones reductoras. Se expuso el gel a una película de rayos
X para el análisis mediante autorradiografía de las proteínas
marcadas radiactivamente e inmunoprecipitadas.
Los resultados de ese análisis indicaron que el
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el
hibridoma A4.6.1 reaccionaba de forma cruzada con ambas, las formas
de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF.
Ejemplo antecedente
3
Las secuencias de nucleótidos y codificante de
aminoácido del receptor flt del hVEGF se descubren en Shibuya
et al., Oncogene 5:519-524 (1990). La
secuencia codificante del dominio extracelular del receptor
flt del hVEGF se fusionó a la secuencia codificante de la
cadena pesada de la IgG1 humana en un proceso de dos pasos.
Se usó la mutagénesis dirigida a un sitio para
introducir un sitio de restricción BstBI en ADN que codificaba el
flt en un sitio 5' respecto el codón para el aminoácido 759
del flt, y para convertir el único sitio de restricción
BstEII en el plásmido pBSSK-FC, Bennet et
al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067
(1991), en un sitio BstBI. El plásmido modificado se digirió con con
EcoRI y BsTBI, y el gran fragmento de ADN de plásmido resultante se
ligó junto con un fragmento EcoRI-BstBI del ADN del
flt que codificaba el dominio extracelular (aminoácidos
1-758) del receptor flt del hVEGF.
La construcción resultante se digirió con ClaI y
NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, el cual se
insertó a continuación en el sitio de clonación múltiple del vector
de expresión en mamíferos pHEBO2 (Leung et al., Neuron
8:1045 (1992)) mediante ligación. Los extremos del fragmento de 3,3
kb se modificaron, por ejemplo, mediante la adición de conectores,
para obtener la inserción del fragmento en el vector en la
orientación correcta para su expresión.
Se transfectaron células huésped de mamíferos
(por ejemplo, las células CEN4 (Leung et al., ver más
arriba)) con el plásmido pHEBO2, que contenía el inserto del
flt, mediante electroporación. Las células transfectadas se
cultivaron en medio que contenía aproximadamente un 10% de suero
fetal bovino, glutamina 2 mM, y antibióticos, y a aproximadamente el
75% de confluencia se transfirieron a medio carente de suero. El
medio se condicionó durante 3-4 días antes de
recogerlo, y la proteína de fusión flt-IgG se purifico a
partir del medio condicionado mediante cromatografía sobre una
matriz de proteína A-Sepharose, esencialmente tal
como se describe en Bennett et al., J. Biol. Chem.
266:23060-23067 (1991).
(Ejemplo
antecedente)
Se ensayó mediante ELISA la producción de hVEGF
en varias líneas celulares tumorales creciendo en cultivo. Se halló
que las líneas celulares tumorales de ovario, pulmón, colon,
gástricas, de mama y de cerebro producían hVEGF. Tres líneas
celulares que producen el hVEGF, la NEG 55 (línea celular de glioma
humano, obtenida del Dr. M. Westphal, Departamento de Neurocirugía,
University Hospital Eppendor, Hamburgo, Alemania, también denominada
G55), la A-673 (línea celular de rabdomiosarcoma
humano, obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC),
Rockville, Maryland, EE.UU., 28052, como línea celular con nº de CRL
1598), y la SK-LMS-1 (línea celular
de leiomiosarcoma, obtenida de la ATCC como la línea celular número
HTB 88), se usaron para estudios adicionales.
Se inyectaron subcutáneamente de seis a diez
ratones inmunodeprimidos (nude) (Charles River Laboratory,
Wilmington, Massachusetts, EE.UU.) con 1-5 \times
10^{6} células tumorales en 100-200 \mul de PBS.
En diversos instantes, una vez se había establecido el crecimiento
tumor, se inyectaron los ratones intraperitonealmente, una o dos
veces por semana, con varias dosis de anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF de A4.6.1, un anticuerpo monoclonal
anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño del
tumor se midió cada semana, y a la conclusión del estudio los
tumores se extrajeron y pesaron.
El efecto de varias cantidades del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento
de los tumores de NEG 55 en ratones se muestra en las Figuras 4 y 5.
La Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug ó 100
\mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de
A4.6.1, empezando una semana después de la inoculación de células
NEG 55, tenían una tasa de crecimiento del tumor sustancialmente
reducida en comparación con los ratones tratados, bien con el
anticuerpo irrelevante o con PBS. La Figura 5 muestra que cinco
semanas después de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño
de los tumores en los ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 eran aproximadamente del 50%
(en el caso de los ratones tratados con dosis de 25 \mug del
anticuerpo) al 85% (en el caso de los ratones tratados con dosis de
100 \mug del anticuerpo) menores que el tamaño de los tumores en
ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o con PBS.
El efecto del tratamiento con el anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento
de los tumores de SK-LMS-1 en
ratones se muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la
inoculación de la células SK-LMS-1,
el tamaño promedio de los tumores en ratones tratados con el
anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente
un 75% inferior respecto los tamaños de los tumores en ratones
tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF sobre el crecimiento de
tumores de A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas
después de la inoculación de las células A673, el tamaño promedio de
los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente del 60% (en
el caso de los ratones tratados con dosis de 10 \mug del
anticuerpo) a más del 90% (en el caso de los ratones tratados con
dosis de 50-400 \mug del anticuerpo) inferiores al
tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
irrelevante o PBS.
(Ejemplo
antecedente)
Las células de glioblastoma humano NEG55 o las
células de rabdomiosarcoma A673 se sembraron a una densidad de 7
\times 10^{3} células/ml en placas multipocillos (12
pocillos/placa), en medio F12/DMEM que contenían un 10% de suero
fetal bovino, glutamina 2 mM, 7y antibióticos. A continuación se
añadió el anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 a los
cultivos celulares hasta una concentración final de
0-20,0 \mug de anticuerpo/ml. Transcurridos cinco
días, las células que crecían en los pocillos se disociaron mediante
exposición a tripsina, y se contaron en un contador Coulter.
Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de esos
estudios. Como es evidente, el anticuerpo anti-hVEGF
de A4.6.1 no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento
de las células NEG55 y A673 en cultivo. Estos resultados indican que
el anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 no es citotóxico,
y sugieren con fuerza que los efectos antitumorales del anticuerpo
observados se deben a su inhibición de la neovascularización mediada
por el VEGF.
Ejemplo
6
(Ejemplo
antecedente)
La quimiotaxis de las células endoteliales, y de
otras células, incluyendo los monocitos y linfocitos, juega un papel
importante en la patogénesis de la artritis reumatoide. La migración
y proliferación de las células endoteliales acompañan la
angiogénesis que ocurre en el sinovio reumatoide. El tejido
vascularizado (pannus) invade y destruye el cartílago articular.
Para determinar si los antagonistas del hVEGF
interfieren con este proceso, ensayamos el efecto del anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 sobre la quimiotaxis de células
endoteliales estimuladas, mediante fluido sinovial procedente de
pacientes que tienen la artritis reumatoide. Como control, ensayamos
el efecto del anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 sobre
la quimiotaxis de células endoteliales estimuladas mediante fluido
sinovial procedente de paciente que tienen osteoartritis (la
angiogénesis que ocurre en la artritis reumatoide no ocurre en la
osteoartritis).
La quimiotaxis de las células endoteliales se
ensayó usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con
procedimientos establecidos. Thompson et al., Cancer
Res. 51:2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Biol.
Med. 197:458 (1991). Aproximadamente 10^{4} células
endoteliales de la vena umbilical humana se dejaron adherir a
filtros recubiertos de gelatina (tamaño de poro de 0,8 micrones), en
microcámaras multipocillos de 48 pocillos, en medio de cultivo que
contenía un 0,1% de suero fetal bovino. Transcurridas
aproximadamente dos horas, se invirtieron las cámaras y se añadieron
a los pocillos muestras de ensayo (fluido sinovial de artritis
reumatoide, fluido sinovial de osteoartritis, FGF básico (bFGF)
(hasta una concentración final de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 (hasta una concentración final
de 10 \mug/ml). Después de dos a cuatro horas, se tiñeron y
contaron las células que habían migrado.
La Figura 10 muestra los resultados promedio de
esos estudios. Los valores mostrados en la columna marcada "Fluido
Sinovial", y los mostrados al final de la página para los
controles, son el número promedio de células endoteliales que
migraron en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS solo. Los
valores en la columna marcada "Fluido Sinovial + mAB VEGF" son
el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia
de fluido sinovial más anticuerpo anti-hVEGF de
A4.6.1 añadido. Los valores en la columna marcada "% de
Supresión" indican el porcentaje de reducción en la migración de
células endoteliales, inducida por el fluido sinovial, que resulta
de la adición del anticuerpo anti-hVEGF. Tal como se
indica, el anticuerpo anti-hVEGF inhibió
significativamente la capacidad del fluido sinovial de la artritis
reumatoide (53,40 porcentaje promedio de inhibición), pero no la del
fluido sinovial de la osteoartritis (13,64 porcentaje promedio de
inhibición), para inducir la migración de células endoteliales.
Claims (1)
1. Utilización de un antagonista del hVEGF en la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la
degeneración macular asociada a la edad, en donde el antagonista del
hVEGF interfiere con la unión del hVEGF al receptor flt y/o
al receptor flk1, y en donde el antagonista del hVEGF es un
anticuerpo anti-hVEGF o fragmento del mismo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41330595A | 1995-03-30 | 1995-03-30 | |
| US413305 | 1995-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2233967T3 true ES2233967T3 (es) | 2005-06-16 |
Family
ID=23636728
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04026995T Expired - Lifetime ES2255027T3 (es) | 1995-03-30 | 1996-03-28 | Antagonistas de factores de crecimiento de celulas endotheliales vasculares. |
| ES96910651T Expired - Lifetime ES2233967T3 (es) | 1995-03-30 | 1996-03-28 | Antagnositas del factor de crecimiento de celulas del endotelio vascular. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04026995T Expired - Lifetime ES2255027T3 (es) | 1995-03-30 | 1996-03-28 | Antagonistas de factores de crecimiento de celulas endotheliales vasculares. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (8) | US20070253959A1 (es) |
| EP (3) | EP1627643A3 (es) |
| JP (1) | JPH11502853A (es) |
| AT (2) | ATE311902T1 (es) |
| AU (1) | AU696487B2 (es) |
| CA (3) | CA2754887A1 (es) |
| DE (2) | DE69635565T2 (es) |
| DK (1) | DK0817648T3 (es) |
| ES (2) | ES2255027T3 (es) |
| IL (1) | IL117645A (es) |
| MX (1) | MX9706828A (es) |
| NZ (1) | NZ305699A (es) |
| PT (1) | PT817648E (es) |
| WO (1) | WO1996030046A1 (es) |
Families Citing this family (229)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6168778B1 (en) | 1990-06-11 | 2001-01-02 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Vascular endothelial growth factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes |
| US6762290B1 (en) | 1999-07-29 | 2004-07-13 | Gilead Sciences, Inc. | High affinity vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor nucleic acid ligands and inhibitors |
| US6245530B1 (en) | 1995-08-01 | 2001-06-12 | Ludwig Institute For Cancer Research | Receptor ligand |
| US6818220B1 (en) | 1994-11-14 | 2004-11-16 | Licentia Ltd. | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof |
| US6130071A (en) * | 1997-02-05 | 2000-10-10 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) ΔCys156 protein and gene, and uses thereof |
| US6221839B1 (en) | 1994-11-14 | 2001-04-24 | Helsinki University Licensing Ltd. Oy | FIt4 ligand and methods of use |
| US6403088B1 (en) | 1995-08-01 | 2002-06-11 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3) |
| US6645933B1 (en) | 1995-08-01 | 2003-11-11 | Helsinki University Licensing Ltd. Oy | Receptor ligand VEGF-C |
| US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
| US6361946B1 (en) | 1997-02-05 | 2002-03-26 | Licentia Ltd | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
| US7423125B2 (en) | 1995-08-01 | 2008-09-09 | Vegenics Limited | Antibodies to VEGF-C |
| US6426335B1 (en) | 1997-10-17 | 2002-07-30 | Gilead Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes |
| US6051698A (en) * | 1997-06-06 | 2000-04-18 | Janjic; Nebojsa | Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes |
| US7125714B2 (en) | 1997-02-05 | 2006-10-24 | Licentia Ltd. | Progenitor cell materials and methods |
| DK0973804T3 (da) | 1997-04-07 | 2007-05-07 | Genentech Inc | Anti-VEGF-antistoffer |
| US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
| US20070059302A1 (en) | 1997-04-07 | 2007-03-15 | Genentech, Inc. | Anti-vegf antibodies |
| US20020032315A1 (en) | 1997-08-06 | 2002-03-14 | Manuel Baca | Anti-vegf antibodies |
| DE19744531A1 (de) * | 1997-10-09 | 1999-05-27 | Klaus Dr Rer Nat Bosslet | Bindemoleküle gegen Rezeptor-Ligand-Komplexe |
| US6391311B1 (en) | 1998-03-17 | 2002-05-21 | Genentech, Inc. | Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1 |
| GB9723780D0 (en) * | 1997-11-12 | 1998-01-07 | Univ Manchester | Regulation of ocular angiogenesis |
| IL137649A (en) * | 1998-02-18 | 2004-08-31 | Genentech Inc | Method of adsorption chromatography |
| AU758353B2 (en) * | 1998-03-17 | 2003-03-20 | Genentech Inc. | Polypeptides homologous to VEGF and BMP1 |
| EP2016953A3 (en) | 1998-12-22 | 2009-04-15 | Genentech, Inc. | Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof |
| DE10008946C1 (de) | 2000-02-25 | 2001-10-18 | Basf Coatings Ag | Verfahren zur Herstellung farb- und/oder effektgebender Mehrschichtlackierungen auf Automobilkarosserien |
| EP2168980A1 (en) | 2000-06-23 | 2010-03-31 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogensis |
| EP2792747A1 (en) | 2000-06-23 | 2014-10-22 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis |
| DE10043405C1 (de) | 2000-09-04 | 2002-06-27 | Basf Coatings Ag | Verfahren zur Herstellung farb- und/oder effektgebender Lackierungen |
| DE10130972C1 (de) | 2001-06-27 | 2002-11-07 | Basf Coatings Ag | Verfahren zur Herstellung von Beschichtungen aus thermisch und mit aktinischer Strahlung härtbaren Beschichtungsstoffen und mit dem Verfahren herstellbare Lackierungen |
| US20050123925A1 (en) | 2002-11-15 | 2005-06-09 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
| CA2473144C (en) | 2002-02-05 | 2013-05-28 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| CA2474405A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Richard Brunner | Medicament for the treatment of choroidal neovascularisation |
| ES2545067T3 (es) | 2002-04-26 | 2015-09-08 | Genentech, Inc. | Purificación de proteínas basada en la no afinidad |
| MXPA05012723A (es) * | 2003-05-30 | 2006-02-08 | Genentech Inc | Tratamiento con anticuerpos anti-vgf. |
| US7601341B2 (en) | 2003-06-05 | 2009-10-13 | Research Development Foundation | Vascular endothelial growth factor fusion constructs used to inhibit osteoclastogenesis |
| DK3095793T3 (da) | 2003-07-28 | 2020-05-25 | Genentech Inc | Reducering af udvaskning af protein A under en protein A-affinitetskromatografi |
| NZ546088A (en) | 2003-08-27 | 2009-10-30 | Ophthotech Corp | Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders using a PDGF antagonist and a VEGF antagonist |
| DE102004027650A1 (de) | 2004-06-05 | 2006-01-05 | Basf Coatings Ag | Verfahren zum Beschichten elektrisch leitfähiger Substrate |
| US8604185B2 (en) | 2004-07-20 | 2013-12-10 | Genentech, Inc. | Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use |
| BRPI0513534A (pt) | 2004-07-20 | 2008-05-06 | Genentech Inc | inibidores de proteìna 4 semelhante à angiopoietina, combinações, e seu uso |
| US7655229B2 (en) | 2004-09-02 | 2010-02-02 | Chan Andrew C | Anti-FC-gamma RIIB receptor antibody and uses therefor |
| US7662926B2 (en) | 2004-09-02 | 2010-02-16 | Genentech, Inc. | Anti-Fc-gamma receptor antibodies, bispecific variants and uses therefor |
| RS52539B (en) | 2004-10-21 | 2013-04-30 | Genentech Inc. | METHOD FOR TREATMENT OF INTRAOCULAR NEOVASCULAR DISEASES |
| PT1869085E (pt) | 2005-03-24 | 2012-06-01 | Vlaams Interuniv Inst Biotech Vzw | Novo anticorpo anti-plgf |
| EP1881849A2 (en) * | 2005-04-29 | 2008-01-30 | Research Development Foundation | Vascular targeting of ocular neovascularization |
| EP1904095B1 (en) | 2005-06-30 | 2013-05-29 | VIB, vzw | Treatment of liver cirrhosis and its complications |
| WO2007011873A2 (en) * | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Genentech, Inc. | Method for treating intraocular neovascular diseases |
| US8168584B2 (en) * | 2005-10-08 | 2012-05-01 | Potentia Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating age-related macular degeneration by compstatin and analogs thereof |
| UA96139C2 (uk) | 2005-11-08 | 2011-10-10 | Дженентек, Інк. | Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1) |
| TWI596111B (zh) | 2006-01-05 | 2017-08-21 | 建南德克公司 | 抗ｅｐｈｂ４抗體及使用該抗體之方法 |
| AR059096A1 (es) | 2006-01-20 | 2008-03-12 | Genentech Inc | Anticuerpos anti- efrina -b2 y metodos que usan estos |
| AR059851A1 (es) | 2006-03-16 | 2008-04-30 | Genentech Inc | Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso |
| JP2009539384A (ja) | 2006-06-06 | 2009-11-19 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗ｄｌｌ４抗体および抗ｄｌｌ４抗体使用の方法 |
| FR2902799B1 (fr) | 2006-06-27 | 2012-10-26 | Millipore Corp | Procede et unite de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide |
| US8247384B2 (en) * | 2006-11-15 | 2012-08-21 | Coda Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for wound healing |
| EP2101807B1 (en) | 2006-12-19 | 2016-05-25 | Genentech, Inc. | Vegf-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors |
| US8569464B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-10-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| WO2008079280A1 (en) | 2006-12-21 | 2008-07-03 | Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US8362217B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-01-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| ZA200904482B (en) | 2007-01-22 | 2010-09-29 | Genentech Inc | Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies |
| EP2158215B1 (en) | 2007-05-17 | 2015-04-22 | Genentech, Inc. | Crystal structures of neuropilin fragments and neuropilin-antibody complexes |
| ES2469743T3 (es) | 2007-05-17 | 2014-06-18 | Genentech, Inc. | Inhibición de la metástasis tumoral por anticuerpos anti neuropilina 2 |
| PE20090321A1 (es) | 2007-06-04 | 2009-04-20 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica |
| HUE037633T2 (hu) | 2007-07-09 | 2018-09-28 | Genentech Inc | Diszulfidkötés redukciójának megelõzése polipeptidek rekombináns elõállítása során |
| KR20140015166A (ko) | 2007-10-30 | 2014-02-06 | 제넨테크, 인크. | 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제 |
| ES2554812T3 (es) | 2007-11-09 | 2015-12-23 | Genentech, Inc. | Composiciones de antagonistas de quinasa 1 de tipo receptor de activina y métodos de uso |
| TWI468417B (zh) | 2007-11-30 | 2015-01-11 | Genentech Inc | 抗－ｖｅｇｆ抗體 |
| US8999702B2 (en) | 2008-06-11 | 2015-04-07 | Emd Millipore Corporation | Stirred tank bioreactor |
| DK3216803T3 (da) | 2008-06-25 | 2020-06-02 | Novartis Ag | Stabile og opløselige antistoffer, der hæmmer vegf |
| RS59232B1 (sr) | 2008-08-14 | 2019-10-31 | Genentech Inc | Postupci za uklanjanje zagađivača koristeći hromatografiju membrane razmene jona sa razmeštanjem autohtonih proteina |
| MX2011002372A (es) | 2008-09-10 | 2011-04-04 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para la prevencion de la degradacion oxidativa de proteinas. |
| BRPI0920224A2 (pt) | 2008-10-02 | 2017-06-27 | Life Sciences Res Partners Vzw | inibição de plgf para tratar leucemia positiva para cromossoma filadélfia |
| JP5913980B2 (ja) | 2008-10-14 | 2016-05-11 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 免疫グロブリン変異体及びその用途 |
| CN102272148A (zh) | 2008-11-03 | 2011-12-07 | 分子组合公司 | 抑制vegf-a受体相互作用的结合蛋白 |
| WO2010059969A2 (en) | 2008-11-22 | 2010-05-27 | Genentech, Inc. | Anti-angiogenesis therapy for the treatment of breast cancer |
| JP2012511929A (ja) | 2008-12-16 | 2012-05-31 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | 攪拌タンク反応器及び方法 |
| EP2358734A1 (en) | 2008-12-16 | 2011-08-24 | Millipore Corporation | Purification of proteins |
| KR20160021308A (ko) | 2008-12-23 | 2016-02-24 | 제넨테크, 인크. | 암 환자에서의 진단 목적용 방법 및 조성물 |
| EP2400992B1 (en) | 2009-02-27 | 2015-07-22 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for protein labelling |
| TWI428142B (zh) | 2009-05-08 | 2014-03-01 | Genentech Inc | 人類化之抗－ｅｇｆｌ７抗體及其使用方法 |
| WO2010145846A1 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Bayer Bioscience N.V. | Nicotiana benthamiana plants deficient in xylosyltransferase activity |
| SG10201510152RA (en) | 2009-07-13 | 2016-01-28 | Genentech Inc | Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer |
| AR077595A1 (es) | 2009-07-27 | 2011-09-07 | Genentech Inc | Tratamientos de combinacion |
| MX2012001306A (es) | 2009-07-31 | 2012-02-28 | Genentech Inc | Inhibicion de matastasis de tumor. |
| SG10201901417UA (en) | 2009-08-11 | 2019-03-28 | Genentech Inc | Production of proteins in glutamine-free cell culture media |
| TW201431558A (zh) | 2009-08-15 | 2014-08-16 | 建南德克公司 | 用於治療先前治療過之乳癌之抗-血管新生療法 |
| EP3736338A1 (en) | 2009-09-01 | 2020-11-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Enhanced protein purification through a modified protein a elution |
| CA2773662A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Genentech, Inc. | Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent |
| CA2772670A1 (en) | 2009-09-17 | 2011-03-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients |
| WO2011056497A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor type iib compositions and methods of use |
| WO2011056502A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use |
| TWI505836B (zh) | 2009-12-11 | 2015-11-01 | Genentech Inc | 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法 |
| EP3616719A1 (en) | 2009-12-21 | 2020-03-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antibody formulation |
| HUE027713T2 (en) | 2009-12-23 | 2016-10-28 | Hoffmann La Roche | Anti-BV8 antibodies and their use |
| EP2531592A1 (en) | 2010-02-04 | 2012-12-12 | Vivalis | Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells |
| MX2012009554A (es) | 2010-02-23 | 2012-11-23 | Hoffmann La Roche | Terapia anti-angiogenesis para el tratamiento del cancer ovarico. |
| ES2602971T3 (es) | 2010-03-02 | 2017-02-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Composición de anticuerpo modificado |
| KR101878369B1 (ko) | 2010-03-22 | 2018-07-16 | 제넨테크, 인크. | 단백질-함유 제제의 안정화에 유용한 조성물 및 방법 |
| EP2554669B1 (en) | 2010-03-26 | 2018-09-19 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment |
| TWI510246B (zh) | 2010-04-30 | 2015-12-01 | Molecular Partners Ag | 抑制ｖｅｇｆ－ａ受體交互作用的經修飾結合性蛋白質 |
| MX2012012743A (es) | 2010-05-03 | 2012-11-23 | Genentech Inc | Composiciones y metodos utiles para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina. |
| EP2571903B1 (en) | 2010-05-17 | 2019-09-04 | EMD Millipore Corporation | Stimulus responsive polymers for the purification of biomolecules |
| HUE030820T2 (en) | 2010-05-28 | 2017-06-28 | Hoffmann La Roche | Decreasing Lactate Levels and Enhancing Polypeptide Production by Control of Lactate Dehydrogenase and Pyruvate Dehydrogenase Kinase Expression |
| WO2011153224A2 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer |
| WO2011153243A2 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Genentech, Inc. | Anti-angiogenesis therapy for treating gastric cancer |
| SG186783A1 (en) | 2010-06-24 | 2013-02-28 | Genentech Inc | Compositions and methods containing alkylgycosides for stabilizing protein- containing formulations |
| CN103097418A (zh) | 2010-07-09 | 2013-05-08 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗神经毡蛋白抗体及使用方法 |
| MX2013000672A (es) | 2010-07-19 | 2013-02-27 | Hoffmann La Roche | Metodo para identificar un paciente con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer. |
| MX2013000667A (es) | 2010-07-19 | 2013-02-27 | Hoffmann La Roche | Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anticancer. |
| US20130130317A1 (en) | 2010-08-02 | 2013-05-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method for producing substance |
| KR20130100125A (ko) | 2010-08-13 | 2013-09-09 | 제넨테크, 인크. | 질환의 치료를 위한, ＩＬ-1β 및 ＩＬ-18에 대한 항체 |
| AR082693A1 (es) | 2010-08-17 | 2012-12-26 | Roche Glycart Ag | Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf |
| WO2012030512A1 (en) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Percivia Llc. | Flow-through protein purification process |
| SG190788A1 (en) | 2010-11-15 | 2013-07-31 | Five Prime Therapeutics Inc | Fgfr1 extracellular domain combination therapies |
| CN107312796A (zh) | 2010-12-15 | 2017-11-03 | 大学共同利用机关法人情报·系统研究机构 | 蛋白质的生产方法 |
| WO2012091023A1 (ja) | 2010-12-27 | 2012-07-05 | 協和発酵キリン株式会社 | 培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法 |
| WO2012092539A2 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Antibodies to dll4 and uses thereof |
| WO2012095514A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Vivalis | Recombinant protein production system |
| US9527925B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
| SG194045A1 (en) | 2011-04-01 | 2013-11-29 | Genentech Inc | Combinations of akt inhibitor compounds and abiraterone, and methods of use |
| AU2012245439B2 (en) | 2011-04-20 | 2017-04-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Endoglin polypeptides and uses thereof |
| MX2013012716A (es) | 2011-05-03 | 2014-03-21 | Genentech Inc | Agentes de disociacion vascular y sus usos. |
| WO2012172054A1 (en) | 2011-06-16 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Modified multimeric ubiquitin proteins binding vegf-a |
| EP2551348B1 (en) | 2011-07-29 | 2014-09-24 | Icon Genetics GmbH | Production of galactosylated N-glycans in plants |
| EP2744825A1 (en) | 2011-08-17 | 2014-06-25 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Inhibition of angiogenesis in refractory tumors |
| EP2764105B1 (en) | 2011-10-04 | 2017-03-15 | Icon Genetics GmbH | Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity |
| EP2785739B1 (en) | 2011-12-01 | 2017-03-15 | ThromboGenics N.V. | Improving trabeculectomy outcome |
| WO2013082511A1 (en) | 2011-12-02 | 2013-06-06 | Genentech, Inc. | Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists |
| JP6605202B2 (ja) | 2011-12-22 | 2019-11-13 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | イオン交換膜クロマトグラフィー |
| SI2825558T1 (sl) | 2012-03-13 | 2019-08-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Kombinirana terapija za zdravljenje raka jajčnikov |
| SG10201508420VA (en) | 2012-03-27 | 2015-11-27 | Genentech Inc | Improved harvest operations for recombinant proteins |
| AR091220A1 (es) | 2012-05-31 | 2015-01-21 | Genentech Inc | Metodos para tratar cancer usando antagonistas de union a pd-1 axis y antagonistas de vegf |
| PE20150361A1 (es) | 2012-07-13 | 2015-03-14 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares |
| JP6464085B2 (ja) | 2012-08-07 | 2019-02-06 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 神経膠芽腫の治療のための併用療法 |
| EP3660033B9 (en) | 2012-11-15 | 2022-06-22 | Apellis Pharmaceuticals, Inc. | Long-acting compstatin analogs and related compositions and methods |
| US9393327B2 (en) | 2012-12-19 | 2016-07-19 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for radiohalogen protein labeling |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
| AU2014243783B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-12-13 | Genentech, Inc. | Antibody formulations |
| US10308687B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-06-04 | Apellis Pharmaceuticals, Inc. | Cell-penetrating compstatin analogs and uses thereof |
| JP2016524611A (ja) | 2013-05-23 | 2016-08-18 | ファイヴ プライム セラピューティクス インク | がんを治療する方法 |
| EP3019243A4 (en) | 2013-07-12 | 2017-03-15 | Ophthotech Corporation | Methods for treating or preventing ophthalmological conditions |
| US10617755B2 (en) | 2013-08-30 | 2020-04-14 | Genentech, Inc. | Combination therapy for the treatment of glioblastoma |
| US10456470B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-10-29 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma |
| CA2928708A1 (en) | 2013-10-25 | 2015-04-30 | Acceleron Pharma, Inc. | Endoglin peptides to treat fibrotic diseases |
| US10568951B2 (en) | 2013-11-18 | 2020-02-25 | Formycon Ag | Pharmaceutical composition of an anti-VEGF antibody |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| JOP20200096A1 (ar) | 2014-01-31 | 2017-06-16 | Children’S Medical Center Corp | جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها |
| CU24481B1 (es) | 2014-03-14 | 2020-03-04 | Immutep Sas | Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3 |
| JP2017516458A (ja) | 2014-03-24 | 2017-06-22 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | ｃ−ｍｅｔ拮抗剤による癌治療及びｃ−ｍｅｔ拮抗剤のＨＧＦ発現との相関 |
| EP3126386A1 (en) | 2014-03-31 | 2017-02-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists |
| US20170232199A1 (en) | 2014-05-12 | 2017-08-17 | Formycon Ag | Pre-Filled Plastic Syringe Containing a VEGF Antagonist |
| BR112017000142B1 (pt) | 2014-07-09 | 2021-08-17 | Genentech, Inc | Métodos para melhorar a recuperação por descongelamento de bancos de células e para congelamento de células cho para armazenamento, grupo de células cho para o congelamento de células de mamíferos, e banco de células |
| WO2016011052A1 (en) | 2014-07-14 | 2016-01-21 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma |
| DK3180018T3 (da) | 2014-08-12 | 2019-10-28 | Massachusetts Inst Technology | Synergistisk tumorbehandling med IL-2 og integrinbindende Fc-fusionsprotein |
| US20170224777A1 (en) | 2014-08-12 | 2017-08-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine |
| CN114010788A (zh) | 2014-08-22 | 2022-02-08 | 奥克兰联合服务有限公司 | 通道调节剂 |
| JP6681905B2 (ja) | 2014-09-13 | 2020-04-15 | ノバルティス アーゲー | Ａｌｋ阻害剤の併用療法 |
| WO2016044334A1 (en) | 2014-09-15 | 2016-03-24 | Genentech, Inc. | Antibody formulations |
| AU2015327868A1 (en) | 2014-10-03 | 2017-04-20 | Novartis Ag | Combination therapies |
| MA41044A (fr) | 2014-10-08 | 2017-08-15 | Novartis Ag | Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer |
| CR20170143A (es) | 2014-10-14 | 2017-06-19 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas |
| EA201791029A1 (ru) | 2014-11-10 | 2017-12-29 | Дженентек, Инк. | Антитела против интерлейкина-33 и их применение |
| WO2016100882A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Novartis Ag | Combination therapies |
| JP2018508183A (ja) | 2014-12-23 | 2018-03-29 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 化学療法耐性癌を治療及び診断する組成物及び方法 |
| MX2017015937A (es) | 2015-06-08 | 2018-12-11 | Genentech Inc | Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40 y antagonistas de unión al eje de pd-1. |
| US20180207273A1 (en) | 2015-07-29 | 2018-07-26 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
| PT3317301T (pt) | 2015-07-29 | 2021-07-09 | Novartis Ag | Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3 |
| WO2017019896A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1 |
| BR112018006810A2 (pt) | 2015-10-07 | 2018-10-23 | Apellis Pharmaceuticals Inc | regimes de dosagem |
| CA3001362C (en) | 2015-10-30 | 2020-10-13 | Genentech, Inc. | Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof |
| SG11201803520PA (en) | 2015-11-03 | 2018-05-30 | Janssen Biotech Inc | Antibodies specifically binding pd-1 and their uses |
| CA3005692A1 (en) | 2015-11-18 | 2017-05-26 | Formycon Ag | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
| CN108883057A (zh) | 2015-11-18 | 2018-11-23 | Sio2医药产品公司 | 用于眼科配制品的药物包装 |
| CA3005117C (en) | 2015-11-18 | 2023-01-24 | Formycon Ag | Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
| AU2016369537B2 (en) | 2015-12-17 | 2024-03-14 | Novartis Ag | Antibody molecules to PD-1 and uses thereof |
| EP3407868A1 (en) | 2016-01-26 | 2018-12-05 | Formycon AG | Liquid formulation of a vegf antagonist |
| US10941406B2 (en) | 2016-03-29 | 2021-03-09 | Geltor, Inc. | Expression of proteins in gram-negative bacteria wherein the ratio of periplasmic volume to cytoplasmic volume is between 0.5:1 and 10:1 |
| AU2017248766A1 (en) | 2016-04-15 | 2018-11-01 | Genentech, Inc. | Methods for monitoring and treating cancer |
| WO2017181111A2 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Genentech, Inc. | Methods for monitoring and treating cancer |
| JP7050702B2 (ja) | 2016-07-08 | 2022-04-08 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｎｒｆ２及びその遺伝子の下流標的遺伝子の発現状態及び変異状態によるがんの診断及び治療方法 |
| TWI823836B (zh) | 2016-07-08 | 2023-12-01 | 美商建南德克公司 | 人類副睪蛋白４（ｈｅ４）用於評定癌症治療反應性之用途 |
| JP2019524820A (ja) | 2016-08-12 | 2019-09-05 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｍｅｋ阻害剤、ｐｄ−１軸阻害剤及びｖｅｇｆ阻害剤での組合せ療法 |
| EP3568150A4 (en) | 2017-01-10 | 2020-12-02 | Xcella Biosciences, Inc. | POLYTHERAPY FOR TUMOR TREATMENT WITH INTEGRIN-BOUND FC FUSION PROTEIN AND IMMUNE MODULATOR |
| US10350266B2 (en) | 2017-01-10 | 2019-07-16 | Nodus Therapeutics, Inc. | Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein |
| AU2018228873A1 (en) | 2017-03-01 | 2019-08-29 | Genentech, Inc. | Diagnostic and therapeutic methods for cancer |
| CN110831544B (zh) | 2017-04-07 | 2022-11-18 | 阿佩利斯制药有限公司 | 长效坎普他汀类似物、其组合物的给药方案及其医药用途 |
| WO2018215580A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist |
| EP3630043A1 (en) | 2017-05-24 | 2020-04-08 | Formycon AG | Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
| US20200171244A1 (en) | 2017-05-24 | 2020-06-04 | Sio2 Medical Products, Inc. | Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
| SG11201912473PA (en) | 2017-06-22 | 2020-01-30 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
| WO2018237173A1 (en) | 2017-06-22 | 2018-12-27 | Novartis Ag | ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES |
| WO2019020777A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Formycon Ag | LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST |
| US11180541B2 (en) | 2017-09-28 | 2021-11-23 | Geltor, Inc. | Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof |
| CN111989095A (zh) | 2018-04-16 | 2020-11-24 | 上海岸阔医药科技有限公司 | 预防或治疗肿瘤疗法副作用的方法 |
| JP7361727B2 (ja) | 2018-05-24 | 2023-10-16 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | Ｐｓｍａ結合剤及びその使用 |
| AR126019A1 (es) | 2018-05-30 | 2023-09-06 | Novartis Ag | Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación |
| US20210214459A1 (en) | 2018-05-31 | 2021-07-15 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
| SI3818078T1 (sl) | 2018-07-03 | 2024-05-31 | Bristol-Myers Squibb Company | Postopki za proizvodnjo rekombinantnih proteinov |
| KR20210074341A (ko) | 2018-10-10 | 2021-06-21 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 고밀도 생물 반응기 배양에서 막 기체 전달을 위한 방법 |
| CN113196061A (zh) | 2018-10-18 | 2021-07-30 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 肉瘤样肾癌的诊断和治疗方法 |
| EP3875595A4 (en) | 2018-11-02 | 2022-07-13 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | METHOD FOR PREPARING LIQUID CULTURE MEDIUM |
| WO2020109343A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy for treatment of macular degeneration |
| CA3133652A1 (en) | 2019-04-01 | 2020-10-08 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations |
| TW202104254A (zh) | 2019-04-12 | 2021-02-01 | 美商格爾托公司 | 重組彈性蛋白及其生產 |
| JP2022529985A (ja) | 2019-04-19 | 2022-06-27 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 抗ｐｓｍａ／ｃｄ３抗体で前立腺癌を治療する方法 |
| AU2020270376A1 (en) | 2019-05-03 | 2021-10-07 | Genentech, Inc. | Methods of treating cancer with an anti-PD-L1 antibody |
| EP4007808A1 (en) | 2019-08-01 | 2022-06-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of improving protein productivity in fed-batch cell cultures |
| EP4031578A1 (en) | 2019-09-18 | 2022-07-27 | Novartis AG | Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies |
| WO2021100034A1 (en) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | Protalix Ltd. | Removal of constructs from transformed cells |
| IL296256A (en) | 2020-03-13 | 2022-11-01 | Genentech Inc | Antibodies against interleukin-33 and uses thereof |
| WO2021191870A1 (en) | 2020-03-27 | 2021-09-30 | Dcprime B.V. | Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy |
| EP4127724A1 (en) | 2020-04-03 | 2023-02-08 | Genentech, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods for cancer |
| EP4171617A1 (en) | 2020-06-30 | 2023-05-03 | Mendus B.V. | Use of leukemia-derived cells in ovarian cancer vaccines |
| WO2022066595A1 (en) | 2020-09-22 | 2022-03-31 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for producing therapeutic proteins |
| JP2023545999A (ja) | 2020-10-05 | 2023-11-01 | プロタリクス リミテッド | ダイサー（ｄｉｃｅｒ）様ノックアウト植物細胞 |
| KR20230088781A (ko) | 2020-11-13 | 2023-06-20 | 제넨테크, 인크. | 고형 종양 치료를 위한 krasg12c 억제제 및 vegf 억제제를 포함하는 방법 및 조성물 |
| KR20230135075A (ko) | 2021-01-22 | 2023-09-22 | 멘두스 비.브이. | 종양 백신접종 방법 |
| MX2023008909A (es) | 2021-01-28 | 2023-10-23 | Janssen Biotech Inc | Proteínas de unión a psma y usos de estas. |
| JP2024510989A (ja) | 2021-03-12 | 2024-03-12 | メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ | ワクチン接種方法及びｃｄ４７遮断薬の使用 |
| JP2024516230A (ja) | 2021-04-30 | 2024-04-12 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | がんのための治療及び診断方法並びに組成物 |
| BR112023026966A2 (pt) | 2021-07-02 | 2024-03-12 | Hoffmann La Roche | Métodos para tratar um indivíduo com melanoma, para alcançar uma resposta clínica, para tratar um indivíduo com linfoma não hodgkin, para tratar uma população de indivíduos com linfoma não hodgkin e para tratar um indivíduo com câncer colorretal metastático |
| EP4377351A1 (en) | 2021-07-28 | 2024-06-05 | F. Hoffmann-La Roche AG | Methods and compositions for treating cancer |
| WO2023015234A1 (en) | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Bristol-Myers Squibb Company | Cell culture methods for producing therapeutic proteins |
| IT202100023357A1 (it) | 2021-09-09 | 2023-03-09 | Cheirontech S R L | Peptidi con attività anti-angiogenica |
| WO2023049687A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of controlling the level of dissolved oxygen (do) in a solution comprising a recombinant protein in a storage container |
| WO2023080900A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for classifying and treating kidney cancer |
| CN118742325A (zh) | 2022-01-28 | 2024-10-01 | 上海岸阔医药科技有限公司 | 预防或治疗与抗肿瘤剂相关的疾病或病症的方法 |
| WO2023155905A1 (zh) | 2022-02-21 | 2023-08-24 | 上海岸阔医药科技有限公司 | 化合物及其用途 |
| WO2023212298A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4456550A (en) * | 1982-11-22 | 1984-06-26 | President And Fellows Of Harvard College | Vascular permeability factor |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5036003A (en) * | 1987-08-21 | 1991-07-30 | Monsanto Company | Antibodies to VPF |
| US5008196A (en) * | 1987-08-21 | 1991-04-16 | Monsanto Company | Stimulation of endothelial cell growth |
| US5720937A (en) * | 1988-01-12 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | In vivo tumor detection assay |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5219739A (en) * | 1989-07-27 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121 |
| US5194596A (en) * | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
| US6582959B2 (en) * | 1991-03-29 | 2003-06-24 | Genentech, Inc. | Antibodies to vascular endothelial cell growth factor |
| US5185438A (en) * | 1991-04-02 | 1993-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2 |
| US5310764A (en) * | 1992-05-08 | 1994-05-10 | Steven Baranowitz | Treatment of age related macular degeneration with beta-carotene |
| DE69233803D1 (de) * | 1992-10-28 | 2011-03-31 | Genentech Inc | Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten |
| US6177401B1 (en) * | 1992-11-13 | 2001-01-23 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften | Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis |
| US5731294A (en) * | 1993-07-27 | 1998-03-24 | Hybridon, Inc. | Inhibition of neovasularization using VEGF-specific oligonucleotides |
| US5840301A (en) * | 1994-02-10 | 1998-11-24 | Imclone Systems Incorporated | Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors |
| US6811779B2 (en) * | 1994-02-10 | 2004-11-02 | Imclone Systems Incorporated | Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy |
| US6448077B1 (en) * | 1994-02-10 | 2002-09-10 | Imclone Systems, Inc. | Chimeric and humanized monoclonal antibodies specific to VEGF receptors |
| US5861499A (en) * | 1994-02-10 | 1999-01-19 | Imclone Systems Incorporated | Nucleic acid molecules encoding the variable or hypervariable region of a monoclonal antibody that binds to an extracellular domain |
-
1996
- 1996-03-25 IL IL11764596A patent/IL117645A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 DK DK96910651T patent/DK0817648T3/da active
- 1996-03-28 CA CA2754887A patent/CA2754887A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-28 EP EP05024269.2A patent/EP1627643A3/en not_active Withdrawn
- 1996-03-28 EP EP96910651A patent/EP0817648B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 DE DE69635565T patent/DE69635565T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 ES ES04026995T patent/ES2255027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 WO PCT/US1996/004338 patent/WO1996030046A1/en active IP Right Grant
- 1996-03-28 AU AU53787/96A patent/AU696487B2/en not_active Expired
- 1996-03-28 AT AT04026995T patent/ATE311902T1/de active
- 1996-03-28 MX MX9706828A patent/MX9706828A/es active IP Right Grant
- 1996-03-28 DE DE69634079T patent/DE69634079T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 AT AT96910651T patent/ATE285251T1/de active
- 1996-03-28 JP JP8529682A patent/JPH11502853A/ja active Pending
- 1996-03-28 EP EP04026995A patent/EP1506787B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 CA CA2213833A patent/CA2213833C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 CA CA2805588A patent/CA2805588A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-28 PT PT96910651T patent/PT817648E/pt unknown
- 1996-03-28 NZ NZ305699A patent/NZ305699A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 ES ES96910651T patent/ES2233967T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-06-20 US US11/766,051 patent/US20070253959A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-03-20 US US12/052,524 patent/US20080181900A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-03-10 US US12/401,179 patent/US20090169556A1/en not_active Abandoned
- 2009-10-05 US US12/573,720 patent/US20100119523A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-08-23 US US12/861,741 patent/US20100316652A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-03-21 US US13/053,164 patent/US20110287024A1/en not_active Abandoned
-
2012
- 2012-02-24 US US13/404,252 patent/US20130028911A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-01-24 US US14/163,891 patent/US20140377276A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2233967T3 (es) | Antagnositas del factor de crecimiento de celulas del endotelio vascular. | |
| ES2173873T5 (es) | Utilizacion de anticuerpos anti-vegf para el tratamiento del cancer. | |
| ES2245833T5 (es) | Antagonistas del factor de crecimiento celular del endotelio vascular y usos de los mismos | |
| US20030206899A1 (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists | |
| US20020032313A1 (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists | |
| US20030023046A1 (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists | |
| US20010021382A1 (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists | |
| US20060193862A1 (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists | |
| KR100315613B1 (ko) | 혈관 내피 세포 성장 인자에 대한 길항제 |