MXPA04004491A - Modulacion de funcion de receptores similares a inmunoglobulina leucocitaria para tratar artritis reumatoide. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se relaciona con metodos para tratar artritis reumatoide (RA) al administrar uno o m{as agentes que se dirigen especificamente a LIR-2, LIR-3 y LIR-7. los resultados que se describen en la presente indican que estos tres LIR pueden participar en la regulacion de la activacion de leucocitos que infiltran tejido sinovial. De esta manera, se puede diminuir la inflamacion de las articulaciones de los pacientes con RA al administrar agentes que modulan la expresion o la funcion de LIR-2, lir-3 o LIR-7 para reducir o eliminar la activacion de monocitos o macrofagos presentes en articulaciones inflamadas para reducir su reclutamiento al sitio de inflamacion. Esto se puede llevar a cabo al modular el LIR-7, el cual transmite una senal estimuladora o al modular LIR-2 o LIR-3 o ambos, los cuales cuando se activan ejercen un efecto inhibidor, o al modular concurrentemente dos o los tres de estos LIR.

Description

MODULACIÓN DE FUNCIÓN DE RECEPTORES SIMILARES A INMUNOGLOBULINA LEUCOCITARIA PARA TRATAR ARTRITIS REUMATOIDE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La artritis reumatoide (AR) es una sinovitis inflamatoria crónica que está caracterizada por hipertrofia sinovial y formación de paño sinovial con destrucción concomitante de cartílago yuxtaarticular y hueso (Tak, PP, Arthritis & Rheumatisin 43 (12) ;2619-33 (2001)). Las células predominantemente inflamatorias encontradas en los sitios inflamados son macrófagos (sinoviocitos tipo A) y células similares a fibroblastos (sinoviocitos tipo B) así como cantidades aumentadas de neutrófilos, mastocitos, células citolíticas naturales, células plasmáticas y linfocitos (Leirisalo-Repo et al., Inflammation 17(4):427-42 (1993); Gotis-Graham I y McNeil HP, Arthritis & Rheumatism 40(3) :479-89 (1997); Malone et al., Arthritis & Rheumatism 30(2):l30-37 (1987); Bromley M y Wooley DE, Arthritis & Rheumatism 27:857-63 (1984); Jefferis R. , British Medical Eulletin 51 (2) : 312-31 (1995)). Estas células aparentemente promueven la inflamación y destrucción de tejido al liberar diversos factores tales como mediadores lipidíeos (Elmgreen et al., Aun R eum Dis 46:501-05 (1987); Moilanen E . , Pharmacol Toxicol 75 (Suppl REF. : 155555 2) :4-8 (1994)), citocinas proinflamatorias (Firestein et al . , J Immunol 144:3347-53 (1990); Westacott et al . , Ann Rheu Dis 49: (9) 676-81 (1990); Alvaro-Gracia et al., J". Clin Invest 86:1790-98 (1990); Brennan et al., Br J Rheumatol 30 (Suppl 1) :76-80 (1991)) y enzimas degradantes de tejido (Hembry et al., Ann Rheum Dis 54(l):25-32 (1995); Taylor et al., Ann Rheum Dis 53(1) :768-72 (1994)) . Los macrófagos sinoviales son la fuente predominante de interleucina IL-?ß y factor de necrosis tumoral TNFa, los cuales son centrales para la patogénesis de AR, como se vuelve evidente por la eficacia de los tratamientos modificadores de enfermedad dirigidos hacia estas citocinas (Feldmann M y aini RN, Ann Rev Immunol 19:163-96 (2001)). Probablemente la destrucción de la articulación en AR es mediada por proteasas derivadas de macrófagos y osteoclastos . Aunque existe evidencia abundante de la presencia de leucocitos activados en sinovio reumatoide, aún no se comprenden bien uno o varios de los mecanismos y la regulación de su activación. Una familia nueva de proteínas denominadas "receptores similares a inmunoglobulina leucocitaria" (LIR, por sus siglas en inglés) , o "transcritos similares a inmunoglobulina (ILT, por sus siglas en inglés)" se expresan sobre las superficies de diversas células involucradas en la inflamación y las respuestas inmunologicas. Se ha demostrado in vitro que los miembros de esta familia modulan respuestas celulares a través de motivos inhibidores basados en tirosina de inmunorreceptor (ITI , por sus siglas en inglés) presentes en las colas citoplásmicas o mediante asociación en la membrana celular con otras proteínas que contienen un "motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor" o "motivo ITAM (por sus siglas en inglés)" (Arm et al., J Immunol 159:2342 (1997); Fanger et al., Eur J Immunol 28:3423-34 (1998); Borges et al., J Immunol 159:5192-96 (1997); Samaridis J y Colonna M, Eur J Immunol 27:660-65 (1997); WO 98/48017; E.U.A. 6,140,076; y WO 00/68383). El alcance de las respuestas celulares reguladas por las LI se ha estudiado in vitro. Se ha demostrado que el reconocimiento de moléculas CPH clase I por LIR-1 o LIR-2 inhibe la actividad de linfocitos citolíticos naturales y la citotoxicidad de linfocitos T (véase, por ejemplo, Colonna et al., J. Exp Medí 186:1809-18 (1997); Fanger et al., 1998). La ligación conjunta de LIR-1, LIR-2, LIR-3 o LIR-5 inhibidores con un receptor activante tal como BCR, TCR, FcyR o moléculas de CPH clase I genera la inhibición del flujo de Ca2+ y los eventos subsecuentes corriente abajo inducidos por la molécula activante (Celia et al., J. Exp Med 185:1743-51; Colonna et al., 1997; Colonna et al., 1998; y Saverino et al . , J Immunol 165:3742-55 (2000)). Recientemente se han dilucidado estos eventos para la interacción de LIR-1 con el receptor de linfocitos T (Dietrich et al., J Immunol 166:2514-21 (2001)). Se ha sugerido que los LIR y las moléculas relacionadas pueden determinar el umbral o grado de activación de leucocitos en condiciones inflamatorias. Esta idea es fundamentada por estudios recientes en ratones en los cuales la ruptura de gp49Bl, la cual es una proteína con similitudes con los LIR (Daheshia et al., J Exp Med 189:309-318 (2001)). Los LIR inhibidores, los cuales incluyen los LIR 1, 2, 3, 5 y 8, muestran dominios citoplásmicos grandes que contienen dos a cuatro ITIM. Los LIR-2, también conocidos como WILT4" o "MIR10", contienen tres motivos ITIM y unen un arreglo diverso de proteínas de CPH clase I que incluyen alelos HLA-A, HLA-B y HLA-C (Fanger et al., 1998). Se sabe que LIR-1 y LIR-2 interactúan con moléculas clase I con especificidad amplia, reconociendo alelos dentro de HLA-A, B, C y HLA-G (Colonna et al., 1998; Cosman et al., I mnity 7:273-82 (1997); Banham et al., J Leukocyte Biol. 65:841-45 (1999)). Una manera por medio de la cual los LIR inhibidores median la inhibición de la activación celular es reclutando la fosfatasa 1 que contiene el dominio de homología src 2 (SH2) (SHP-1) para inhibir o terminar la señalización a través de cascadas de tirosina cinasa cin receptor (por ejemplo, véase Celia et al., 1997; Colonna et al., 1997; Colonna et al., J" Immunol 160:3096-3100 (1998); y Dietrich et al., J Immunol 166:2514-21 (2001)). Los LIR activadores, que incluyen LIR-6a, LIR6b y LIR-7, están caracterizados por un dominio citoplásmico corto y un residuo arginina cargado positivamente dentro del dominio transmembrana1 que puede facilitar su asociación con FceRIy. LIR-7 también se le denomina "ILTl". Aunque LIR-7 en sí mismo contiene una cola citoplásmica más bien corta, se asocia específicamente en la membrana celular con la cadena ? del receptor Fe (FceRIy) (Nakajima et al., J" Immnol 162:5-8 (1999) ) . Esta cadena ? del receptor Fe tiene una cola citoplásmica que contiene un ITAM, y de esta manera puede transmitir una señal estimuladora. Se sabe que (FceRIy) sirve como un asociado de señalización para otras proteínas, específicamente FCaR y receptores de linfocitos citolíticos naturales activantes. Nakajima et al., proponen que LIR-7 activa a células utilizando la proteína asociada FceRIy para transmitir o emitir la señal estimuladora. El residuo arginina cargado positivamente dentro del dominio transmembranal de LIR-7 puede facilitar la asociación con Fc RIy. Nakajima et al demostraron la capacidad de LIR-7 para mediar la activación celular al demostrar que se puede activar la liberación de serotonina en células leucémicas basofilas de rata (células RBL, por sus siglas en inglés) que expresan LIR-7 transfectado . La liberación de serotonina se activa al exponer a las células a anticuerpos que se unen de manera cruzada con LIR-7 en la superficie celular. Además, este equipo demostró que la unión cruzada de LIR-7 induce movilización de calcio intracelular en varios tipos de células, incluyendo monocitos primarios, células P815 transformadas con un vector de expresión LIR-7 y las células RBL transfectadas (Nakajima et al., 1999). La movilización de calcio es un suceso temprano en la activación de monocitos. Se ha estudiado detalladamente la distribución celular de LIR-1, LIR-2, LIR-5 y LIR-7 utilizando anticuerpos monoclonales . LIR-1 se expresa en la totalidad de los monocitos de sangre periférica, células dendríticas derivadas in vitro y macrófagos, linfocitos B-subgrupo de linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (Samaridis et al., 1997; Cosman et al., 1997). Se ha informado de una distribución celular más restringida para LIR-2 y LIR-5, los cuales son más prominentes en monocitos y células dendríticas (Colonna et al., 1998). LIR-7 se expresa en todos los monocitos y granulocitos de sangre periférica, macrófagos derivos in vitro y en células dendríticas (Nakajima et al., 1999). A nivel de ARNm, se detectaron transcriptos para LIR-3 y LIR-6 en monocitos y linfocitos B, se detectaron transcriptos para LIR-4 en linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales y monocitos, mientras que se detectaron transcriptos para LIR-8 únicamente en linfocitos citolíticos naturales (Borges et al., 1997; Arm et al., 1998). De esta manera, la modulación terapéutica de la expresión de LIR es un área promisoria de exploración.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan con la presente métodos para tratar AR al administrar uno o más agentes que se dirigen específicamente a LIR-2, LIR-3 y LIR-7. Los resultados descritos en la presente indican que estos tres LIR pueden participar en la regulación de la activación de leucocitos que infiltran tejido sinovial. De esta manera, se puede disminuir la inflamación de las articulaciones de pacientes con AR al administrar agentes que modulan la expresión o función de LIR-2 o LIR-3 o LIR-7, o cualquiera de ellas en cualquier combinación, para reducir o eliminar la activación de monocitos o macrófagos presentes en articulaciones inflamadas, o para reducir su reclutamiento hacia el sitio de inflamación. Esto se puede llevar a cabo al modular el LIR-7, el cual transmite una señal estimuladora o al modular LIR-2 o LIR-3, los cuales cuando se activan ejercen un efecto inhibidor o bien al modular concurrentemente dos o a los tres LIR. Se han tratado a pacientes con AR de acuerdo con la invención al administrar una cantidad eficaz de un agente agonista que une LIR-2 o LIR-3, o mediante administración concurrente de agonistas que unen cada una de estas proteínas por lo que se fomenta su actividad inhibidora. La administración de un agonista para LIR-2 o un agonista para LIR-3 a un paciente con AR resultará en una disminución en la movilización de calcio en los monocitos sinoviales del paciente. En una modalidad preferida de la invención, el agente es un anticuerpo agonista que es inmunorreactivo específicamente con LIR-2. En otra modalidad preferida, el agente es un anticuerpo agonista que es inmunorreactivo específicamente con LIR-3. Se prefieren los anticuerpos monoclonales . Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado en el cual la región variable se deriva de un roedor y el resto es de un humano. De manera más preferible, los anticuerpos monoclonales son completamente humanos. En otras modalidades, los agonistas LIR-2 o LIR-3 son moléculas orgánicas pequeñas . En otro aspecto de la invención, los pacientes con AR se tratan con un agente que antagoniza la actividad biológica de LIR-7. Tal agente bloqueará parcial o completamente a LIR-7 impidiendo que se active, y de esta manera evita que active monocitos o macrófagos en el sitio de la articulación inflamada. La administración de un antagonista LIR-7 a un paciente con AR resultará en una disminución en la cantidad de calcio liberado de los monocitos sinoviales en el paciente. En un aspecto de la invención, el agente es un anticuerpo antagonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-7, es decir, el anticuerpo se une específicamente con un epítopo que es único para LIR-7. Tales anticuerpos son anticuerpos bloqueadores y bloquean la unión de LIR-7 a su ligando. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado y en otra modalidad preferida el anticuerpo monoclonal es completamente humano. En otra modalidad, el antagonista de LIR-7 es un polipéptido soluble que comprende la región extracelular de LIR-7, que incluye proteínas de fusión en las cuales esta región extracelular está unida con la región Fe de una proteína inmunoglobulina humana. En otras modalidades adicionales, el antagonista LIR-7 es una molécula orgánica pequeña. El antagonista de LIR-7 se puede administrar solo o junto con un agonista de LIR-2 o LIR-3. Otros aspectos de la invención proporcionan métodos de tratamiento que involucran el tratamiento concurrente de AR con varias combinaciones de agentes agonistas que activan LIR-2 o LIR-3, administrados de manera concurrente entre sí o administrados de manera concurrente con agentes que antagonizan LIR-7. Esto incluye tratamientos que comprenden la administración concurrente de una de las siguientes combinaciones: i) un agente que es un agonista de LIR-3 y un agente que antagoniza LIR-7; ii) un agente que es un agonista de LIR-2 y un agente que antagoniza LIR-7; iii) un agente que es un agonista de LIR-2 y un agente que antagoniza LIR-3; iv) un agente que es un agonista de LIR-2, un agente que es un agonista de LIR-3 y un agente que antagoniza LIR-7. Preferiblemente tales agentes son anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos humanizados o humanos. Otros agentes preferidos son moléculas orgánicas pequeñas que son agonistas de LIR-2 o LIR-3 o que antagonizan LIR-7. Además, se proporcionan métodos de tratamiento que combinan los moduladores LIR descritos en lo anterior con el uso concurrente de otras medicaciones utilizadas para tratar artritis reumatoide.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se muestra en la presente, utilizando técnicas inmunohistoquimicas , que LIR-2, LIR-3 y LIR-7 se expresan de manera diferencial en leucocitos que se infiltran en el sinovio de pacientes con AR. Los pacientes con AR son personas quienes presentan una o más articulaciones inflamadas o muy sensibles al dolor y cuyas pruebas cercas proporcionan resultados positivos para el factor reumatoide. Las respuestas inflamatorias, tales como las que se observan en pacientes con AR, probablemente son reguladas por una red compleja de señales inhibidoras y activadores. De esta manera, en la presente se proporcionan métodos terapéuticos que comprenden administración de agentes que modulan la expresión de AR en el sinovio de LIR-2, LIR-3 o LIR-7. En una modalidad de la invención, los tratamientos terapéuticos descritos se administran a pacientes con AR cuyos tej idos sinoviales expresan concentraciones elevadas de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 en comparación con pacientes que no presentan AR (tejidos control) . Para determinar si los niveles de estas proteínas se encuentran elevados, se analizan tejidos de biopsias sinoviales mediante tinción con anticuerpos contra estos LIR. Los agentes que inhibien o mejoran la actividad biológica de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 se denominan en la presente como "moduladores de LIR" . Las observaciones que se describen en la presente indican que LIR-2, LIR-3 y LIR-7 se expresan en concentraciones elevadas en leucocitos que se infiltran en el sinovio de pacientes con AR pero que no están elevados en el sinovio de pacientes quienes tienen osteoartritis (OA, por sus siglas en inglés) . AR se caracteriza por infiltración extensa en tejidos sinoviales de leucocitos que median la inflamación mientras que OA es una condición degenerativa crónica que habitualmente no está relacionada con la inflamación. Las observaciones descritas indican también que la expresión de LIR-2, LIR-3 y LIR-7 es menor en pacientes con AR con fibrosis establecida en comparación con los pacientes con AR en etapas tempranas de la enfermedad.

Generalmente, la fibrosis se desarrolla únicamente en pacientes con AR quienes han padecido la enfermedad muchos años. Por ejemplo, aquellos afectados durante ocho o más años es probable que tengan articulaciones fibróticas desarrolladas. En una modalidad de la invención, los moduladores de LIR se administran a pacientes con AR cuyas articulaciones no se han vuelto fibróticas. Como se utiliza en la presente, el término LIR-2 abarca un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, así como variantes y muteínas que tienen las propiedades biológicas de esta proteína. La LIR-2 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, tiene una región extracelular predicha de 458 aminoácidos (aminoácidos 1-458 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) que incluye un péptido señal de 16 aminoácidos en los aminoácidos 1-16. Este LIR-2 también incluye un dominio transmembranal en los aminoácidos 459-483 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y un dominio citoplásmico que incluye los aminoácidos 484-598 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. El dominio extracelular incluye cuatro dominios similares a inmunoglobulina y el dominio citoplásmico incluye tres motivos ITIM en los aminoácidos 531-536, 560-565 y 590-595. Como se utiliza en la presente, el término "LIR-2" también incluye un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 90%, o de manera más preferible una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 95%, o de manera más preferible de por lo menos 98% con los aminoácidos 17-458 de LIR-2 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y que también tiene una actividad biológica asociada con LIR que tiene las secuencias de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Un ejemplo de tal actividad biológica que la capacidad para unir un polipéptido de CPH clase I. La capacidad de los polipéptidos de LIR-2 para unir CPH I se puede determinar por cualquier ensayo conveniente, tal como un ensayo que detecta la unión del polipéptido LIR-2 a una proteína de CPH clase I que se expresa sobre la superficie de células. Se puede determinar la especificidad de unión al realizar pruebas en donde los anticuerpos específicos para CPH I puede bloquear la unión de LIR-2 putativa a células que se sabe expresan CPH I. Las células y las líneas de células que se pueden utilizar para tales pruebas incluyen cualquier célula que expresa CPH I tal como CB23, HSB2, MP-1, Jurkat, linfocitos T primarios, linfocitos B primarios o linfocitos citolíticos naturales primarias. Un ensayo adecuado para detectar la unión de LIR-2 a CHP I es el ensayo de citometría de flujo descrito en WO 98/48017, el cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Brevemente, para realizar este ensayo, las células que expresan CPH I primero se lavan con amortiguador FACS (FCS 2% en PBS con azida 0.2%), después se incuban alícuotas de aproximadamente 105 células durante aproximadamente una hora en 100 µ? de amortiguador de bloqueo (FCS 2%, NGS 5%, suero de conejo 5% en PBS) . A cada muestra de células se le agregan cantidades en aumento (por ejemplo 0, 2, 5 o 10 pg) del suero control o W6/32 (ATCC HB-95) en 100 µ? de amortiguador bloqueador. W6/32 es un anticuerpo específico para las cadenas pesadas de CPH clase I, que incluyen los polipéptidos HLA-A, B y C, y la preincubación con este anticuerpo bloqueará competitivamente la unión específica de otras proteínas a CPH I. Después de la adición de W6/320 suero control las muestras se incuban en hielo durante aproximadamente una hora y después se lavan aproximadamente tres veces con 200 µ? de amortiguador FACS. Después se agregan aproximadamente 5 µg de un polipéptido LIR-2. El polipéptido LIR-2 para este ensayo es una proteína de fusión soluble que comprende la región extracelular de LIR-2 unida con la región Fe de la proteína inmunoglobulina IgG humana (sLIR-2/Fc) . El polipéptido sLIR-2/Fc en amortiguador bloqueador se agrega a cada muestra y la mezcla se incuba en hielo durante aproximadamente una hora. Después de incubación con sLIR-2/Fc las células se lavan varias veces con amortiguador FACS y se tratan durante aproximadamente 45 minutos con anticuerpos de ratón etiquetado con biotina que es inmunorreactivo específicamente a la región Fe de la IgG humana (disponible de Jackson Research Laboratories) y SAPE (estreptavidina-ficoeritrina; disponible de Molecular Probes) . SAPE es un compuesto fluorescente que se unirá a la porción biotina del complejo contra Fe humana/biotina y emitirá fluorescencia cuando se expone a las condiciones apropiadas de excitación y emisión. De esta manera, los anticuerpos contra Fe humano biotinados reaccionan con sLIR-2/Fe unido a célula, y a su vez SAPE se une a la porción biotina del anticuerpo contra Fe humano. Para detectar células en las cuales se ha unido sLIR-2/Fc, las células se exponen a LIR-2/Fc, el anticuerpo contra Fe humano y SAPE se lavan con amortiguador FACS y se someten a citometría de flujo para detectar las células etiquetadas con SAPE. Si sLIR-2/Fc se une a las células pero se impide de manera competitiva hacer esto por W6/32, esto indica que sLIR-2/Fc es capaz de unión específica a CPH I . El por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos, como se utiliza en la presente, se determina al dividir el número de aminoácidos alineados que son idénticos entre el número total de aminoácidos en la más corta de las dos secuencias que se comparan. Están disponibles comercialmente muchos programas de computadora para alinear secuencias y determinar identidades de secuencia y variaciones. Estos programas proporcionan información de identidad en base en la definición de identidad establecida en lo anterior. Un programa de computadora adecuado es el programa GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et. al. (iVucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG, por sus siglas en inglés) . El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol.. 48:443, 1970), realizado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Los parámetros implícitos preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación única (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para aminoácidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, como se describe por Schwartz and Dayhoff, eds . , Atlas of Protein Seguence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358, 1979; (2) un castigo de 3.0 para cada separación y un castigo de 0.10 adicional para cada símbolo en cada separación; y (3) sin castigo para finales de separaciones. También es útil para estas comparaciones otro programa similar denominado BESTFIT, el cual también está disponible de la University of Wisconsin como parte del paquete de computadora GCG para manipulación de secuencia. El término "LIR-2", como se utiliza en la presente, se refiere además a un polipéptido que es codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. Tales moléculas de ácido nucleico incluyen ADN de cadena sencilla y de cadena doble. También se incluyen moléculas de ARN que tienen el equivalente de secuencia pero en donde "U" sustituye a "T" . Los polipéptidos de LIR-2 codificados por tales ácidos nucleicos son capaces de unir CPH I. También se encuentran abarcados por el término "LIR-2" polipéptidos que poseen una actividad biológica mostrada por el LIR-2 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y que son codificados por moléculas de ácido nucleico cuyos complementos son capaces de hibridizar bajo rigurosidad moderada o condiciones altamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. Las condiciones de hibridación altamente rigurosas se diseñan para minimizar la formación de pares de bases mal pareados. Los parámetros básicos que alteran la rigurosidad de condiciones de hibridación y la guía para diseñar condiciones adecuadas se establecen por Sambrook, J. , E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4). La hibridación se puede llevar a cabo en solución o por anclaje del ácido nucleico objetivo a una superficie sólida, tal como un filtro de nitrocelulosa o de nylon. El ADN que se va a probar se marca, desnaturaliza y utiliza como una sonda en la reacción de hibridación. Las condiciones de cualquier grado de rigurosidad deseado se pueden determinar fácilmente por aquellos habitualmente expertos en la técnica en base, por ejemplo, en la longitud o la composición de bases del ADN. Una manera de obtener condiciones de rigurosidad moderada para ADN objetivo unido a filtro involucra utilizar una solución de prelavado que contiene 5 x SSC, SDS 0.5%, EDTA 1.0 m (pH 8.0), amortiguador de hidridación que contiene 6 x SSC, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 68°C (o utilizando un amortiguador de hibridación que contiene formamida 50% y 6 x SSC, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 42 °C) , posteriormente lavar los filtros a aproximadamente 60°C en amortiguador que contiene 0.5 x SSC y SDS 0.1%. "SSC" (lx) es NaCl 0.15 M, citrato de sodio 0.015 M, pH 7.0. Generalmente, las condiciones de rigurosidad elevadas se definen como en lo anterior, excepto que la etapa de lavado se lleva a cabo en 0.2 x SSC/SDS 0.1% a aproximadamente 68°C. Si se desea, SSPE (1 x SSPE es NaCl 0.15 , NaH2P0 10 mM y EDTA 1.25 mM, pH 7.4} puede sustituir a SSC en la hibridación y los amortiguadores de lavado descritos antes y el SDS se puede incrementar u omitir de cualquiera de los amortiguadores de hibridación o de lavado sin que se altere la rigurosidad. Las actividades biológicas presentadas por las proteínas LIR-2 codificadas por estos ácidos nucleicos incluyen una o más de las siguientes: la capacidad para unir proteínas CPH clase I; la capacidad, cuando se activan, para reducir el flujo de calcio intracelular en monocitos activados; y la capacidad, cuando se activan, para reducir la concentración de tirosina fosforilada intracelular en monocitos activados. Además, los polipéptidos LIR-2 de acuerdo con la invención incluyen proteínas que son capaces de unir CPH I y que son inmunorreactivas con un anticuerpo que es inmunorreactivo específicamente con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. Un anticuerpo que es específicamente inmunorreactivo con LIR-2 es aquel que no muestra unión apreciable con otras proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para LIR-2 no se unirán con LIR-3 o LIR-7. Los métodos para producir anticuerpos específicos son bien conocidos en la técnica y se puede utilizar cualquier método adecuado para producir tales anticuerpos, tales como los métodos discutidos en lo siguiente. Generalmente, los polipéptidos LIR-2 que reaccionan con tales anticuerpos son codificados por un ácido nucleico capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 1. Como se utiliza en la presente, el término "LIR-3" abarca un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 así como variantes y muteínas que tienen las propiedades biológicas de esta proteína. El polipéptido LIR-3 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 se puede codificar, por ejemplo, por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3. El término "LIR-3" también incluye variantes que tienen por lo menos 90%, y de manera más preferible por lo menos 95%, o de manera mucho más preferible por lo menos 98% de la identidad de secuencia de aminoácidos con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 y que poseen además actividad biológica expresada por un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. Tales actividades biológicas incluyen la capacidad para reducir el flujo de calcio intracelular en monocitos activados y la capacidad para reducir la cantidad de tirosina fosforilada en proteínas presentes en monocitos activados. El por ciento de identidad se determina como se describe en lo anterior. La secuencia de aminoácidos de LIR-3 que se presenta en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 tiene un dominio extracelular que contiene los aminoácidos 1-443, el cual incluye un péptido señal de los aminoácidos 1-16; un dominio transmembranal que incluye los aminoácidos 444-464; y un dominio citoplásmico que tiene los aminoácidos 465-631. La región extracelular del polipéptido LIR-3 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 contiene cuatro dominios similares a inmunoglobulina (similares a Ig) y esta región citoplásmica contiene dos pares de motivos ITIM. En la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, un primer par de motivos ITIM se encuentran en los aminoácidos 512-517, 541-546, y un segundo par está en los aminoácidos 593-598 y 623-628. Como se utiliza en la presente, el término "LIR-3" por lo tanto abarca un polipéptido que tiene cuatro dominios similares a Ig en su región extracelular, cuatro motivos ITIM en su cola citoplásmica y que tiene por lo menos una actividad biológica mostrada por un LIR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. Los polipéptido LIR-3 de acuerdo con la invención son capaces de transmitir un estímulo inhibidor que suprime la liberación de calcio en monocitos que expresan esta proteína. LIR-2 y LIR-3 son proteínas inhibidoras. Las actividades biológicas de estas proteínas incluyen la capacidad de inhibir monocitos que se han activado. En un método para ensayar esta actividad de LIR-2 o LIR-3, los monocitos primero se activan al ser expuestos a anticuerpo contra CD64. Esta activación es acompañada por la liberación intracelular de calcio y por la fosforilación de los residuos tirosina en proteínas en estas células. LIR-2 y LIR-3 se expresan en la superficie de los monocitos activados. La activación de LIR-2 o LIR-3 en estos monocitos puede ser acompañada, por ejemplo, por exposición de las células a un anticuerpo antagonista específico para cualquiera de LIR-2 o LIR-3. En algunos casos, la activación también involucrará agregar un segundo anticuerpo que reacciona con un anticuerpo contra LIR, lo que resulta en un reticulado de LIR que se expresa sobre la superficie celular. Este reticulado activará la función inhibidora de LIR-2 o LIR-3, lo que resulta en un flujo de calcio reducido el cual se puede determinar por ensayo como se describe en lo siguiente. El término "LIR-7" abarca al polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 así como variantes y muteínas que tengan las propiedades biológicas de esta proteína. La secuencia de aminoácidos que se presenta en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 tiene un dominio extracelular que incluye los aminoácidos 1-449, un péptido señal de los aminoácidos 1-16, un dominio transmembranal que incluye los aminoácidos 450-468 con un residuo arginina cargado en el aminoácidos 452 y con un dominio citoplásmico corto en los aminoácidos 469-463. El dominio extracelular incluye cuatro dominios similares a inmunoglobulia. En un aspecto de la invención, el polipéptido LIR-7 es codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5. Además, el término "LIR-7" abarca polipéptido codificados por ácido nucleicos capaces de hibridizar bajo condiciones moderadamente rigurosas o altamente rigurosas con el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 y que además tiene una actividad biológica presentada por una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6. Las condiciones de hibridación se definen como se describe en lo anterior. Los polipéptido LIR-7 de acuerdo con la invención poseen capacidad estimuladora (véase, por ejemplo, Nakajima et al., 1999). La activación de un polipéptido LIR-7 estimula la liberación de serotinina de células de leucemia basófilas de rata y estimula la liberación de calcio de monocitos primarios u otras células que expresan esta proteína. La liberación de calcio es un indicador mensurable de la activación de monocitos y se puede detectar, por ejemplo, utilizando el ensayo en Nakajima et al. para monitoreo de concentraciones citosplásmicas de calcio en células individuales (1999) . Para llevar a cabo este ensayo, las células se cargan con colorante Indo-1 AM (Sigma, St . Louis, MO) y se analizan en un citofluorómetro de flujo como se describe previamente (véase Colonna et al., 1997 y Nakajita et al., 1999). Brevemente, se adquiere un valor basal antes de poner en pausa el análisis para la adición de anticuerpos que se unen de manera cruzada con LIR-7. La unión cruzada generalmente requiere agregar un anticuerpo monoclonal contra LIR-7 y un anticuerpo dirigido contra la IgG de la especie animal en la cual se generaron los anticuerpos contra LIR-7. El análisis consiste en la medición de la proporción de emisión espectral 405/525 del colorante Indo-1 cargado por citrometría de flujo. La liberación de serotonina es otro indicador que se puede utilizar para medir la actividad de LIR-7. La liberación de serotonina se ensaya como se describe previamente en Colonna et al., 1997. Brevemente, las células son pulsadas con H3-serotonina (5-hidroxitriptamina) , se lavan y después se ponen en contacto con anticuerpos contra serototina y anticuerpos que dan unión cruzada con LIR-7 sobre la superficie de la célula o con un anticuerpo control para corregir la liberación espontánea. La liberación de serotonina se calcula de acuerdo con la fórmula: % de liberación de serotonina = 100 x ( [cpm de muestra] - [cpm de liberación espontánea] ) / (cpm total) . El término "LIR-2", como se utiliza en la presente, también abarca polipéptidos que son inmunorreactivos con anticuerpos que se unen específicamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y que poseen además una actividad biológica característica de una proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2. Como se utiliza en la presente, el término "LIR-3" también abarca polipéptidos que son inmunoreactivos con anticuerpos que se unen específicamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 y que poseen además una actividad biológica característica de una proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4. El término "LIR-7" abarca polipéptidos que son inmunorreactivos con anticuerpos que se unen específicamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 y que poseen además una actividad biológica característica de una proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6.

Agentes terapéuticos Los agentes terapéuticos útiles para los métodos terapéuticos descritos incluyen agentes no tóxicos capaces de incrementar el nivel de expresión o la función de LIR-2 o LIR-3, y agentes no tóxicos capaces de disminuir el nivel de expresión o la función de LIR-7. Los agentes ejemplares para este propósito incluyen anticuerpos agonistas inmunorreactivos específicamente con LIR-2 o LIR-3 y anticuerpos antagonistas inmunorreactivos específicamente con LIR-7. En otras modalidades, el agente terapéutico es un polipéptido soluble que comprende parte o la totalidad de la región extracelular de LIR-7, que incluye proteínas de fusión en las cuales la región extracelular de LIR-7 está unida con la región Fe de una inmunoglobulina IgG humana (sLIR-7:Fc). El LIR-7 :Fc actuará como un inhibidor competitivo de LIR-7 nativo. En un aspecto de la invención, el agente terapéutico es un polipéptido en el cual los aminoácidos 1-449 o 17-449 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 se fusionan con una región Fe de IgGl, como se describe en lo anterior. Para generar anticuerpos específicos para uno de los LIR, uno puede utilizar como un estímulo antigénico la totalidad del LIR, o un polipéptido que comprende la región extracelular de LIR-2, LIR-3 o LIR-7, o una porción secundaria antigénica del mismo. Las regiones extracelulares de LIR-2, LIR-3 y LIR-7 corresponde, respectivamente, a los aminoácidos 1-458 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2, los aminoácidos 1-443 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 y los aminoácidos 1-449 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6. Los aminoácidos 1-16 de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, 4 y 6 corresponden a la secuencia de señal que se separan durante la maduración del LIR. Los LIR-2, LIR-3 o LIR-7 de longitud completa o sus regiones extracelulares con o sin una secuencia de señal se pueden utilizar para generar anticuerpos. Las regiones extracelulares de LIR-2, LIR-3 y LIR-7 carecen de un péptido señal y podrían corresponder, respectivamente, a los aminoácidos 17-458 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, 17-443 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 o 17-449 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6. Adicionalmente se pueden generar anticuerpos utilizando porciones secundarias de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 que contienen por lo menos un epítopo antigénico que es único para dicho LIR. Los anticuerpos policlonales y monoclonales para uso como agentes terapéuticos se pueden preparar por técnicas convencionales (véase, por ejemplo Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analys, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York 1980; y AntiJbodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; véase también la patente de E.U.A. 4,411,993). En el documento WO 98/48017 se describe un protocolo ejemplar para producir anticuerpos monoclonales. Brevemente, se inmuniza a ratones BALB-C a la O, 2 y 6 semanas con 10 µ? del polipéptido LIR antigénico. La inmunización primaria utiliza adyuvante TITERMAX de Vaxcell, Inc., y las inmunizaciones subsecuentes utilizan adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) . A las 11 semanas, los ratones se refuerzan por administración intravenosa de 3-4 pg de la proteína antigénica PBS. Tres días después del refuerzo intravenoso se cosechan los esplenocitos y se fusionan con un asociado de fusión de mieloma Ag8.653 utilizando una solución PEG 1500 acuosa 50%. Para cribar las células de hibridoma, los sobrenadantes de las colonias individuales de las células de hibridoma se criban por ELISA contra células COS-1 que se han transfectado con el LIR contra el cual se ha generado anticuerpos. Para este criado, se agregan 2 x 103 células COS-1 transíectadas en PBS a pozos individuales de una placa de microtitulación de 96 pozos de poliestireno y las células se secan en la placa como el antígeno de recubrimiento de placa. Los sobrenadantes positivos posteriormente se confirman por análisis FACS y RIP utilizando células COS-1 transíectadas con LIR. Los hibridomas se clonan y se siguen utilizando los mismos ensayos. Los cultivos monoclonales se expanden y los sobrenadantes se purifican por cromatografía de afinidad utilizando agarosa y proteína A BioRad. Las variaciones de los procedimientos anteriores son conocidos en la técnica y, si se desea se pueden utilizar para producir o cribar los hibridomas . Los anticuerpos monoclonales de la presente invención también incluyen versiones humanizadas de anticuerpos monoclanes murinos o de ratón. Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar por técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a humanos. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de ratón o de rata (o únicamente el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender en sitios de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino o de rata y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) así como una región constante derivada de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y sometidos a ingeniería adicional incluyen aquellos descritos por Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84 :3439, 1987), Larrick et al., (Bio/Technology 7 :934, 1989) y Winter y Harris (TIPS 14:139, Can, 1993) . Las técnicas útiles para humanizar anticuerpos también se discuten en la patente de E.U.A. 6.054,297. Los procedimientos para generar anticuerpos transgénicamenté se pueden encontrar en el documento GB 2,272,440, y las patentes de E.U.A. Nos. 5,569,825 y 5,545,806 y patentes relacionadas. Preferiblemente, para uso en humanos, los anticuerpos son humanos o humanizados; las técnicas para crear tales anticuerpos humanos o humanizados también son bien conocidas y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Medarex Inc. (Princeton, NJ) y Abgenix Inc. (Fremont, CA) . En otra modalidad preferida, los anticuerpos completamente humanos para uso en humanos se producen por cribado de una biblioteca de presentación de fago de dominios variables anticuerpo humano (Vaughan et al., 1998, Wat Biotechnol. 16 (6) : 535-539 ; y patente de E.U.A. No. 5, 969, 108) . Los procedimientos de cribado se utilizan para determinar si un anticuerpo específico de LIR es agonista o antagonista. Los anticuerpos agonistas específicos para LIR-2 o LIR-3 son útiles como agentes terapéuticos para tratar AR y se pueden identificar, por ejemplo, por su capacidad para disminuir el flujo de calcio o la fosforilación de tirosina en monocitos activados que expresan LIR-2 o LIR-3. Para tales ensayos, los monocitos son activados y se mide el flujo de calcio como se describe en lo anterior en presencia o ausencia del anticuerpo específico para LIR-2 o específico para LIR-3 que es cribado. Los monocitos activados se exponen durante el análisis al anticuerpo agonista putativo. Los anticuerpos antagonistas contra LIR-7 útiles como agentes terapéuticos para AR se pueden identificar por su capacidad para unirse a LIR y no activar el flujo de calcio en monocitos . En un aspecto de la invención, los estímulos antigénicos utilizados para generar anticuerpos específicos para LIR, para uso como un agente terapéutico es una proteína de fusión que comprende la porción Fe de IgG humana y la región extracelular del LIR objetivo. Un polipéptido Fe adecuado para este propósito es el polipéptido de la región Fe nativa derivado de IgG 1 humano que se describe en la solicitud de patente PCT WO 93/10151, la cual se incorpora en la presente como referencia. Otro polipéptido Fe útil para construir proteínas de fusión es la muteína Fe descrita en la patente de E.U.A. 5,457,035. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fe nativa presentada en WO 93/10151, excepto que se ha cambiado el aminoácido 19 de Leu a Ala, se ha cambiado el aminoácido 20 de Leu a Glu y se ha cambiado el aminoácido 22 de Gly a Ala. Esta muteína Fe muestra afinidad reducida por receptores de inmunoglobulina . Un medio adecuado para producir una proteína de fusión LIR: Fe es el que se describe en WO 98/48017. Para aplicar este método, se fusiona un ADNc que codifica para la totalidad o parte de la región extracelular de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 con un ADN que codifica para una región Fe de IgG humana. Para producir una fusión LIR-2 :Fc se puede utilizar la totalidad de la región extracelular (aminoácidos 1-458 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2) o una porción de la misma que es capaz de unir MHC I. El ADNc que codifica para la región extracelular del LIR se obtiene mediante la utilización de cebadores de PCR que flanquean las secuencias nucleotídicas que codifican para la región extracelular. Para este propósito, el ADNc de LIR de longitud completa se puede utilizar como una plantilla para PCR tal como, por ejemplo, los ADNc que tienen una secuencia nucleotídica como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, NUMERO: 3 o NÚMERO: 5. En una modalidad de la invención, los cebadores se sintetizan con sitios de restricción Sal I y 2\fot II insertados en las partes terminales 5 ' y 3 ' de manera que el producto de amplificación produce sitios de restricción Sal I y Not II en los extremos 5' y 3', respectivamente, del fragmento de ADN amplificado. Estos sitios de restricción facilitan la unión del ADN amplificado dentro de un vector de expresión. Alternativamente, se pueden insertar otros sitios de restricción en los extremos del ADN amplificado. En una modalidad preferida de la invención, para preparar un constructo (plásmido recombinante) vector para expresar las proteínas de fusión, el ADN que codifica para la región Fe humana de muteína de IgG 1 se liga con ADN que codifica para la región extracelular de LIR-2, LIR-3 o LIR-7. En una modalidad de la invención, esto se realiza de manera que la región extracelular de LIR se localiza en la parte amino terminal de la proteína de fusión. Los constructos de ADN de fusión después se ligan en un vector de expresión adecuado tal como PDC409 y se expresan en una célula hospedadora adecuada tal como células CV1-EBNA o COS (ATCC CTL-1650) . Se puede utilizar la línea de células de mono COS-1 para confirmar la expresión de la proteína de fusión. Para purificar las proteínas de fusión, los sobrenadantes de cultivos COS-1 se clarifican por centrifugación y se purifican, por ejemplo, mediante la utilización del sistema BioCad y la columna 20A POROS de PerSeptive Biosystems, o por otros métodos comparables conocidos por los expertos en la técnica. La proteína eluida y acumulada se puede analizar utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida SDS con tinción de plata para confirmar la expresión y para verificar que la proteína recombinante expresada tiene el peso molecular esperado.

Tratamientos concurrentes En la presente se proporciona una combinación de tratamientos en los cuales se administran de manera concurrente uno más moduladores de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 con uno o más medicamentos adicionales utilizados para tratar AR. En tales métodos de tratamiento, los moduladores de LIR se pueden administrar de manera concurrente con uno, dos, tres o más medicamentos adicionales utilizados para tratar AR. Las medicaciones adicionales se pueden administrar de manera simultánea o alternativa con los moduladores de LIR. Alternativamente, los moduladores de LIR se pueden administrar intermitentemente contra un fondo de tratamiento continuo con algún otro agente que sea utilizado para tratar AR tal como, por ejemplo, un antagonista de factor a de necrosis tumoral (TNFa, por sus siglas en inglés) o un antagonista de IL-1. Los moduladores de LIR y otros tratamientos para AR se pueden administrar de manera simultánea, alternativa o secuencial y la frecuencia de su administración puede ser igual o diferente. Los antagonistas de TNFa adecuados para uso concurrente con moduladores LIR en el tratamiento de AR incluyen anticuerpos contra TNFa. Tales anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales humanizados y completamente humanos. Un anticuerpo humanizado ejemplar para administración concurrente con un modulador de LIR es el anticuerpo monoclonal quimérico IgG 1 Kappa denominado infliximab, el cual se vende por Centocor como REMICADEMR. Infliximad está constituido de regiones constante humana y variable murina y se une específicamente a TNFa humano. Otros anticuerpos contra TNFa adecuados incluyen los anticuerpos humanizados D2E7 y CDP571, y los anticuerpos descritos en los documentos EP 0 516 785 Bl, E.U.A. 5,656,272, EP 0 492 448 Al.

El modulador de LIR se puede administrar de manera concomitante con diversas clases de agentes que se utilizan para tratar AR que incluyen inhibidores de LIR-1, anticuerpos dirigidos contra proteínas de superficie de linfocitos T y oligonucleótidos antisentido o ribozimas que interfieren con la traducción de TNFa, un receptor de TNFa o una enzima en las vías metabólicas para la síntesis de TNFa. Los oligonucleoótidos antisentido adecuados para administración concurrente con moduladores LIR incluyen los descritos en la patente de E.U.A. No. 6,228,642. También son adecuados para administración concurrente con los moduladores LIR los inhibidores del péptido TNFa descritos en los documentos E.U.A. 5,641,751 y E.U.A. 5,519,000 y los péptidos que contienen D-aminoácidos descritos en el documento de E.U.A. 5,753,628. Además, las condiciones descritas en la presente se pueden tratar con inhibidores de enzima convertidora TNFa. Las combinaciones preferidas incluyen administración de moduladores LIR, concurrentemente con un inhibidor de TNFa que es una forma soluble de un receptor TNF (sTNFR) . La forma soluble sTNFR puede incluir monómeros, proteínas de fusión (también denominadas proteínas "quiméricas") dímeros, trímeros o multímeros de orden superior. En algunas modalidades de la invención, el derivado de sTNFR es uno que imita a TNFR de 75 kDa o TNFR de 55 kDa y que se une a TNFa en el cuerpo de los pacientes. Los imitadores de sT FR de la presente invención se pueden derivar de los TNFR p55 o p75 o fragmentos de los mismos. Los TNFR diferentes de p55 y p75 también son útiles para derivar compuestos solubles para tratar los diversos trastornos médicos descritos en la presente tales como, por ejemplo, el TNFR que se describe en WO 99/04001. Las moléculas de sTNFR utilizadas para construir imitadores de TNFR incluyen, por ejemplo, análogos o fragmentos de TNFR nativos que tengan por lo menos 20 aminoácidos que carezcan de la región transmembranal del TNFR nativo y que sean capaces de unir TNFa. La unión de los sTNFR a TNFa se puede ensayar utilizando ELISA o cualquier otro ensayo conveniente. Los polipéptidos sTNFR o fragmentos de la invención se pueden fusionar con un segundo polipéptido para formar una proteína quimérica. El segundo polipéptido puede promover la formación espontánea por la proteína quimérica de un dímero, trímero o multímero de orden superior que es capaz de unir un TNFa o una molécula LTa e impedir que se una a receptores unidos a célula. Las proteínas quiméricas utilizadas como antagonistas incluyen, por ejemplo, moléculas derivadas de la región constante de una molécula de anticuerpo y la porción extracelular de un TNFR. Tales moléculas se denominan en la presente como proteínas de fusión TNFR-Ig. Una proteína de fusión TNFR-Ig adecuada para tratar enfermedades en humanos y otros mamíferos es TNFR: Fe, recombinante, un término el cual, como se utiliza en la presente se refiere a "etanercept" , el cual es un dimero de dos moléculas de la porción extracelular del receptor TNFa p75, cada molécula consiste de un polipéptido derivado de TNFR de 235 aminoácidos que se fusiona a una porción Fe de 232 aminoácidos de IgGi humana. Etanercept actualmente se vende por Immunex Corporation bajo el nombre comercial ENBREL" . También se abarcan por la invención los tratamientos que combinan moduladores LIR con un compuesto que comprende la porción extracelular de TNFR 55 kDa fusionado a la porción Fe de IgG, así como a composiciones y combinaciones que contienen tales agentes terapéuticos. Además, los inhibidores TNF adecuados se pueden derivar de las regiones extracelulares de las moléculas receptoras de TNFa diferentes de TNFR p55 y p75, tales como por ejemplo el TNFR descrito en WO 99/04001, que incluye los TNFR-Ig derivados de este TNFR. Además, estos moduladores LIR se pueden administrar a pacientes con AR concurrentemente con agentes que disminuyen la destrucción ósea en articulaciones artríticas que incluyen, por ejemplo, formas solubles de RANK, tales como RANK: Fe, u osteoprotegerina (véase el documento de E.U.A. 6,017,729 y WO 98/46751) . Otros medicamentos adecuados para administración concurrente con un modulador LIR incluye analgésicos que incluyen, pero que no se limitan a acetaminofeno, codeína, napsilato de propoxifeno, clorhidrato de oxicodona, bitartrato de hidrocodona y tramadol . Además , el modulador LIR se puede administrar de manera concomitante con un medicamento ant rreum tico modificador de la enfermedad (DMARD, por sus siglas en inglés> que incluye pero que no se limita a metrotexato, sulfasalazina, sales de oro, azatioprina, ciclosporina, antipalúdicos, esteroides (por ejemplo prednisona) y colquicina. Los antiinflamatorios también se pueden coadministrar con el modulador LIR. Tales antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a: aspirina; ibuprofeno; indometacina; celecoxib; rofecoxib; quetorolaco; nambumetona; piroxicam; naproxeno; oxaprozina; sulindac; quetoprofeno; diclofenaco; y otros inhibidores de COX-1 y COS-2, derivados de ácido salicílico, derivados de ácido propiónico, derivados de ácido acético, derivados de ácido fenámico, derivados de ácido carboxílico, derivados de ácido butírico, oxicames, pirazoles y pirazolonas que incluyen antiinflamatorios recién desarrollados que son eficaces para tratar articulaciones artríticas. Los inhibidores de IL-1 adecuados para uso concurrente con moduladores de LIR incluyen fragmentos peptídicos que unen receptor de IL-1, anticuerpos dirigidos contra IL-1 o IL-?ß o receptor IL-1 tipo I, y proteínas recombinantes que comprenden la totalidad o porciones de los receptores para IL-1 o variantes modificadas de los mismos que incluyen muteínas modificadas genéticamente, formas multiméricas y formulaciones de liberación sostenida. Los antagonistas particulares incluyen polipéptidos IL-lra, inhibidores de la enzima convertidora IL-?ß (ICE), anticuerpos antagonistas del receptor tipo I de IL-1, formas de unión de IL-1 del receptor IL-1 tipo I y receptor IL tipo II, anticuerpos para IL-1 que incluyen IL-lot e IL-?ß y otros miembros de la familia IL-1, y sustancias terapéuticas conocidas como trampas de IL-1. Los polipéptidos IL-lra incluyen las formas de IL-lra descritas en el documento E.U.A. 5,075,222 y formas modificadas y variantes que incluyen las descritas en los documentos de E.U.A. 5,922,573, WO 91/17184, WO 92/16221 y WO 96/09323, todas las cuales son. Los inhibidores de la enzima convertidora ß de IL-1 (ICE) incluyen peptidilo e inhibidores ICE de molécula pequeña que incluyen los derivados en las solicitudes de patentes PCT WO 91/15577; WO 93/05071; WO 93/09135; WO 93/1477 y WO 93/16710; y la solicitud de patente europea 0 547 699. Los compuestos no peptidilos incluyen los descritos en la solicitud de patente PCT WO 95/26958, documento de E.U.A. 5,552,400, E.U.A. 6.121,266, Dolle et al., J. Med. Chem. , 39:2438-2440 (1996) . Los inhibidores de ICE adicionales se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,162,790, 6,204,261, 6,136,787, 6,103,711, 6,025,147, 6,008,217, 5,973,111, 5,874,424, 5,847,135, 5,843,904, 5,756,466, 5,656,627, 5,716,929. Las formas de unión de IL-1 del receptor IL-1 tipo I y del receptor IL-1 tipo II adecuados para administración concurrente con moduladores LIR se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,968,607, 4,968,607, 5,081,228, Re 35,450, 5,319,071 y 5,350,683. Las trampas IL-1 se describen en WO 018932. Los antagonistas IL-1 adecuados para administración concurrente con moduladores LIR incluyen además, proteínas quiméricas que incluyen porciones tanto de una molécula de anticuerpo como de una molécula antagonista de IL-1. Tales moléculas quiméricas pueden formar monómeros, dímeros o multímeros de orden superior.. Otros antagonistas de IL-1 adecuados incluyen péptidos derivados de IL-1 que son capaces de unirse competitivamente al receptor señalizador de IL-1, IL-1 R tipo I. Además, los moduladores de LIR se pueden utilizar para tratar RA junto con moléculas pequeñas tales como talidomida o análogos de talidomida, pentoxifilina, inhibidores de metaloproteinasa de matriz (MMP, por sus siglas en inglés) u otras moléculas pequeñas. Los inhibidores adecuados de MMP incluyen, por ejemplo, los que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,883,131, 5,863,949 y 5,861,510 así como los compuestos mercaptoalquilpeptidilo descritos en el documento de E.U.A. 5,872,146. Otras moléculas pequeñas adecuadas para administración concurrente son moléculas capaces de reducir la producción de TNFa, que incluyen las descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 5,508,300, 5,596,013 y 5,563,143 cualquiera de las cuales se pueden administrar combinadas con moduladores de LIR. Las moléculas pequeñas adicionales útiles para tratar AR junto con los modulares de LIR incluyen inhibidores de MMP que se describen en el documento de E.U.A. 5,747,514 o E.U.A. 5,691,382 así como los derivados de ácido hidroxámico descritos en el documento de E.U.A. 5,821,262 y moléculas pequeñas que inhiben la producción de fosfodiesterasa IV y TNFa, tales como los derivados de oximas sustituidos (WO 96/00215), quinolinosulfonamidas (E.U.A. 5,834,485) derivados de arilfurano (WO 99/18095) y derivados heterobicíclicos (WO 96/01825; GB 2 291 422 A), derivados de tiazol que suprimen TNFa e IFNy (WO 99/15524) así como derivados de xantina que suprimen TNFa y otras citocinas proinflamatorias (véase, por ejemplo, los documentos de E.U.A. 5,118,500, 5,096,906 y 5,196,430) .

Preparaciones Farmacéuticas Se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de un modulador de LIR de la presente invención (de cualquier fuente derivada que incluye, sin limitación de fuentes recombinantes y no recombinantes) en combinación con otros componentes tales como un diluyente, portador o excipiente fisiológicamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de uno o varios de los ingredientes activos. Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterioestáticos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor,- y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Los agentes terapéuticos de acuerdo con la invención se pueden combinar en mezcla, ya sea como el material activo único o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo solución salina, tris-HCl, acetato y soluciones amortiguadas de fosfato) , preservativos (por ejemplo timerosal, alcohol bencílico, parabenos) , emulsificantes, solubilizantes, adyuvantes o portadores. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen las que se describen en Remington 's Phar aceutical Sciences, 16th ed. 1980, ack Publishing Company, Easton, PA. Además, los moduladores LIR para composiciones farmacéuticas pueden formar complejos con polietilenglicol (PEG) , iones metálicos o se pueden incorporar en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etcétera, o se pueden incorporar en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasmas o esferoblastos . Los lípidos adecuados para formulación liposómica incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de tales formulaciones liposómicas está dentro del nivel de los expertos en la técnica, como se describe, por ejemplo en las patentes de E.U.A. Nos. 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028 y 4,737,323. Tales composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo y por lo tanto se seleccionan de acuerdo con la aplicación propuesta de manera que las características del portador dependerán de la vía seleccionada de administración . En una modalidad preferida de la invención se utilizan formas de liberación sostenida de polipéptidos moduladores de LIR. Las formas de liberación sostenida adecuadas para uso en los métodos que se describen incluyen, pero no se limitan a moduladores de LIR que son encapsulados en un polímero biocompatible que se disuelve lentamente (tales como las micropartículas de alginato descritas en el documento de E.U.A. No. 6,036,978), mezcladas con tal polímero (que incluyen hidrogeles aplicados tópicamente) o incrustados en un implante semipermeable biocompatible . También se incluyen formulaciones de micropartículas adecuadas para inyección en las cuales se han incorporado uno o varios agentes terapéuticos. También se incluyen los moduladores terapéuticos de LIR que se han modificado para incrementar su vida media en sangre. Por ejemplo, el modulador de LIR se puede conjugar con polietilenglicol para inyección utilizando métodos conocidos.

Régimen para Administración Como se utiliza en la presente, la frase "administración de una cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente que antagoniza LIR-7 o que agoniza con LIR-2 o LIR-3 significa que el paciente es tratado con el agente terapéutico en una cantidad y por un tiempo suficientes para inducir una mejora, preferiblemente una mejora sostenida en por lo menos un indicador que refleja la gravedad del desorden. Se considera que una mejora es "sostenida" si el paciente muestra la mejoría en por lo menos dos ocasiones con una diferencia de uno o más días, de manera más preferible por una o más semanas. El grado de mejoría se determina en base en los signos o síntomas y las determinaciones también pueden utilizar cuestionarios que se aplican al paciente, tales como cuestionarios respecto a la calidad de vida. Varios indicadores que reflejan el grado de enfermedad del paciente se pueden establecer para determinar si la cantidad y tiempo de tratamiento es suficiente. El valor de líneas de base para uno o varios de los indicadores seleccionados se establece por examen del paciente antes de la administración de la primera dosis del agente terapéutico. Preferiblemente, el examen de línea de base se realiza en los siguientes aproximadamente 60 días de administración de la primera dosis, y se puede realizar en cualquier momento posterior o hasta el mismo día que la primera dosis. La mejora se induce por administración de agentes terapéuticos de acuerdo con la invención hasta que el paciente manifiesta una mejoría con respecto a los valores iniciales para uno o varios de los indicadores seleccionados. En este contexto, el término "línea de base" (condiciones iniciales o condiciones de referencia) se refiere a la medición del indicador seleccionado antes de que se administre la primera dosis en el paciente. En una modalidad de la invención una cantidad y tiempo suficiente de tratamiento para AR se producirán cuando el tratamiento ha inducido una mejoría de acuerdo con los criterios del American College of Fheumatology (ACR) modificado por Felson et al. (Felson et al., Arthritis Rheum 6 : 727-735, 1995) . Cuando se utiliza los criterios de ACR, se considera que el tratamiento es suficiente cuando el paciente presenta una mejoría de por lo menos 20% (ACR20) o en por lo menos 50% (ARC50) tanto en la cuenta de sensibilidad excesiva en las articulaciones (aproximadamente 78 articulaciones determinadas) y la cuenta de articulaciones hinchadas (aproximadamente 76 articulaciones determinadas) y que también muestra una mejoría en tres de los siguientes 5 incisos: 1) determinación de dolor del sujeto; 2) determinación global del sujeto; 3) determinación global del médico; 4) incapacidad autodeterminada por el sujeto; 5) reacción en fase aguda (velocidad de sedimentación de eritrocitos Westergreen o concentración de proteína C reactiva) . De los cinco criterios precedentes, los primeros cuatro se califican en una escala Likert . Las determinaciones realizadas por el sujeto y las globales se determinan en base en el estado general de la enfermedad del paciente. En otra modalidad de la invención, se determina la suficiencia de tratamiento por autodeterminación por parte del paciente o bien por determinación por el médico. La autodeterminación del paciente o las determinaciones del médico se pueden medir, por ejemplo, en una escala numérica subjetiva en la cual un extremo de la escala representa "sin enfermedad" y el otro extremo indica "enfermedad grave" (es decir, una escala "Likert") . En cualquiera de los extremos de la escala se puede utilizar para representar "sin enfermedad" . Tal escala puede tener cualquier intervalo deseado de valores numéricos, por ejemplo 0-3, 0-4, 0-5, 0-6, 0-7, etcétera, y proporciona una base para la comparación de la condición del paciente en la línea de base. En el sistema de 0-3 puntos, por ejemplo, puede involucrar las siguientes categorías: 0 = sin enfermedad; 1 = enfermedad ligera; 2 = enfermedad moderada; 3 = enfermedad grave. En este ejemplo, un paciente puede considerar que ha "mejorado" si su calificación disminuye en una categoría. Como se utiliza en la presente, se entiende que el término "escala de Likert" incluye escalas analógicas visuales (VAS, por sus siglas en inglés) en las cuales un paciente o el médico encierra un número que considera que representa mejor el estado del paciente con respecto al parámetro que se mide. Si la calificación del paciente empeora en comparación con la calificación en las condiciones iniciales, se le asigna un valor negativo al cambio en su calificación de Likert. Las dosificaciones adecuadas variarán, en base en factores tales como la naturaleza y gravedad del trastorno que se va a tratar, el peso corporal del paciente, edad, condiciones generales y enfermedad anterior o tratamientos, así como la vía de administración. Las dosis preliminares se pueden determinar de acuerdo con pruebas en animales y la escala de dosificaciones para administración humana se realiza de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica tales como los ensayos de dosificación estándar. Se puede formular una dosis en modelos animales para obtener un intervalo de concentración plasmática circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición semimáxima de los síntomas) , determinado en cultivo celular, mientras que minimiza toxicidades. Tal información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Finalmente, el médico que atiende decidirá la cantidad de agente terapéutico de la presente invención con la cual tratar a cada paciente individual y puede regular las dosis y las frecuencias de administración de acuerdo con las necesidades individuales del paciente. Se puede utilizar cualquier vía de administración eficaz para administrar terapéuticamente un modulador de LIR para los presentes métodos de tratamiento. Si se inyecta, el agonista o antagonista de LIR se puede administrar, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional o intraperitoneal o por vías subcutáneas, mediante inyección rápida o en bolo o mediante infusión continua. Otros medios de administración adecuados incluyen liberación sostenida a partir de implantes, inhalación por aerosol, gotas para los ojos, preparaciones orales que incluyen pildoras, jarabes, grageas o gomas masticables, y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, aspersiones, ungüentos u otras técnicas adecuadas. De manera alternativa, los moduladores de LIR proteináceos se pueden administrar al implantar células cultivadas que expresan la proteína, por ejemplo, al implantar células que expresen la proteína moduladora, es decir, un antagonista de LIR-7, un agonista de LIR-8 o un agonista de LIR-3. En una modalidad, las células propias del paciente son inducidas para que produzcan el modulador de LIR por transfección in vivo o ex vivo con un ADN que codifica para el modulador. Este ADN se puede introducir en las células del paciente, por ejemplo por inyección de ADN desnudo o de ADN encapsulado en liposomas que codifica para el modulador, por infección con un vector viral que exprese el ADN o por otro medio conocido en la técnica. Cuando se administra el modulador LIR combinado con uno o más compuestos biológicamente activos diferentes, estos se pueden administrar por vías iguales o diferentes y se pueden administrar simultáneamente, por separado o de manera secuencial . Las composiciones farmacéuticas para inyección que comprenden proteínas que son moduladores de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 pueden contener una dosis de aproximadamente 0.01 ng a aproximadamente 100 mg (de manera preferible de aproximadamente 0.1 ng a aproximadamente 10 mg, y de manera más preferible de aproximadamente 0.1 iq a aproximadamente 1 mg) del polipéptido terapéutico por kilogramo de peso corporal . En una modalidad de la invención, tales composiciones se administran una vez al mes para tratar los diversos trastornos médicos descritos en la presente, en otra modalidad se administran por lo menos con un intervalo de 1 vez a la semana, y en otra modalidad se administran por lo menos dos o más veces a la semana. Cuando la vía de administración es inyección o infusión intravenosa, la cantidad eficaz de moduladores LIR por dosis de adulto se puede calcular en base en el área superficial corporal . Un intervalo de dosis preferida para un anticuerpo terapéutico u otro agente terapéutico que comprende la proteína es 1-20 mg/m2 y de manera más preferible 5-12 mg/m2. De manera alternativa, una dosis plana se puede administrar, cuya cantidad puede variar de 5 a 100 mg/dosis. Los intervalos de dosis ejemplares para una dosis plana que se va administrar por inyección subcutánea son 5-25 mg/dosis, 25-50 mg/dosis y 50-100 mg/dosis. En una modalidad de la invención, un trastorno médico se trata por administración de una preparación aceptable para inyección contiene polipéptidos terapéuticos en una dosis plana que contiene 1, 5, 10, 25 ó 50 mg. El agente terapéutico se puede administrar repetidamente a una frecuencia de una vez cada ocho semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada dos semanas, una vez cada semana; dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana o diariamente. Si se utiliza una vía de administración diferente a la inyección, la dosis se ajusta apropiadamente de acuerdo con las prácticas médicas estándar. Si se utiliza un anticuerpo como el antagonista de LIR-7 o como el agonista de LIR-2 o LIR-3, un intervalo de dosis preferido es de 1-10 mg/kg, y otro intervalo de dosis preferido es de 0.75 a 7.5 mg/kg de peso corporal. Se prefieren anticuerpos humanizados, esto es, anticuerpos en los cuales únicamente la porción de unión de antígeno de la molécula de anticuerpo se deriva de una fuente no humana. Tales anticuerpos se pueden inyectar por vía subcutánea, intramuscular o se pueden administrar por vía intravenosa y se pueden utilizar de manera concurrente con metotrexato para reducir el desarrollo de anticuerpos del hospedador contra el agente terapéutico. La duración del tratamiento puede variar, en base en la respuesta del paciente. En muchos casos se obtendrá una mejora en la condición del paciente al inyectar la dosis terapéutica durante un período de por lo menos tres semanas, aunque pueden ser necesarios tratamientos de períodos más prolongados para inducir el grado deseado de mejora. El régimen puede continuar indefinidamente, realizándose ajustes a la dosis y frecuencia si esto se considera necesario por el médico del paciente. Para pacientes pediátricos (con edades de 4 a 17 años) un régimen adecuado involucra la inyección subcutánea de 0.4 mg/kg hasta una dosis máxima de 25 mg de un modulador LIR polipeptídico, administrado por inyección subcutánea una o más veces a la semana. Al tratar AR, la cual es una condición crónica, una mejoría en la condición del paciente se obtiene al administrar repetidamente este medicamento durante un período de por lo menos una semana o más, de manera más preferible durante un mes o más durante una, dos o tres meses o un período más prolongado, o bien de manera indefinida. El tratamiento puede continuar indefinidamente a la misma dosis y frecuencia que en el mes inicial de tratamiento, o a una dosis o frecuenci reducidas, o se puede administrar de manera intermitente junto con algún otro tratamiento que se esté utilizando como el tratamiento principal para un paciente determinado. Si la dosis o frecuencia de administración se reduce o se suspende, posteriormente se puede reiniciar en el nivel original si los síntomas empeoran. Tales determinaciones se realizan por el médico de los pacientes de acuerdo con las prácticas médicas estándar. Se entiende que la respuesta por pacientes individuales a las medicaciones mencionadas antes pueden variar y que la combinación más eficaz de medicamentos y regímenes de dosificación para cada paciente se determinará por su médico. El siguiente ejemplo se proporciona a modo de ilustración y de ninguna manera como una limitante. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden realizar variaciones de la invención y constituida en este ejemplo, especialmente en base en las enseñanzas de las diversas referencias mencionadas en la presente.

EJEMPLO Este estudio compara la expresión in vivo y la distribución celular de varios LIR en el sinovio de pacientes que tienen A , osteoartritis (OA, por sus siglas en inglés) y pacientes normales. El sinovio OA se incluye en este estudio debido a que, en contraste AR, las reacciones inflamatorias en el tejido sinovial en OA se producen en ausencia de formación de paño e invasión de tejido (Ehrlich et al., In: Moskowitz et al., Eds., Osteoarthritis : diagnosis and management, Philadelphia, W.B. Saunders, 199-211 (1984) ; Dieppe et al., En: Moskowitz et al., Eds, Osteoarthritis: diagnosis and medical/surgical management. 2nd., Philadelphia, W.B. Saunders, 399-412 (1992)). Utilizando inmunohistoquímica, se estudia la expresión de los LIR inhibidores y activantes en el sinovio de seis pacientes con AR, tres pacientes con osteoartritis y tres sujetos control.

La tinción con anticuerpos específicos se utiliza para detectar la expresión de LIR-2, LIR-3 y LIR-7 y la tinción por secciones en serie con anticuerpos específicos para líneas de células se utiliza para evaluar la localización celular de los LIR expresados. La expresión de dos polipéptidos LIR inhibidores, LIR-2 y LIR-3 y un polipéptido LIR activante, LIR-7 se examinan en este grupo de experimentos. En general, los tres LIR tienen una expresión relativamente limitada en células de origen mieloide, células las cuales son fuentes importantes de citocinas y proteasas en AR. Se sabe que LIR-2 reconoce moléculas de CPH clase I las cuales están distribuidas ampliamente en te idos humanos. Seis pacientes con antecedentes de AR que varían de dos a catorce años, y tres pacientes con antecedentes de OA que varían de 3 a 13 años, experimentaron extirpación de tejido sinovial de la articulación de la rodilla bajo anestesia general. El tejido sinovila normal se obtiene de tres sujetos durante una cirugía reconstructiva de la rodilla por ruptura de menisco por traumatismo. El tejido sinovial se incrusta en el compuesto OCT, se congela rápidamente en nitrógeno líquido (Tissue-Tek, Miles, Elkhart, IN) y se corta a 2-4 \im para análisis histopatológico y estudios inmunohistoquímicos . Se generan anticuerpos monoclonales IgGl de ratón específicos, contra LIR-2, LIR-3 y LIR-7 en ratones BALB/c por inmunización con proteínas de fusión LIR/Fc que contienen los dominios extracelulares de LIR fusionados a la región Fe de IgGl humana, como se describe (véase Cosman et al., Immunity 7:273-282 (1997)). Los anticuerpos fueron cribados para inmunorreactividad específica por ELISA contra un grupo de proteínas de fusión LIR/Fc y por análisis FACS utilizando células COS-1 transíectadas con los ADNc para LIR de longitud completa. Se utiliza anticuerpo IgGl de ratón, no relacionado, como control negativo (Biosource International, Camarillo, CA) . Estos anticuerpos se utilizaron en técnicas de tinción con fosfatasa alcalina de tres etapas como se describe en Tedia et al., Am J Pathol 148 (5) : 1367-73 (1996), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Brevemente, se equilibran secciones fijadas con acetona, con solución salina amortiguada con TRIS (TBS) y se bloquean con suero equino puro, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las secciones después se incuban con 5 pg/ml de anticuerpos primarios durante la noche, a 4°C. Después de cuatro lavados con TBS, las secciones se incuban con anticuerpos de caballo IgG contra ratón biotinado (Vector laboratories, Burlingame, CA) durante una hora a temperatura ambiente. Después de 4 lavados con TBS, las secciones se incuban con conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Vector laboratories) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se detecta la inmunorreactividad utilizando un sustrato calorimétrico de fosfatasa alcalina (vector red, Vector laboratories) y se realiza una contratinción breve, con hematoxilin . Las condiciones óptimas para uso de cada anticuerpo contra LIR inicialmente se definen utilizando un grupo de tejidos normales que probablemente contengan células que expresen LIR, incluyendo la piel, timo, nodulos linfáticos y células del bazo. Las secciones adyacentes a las analizadas con anticuerpos contra LIR también se analizaron con el fin de determinar los tipos de células específicas que son inmunorreactivas con anticuerpos específicos para los LIR. Esto se realiza utilizando los métodos descritos en Tedia et al., Cytokine 11 (7):531-40 (1999), la cual se incorpora en la presente como referencia y Tedia et al., 1996. Este esfuerzo utiliza anticuerpos para detectar macrofagos (IgGl de ratón contra CD68) , linfocitos T (policlonal de conejo contra CD3) , células endoteliales (IgGl de ratón contra el factor de Von-Willebrand) , catepsina G de neutrófilos (policlonal de conejo) y triptasa de mastocitos (IgGl de ratón) . Estos anticuerpos se adquieren de DAKO (Glostrup, Dinamarca) . El procedimiento de tinción utilizado es esencialmente como se describe en lo anterior para la tinción contra LIR. Además de la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos específicos, se utiliza una tinción estándar de hematoxilina y eosina para evaluar la calidad y la histología de cada sección. Las secciones de tejido de los estudios inmunohistoquímicos se evalúan al contar las células que se observan en campos contiguos a través de toda la sección. Brevemente, se seleccionan por sección un promedio de 18 campos con una ampliación de 250x, en un procedimiento de muestreo sistemático. Después de asegurar que las secciones de control teñidas con el anticuerpo de control isotipo no muestran inmunorreactividad significativa, se enumeró el número de células positivas (teñidas de rojo) por campo. Aunque se observa variación regional significativa en la tinción, la cuenta media para toda la sección se reporta como una medida conservadora de la tinción para cada anticuerpo. Las características histológicas observadas de las muestras de tejido sinovial y la expresión de los tres LIR se resumen en la tabla 1. Las secciones de dos pacientes con AR (AR1 y AR2) quienes presentan una duración de enfermedad relativamente corta (2-5 años) muestran infiltración extensa con células inflamatorias, que incluyen macrófagos CD68-positivos , neutrófilos catepsina G-positivos, una cantidad moderada de mastocitos triptasa-positivos y grupos de linfocitos T CD3 positivos. En los cuatros pacientes restantes con AR, quienes han presentado la enfermedad durante 8-14 años, existen grados variables de infiltración celular inflamatoria y en estos pacientes es evidente la fibrosis tisular. En las secciones de dos de los pacientes con OA, existe una infiltración significativa de macrofagos con cantidades limitadas de linfocitos T y mastocitos (tabla 1) . El tercer paciente con OA presente fibrosis extensa con macrofagos en los bordes exteriores de la membrana sinovial . Se observan pocas o nulas células inflamatorias en las secciones obtenidas de sujetos normales. Como se muestra en la tabla 1, existe una expresión extensa de LIR-2 y LIR-7 en secciones que se obtienen de tres pacientes con AR con una duración temprana a intermedia de enfermedad (pacientes AR1, AR2 y AR3) . LIR-2 se localiza de manera conjunta de con LIR-7 en neutrofilos y macrofagos que se infiltran al sinovia reumatoide. La expresión de LIR-2 y LIR-7 se marca especialmente en la enfermedad reumatoide temprana (tabla 1) , pero es extremadamente limitada para pacientes con una duración prolongada de AR (8 años o más) . Al incrementarse la duración de AR, el tejido sinovial muestra más cambios fibróticos y el número de células que expresan LIR-2 y LIR-7 disminuye notablemente. Se encontró una expresión despreciable tanto de los LIR activantes como inhibidores en tejidos sinoviales obtenidos de pacientes con OA. No se detectó expresión de LIR en tejidos sinovial de donadores normales.

LIR-3 sé expresa en macrofagos infiltrados en el sinovio reumatoide de dos de los tres pacientes con AR temprano, pero en el ninguno de los pacientes con AR tardío. No se detecta expresión de LIR-2, LIR-3 o LIR-7 en tejido control obtenidos de sujetos normales . La tabla 2 presenta los resultados que se obtienen al teñir secciones en serie de muestras de tejido sinovial con anticuerpos específicos para LIR y para raacrófagos, células endoteliales , neutrófilos, mastocitos y linfocitos T CD3+. No se detectan LIR en los linfocitos T CD3+. Como se muestra en la tabla 2, en contraste con la restricción de LIR-2 y LIR-3, la expresión a leucocitos inflamatorios, LIR-7 se expresa de manera variable en neutrófilos, macrofagos, mastocitos, células similares a fibroblastos (determinado por morfología celular) y células endoteliales en el sinovio de pacientes con AR. La distribución celular de LIR-2 y LIR-7 difiere de la que se observa entre pacientes con AR, lo que refleja referencias en la naturaleza del infiltrado de células inflamatorias. Los neutrófilos son la principal fuente celular de LIR-2 en el paciente AR1, pero los macrofagos son la fuente celular principal de LIR-2 en el paciente AR2. Entre los pacientes con AR en general, la expresión de LIR-7 es un poco menor que la de LIR-2 y la distribución celular de LIR-7 es más amplia que la de LIR-2. En el paciente AR1 , LIR-7 se expresa por neutrófilos, macrófagos, tnastocitos y células endoteliales, y en el paciente AR, por macrófagos, células endoteliales y sinoviocitos similares a fibroblastos. Las fuentes celulares de LIR-2 y LIR-7 en todos los pacientes restante con AR son macrófagos, y en menor grado células endoteliales. La expresión limitada de LIR-2 que se observa en OA se encuentra principalmente en macrófagos CD68+. En pacientes con AR, LIR-3 se expresa de manera exclusiva por macrófagos y sinoviocitos similares a fibroblastos. Los anticuerpos de control negativo que coinciden con isotipo no proporcionan inmunot inción en ninguno de los pacientes. Los resultados que se presentan en lo anterior muestran que el sinovio de pacientes con AR temprano muestra expresión elevada de LIR-2 inhibidor, el cual es capaz de reconocer y asociarse con moléculas de CPH clase I. También se observa expresión elevada de LIR-3 en pacientes con AR . La expresión extensa de LIR-7, el cual tiene la capacidad de activar células, se observa también en macrófagos y neutrófilos de pacientes con AR . Además, se observa cierta expresión de LIR-7 en mastocitos y células endotel iales . Se observa poca expresión de LIR en el sinovio de pacientes con 0A( en sujetos control o en dos pacientes con AR de larga duración que es acompañado por fibrosis. Por lo tanto, estos resultados sugieren que los LIR pueden regular la expresión de proteasa y citosina en el infiltrado inflamatorio en AR y de esta manera contribuyen al proceso de formación de paño y destrucción de la articulación .

Tabla 1 (Expresión de receptores similares a inmunogiobulina Ieucocitaria en AR, OA y en sinovio normal Expresión inmunohistoquimica de los LIR (mediana de la cuenta de células/HPF) Sujeto Duración de la Histología LIR-2 LIR-3 LIR-7 enfermedad (años) Artritis reumatoide RA1 2 Infiltración extensa de neutrófilos y números moderados de macrófagos y 39 6 18 mastocitos RA2 5 Infiltración dispersada de macrófagos y áreas pequeñas de agregación de 25 1 13 linfocttos RA3 8 Agregación de macrófagos y linfocitos. Grado moderado de fibrosis con 15 7 8.5 infiltración de mastocitos RA4 8 Fibrosis extensa y proliferación endoteiiai con algunas áreas de infiltración de 5 2 3 macrófagos CD68+ RA5 10 Fibrosis extensa con números pequeños de macrófagos 0 0.5 0.5 RA6 14 Fibrosis extensa con número pequeño de macrófagos 0.5 0.5 0.5 Osteoartritis 0A1 3-5 Infiltración moderada de macrófagos y linfocitos 0.5 1 0 0A2 9 Infiltración moderada de macrófagos y linfocitos. Cantidades limitadas de 0 2.5 0 mastocitos 20 0A3 13 Fibrosis extensa 2 7 1 Controles N1 - 0 0 0 N2 - 0 0 0 N3 - 0 0 0 Tabla 2 Fuentes celulares de LIR-2, LIR-3 y LIR-7 en sinovlo de pacientes con artritis reumatolde y osteoartritis ND, indica que no se realizó debido a la expresión limitada de LIR Sujetos LIR-2 LIR-3 LIR-7 Artritis reumatoide RA1 Neutrófilos Macrófagos Neutrófilos, macrófatos, mastodtos y células endoteliales RA2 Macrófagos Macrófagos y células similares a fibroblastos Macrófagos, células endoteliales, células similares a fibroblastos RA3 acrófagos y células endoteliales Macrófagos y células similares a fibroblastos Macrófagos, mastodtos y células endoteliales RA4 Macrófagos Células similares a fibroblastos y macrófagos Macrófagos y células endoteliales RA5 ND Células similares a fibroblastos Células endoteliales RA6 ND ND Células similares a fibroblastos Osteoartritis OA1 Macrófagos Macrófagos Macrófagos 20 OA2 ND Macrófagos ND OA3 Células similares a fibroblastos Células similares a fibroblastos Células endoteliales Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para tratar a un paciente que tiene artritis reumatoide, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes que modulan la expresión o función de LIR-2 o LIR-3 o LIR-7, o cualquiera de ellas en cualquier combinación. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar al paciente un agente que antagoniza la actividad de LIR-7.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar al paciente un agente que es un agonista de LIR-2.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar al paciente un agente que es un agonista de LIR-3.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar de manera concurrente al paciente un agente de una combinación que se selecciona del grupo que consiste de: un agente que es un agonista de LIR-3 y un agente que antagoniza LIR-7; un agente que es un agonista de LIR-2 y un agente que antagoniza LIR-7; un agente que es un agonista de LIR-2 y un agente que es un agonista de LIR-3; un agente que es un agonista de LIR-2, un agente que es un agonista de LIR-2 y un agente que antagoniza LIR-7.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el antagonista de LIR-7 es un anticuerpo antagonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-7.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el agonista de LIR-2 es un anticuerpo agonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-2.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agonista de LIR-3 es un anticuerpo agonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-3.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es tratado concurrentemente con por lo menos un medicamento adicional que se selecciona del grupo que consiste de un antagonista de TNFa, un antagonista de IL-1, un anticuerpo contra CD4, un medicamento antiinflamatorio no esteroideo, un analgésico y un médicamente antirreumático modificador de la enfermedad.
10. 10. Un método para tratar un paciente que tiene artritis reumatoide, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes que se seleccionan del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal agonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-2, un anticuerpo monoclonal agonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-3 y un anticuerpo monoclonal antagonista que es específicamente inmunorreactivo con LIR-7.