CN115175940A

CN115175940A - Lilrb3抗体分子及其用途

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Publication number: CN115175940A
Application number: CN202180017259.5A
Authority: CN
Inventors: B·弗伦德修斯; 阿里·鲁加尼安; 马克·克拉格
Original assignee: University of Southampton; Bioinvent International AB
Current assignee: University of Southampton; Bioinvent International AB
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2021-02-12
Publication date: 2022-10-11
Also published as: AU2021218982A1; EP4103613A1; BR112022015832A2; JP2023515398A; WO2021160838A1; CA3167424A1; KR20220154686A; US20230070339A1; IL295164A

Abstract

描述了抗LILRB3抗体分子，如激动性抗LILRB3抗体分子，其用于通过人骨髓细胞的重编程来治疗移植排斥或自身免疫。还描述了特异性抗LILRB3抗体分子以及此类抗体分子在医学中的用途，例如在治疗移植排斥、自身免疫性病症或炎性病症中的用途。

Description

LILRB3抗体分子及其用途

技术领域

本发明涉及特异性结合LILRB3(ILT5)的新型抗体分子。本发明还涉及此类新型抗体分子或特异性结合LILRB3(ILT5)的其它抗体分子在治疗移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症中的用途。

背景技术

人白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LILR)家族，也称为人免疫球蛋白样转录物(ITL)，包含调节免疫应答的六个活化性(LILRA1-6)和五个抑制性(LILRB1-5)LILR(1，2)。两种受体亚型均显示两个或四个同源的C-2型免疫球蛋白(Ig)样细胞外结构域，但它们的跨膜区和胞质区不同(3，4)。LILRA具有短的截短的胞质结构域，在其跨膜结构域中具有带电荷的精氨酸残基，允许它们与携带ITAM的FcεR的γ链缔合以传播活化信号级联(5)。相反，LILRB具有含多个ITIM结构域的长胞质结构域，其募集引起抑制性信号传导的磷酸酶，如SHP-1和SHIP-1(3，4)。这些多基因受体位于人染色体19q13.4，表现出显著的等位基因变异，LILRB3(ILT5/CD85a)和LILRB4(ILT3/CD85k)显示至少15种不同的变体(3.6)。

认为抑制性LILRB充当免疫检查点，用于控制和限制明显的免疫应答(1，2)。与此一致，LILRB在抑制性(也称为替代活化或M2)巨噬细胞和耐受性树突状细胞(DC)中的表达增加(7－10)。在单核细胞上，LILRB1(ILT2/CD85j)和LILRB2(ILT4/CD85d)与FcγRI(CD64)的共连接导致SHP-1活化，减少下游磷酸化事件和细胞内钙动员(11)。在与HLAI类(HLA-I)配体连接后，LILRB1和LILRB2防止DC的迁移，并促进其释放抗炎细胞因子(1，12)。类似地，LILRB1在巨噬细胞上与恶性细胞上常见的HLA-I亚基β2-微球蛋白的结合限制了它们的吞噬潜力(13)。LILRB还显示在体外和体内均使DC产生耐受性，随后抑制T细胞应答(7，8，12，14，15)。因此，HLA-G与LILRB1和LILRB2的结合是妊娠期间胎儿－母体界面处的重要免疫抑制途径(16－18)。LILRB1也在NK细胞上表达并且已经被报道抑制NK细胞的细胞毒性(19)。

虽然小鼠不表达LILRB，但是直向同源配对的Ig样受体(PIR)-B调节免疫系统的各种臂。PIR-B通过与CD8细胞上表达的I类MHC相互作用调节DC对细胞毒性T淋巴细胞的引发(20)；并负面影响嗜中性粒细胞和巨噬细胞中的整联蛋白信号传导(21)。此外，PIR-B调节骨髓源性抑制细胞(MDSC)的分化，这有助于肿瘤进展(22)。与PIR-B类似，HLA-G和LILRB1之间的相互作用通过有效MDSC的扩增支持同种异体移植物植入(23，24)。

在抑制性LILRB中，含有4个细胞内ITIM基序的LILRB3(ILT5/LIR3/CD85a)由于其对骨髓细胞的相对限制和在骨髓细胞上的高表达而呈现有吸引力的免疫调节靶标(2)。尽管在二十世纪九十年代末发现了它，但由于缺乏特异性试剂和模型系统，它的确切功能和免疫调节潜力尚未完全确定。

发明内容

为了研究LILRB3的潜在免疫调节能力，使用BioInvent International AB公司专有的

和F.I.R.S.T^TM平台技术生成一组LILRB3特异性单克隆抗体(mAb)。抗体与Ig样结构域2和4中的两个主要但不连续的表位结合。LILRB3在原代人单核细胞和巨噬细胞上的连接导致表型和功能改变以及体外免疫应答的有效抑制，包括调理过的癌细胞的吞噬作用和T细胞增殖的显著降低。重要的是，在人源化小鼠中靶向LILRB3诱导了耐受性状态，并允许同种异体人淋巴瘤细胞的植入增强。我们的发现揭示了人LILRB3的免疫调节功能，并鉴定了其作为重要的骨髓免疫检查点的潜力，在移植、感染和自身免疫中具有潜在的作用。

导致本发明的工作包含以下：

·一组人单克隆抗LILRB3抗体激动活性的生成和表征，

·证明LILRB3在人骨髓细胞上的连接诱导了抗炎表型，导致随后的T细胞增殖抑制

·证明LILRB3在人巨噬细胞上的连接抑制了调理过的靶细胞的吞噬作用

·证明激动性抗LILRB3抗体在人源化小鼠中诱导了耐受性，从而允许成功植入同种异体细胞。

因此，本发明涉及特异性结合LILRB3(ILT5)的抗体分子，其用于治疗移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症。

本发明还涉及特异性结合LILRB3(ILT5)的特异性抗体分子，其选自由包含CDRVH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3中的1至6个的抗体分子组成的组，

其中如果存在的话，VH-CDR1选自由以下组成的组：SEQ.ID.NO:1、9、17和25；

其中如果存在的话，VH-CDR2选自由以下组成的组：SEQ.ID.NO:2、10、18和26；

其中如果存在的话，VH-CDR3选自由以下组成的组：SEQ.ID.NO:3、11和19和27；

其中如果存在的话，VL-CDR1选自由以下组成的组：SEQ.ID.NO:4、12、20和28；

其中如果存在的话，VL-CDR2选自由以下组成的组：SEQ.ID.NO:5、13、21和29；以及

其中如果存在的话，VL-CDR3选自由以下组成的组：SEQ.ID.NO:6、14、22和30。

本发明还涉及编码以上抗体分子中的至少一种抗体分子的分离的核苷酸序列。

本发明还涉及包含以上核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列的质粒。

本发明还涉及包含上述核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列或上述质粒中的至少一种质粒的细胞。

本发明还涉及用于医学的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞。

本发明还涉及用于治疗移植排斥的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞。

本发明还涉及用于治疗自身免疫性病症(也称为自身免疫)的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞。

本发明还涉及用于治疗炎性病症的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞。

本发明还涉及上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞用于治疗移植排斥的用途。

本发明还涉及上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞用于治疗自身免疫性病症的用途。

本发明还涉及上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞用于治疗炎性病症的用途。

本发明还涉及药物组合物，其包含或由上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞，或任选地药学上可接受的稀释剂、载体、媒介物和/或赋形剂中的至少一种组成。这种药物组合物可用于治疗移植排斥。这种药物组合物还可以或可替代地用于治疗自身免疫性病症。这种药物组合物还可以或可替代地用于治疗炎性病症。

本发明还涉及用于治疗患者移植排斥的方法，其包含向患者施用治疗有效量的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞中的至少一种。

本发明还涉及用于治疗患者自身免疫性病症的方法，其包含向患者施用治疗有效量的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞中的至少一种。

本发明还涉及用于治疗患者炎性病症的方法，其包含向患者施用治疗有效量的上述抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞中的至少一种。

本发明还涉及抗体分子、供使用的抗体分子、分离的核苷酸序列、供使用的分离的核苷酸序列、质粒、供使用的质粒、细胞、供使用的细胞、用途、药物组合物和治疗方法，如本文参考所附说明书、实例和/或附图所述。

具体实施方式

因此，本发明涉及特异性结合LILRB3(ILT5)的抗体分子。在本文中，术语“特异性结合LILRB3的抗体分子”可以与术语“抗LILRB3抗体分子(或分别“特异性结合ILT5的抗体分子”和“抗ILT5抗体分子)互换使用，是指特异性结合LILRB3(ILT5)的细胞外结构域中的至少一个表位的抗体分子。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学的技术人员容易理解的术语。

评估蛋白质结合的方法是生物化学和免疫学的技术人员已知的。本领域技术人员将理解，这些方法可用于评估抗体与靶标的结合；以及这些相互作用的相对强度，或特异性，或抑制，或预防，或减少。可用于评估蛋白质结合的方法的实例是例如免疫测定、Biacore、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术(FACS)。针对关于抗体特异性的讨论，参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第二版,雷文出版社(Raven Press),纽约(New York)第332-336页(1989)。

根据本发明，表达与抗体分子结合的LILRB3的靶细胞可以是任何LILRB3表达细胞，如人骨髓细胞，包括单核细胞和巨噬细胞。

在不受任何特定机制约束的情况下，一个假设是根据本发明的抗体分子与LILRB3结合的作用可以是导致ITIM结构域磷酸化的作用。LILRB3含有四个细胞内ITIM。这反过来又抑制细胞活化并诱导骨髓细胞产生免疫抑制基因。这从下面示出人单核细胞的RNAseq分析的实例中显而易见。

在一些实施例中，除了与LILRB3结合之外，通过与Fcγ受体结合的抗体分子可以提高激动活性。在一些此类实施例中，激动性非阻断性LILRB3抗体分子对抑制性Fcγ受体的结合亲和力高于对活化Fcγ受体的结合亲和力。以与活化Fcγ受体相比对抑制性Fcγ受体的更高的亲和力，包含了以与单独活化Fcγ受体相比，例如，与FcγRIIA、FcγRIIIA和FcγRI相比与抑制性Fcγ受体的更高的亲和力结合的变体的含义。

小鼠与人FcγR系统之间的相对高的同源性解释了物种之间保守的FcγR介导的机制的许多一般方面。然而，小鼠和人IgG亚类在其对其同源FcγR的亲和力方面有所不同，使其在将小鼠系统中的FcγR介导的观察转化为基于人IgG的治疗剂以选择示出与人活化与抑制性FcγR的适当结合的抗体、抗体亚类和/或经工程化的亚类变体时非常重要。人抗体分子对单独人FcγR的亲和力和/或亲合力可以使用表面等离子体共振(SPR)来确定。

在一些实施例中，与Fc受体的结合通过激动性抗体分子的Fc区与Fc受体之间的正常相互作用发生。在一些此类实施例中，抗体分子是具有与Fcγ受体的Fc区结合的IgG。在一些此类实施例中，抗LILRB3抗体是人IgG2同种型，其对人抑制性FcγRIIB和人活化性FcγRIIA和FcγRIIIA具有相似的中间亲和力，但不与人活化性FcγRI有效结合。在一些实施例中，抗LILRB3抗体是人IgG1同种型，其与IgG2相比以更高亲和力结合FcγRIIB，但也以更高亲和力结合活化的人活化性FcγRIIA、FcγRIIIA，并且另外以高亲和力结合活化的FcγRI。在其它实施例中，抗LILRB3抗体是经工程化以增强与FcγRIIB的结合的人IgG，例如“SELF”突变(Chu等人，“通过CD19和FcγRIIb与经Fc工程化的抗体的共连接抑制原代人B细胞的B细胞受体介导的活化(Inhibition of B cell receptor-mediated activation ofprimary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies)”《分子免疫学(Mol Immunol)》2008年9月；45(15):3926-33)，和/或被工程化为用于相对增强与活化FcγR，例如V9或V11突变R相比与FcγRIIB的结合(Mimoto等人，《与FcγRIIa^R131和FcγRIIa^H131相比具有选择性增强的FcγRIIb结合的工程化抗体Fc变体(Engineered antibody Fc variant with selectively enhanced FcγRIIb binding over both FcγRIIa^R131 and FcγRIIa^H131)》《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng Des Sel.)》2013年10月；26(10):589–598。)。在针对活化和抑制性FcγR人源化的动物中，被工程化为用于增强与抑制性FcγRIIB的结合或特异性地增强特异性地与抑制性FcγRIIB的而不是活化FcγRIIA的结合亲和力的此类IgG变体已经被示出为增加CD40激动剂抗体CP-870,893的体内激动剂活性和治疗活性(Dahan等人，2016，“激动性、人抗CD40单克隆抗体的治疗活性需要选择性FcγR连接(Therapeutic Activity ofAgonistic,Human Anti-CD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcgammaREngagement)”，《癌细胞(Cancer Cell)》，29:820-31)。

除了LILRB3之外，激动性抗体分子可以结合的Fc受体是在如巨噬细胞、单核细胞、MDCS、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞或树突细胞等骨髓源性细胞的表面上，或在如NK细胞、B细胞或某些T细胞等淋巴细胞的表面上发现的受体。

在其它实施例中，抗体分子可以包含与Fcγ受体的结合降低的修饰的Fc区，如IgG1抗体分子的去糖基化或无糖基化变体。此无糖基化可以例如通过抗体链中的位置297(N297X)中的天冬酰胺的氨基酸取代来实现。所述取代可以利用谷氨酰胺(N297Q)、或用丙氨酸(N297A)、或用甘氨酸(N297G)、或用天冬酰胺(N297D)或通过丝氨酸(N297S)。其它取代例如已由Jacobsen FW等人,《生物化学杂志》2017,292,1865-1875进行了描述(参见例如表1)；此类另外的取代包含L242C、V259C、A287C、R292C、V302C、L306C、V323C、I332C和/或K334C。

抗体是免疫学和分子生物学领域的技术人员众所周知的。通常，抗体包括两条重(H)链和两条轻(L)链。在本文中，有时将此完整抗体分子称为全尺寸(full-size)或全长(full-length)抗体。抗体的重链包括一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，并且抗体的分子轻链包括一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。可变结构域(有时统称为F_V区)与抗体的靶标或抗原结合。每个可变结构域包括三个环，所述环被称为互补决定区(CDR)，其负责靶标结合。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能。根据抗体或免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列，所述抗体或免疫球蛋白可以被分配到不同类别。存在免疫球蛋白的五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且在人中，这些类别中的几个类别被进一步划分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。

抗体的另一部分是Fc区(另外被称为片段可结晶结构域)，其包括所述抗体的重链中的每条重链的恒定结构域中的两个恒定结构域。如上文所提及的，Fc区负责抗体与Fc受体之间的相互作用。

如本文所使用的术语抗体分子涵盖全长或全尺寸抗体以及全长抗体的功能片段和此类抗体分子的衍生物。

全尺寸抗体的功能片段具有与对应全尺寸抗体相同的抗原结合特性并且包含与对应全尺寸抗体相同的可变结构域(即，VH和VL序列)和/或相同的CDR序列。功能片段不总是含有对应全长抗体的所有六个CDR。应当理解的是，含有三个或更少个CDR区(在一些情况下，甚至仅单个CDR或其一部分)的分子能够保留一个或多个CDR所衍生的抗体的抗原结合活性。例如，在Gao等人，1994，《生物化学杂志》，269:32389-93中，描述了整个VL链(包含所有三个CDR)对其底物具有高亲和力。

含有两个CDR区的分子描述于例如，Vaughan和Sollazzo 2001,《组合化学与高通量筛选(Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening)》，4:417-430中。在第418页(右栏—3“设计策略(Our Strategy for Design)”)中，描述了仅包含散布在框架区内的H1和H2 CDR高变区的微抗体。所述微抗体被描述为能够与靶标结合。Vaughan和Sollazzo引用了以下Pessi等人，1993，《自然》，362:367-9和Bianchi等人，1994，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，236:649-59，并且所述文献更详细地描述了H1和H2微抗体和其性质。在Qiu等人，2007，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，25:921-9中，证明了由两个连接的CDR组成的分子能够结合抗原。Quiocho 1993，《自然》，362:293-4提供了“微抗体”技术的总结。Ladner 2007，《自然生物技术》，25:875-7指出，含有两个CDR的分子能够保留抗原结合活性。

含有单个CDR区的抗体分子描述于例如，Laune等人，1997，《生物化学杂志》，272:30937-44中，其中证明了衍生自CDR的一系列六肽显示出抗原结合活性，并且注意到完整的单个CDR的合成肽显示出强结合活性。在Monnet等人，1999，《生物化学杂志》，274:3789-96中，示出了一系列12聚体肽和相关框架区具有抗原结合活性，并且指出CDR3样肽单独能够结合抗原。在Heap等人，2005，《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》，86:1791-1800中，报道了“微抗体”(含有单个CDR的分子)能够结合抗原，并且示出来自抗HIV抗体的环状肽具有抗原结合活性和功能。在Nicaise等人，2004，《蛋白质科学(Protein Science)》，13:1882-91中，示出了单个CDR可以赋予抗原结合活性和对其溶菌酶抗原的亲和力。

因此，具有五个、四个、三个或更少的CDR的抗体分子能够保留其所衍生的全长抗体的抗原结合性质。

抗体分子也可以是全长抗体的衍生物或此抗体的片段。当使用衍生物时，所述衍生物应当具有与对应全长抗体相同的抗原结合特性，在某种意义上所述衍生物与靶标上的和全长抗体相同的表位结合。

因此，如本文所使用的术语“抗体分子”包含所有类型的抗体分子以及其功能片段和其衍生物，包含：单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人来源的抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、Fab片段、F(ab')₂片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗体重链、抗体轻链、抗体重链的同二聚体、抗体轻链的同二聚体、抗体重链的异二聚体、抗体轻链的异二聚体、此类同二聚体和异二聚体的抗原结合功能片段。

进一步地，如本文所使用的术语“抗体分子”包含所有类别的抗体分子和功能片段，包含：IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD和IgE，除非另有说明。

在一些实施例中，抗体分子是人抗体分子、人源化抗体分子或人来源的抗体分子。在本文中，人源化抗体分子是指已经被修饰以增加其与人抗体的相似性的原始非人抗体。人源化抗体分子可以例如最初是鼠抗体或lama抗体。在本文中，人源的抗体分子是指已经被修饰的原始人抗体分子。

在一些实施例中，抗体分子是IgG抗体。

在一些实施例中，抗体分子是野生型IgG抗体。

在一些实施例中，抗体分子是Fc工程化IgG抗体，如上述抗体，包括无糖基化或去糖基化的IgG抗体分子，例如包括297位天冬酰胺取代的那些抗体分子，例如N297Q或N297A取代。

在一些实施例中，抗体分子是人IgG1抗体。人IgG1抗体对应于鼠IgG2a抗体，因此如果要使用人IgG1的鼠替代物，例如用于体内研究，则使用鼠IgG2a形式。

在一些实施例中，抗体分子是人IgG2抗体。人IgG2抗体对应于鼠IgG3抗体，因此如果要使用人IgG2的鼠替代物，例如用于体内研究，则使用鼠IgG3形式。

在一些实施例中，抗体分子是人IgG4抗体。人IgG4抗体对应于鼠IgG1抗体，因此如果要使用人IgG4的鼠替代物，例如用于体内研究，则使用鼠IgG1形式。

Fc修饰可以在人和鼠抗体分子之间有所不同；例如，鼠N297A IgG2a抗体分子可用作人N297Q IgG1抗体分子的替代物。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体是单克隆抗体。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体是多克隆抗体。

如上所述，本发明涵盖了不同类型和形式的抗体分子，并且是免疫学领域技术人员已知的。众所周知的是，用于治疗目的的抗体通常被修饰抗体分子的性质的另外的组分修饰。

因此，包含了本文所述的抗体分子，或如本文所述的使用抗体分子(例如，单克隆抗体分子和/或多克隆抗体分子和/或双特异性抗体分子)包括可检测部分和/或细胞毒性部分。

“可检测部分”包含来自包括以下的组的一种或多种：酶；放射性原子；荧光部分；化学发光部分；生物发光部分。可检测部分允许抗体分子在体外和/或体内和/或离体可视化。

“细胞毒性部分”包含放射性部分和/或酶，例如其中酶是胱天蛋白酶和/或毒素，例如其中毒素是细菌毒素或毒液；其中细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。

进一步包含了抗体分子可以呈分离的形式和/或经纯化的形式，和/或可以是聚乙二醇化的。聚乙二醇化是向分子，诸如抗体分子或衍生物，添加聚乙二醇聚合物以修饰其行为，例如以通过增加其水动力学尺寸来延长其半衰期，从而防止肾清除的方法。

如上文所讨论的，抗体的CDR与抗体靶标结合。向本文所描述的每个CDR分配氨基酸符合根据以下的定义：Kabat EA等人，1991，“免疫学上所关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”第五版,NIH出版号：91-3242,第xv-xvii页。

如技术人员将了解的，还存在用于向每个CDR分配氨基酸的其它方法。例如，国际免疫遗传学信息系统(International ImMunoGeneTics information system)(IMGT(R))(http://www.imgt.org/，以及Lefranc和Lefranc“免疫球蛋白概况(The ImmunoglobulinFactsBook)”，由学术出版社(Academic Press)出版，2001)。

在一些实施例中，特异性结合LILRB3的抗体分子包含下表1中列出的VH-CDR1序列之一。

在一些实施例中，特异性结合LILRB3的抗体分子包含下表1中列出的VH-CDR2序列之一。

在一些实施例中，特异性结合LILRB3的抗体分子包含下表1中列出的VH-CDR3序列之一。

在一些实施例中，特异性结合LILRB3的抗体分子包含下表1中列出的VL-CDR1序列之一。

在一些实施例中，特异性结合LILRB3的抗体分子包含下表1中列出的VL-CDR2序列之一。

在一些实施例中，特异性结合LILRB3的抗体分子包含下表1中列出的VL-CDR3序列之一。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体分子是选自由抗体分子组成的组的抗体分子，其中可变重链(VH)中的三个CDR选自由以下组成的组：

SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2和SEQ.ID.NO:3；

SEQ.ID.NO:9、SEQ.ID.NO:10和SEQ.ID.NO:11；

SEQ.ID.NO:17、SEQ.ID.NO:18和SEQ.ID.NO:19；以及

SEQ.ID.NO:25、SEQ.ID.NO:26和SEQ.ID.NO:27。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体分子是选自由抗体分子组成的组的抗体分子，其中可变轻链(VL)中的三个CDR选自由以下组成的组：

SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5和SEQ.ID.NO:6；

SEQ.ID.NO:12、SEQ.ID.NO:13和SEQ.ID.NO:14；

SEQ.ID.NO:20、SEQ.ID.NO:21和SEQ.ID.NO:22；以及

SEQ.ID.NO:28、SEQ.ID.NO:29和SEQ.ID.NO:30。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体分子是选自由包含选自由以下组成的组的VH的抗体分子组成的组的抗体分子：SEQ.ID.NO:7、15、23和31。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体分子是选自由包含选自由以下组成的组的VL的抗体分子组成的组的抗体分子：SEQ.ID.NO:8、16、24和32。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体分子包含具有以下的CH：SEQ.ID.NO:41。

在一些实施例中，抗LILRB3抗体分子包含具有以下的CL：SEQ.ID.NO:42。

表1：抗LILRB3抗体分子的特异性序列(在VH和VL序列中，CDR序列以粗体文本标记)

如实例1中详细解释的，上表1中的序列都是人源的并衍生自

文库。

在一些实施例中，特异性结合本文所述LILRB3的抗体分子还可以包含下表2中列出的恒定区(CH和/或CL)中的一者或两者。

表2：

上表2中的CH(SEQ.ID.NO:33)和(SEQ.ID.NO:34)序列是人源的。

如上所述，在一些实施例中，抗体分子结合人LILRB3)。在一些此类实施例中，优选抗体分子与人LILRB3强烈结合，即它们具有低EC50值。

在一些实施例中，抗体分子结合人LILRB3和食蟹猴LILRB3(cmLILRB3或cynoLILRB3)是有利的。与在食蟹猴(也称为食蟹猕猴(crab-eating macaque)或食蟹猴(Macacafascicularis))细胞上表达的LILRB3的交叉反应性可能是有利的，因为这使得能够在不必使用替代抗体的情况下对抗体分子进行动物测试，特别关注耐受性。

在一些实施例中，需要的是使用替代抗体测试小鼠体内的相关体内模型中的抗体分子的功能活性。为了确保人体内的抗体分子的作用与小鼠体内的替代抗体的体内结果之间的可比性，必要的是选择具有与人抗体分子相同的体外特性的功能等效的替代抗体。

在一些实施例中，本发明或根据本发明使用的抗体分子是能够与本文提供的特异性抗体竞争，例如能够与包含选自以下组成的组的VH的抗体分子竞争的抗体分子：SEQ.ID.NO:7、15、23和31；和/或选自由SEQ.ID.NO:8、16、24和32组成的组的VL，用于结合LILRB3。

“能够竞争”是指竞争抗体能够抑制或以其它方式至少部分干扰本文定义的抗体分子与特异性靶LILRB3的结合。

例如，这种竞争性抗体分子能够抑制本文所述的抗体分子与LILRB3的结合至少约10％；例如至少约20％，或至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％，或约100％。

可以通过本领域的技术人员众所周知的方法来确定竞争性结合，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)。

可以使用ELISA测定来评价表位修饰或阻断抗体。适用于标识竞争性抗体的另外的方法公开于《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，Harlow和Lane中，所述文献通过引用并入本文(例如，参见第567页到第569页、第574页到第576页、第583页以及第590到第612页，1988，冷泉港实验室(CSHL)，纽约(NY)，ISBN 0-87969-314-2)。

在一些实施例中，感兴趣的是不使用抗LILRB3抗体分子本身，而是使用编码这种抗体分子的核苷酸序列。因此，本发明包括编码上述抗LILRB3抗体分子的核苷酸序列。

上述抗体分子和核苷酸序列，或其它抗LILRB3抗体分子或编码此类抗体分子的核苷酸序列可用于医学中，然后此类抗体分子和/或核苷酸序列可以包括在药物组合物中，如下文进一步讨论的。

抗LILRB3抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物可用于治疗移植排斥，如下文进一步讨论的。

抗LILRB3抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物可用于治疗自身免疫性病症，如下文进一步讨论的。

抗LILRB3抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物可用于治疗炎性病症，如下文进一步讨论的。

抗LILRB3抗体分子和/或核苷酸序列可用于制备用于治疗移植排斥的药物组合物。

抗LILRB3抗体分子和/或核苷酸序列可用于制备用于治疗自身免疫性病症的药物组合物。

抗LILRB3抗体分子和/或核苷酸序列可用于制备用于治疗炎性病症的药物组合物。

抗LILRB3抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物可用于治疗患者的移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症，其中向患者施用治疗有效量的抗LILRB3抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物。

可如本文所公开治疗的移植排斥的实例包括与器官移植物(organ transplant)或器官移植(organ transplantation)相关的排斥，如在接受者患有影响移植中被替换的器官的疾病或损伤的情况下，肾、肝、心脏、肺、胰腺和肠从供体到接受者的移植。可如本文所公开治疗的移植排斥的另一个实例包括同种异体移植物的排斥，其中从匹配的供体收集干细胞，如造血干细胞(HSC)并移植到患者体内以抑制疾病并恢复患者的免疫系统。

至少在一些实施例中，移植的接受者应在移植前通过施用激动性LILRB3 mAb进行预处理。在一些实施例中，移植的接受者在移植后还应接受激动性LILRB3 mAb的治疗。

本文所述的抗体分子、药物组合物和治疗可用于预防、治疗或最小化接受者对新器官或其它移植物的排斥。

可如本文所公开治疗的自身免疫性病症或自身免疫的实例包括乳糜泻、1型糖尿病、结节病、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜、阿狄森氏病、类风湿关节炎(RA)、强直性脊柱炎、多肌炎(PM)、皮肌炎(DM)和多发性硬化(MS)。

可如本文所公开治疗的炎性病症的实例包括慢性炎性病症(如类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化(MS))和急性炎性病症(如败血症)。

医学领域的技术人员将理解，药物可以用不同添加剂来修饰，例如以改变身体吸收药物的速率；并且药物可以以不同形式修饰，例如以允许到身体的特定施用途径。

因此，我们包括本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、媒介物和/或佐剂组合到药物组合物中。在此上下文中，术语药物组合物与术语药物制剂、药物调配物、治疗组合物、治疗制剂、治疗调配物和治疗实体可互换使用。

本文所述的药物组合物可以包含抗体分子、核苷酸序列、质粒或细胞，或在一些实施例中由抗体分子、核苷酸序列、质粒或细胞组成。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物可以由质粒组成或包括质粒，所述质粒包括编码上述抗体分子或包括上述核苷酸序列的核苷酸序列。

本发明还涵盖其它治疗方式或药物的“形状”，如抗体药物偶联物、融合蛋白等，以及包括这类治疗方式的药物组合物。

本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物可以适合于肠胃外施用，包括水性和/或非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，和/或缓冲剂，和/或抑菌剂，和/或使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和/或增稠剂。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中呈现并且可以在冷冻干燥(即冻干)条件下储存，仅需要在立即使用之前添加无菌液体载体，例如注射用水。

可由前述种类的无菌粉末和/或颗粒和/或片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

对于人类患者的肠胃外施用，抗LILRB3抗体分子的每日剂量水平通常为患者体重1mg/kg至20mg/kg，或在一些情况下甚至高达100mg/kg，以单剂量或分剂量施用。在特殊情况下，例如在结合长期施用的情况下，可使用较低剂量。在任何情况下，医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且所述实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是一般情况的实例。当然，可以存在个别情况，其中更高或更低的剂量范围是理所当然的，并且此剂量处于本发明的范围内。

通常，本文所述的包含抗体分子的药物组合物(或药物)将含有浓度为大约2mg/ml至150mg/ml之间或大约2mg/ml至200mg/ml之间的抗LILRB3抗体分子。

通常，在人类中，口服或肠胃外施用本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物是最方便的优选途径。对于兽医用途，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物根据正常兽医实践以适当可接受的制剂施用，并且兽医将确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了一种包含有效治疗各种病状(如上文和下文进一步描述)的量的本发明的抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞的药物制剂。优选地，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物适于通过选自包含以下的组的途径递送：静脉内(IV或i.v.)；肌内(IM或i.m.)或皮下(SC或s.c.)。

本发明还包括本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物，其包含本发明的靶结合分子或部分的药学上可接受的酸或碱加成盐。用于制备可用于本发明的上述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的酸，即含有药理学上可接受的阴离子的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸酯)]盐等。也可使用药学上可接受的碱加成盐来产生药学上可接受的盐形式的根据本发明的药剂。可用作试剂以制备在性质上为酸性的本发明药剂的药学上可接受的碱盐的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的那些。此类无毒碱盐包括但不限于：衍生自此类药学上可接受的阳离子的碱盐，诸如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)的碱盐；铵或水溶性胺加成盐，诸如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)；以及低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其它碱盐，等等。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒和/或细胞可冻干以储存并在使用前在合适的载体中重建。可以采用任何合适的冻干方法(例如，喷雾干燥、滤饼干燥(cakedrying))和/或重建技术。本领域的技术人员将理解，冻干和重建可能导致不同程度的抗体活性损失(例如，利用常规免疫球蛋白，IgM抗体的活性损失往往比IgG抗体更大)，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。在一个实施例中，当再水化时，冻干的(冷冻干燥的)多肽结合部分损失的活性(在冻干之前)不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。

本文所述的抗LILRB3抗体分子、核苷酸序列和药物组合物可用于治疗受试者或患者的移植排斥或自身免疫。在本文中，术语受试者和患者可互换使用。

如本文所用的术语“患者”(或受试者)是指已被诊断为患有移植排斥或自身免疫和/或表现出患有移植排斥或自身免疫的症状的包括人在内的动物。

在一些实施例中，患者(或受试者)是已被诊断为患有移植排斥或自身免疫的包括人在内的动物。在一些实施例中，患者(或受试者)是包括人在内的动物，其将进行移植并因此处于移植排斥的风险中；本文讨论的治疗然后作为预防性治疗或出于预防性目的而进行。

在一些实施例中，患者(或受试者)是已被诊断为患有移植排斥或自身免疫和/或表现出移植排斥或自身免疫的症状的包括人在内的哺乳类动物或非哺乳类动物。

治疗可以作为一个疗程施用，也就是说治疗剂在一段时间内施用。疗程的时间长度将取决于许多因素，其可以包括所施用的治疗剂的类型、所治疗的疾病或病状的类型、所治疗的疾病或病状的严重程度以及患者的年龄和健康状况，以及其它原因。

“治疗期间”包括了，患者当前正在接受一系列治程和/或正在接受治疗剂、和/或正在接受一系列治疗剂。

附图说明

在下文的实例中，参考以下附图：

图1.抗人LILRB3的全人mAb的生成。图1A：筛选生成的LILRB3克隆。进行FMAT，并针对LILRB3靶和LILRB1非靶转染的细胞筛选scFv克隆。用较浅颜色的靶特异性scFv和较深颜色的非靶scFv计算MFI。图1B：通过流式细胞术筛选LILRB3 mAb。将外周血单核细胞(PBMC)或LILR转染的CHO-S细胞与His-标记的scFv上清液一起孵育，随后进行抗His-AF647染色。当使用转染的CHO-S细胞时，LILRB1和LILRB2转染的CHO-S细胞用作LILRB3的非靶标。使用TIBCO Spotfire软件将抗体克隆与门控单核细胞和靶转染的CHO-S细胞进行比较，LILRB3特异性克隆以浅灰色突出显示，非特异性克隆以深灰色突出显示，无关同种型对照以灰色突出显示。图1C：LILRB3克隆抗人LILR转染的2B4细胞的特异性。通过流式细胞术测试LILRB3 mAb针对用指定LILR家族成员转染的细胞；提供了代表性克隆(A16)。图1D和E：通过流式细胞术测试LILRB克隆对原代细胞的特异性。PBMC(图1D)或全血(图1E)用APC标记的LILRB3(克隆A16)或hIgG1同种型以及所示的各种白细胞表面标志物染色。直方图是多个供体：单核细胞和B细胞(n＝12)、T细胞和NK细胞(n＝12)和嗜中性粒细胞(n＝6)的代表性图。

图2.LILRB3抗体的表征。图2A：通过SPR评估LILRB3 mAb亲和力。固定LILRB3-hFc重组蛋白，各种LILRB3 mAb流过芯片。使用Biacore^TMT100评估软件计算KD值。示出了代表性的LILRB3克隆。图2B：生成的mAb交叉阻断LILRB3 mAb结合的能力(商业LILRB3mAb；(克隆222821，R&D Systems公司，英国))。将PBMC用未缀合的LILRB3抗体克隆染色，随后用直接缀合的市售LILRB3 mAb染色并通过流式细胞术分析；如图所示，显示了代表性克隆。同种型对照(iso ctrl)用灰色阴影表示，单独的克隆222821用黑色表示，与所示LILRB3克隆组合用灰色线表示。图2C：LILRB3结构域表位作图。用WT LILRB3(全长细胞外部分)、LILRB3-D1-3、LILRB3-D1-2或LILRB3-D1转染的HEK293F细胞用LILRB3克隆染色，然后用抗hIgG-PE二抗染色。示出了生成的结构域构建体和每个构建体的限制酶切消化的示意图。示出了与WT(D4)、D3、D2和D1表达细胞差异结合的两个代表性克隆的染色的直方图，如图所示(n＝3个独立实验)。图2D：LILRB3 2B4报告细胞用10μg/ml LILRB3抗体处理过夜以评估激动作用或拮抗作用。然后通过流式细胞术测量GFP表达；示出了代表性克隆。

图3.LILRB3连接调节T细胞活化和增殖。在存在或不存在同种型对照(iso ctrl)或LILRB3 mAb(10μg/ml)的情况下用针对人CD3和CD28的抗体刺激CFSE标记的PBMC，并在3至5天后通过CFSE稀释测量增殖。图3A：评估处理后的T细胞活化和增殖。培养物中PBMC刺激后的光学显微镜图像。通过CFSE稀释评估CD8+T细胞增殖；示出了代表性直方图。图3B：经SDS-PAGE证实，LILRB3 mAb通过PNGase处理去糖基化(Degly)；示出了代表性克隆。图3C：评估去糖基化LILRB3 mAb对T细胞增殖的影响。通过流式细胞术评估用各种LILRB3 mAb处理的CD8+T细胞的CFSE稀释度。数据相对于抗CD3/CD28处理的样品归一化，平均值用实线表示；示出了代表性克隆。进行双尾配对T检验，星号表示与iso ctrl相比的显著差异水平(***p<0.005)；n＝13至20个独立供体(每个点代表单个供体)。

图4.LILRB3连接调节巨噬细胞吞噬作用。图4A：人MDM用抗CD14和抗LILRB3(A16)染色并通过流式细胞术进行分析。图4B：在与CFSE⁺利妥昔单抗(rituximab)调理过的靶细胞共培养之前，用去糖基化同种型对照(iso ctrl)或LILRB3 mAb(10μg/ml)处理MDM；吞噬作用被定义为双阳性的门控活细胞(CD16⁺CFSE⁺细胞)的数量，使用以下等式作为总MDM(CD16⁺细胞)的百分比：

(双阳性MDM/总MDM)x 100＝％阳性MDM

图4C：去糖基化的LILRB3 mAb对吞噬作用的影响。每个供体一式三份进行，平均值用实线表示(n＝4至6个健康供体)；示出了代表性克隆。进行双尾配对T检验，星号表示与同种型对照相比的显著差异水平(*p<0.05，***p<0.0005)。图4D：通过共聚焦显微镜评估去糖基化的LILRB3 mAb对吞噬作用的影响。LILRB3处理的MDM(灰色)与CFSE标记的B细胞(浅灰色)共培养，固定在4％PFA中并用生物素化WGA染色膜糖蛋白。然后将细胞与二级链霉抗生物素蛋白缀合的AF635一起孵育，并通过共聚焦显微镜进行分析。

图5.LILRB3连接诱导体内耐受性。生成完全重建的人源化小鼠(≥50％循环的hCD45+白细胞)，并在CD14+骨髓细胞上证实人LILRB3的表达。图5A：示出了hCD45+骨髓hCD14⁺骨髓细胞上LILRB3表达的代表性流式细胞术直方图；同种型对照为纯深灰色，LILRB3为纯浅灰色。图5B：在第0天和第4天分别用200μg LILRB3 mAb(克隆A1)或同种型匹配的(hIgG1)对照mAb静脉内和腹膜内(i.p.)注射人源化小鼠。在第7天，用1x10⁷非自体荧光素酶⁺人淋巴瘤细胞腹膜内注射小鼠。使用IVIS成像仪随时间监测淋巴瘤细胞生长，示出了来自3个独立实验的代表性图像(n＝3只小鼠/组)。

图6.人LILRB3连接重新编程人原代骨髓细胞。用同种型对照(iso ctrl)或人LILRB3 mAb(克隆A1)处理新鲜分离的人外周CD14⁺单核细胞。图6A：处理后的单核细胞形态。在培养物中用所示mAb过夜处理新鲜分离的CD14⁺单核细胞后的光学显微镜图像。图6B：LILRB3处理的单核细胞的转录组分析。在mAb处理(约18小时)后从细胞提取RNA并进行RNA测序。左图描绘了与iso ctrl处理的细胞相比显著上调的基因列表，右图描绘了显著下调的基因(n＝4；每行代表单个供体)。图6C：LILRB3在原代人CD14⁺单核细胞上的连接诱导M2极化基因。GSEA图分别示出了LILRB3处理的单核细胞中M2极化基因相对于同种型对照的显著富集。UP；上调，NES；归一化富集得分＝-1.68；FWER；家族模样差别率p<0.001。图6D：在单核细胞上LILRB3连接后选择的基因的qPCR分析。将数据相对于GAPDH mRNA水平归一化，并相对于同种型对照处理的单核细胞的水平标准化。将倍数差异数据转化为log10。使用Bonferroni多重比较检验进行单向ANOVA，n＝3个独立供体(**p<0.005，***p<0.0005)。图6E：GSEA分析示出了与“IFN-γ”(NES＝-2.17；FWER p<0.001)、“IFN-α”(NES＝-2.3；FWER p<0.001)和“同种异体移植排斥”(NES＝-1.58；FWER p＝0.14)信号元件呈负相关且与“氧化磷酸化”呈正相关(NES＝2；FWER p<0.001)。图6F：示意图显示了在APC上连接后LILRB3的免疫抑制功能。

实例

现在将描述具体的非限制性实例，其体现本发明的某些方面。

材料和方法

伦理声明

根据机构指南、赫尔辛基宣言和美国卫生和人类服务部关于实验动物护理和使用指南，对人样品和小鼠进行所有研究。麻省理工学院(MIT)动物护理委员会审查并批准了本文所述的研究。所有人样品(成人外周血和胎儿肝脏)由第三方在知情同意的情况下匿名收集并购买用于研究。对于人外周血，南安普敦大学医院国家医疗服务信托(SouthamptonUniversity Hospitals NHS Trust)获得了使用临床样品的伦理批准；提供知情同意书后，由南安普敦和西南汉普郡研究伦理委员会提供。作为LPD研究LREC号228/02/T的一部分，原发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)样品由人类组织管理局许可的南安普敦大学癌症科学单位组织库提供。

造血干细胞/祖细胞(HSPC)分离和人源化小鼠的生成

根据机构伦理指南(美国加利福尼亚州高级生物科学资源公司(AdvancedBioscience Resources,Inc,CA,USA))，从妊娠15至23周的流产胎儿中获得人胎儿肝脏。所有妇女都对其胎儿组织的捐献给予了书面的知情同意以供研究。在妊娠终止后2小时内收集胎儿。首先将胎肝组织切成小块，并用胶原酶VI(2mg/ml，在Dulbecco改良伊格尔培养基[DMEM]中)在37℃下消化30分钟，并定期混合。通过使消化的组织通过100μm细胞过滤器(美国新泽西州BD生物科学公司(BD Biosciences,NJ,USA))制备单细胞悬浮液。使用CD34⁺选择试剂盒(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华的干细胞技术公司(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC,Canada))纯化CD34⁺细胞；CD34⁺细胞的纯度为90％至99％。通过台盼蓝排除死细胞来计数活细胞。在无菌条件下分离所有细胞。

NSG小鼠购自杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港)并在MIT的动物设施中维持在特定的无病原体条件下。为了重建小鼠，将新生幼鼠(出生不到2天)用伽马辐射源照射100cGy，心脏内注射CD34+CD133+细胞(大约2×10⁵个细胞/接受者)，如先前所报道(25)。约12周龄时，通过外周血单核细胞(PBMC)的流式细胞术测定人白细胞重建。嵌合状态或人白细胞重建的水平如下计算：％CD45+人细胞/(％CD45+人细胞+％CD45+小鼠细胞)。研究中使用了具有≥40％人CD45+白细胞的小鼠。

细胞培养

细胞系在37℃下在补充有10％胎牛血清(FCS)(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，英国)、100U/ml青霉素－链霉素、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸盐(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，英国)的RPMI 1640培养基中在具有5％CO₂的加湿培养箱中在8％CO₂中以130rpm振荡的Freestyle 293F培养基或在8％CO₂中以140rpm振荡的具有8mM谷氨酰胺的Freestyle CHO培养基(赛默飞世尔科技公司，英国)中生长。

抗体生成和产生

LILRB3抗体的生成。

使用

噬菌体展示文库进行各种LILRB3特异性mAb的选择(26)。进行三个连续的淘选循环，以及预淘选步骤。在淘选中，含有LILRB1、LILRB2或LILRB3细胞外结构域的Fc融合蛋白(LILRB-Fc)分别用作非靶标或靶标。如先前所述，这些蛋白质在瞬时转染的HEK293细胞中产生，随后在蛋白质A上纯化(27)。瞬时转染以表达各种LILRB蛋白的CHO-S细胞也用作淘选中的靶标/非靶标。

在淘选1中，使用生物素化的内部产生的重组LILRB-人(h)Fc重组融合蛋白(用链霉抗生物素蛋白包被的

捕获)在有或没有竞争的情况下，或LILRB-hFc包被至蚀刻的聚苯乙烯球(Polysciences公司，美国)/塑料免疫管，选择BioInvent

scFv。通过胰蛋白酶消化洗脱结合噬菌体并使用标准程序在板上扩增(28)。来自淘选1的扩增的噬菌体用于淘选2，重复该过程，来自淘选2的扩增的噬菌体用于淘选3。然而，在第三轮淘选中，将来自所有3种策略的扩增的噬菌体组合并针对LILRB瞬时转染的CHO-S细胞进行选择。

接着，将来自淘选3的富集噬菌体库的LILRB3阳性scFv盒再克隆以允许可溶性scFv在大肠杆菌(E.coli)中表达。使用荧光微量测定技术(FMAT)测试由单个克隆表达的可溶性scFv片段与LILRB转染的CHO-S细胞的结合，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试重组LILRB蛋白。这允许鉴定特异性结合LILRB3的克隆。然后在针对表达LILRB1-3的CHO-S细胞和原代细胞(PBMC)的三次筛选中进一步减少克隆。对显示与单个LILRB结合的特异性模式的克隆进行测序，产生LILRB1-3特异性mAb。

全长IgG的产生。

将上述鉴定的独特scFv克隆到真核表达系统中，使全长IgG在HEK293-EBNA细胞中瞬时表达。然后使用如前所述的基于蛋白A的亲和层析从培养物上清液中纯化抗体(29)。

去糖基化IgG的产生。

为了允许剖析Fc和Fab依赖性效应子功能，在37℃下使用PNGase F(普洛麦格公司(Promega))用0.05U的PNGase/μg的IgG使IgG去糖基化至少15小时。通过SDS-PAGE上重链大小的减小证实去糖基化。

结构域突变构建体的产生

使用分离自健康供体PBMC的野生型LILRB3 cDNA，通过重叠PCR生成一系列结构域突变DNA构建体以表达1、2或3个LILRB3 Ig样结构域(其中结构域基于蛋白质数据库Uniprot中的注释鉴定)。然后将基因构建体克隆到pcDNA3中。

细胞转染

使用Optimem 1培养基(赛默飞世尔科技公司，英国)通过使用233fectin的脂转染用10μg质粒DNA瞬时转染10x10⁶个HEK293F细胞。

人白细胞的制备和单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)的生成

在健康志愿者的知情同意下采集全血。PBMC分离自白细胞血锥(南安普敦综合医院输血服务中心(Blood Transfusion Services,Southampton General Hospital))。使用lymphoprep(Axis-Shield公司，英国)通过梯度密度离心进行分离。如前所述，从健康的外周血人单核细胞中生成MDM(30)。简而言之，将PBMC以2x10⁷个细胞/孔接种在具有1％人AB血清(西格玛奥德里奇，英国)的6孔板(康宁公司(Corning)，英国)中，并在37℃下孵育2小时。洗去未粘附的细胞，将粘附的单核细胞(>90％CD14⁺)在37℃下用5％CO₂孵育过夜。第二天，向各孔中添加100ng/ml人重组M-CSF(内部)。在培养期间补充培养基和细胞因子两次，然后在第7至8天收获细胞。

巨噬细胞吞噬作用测定

将如上所述生成的人MDM以1x10⁵个细胞/孔接种在96孔平底板中。将MDM用10μg/ml LILRB3抗体处理2小时并洗涤。用5μM CFSE(西格玛奥德里奇，英国)标记的原代慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞用利妥昔单抗在4℃下调理25分钟(或赫赛汀(herceptin)作为同种型对照)。然后将MDM和靶CLL细胞分别以1:5的比例在37℃下共培养1小时，然后用10μg/ml CD16-APC(BioLegend公司，英国)在室温下在黑暗中染色15分钟。将细胞洗涤、收获、通过流式细胞术分析并如下计算％吞噬作用：(％双阳性MDM)/(％总MDM)x 100。

流式细胞术

对于PBMC或全血的细胞表面染色，将细胞用2％人AB血清(西格玛奥德里奇，英国)在冰上封闭10分钟，然后用相关APC标记的mAb或hIgG1同种型(BioInvent公司，瑞典)连同以下细胞表面标记物一起染色：CD14-PE(eBioscience公司，英国)、CD20-A488(荧光标记的利妥昔单抗，内部)、CD3-PE-Cy7、CD56-APC-Cy7或CD15海水蓝和CD66B-FITC mAb(均为BioLegend公司，英国)。将细胞在4℃下染色30分钟，然后洗涤两次，首先在10％红细胞(RBC)裂解缓冲液(Serotec公司，英国)中洗涤，然后FACS洗涤(PBS，1％BSA，10mM NaN3)，然后在FACSCalibur或FACSCanto II(BD生物科学公司，美国)上采集，并用FCS Express V3(De Novo软件)进行分析。

对于确定mAb是否与类似的交叉阻断表位结合的测定，将1x10⁶ PBMC用2％人AB血清阻断10分钟，并用10μg/ml未缀合的LILRB3 mAb在4℃下染色30分钟。然后用直接缀合的商业LILRB3 mAb(克隆222821；R&D Systems公司，英国)在4℃下持续20分钟，然后使用FACSCalibur进行洗涤和采集。

对于LILRB3表位作图研究，用相关LILRB3 mAb在4℃下将LILRB3结构域突变体转染的HEK293F细胞染色25分钟，洗涤两次，用抗人PE次级(Jackson ImmunoResearch公司，美国)在4℃下染色20分钟，然后使用FACSCalibur进行洗涤和采集。

对于表达LILR-A1、-A2、-A5、-B1、-B2、-B3、-B4或-B5的2B4报告细胞(或未转染对照)的染色，将细胞用10μg/ml LILRB mAb染色并在37℃下用5％CO2孵育过夜。第二天，洗涤细胞并用二级抗hIgG抗体(Jackson ImmunoResearch公司，美国)在4℃下染色45分钟。洗涤细胞，使用FACScan(BD生物科学公司，美国)进行采集，使用Cell Quest(BD生物科学公司，美国)进行分析。

用FCS Express V3(De Novo软件)和FlowJo分析流式细胞术数据。

表面等离子体共振(SPR)

根据制造商的说明，使用Biacore T100(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国)进行SPR。LILRB3-hFc重组蛋白(具有人Fc标签的细胞外LILRB3结构域)用作配体并通过胺偶联固定到系列S传感器芯片(CM5)上。各种LILRB3 mAb用作“分析物”并流过芯片，并测量SPR。使用Biacore^TMT100评估软件(通用电气医疗集团，英国)，由Kd[1/s]/Ka[1/Ms]的1:1结合的“单价”模型计算KD值。

T细胞增殖测定

在室温下用2μM CSFE标记PBMC(1-2x 10⁷)10分钟。随后将细胞重悬于无血清CTL培养基(Immunospot公司，德国)中，并以1x10⁵个细胞/孔接种于96孔圆底板(康宁公司，英国)中。然后用0.02μg/ml CD3(克隆OKT3，南安普敦大学)、5μg/ml CD28(克隆CD28.2；BioLegend公司，英国)和10μg/ml LILRB3抗体或相关同种型刺激细胞。然后将板在37℃下孵育4天，之后用5μg/ml CD8-APC(克隆SK1；BioLegend公司，英国)对细胞进行染色，收获并通过流式细胞术测量CSFE稀释度，作为T细胞增殖的读数。

体内同种异体移植测定

在第0天和第4天分别用200μg LILRB3 mAb(克隆A1)或同种型匹配的(hIgG1)对照静脉内和腹膜内注射完全重建的人源化小鼠(≥40％循环hCD45+白细胞)。在第7天，对小鼠群腹膜内注射1x10⁷个荧光素酶阳性人“双击”B细胞淋巴瘤(25，31)，源自不相关的不匹配供体。使用IVIS光谱－生物发光成像系统随时间监测淋巴瘤细胞生长，如前所述(25)。

转录组分析

为了评估LILRB3介导的单核细胞的转录变化，使用EasySep^TM人单核细胞富集试剂盒(阴性选择细胞；干细胞技术公司(StemCell Technologies)，美国)从取自健康供体的新鲜制备的PBMC中分离人外周血单核细胞。将细胞在补充有100U/ml青霉素－链霉素、2mM谷氨酰胺和HEPES缓冲液的CTL培养基中孵育，并用10μg/ml同种型对照或激动性LILRB3mAb(克隆A1；hIgG1)处理。18小时后，将细胞在含有β-巯基乙醇的RLT裂解缓冲液中裂解并用RNeasy微试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，美国)提取总RNA。使用在2100生物分析仪(安捷伦科技公司(Agilent Inc)，美国)上的总RNA6000Nano LabChip和根据用于SMARTer通用低输入RNA试剂盒的Illumina TruSeq RNA样品制备指南(Clontech公司，美国)和HiSeq 2000系统(依诺米那公司(Illumina)，美国)制备并测序的cDNA文库对总RNA进行质量评估和定量。使用Bowtie2 v2.2.3将RNAseq输出与hg19进行比对(32)。通过RSEM v1.2.15对映射读数的数量进行定量(33)。使用edgeR对处理前后的成对样品进行差异表达分析(34)，p<0.05，倍数变化临界值>2。使用在线功能富集分析工具DAVID(http://david.ncifcrf.gov/)对差异表达的基因进行注释(35)。使用博德研究院软件(Broad Institute Software)进行基因集富集分析(GSEA)(36)，其中根据edgeR输出的logFC值对基因列表进行预排序。为了比较基因集表达，M1和M2巨噬细胞基因集(37)从分子特征数据库获得(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)。热图用MeV(38)可视化。

定量PCR(qPCR)

基于探针的qPCR用于在20μl反应中扩增cDNA，在96孔PCR板(伯乐公司(Bio-Rad)，英国)中对每种样品条件进行三次反应。根据制造商的方案，每个反应由48ng cDNA，10μl铂qPCR混合物(生命科技公司(Life Technologies)，英国)，8μl DEPC水和1μl基因特异性20xPrimeTime探针/引物混合物组成。含有PCR试剂的96孔板在C1000热循环仪CFX96实时系统PCR仪(伯乐公司，英国基德灵顿)中运行。CFX管理器软件(伯乐公司，英国基德灵顿)用于数据采集和分析最初记录为循环阈值(Ct)的基因表达。将Ct值相对于管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)归一化并相对于同种型对照处理的细胞中的基因表达水平标准化。

统计

对吞噬作用和T细胞增殖数据进行配对双尾T检验；直条表示中值。在至少进行3次实验的条形图上，误差条代表标准偏差。采用Bonferroni多重比较检验的单向ANOVA用于qPCR数据分析。使用GraphPadPrism(v5或6)执行统计分析。

结果

一组特异性LILRB3 mAb的生成

为了研究人LILRB3的蛋白表达和功能，使用人噬菌体展示文库鉴定针对LILRB3的抗体。使用靶LILRB3蛋白(在溶液中，包被到塑料表面或在细胞上表达)并通过针对同源非靶LILRB1和LILRB2蛋白进行选择来进行选择。在三轮噬菌体淘选和富集后，通过流式细胞术和ELISA证实了LILRB3特异性克隆的成功选择(数据未示出)。随后，将靶特异性噬菌体结合的scFv克隆转化为可溶性scFv并通过FMAT和ELISA筛选。对每个克隆的荧光强度作图，并显示靶标对非靶标特异性(图1A)。基于LILRB3的结合和对LILRB1和LILRB2缺乏交叉反应性来选择成功的克隆。然后对选择的克隆进行测序并测试其与原代细胞和转染子的结合(图1B)。一旦选择了靶特异性克隆并将其转化为IgG，通过筛选一组表达LILR的2B4报告细胞系再次证实特异性(图1C)。总共鉴定了16种LILRB3特异性抗体用于进一步研究。用这些LILRB3 mAb对PBMC或全血的进行染色，显示单核细胞(图1D)和嗜中性粒细胞(图1E)的染色占优势，与先前的报告一致(39)。进一步测试LILRB3特异性克隆，并证实其与小鼠直向同源物PIR-B没有交叉反应性(数据未示出)。

LILRB3 mAb以高亲和力结合并映射至不同表位

然后测试LILRB3特异性mAb的结合性质。SPR分析显示，所有LILRB3克隆以剂量依赖性方式结合至重组LILRB3-hFc蛋白(图2A)并且显示一系列亲和力，由A16(8.16x10^-10)表示。有趣的是，所有mAb具有相似的结合速率(约105)，但它们的解离速率相差三个数量级(约10^-3至10^-6)。

然后进行表位作图研究。一些mAb能够阻断商业LILRB3 mAb(例如，A35)的结合，表明共有的或近端相关的表位；而其它不能(例如，A1)，指示在其它地方绑定(图2B)。用一系列瞬时转染到HEK293F细胞的LILRB3结构域(图2D)突变体进一步证实结合特异性，突变体展示所有四个细胞外结构域(WT)、三个、两个或一个结构域。与这些细胞的结合显示两组mAb：与WT、D3和D2表达细胞结合的mAb；和仅结合WT转染的细胞的mAb(图2B)，分别表明在D4内的结合(以A1为例)(图2C)。这些数据证明，针对LILRB3产生了高度特异性的完全人IgG1mAb。表位作图显示，尽管保守残基似乎存在于所有4个结构域中，但LILRB3 mAb结合分别位于D2和D4内的两个不同细胞外显性表位中的任一个。

此外，用与人CD3ζ胞质结构域融合的LILRB3细胞外结构域转染的报告细胞用于研究生成的mAb是否能够交联受体。通过这些杂交细胞的信号传导导致GFP在NFAT启动子下的表达(40)。我们能够鉴定LILRB3 mAb的两个不同组，能够诱导信号传导的组(例如A1)和在与受体结合时是惰性的组(例如A28)(图2D)。

LILRB3连接调节T细胞活化和增殖

接下来，我们试图研究这些mAb对细胞效应子功能的影响。LILRB1先前已显示抑制T细胞应答；通过在CD3信号级联中引起去磷酸化，或与CD8竞争HLA-I结合(41，42)。LILRB还显示出通过诱导CD8+T抑制细胞，使如单核细胞和DC等抗原呈递细胞(APC)产生耐受性，从而间接抑制T细胞应答(10，12，43)。为了研究LILRB3的免疫调节潜力及其调节适应性免疫应答的能力，我们在PBMC测定中测试了LILRB3 mAb，测量了响应抗CD3/CD28刺激的T细胞增殖。CD3和CD28抗体成功地驱动了T细胞活化和增殖，这通过细胞群集和CFSE稀释得到了证实(图3A)。

已知Fcγ受体(FcγR)介导人IgG(29，44－46)的作用，因此，为了研究LILRB3 mAb对T细胞增殖的直接F(ab):受体介导的作用，首先将它们去糖基化以消除由FcγR-IgG相互作用介导的作用(47)。SDS-PAGE证实，与野生型(WT)对照相比，去糖基化的mAb(Degly)的分子量降低，表明成功的去糖基化(图3B)。然后将mAb导入上述T细胞增殖测定。在20个不同的供体中评估了由CD3和CD28抗体驱动的成功的T细胞增殖，显示与对照相比，CD8+T细胞增殖显著增加(p<0.0001)(图3C)。当与人IgG1同种型对照相比时，由克隆A1表示的大部分LILRB3 mAb显著抑制CD8+T细胞增殖(p＝0.0001；图3C)。A28也表现出抑制增殖的趋势，但A16似乎没有抑制作用。这些数据证明，靶向LILRB3可以以明确的mAb特异性方式在任一方向上调节T细胞应答，其中一些递送LILR3B激动性质(增强的抑制)，如A1。当以相同的方式用分离的T细胞重复测定时，没有观察到抑制，证实PBMC中的APC(最可能是单核细胞)负责观察到的作用(数据未示出)。鉴于LILR3B在T细胞上缺乏表达，这一结果是意料之中的。

LILRB3 mAb调节巨噬细胞效应子功能

上述发现表明LILRB3 mAb能够激动或拮抗LILRB3以调节T细胞增殖，可能是通过调节APC功能。因此，由于巨噬细胞也表达高水平的LILRB，并且已知其受LILRB调节(13)，因此研究了LILRB3连接对巨噬细胞吞噬作用的影响。用代表性LILRB3 mAb染色证实了LILRB3在人MDM上的高表达水平(图4A)。为了评估其效应子功能的任何调节，用抗CD20mAb(利妥昔单抗)调理CFSE标记的原代CLL B细胞，并在吞噬作用测定中用作巨噬细胞的靶标(图4B至C)。去糖基化的抗LILRB3克隆显著降低了吞噬作用的程度(在所有情况下p<0.05)(图4C)。通过共聚焦显微镜进一步证实了这些发现，与同种型对照相比，LILRB3处理的巨噬细胞中CFSE+靶细胞的数量较少(图4D)。这些数据表明，大部分LILRB3 mAb递送抑制信号以降低巨噬细胞效应子功能。重要的是，LILRB3 mAb是去糖基化的，能够仅介导Fab依赖性效应而不会由于Fc:FcγR相互作用而引起并发症(48)。

LILRB3连接在人源化小鼠中诱导免疫耐受

鉴于这些数据显示LILRB3连接后适应性(T细胞)和先天性(骨髓性)活性均可被抑制，我们接下来在使用人源化小鼠(用原代人HSC重建)的同种异体植入模型中测试LILRB3调节的可能作用。人源化小鼠的表征表明LILRB3以与人外周血相似的方式在骨髓细胞上表达(图5A)。由于HLA错配，同种异体人淋巴瘤细胞在人源化小鼠中容易被排斥(数据未示出；49)。为了测试LILRB3连接抑制同种异体免疫应答的潜力，我们用激动性LILRB3 mAb(A1)预处理重建的成年人源化小鼠并评估来自不相关供体的同种异体人“双击”B细胞淋巴瘤细胞的植入(31，50)。LILRB3 mAb治疗能够在小鼠中诱导耐受状态并导致人淋巴瘤细胞的成功植入(图5B)。由于高肿瘤负荷，LILRB3治疗的荷瘤小鼠必须被人道地剔除，而同种型对照处理的小鼠容易排斥淋巴瘤细胞而无任何发病率。这些观察结果进一步证实了我们的体外功能测定并鉴定了LILRB3，其为免疫应答过程中骨髓细胞的关键调节因子。

LILRB3连接导致人APC的转录修饰和M2偏移

为了研究LILRB3介导的免疫抑制中涉及的途径和因素，我们研究了LILRB3参与后原代APC中的转录组变化。用激动性LILRB3 mAb(A1)体外短期(约18小时)处理分离的人外周CD14+单核细胞，导致其表型发生显著变化(图6A)，其中细胞显示细长形态，类似“M2”，免疫抑制性IL4/IL-13处理的巨噬细胞(51)。RNAseq分析表明，LILRB3在单核细胞上的连接诱导了类似于“M2”偏移的免疫抑制性巨噬细胞的特征(图6B)。同样，与同种型对照处理的单核细胞相比，LILRB3 mAb处理的单核细胞中与“M1”偏移的免疫刺激性巨噬细胞相关的基因表达下调(图6B至C)。我们通过在另外3个供体上对选定数量的差异调节基因进行qPCR证实了这些数据(图6D)。用较少/非激动性LILRB3 mAb(A28)处理单核细胞不影响单核细胞表型和基因表达(数据未示出和图6C)。基因集富集分析(GSEA)显示与报道的抑制性巨噬细胞的基因特征呈正相关，例如氧化磷酸化(52)。相反，LILRB3连接的单核细胞基因特征与报道的炎性巨噬细胞的基因特征(例如，IFN-γ和IFN-α应答元件)以及同种异体移植排斥呈负相关(图6E)。总之，这些数据证实LILRB3活化导致如单核细胞等APC中显著的表型和转录改变，从而导致下游免疫应答的有效抑制(图6F)。

讨论

我们先前证明LILRB1在人单核细胞上的连接诱导耐受性表型，随后阻碍T细胞应答(12，53)。在本研究中，我们研究了另一个LILR家族成员LILRB3，由于缺乏合适的试剂和实验系统，其功能尚未确定。因此，我们生成并表征了一系列对LILRB3具有特异性的全人mAb。用特异性mAb对不同白细胞群体的染色证实了LILRB3主要限于人骨髓细胞(3)。这在几个独立的供体中得到证实，表明尽管这些受体是多态的(LILRB3具有至少十个变体(3，54))，但抗体识别许多(如果不是全部)变体，这对于开发用于治疗用途的这些试剂是重要的。随后的分析显示LILRB3 mAb显示出一定范围的亲和力，所有这些亲和力都在纳摩尔(nM)范围内，具有相似的开启率，但关闭率差异超过三个数量级。低nM范围的KD值通常被认为是可行的候选药物；例如，利妥昔单抗对其靶标CD20具有8nM的亲和力(55)。这表明此处生成的LILRB3 mAb具有作为治疗剂的潜力。一些选择的LILRB3克隆显示出与其它人LILR转染子意外的交叉反应性，并从随后的分析中排除。然而，应注意，由于LILR3B在其细胞外结构域中与LILRA6共享>95％的序列同源性，如果共表达，LILRB3 mAb则可以与LILRA6很好地相互作用(56)。此外，表位作图实验揭示特异性LILRB3 mAb是针对两个不同表位生成的，因为它们结合了Ig样细胞外结构域2或4。生成的LILRB3 mAb均不结合结构域1或3，表明这些结构域可能不含有保守的独特表位。

通过抑制或增强增殖观察到LILRB3 mAb影响T细胞应答的能力，分别表明激动或拮抗性质。类似于LILRB1(12，13，57)，这可能是通过对APC的作用，因为它们是培养物中唯一表达LILRB3的细胞。与LILRB1(42，53，583，59)不同，LILRB3不在T细胞上表达，并且只能间接地影响T细胞应答。基于在PBMC培养物中细胞的LILRB3表达模式和频率，单核细胞代表最可能受影响的细胞类型。为了支持这一点，激动性LILRB3 mAb在缺乏单核细胞的情况下不抑制T细胞增殖。在许多系统中，结合表位影响mAb调节受体功能的能力(29，60)，因此看到LILRB3 mAb能够发挥相反的功能并不令人惊讶。与LILRB3的第二Ig样结构域结合的大部分LILRB3 mAb能够抑制T细胞增殖。相反，与结构域4结合的一些克隆增强了增殖。然而，D4结合mAb(A1)是最强的增殖抑制剂之一，而另一种D4结合(A28)诱导的抑制作用较小。因此，结构域特异性表位似乎不与LILRB3 mAb介导的效应细胞功能直接相关。

尽管LILRB3 mAb在抑制或增强T细胞增殖的能力方面表现出差异，但大部分克隆抑制巨噬细胞的吞噬作用或没有效果。这表明，在本文中大部分mAb是激动性的，刺激抑制性信号传导和抑制效应子功能，类似于T细胞应答的抑制。

我们证明LILR3B下游免疫抑制活性的观察结果在重建的人源化小鼠模型中得到进一步证实。在该系统中，当LILRB3仅存在于单核细胞上时，在同种异体淋巴瘤细胞植入之前，LILRB3与激动性LILRB3 mAb的连接(31)在体内诱导了耐受性并使得随后的肿瘤生长成为可能。这证明了LILRB3发挥显著免疫抑制作用的能力，这些免疫抑制作用可用于治疗环境，如自身免疫和移植，其中诱导免疫耐受将是有益的。尽管被认为是孤儿受体，但认为LILRB3与细胞角蛋白(CK)相关蛋白(暴露于坏死性癌细胞)、血管生成素样蛋白5和如金黄色葡萄球菌(S.aureus)等细菌相关联(40，61，62)。因此，我们的功能数据表明某些病原体(61)可能能够通过在主动应答期间主动连接LILRB3来破坏免疫应答。

为了研究LILRB3介导的免疫抑制中涉及的途径和因素，我们研究了LILRB3活化后分离的外周骨髓细胞中的转录组变化。LILRB3连接后，在原代人单核细胞中有超过一百个基因受到差异调节，其中一些已知在M2巨噬细胞和TAM中受到调节。双调蛋白是在LILRB3连接的单核细胞中表达显著上调的基因之一。双调蛋白是一种表皮生长因子样生长因子，通过包括增强Treg活性的各种机制负责诱导耐受性和免疫抑制(63)。此外，双调蛋白在肿瘤相关的DC(64)和抑制性/M2巨噬细胞(65)中过表达，并且已被认为在免疫抑制和癌症进展中起关键作用(66)。此类LILRB3诱导因子可能是在我们的T细胞测定中观察到的抑制的原因。我们正在进行的努力旨在测试这一点，并充分理解LILRB3介导的骨髓细胞抑制的机制。最近的一项研究调查了醋酸格拉默(Copaxone)的作用模式，这是一种用于治疗复发缓解型多发性硬化患者的肽基药物，可以改善自身免疫，该研究将LILRB2和LILRB3鉴定为潜在配体(67)。在人骨髓细胞上用拮抗性mAb靶向人LILRB2能够促进它们的促炎活性并增强体内抗肿瘤应答(13)。此外，Zhang及其同事的近期数据表明，白血病细胞中的LILRB4信号传导介导支持肿瘤细胞向远端器官扩散的T细胞抑制(68)。这些数据进一步支持了我们的发现，证明人LILRB的活化通过重新编程骨髓细胞(即，减少M1样成熟并促进MDSC抑制功能)诱导免疫抑制。

本文呈现的研究结果表明，LILRB3在原代人骨髓细胞上的活化发挥了强效的免疫抑制功能，并且LILRB3特异性mAb是潜在强效的免疫调节剂，具有从移植到自身免疫到炎性病症等广泛的应用。

参考文献

1.K.J.Anderson,R.L.Allen，《白细胞免疫球蛋白样受体对T细胞免疫的调节：抗原呈递细胞自身的先天免疫受体(Regulation of T-cell immunity by leucocyteimmunoglobulin-like receptors:innate immune receptors for self on antigen-presenting cells)》，《免疫学(Immunology)》127，8-17(2009)。

2.W.van der Touw,H.M.Chen,P.Y.Pan,S.H.Chen，《LILRB受体介导的骨髓细胞成熟和功能的调节(LILRB receptor-mediated regulation of myeloid cell maturationand function)》，《癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol Immunother)》66，1079-1087(2017)。

3.M.Colonna等人，《人类淋巴细胞和粒单核细胞上主要组织相容性复合体I类分子的一种常见抑制性受体(A common inhibitory receptor for majorhistocompatibility complex class I molecules on human lymphoid andmyelomonocytic cells)》，《实验医学杂志(J Exp Med)》186，1809-1818(1997)。

4.L.Borges,M.L.Hsu,N.Fanger,M.Kubin,D.Cosman，《人淋巴和骨髓Ig样受体家族，其中一些结合I类MHC分子(A family of human lymphoid and myeloid Ig-likereceptors,some of which bind to MHC class I molecules)》，《免疫学杂志(JImmunol)》159，5192－5196(1997)。

5.H.Nakajima,J.Samaridis,L.Angman,M.Colonna，《人骨髓细胞表达与Fc受体γ链结合的活化ILT受体(ILT1)(Human myeloid cells express an activating ILTreceptor(ILT1)that associates with Fc receptor gamma-chain)》，《免疫学杂志(JImmunol)》162，5-8(1999)。

6.C.C.Chang等人，《免疫球蛋白样转录物3基因的多态性和连锁失衡(Polymorphism and linkage disequilibrium of immunoglobulin-like transcript3gene)》《人类免疫学(Hum Immunol)》69，284－290(2008)。

7.F.W.Velten,K.Duperrier,J.Bohlender,P.Metharom,S.Goerdt，《抑制性MHC受体的基因特征鉴定了体外异源刺激能力降低的IL-10诱导的树突细胞的BDCA3(+)亚群(Agene signature of inhibitory MHC receptors identifies a BDCA3(+)subset of IL-10-induced dendritic cells with reduced allostimulatory capacity in vitro)》，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》34，2800－2811(2004)。

8.C.C.Chang等人，《T(S)细胞对树突细胞的耐受化：抑制性受体ILT3和ILT4的关键作用(Tolerization of dendritic cells by T(S)cells:the crucial role ofinhibitory receptors ILT3 and ILT4)》，《自然免疫学(Nat Immunol)》3，237－243(2002)。

9.M.Beyer等人，《人巨噬细胞的高分辨率转录组(High-resolutiontranscriptome of human macrophages)》，《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》7，e45466(2012)。

10.J.S.Manavalan等人，《ILT3和ILT4的高表达是耐受性树突细胞的一般特征(High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenicdendritic cells)》，《移植免疫学(Transpl Immunol)》11，245－258(2003)。

11.N.A.Fanger等人，《I类MHC结合蛋白LIR-1和LIR-2抑制单核细胞中Fc受体介导的信号传导(The MHC class I binding proteins LIR-1and LIR-2inhibit Fcreceptor-mediated signaling in monocytes)》，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》28，3423-3434(1998)。

12.N.T.Young等人，《抑制受体LILRB1调节人树突细胞的分化和调节潜力(Theinhibitory receptor LILRB1 modulates the differentiation and regulatorypotential of human dendritic cells)》，《血液(Blood)》111，3090－3096(2008)。

13.A.A.Barkal等人，《通过抑制性受体LILRB1参与I类MHC抑制巨噬细胞并且是癌症免疫治疗的靶标(Engagement of MHC class I by the inhibitory receptor LILRB1suppresses macrophages and is a target of cancer immunotherapy)》《自然免疫学(Nat Immunol)》19，76-84(2018)。

14.M.K.Rochat等人，《妊娠期间母体维生素D摄入增加脐带血中ILT3和ILT4的基因表达(Maternal vitamin D intake during pregnancy increases gene expressionof ILT3 and ILT4 in cord blood)》，《临床与实验过敏期刊(Clin Exp Allergy)》40，786－794(2010)。

15.M.Brenk等人，《色氨酸剥夺诱导树突细胞上的抑制性受体ILT3和ILT4，有利于诱导人CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞(Tryptophan deprivation induces inhibitoryreceptors ILT3and ILT4 on dendritic cells favoring the induction of human CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells)》，《免疫学杂志(J Immunol)》183，145-154(2009)。

16.M.G.Petroff,P.Sedlmayr,D.Azzola,J.S.Hunt，《蜕膜巨噬细胞可能易受Ia类和Ib类HLA分子的抑制(Decidual macrophages are potentially susceptible toinhibition by class Ia and class Ib HLA molecules)》，《生殖免疫学杂志(J ReprodImmunol)》56，3－17(2002)。

17.R.Apps,L.Gardner,A.M.Sharkey,N.Holmes,A.Moffett，《正常滋养层细胞上HLA-G的同型二聚体复合物通过LILRB1调节抗原呈递细胞(A homodimeric complex ofHLA-G on normal trophoblast cells modulates antigen-presenting cells viaLILRB1)》，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》37，1924-1937(2007)。

18.L.Lombardelli等人，《HLA-G5通过ILT2受体在蜕膜CD4(+)T细胞和巨噬细胞上的差异表达诱导对成功妊娠至关重要的IL-4分泌(HLA-G5 induces IL-4secretioncritical for successful pregnancy through differential expression of ILT2receptor on decidual CD4(+)T cells and macrophages)》，《免疫学杂志(J Immunol)》191，3651-3662(2013)。

19.B.Favier,J.Lemaoult,E.Lesport,E.D.Carosella，《ILT2/HLA-G相互作用通过抑制NK细胞活化突触的晚期事件而不是早期事件损害NK细胞功能(ILT2/HLA-Ginteraction impairs NK-cell functions through the inhibition of the late butnot the early events of the NK-cell activating synapse)》《美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J)》24，689－699(2010)。

20.S.Endo,Y.Sakamoto,E.Kobayashi,A.Nakamura,T.Takai，《PIR-B对树突细胞触发的细胞毒性T淋巴细胞的调节(Regulation of cytotoxic T lymphocyte triggeringby PIR-B on dendritic cells)》，《美国科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America)》105，14515－14520(2008)。

21.S.Pereira,H.Zhang,T.Takai,C.A.Lowell，《抑制性受体PIR-B负调节嗜中性粒细胞和巨噬细胞整联蛋白信号传导(The inhibitory receptor PIR-B negativelyregulates neutrophil and macrophage integrin signaling)》《免疫学杂志(JImmunol)》173，5757-5765(2004)。

22.N.S.Wilson等人，《Fcγ受体依赖性机制驱动癌细胞中抗体介导的靶受体信号传导(An Fcgamma receptor-dependent mechanism drives antibody-mediated target-receptor signaling in cancer cells)》《癌细胞(Cancer Cell)》19，101－113(2011)。

23.W.Zhang,S.Liang,J.Wu,A.Horuzsko，《人抑制性受体ILT2扩增促进同种异体移植物长期存活的CD11b(+)Gr1(+)骨髓源性抑制细胞(Human Inhibitory Receptor ILT2Amplifies CD11b(+)Gr1(+)Myeloid-Derived Suppressor Cells that Promote Long-Term Survival of Allografts)》，《移植(Transplantation)》86，1125－1134(2008)。

24.J.Wu等人，《人白细胞抗原-G的同种型及其在人肾同种异体移植接受中的抑制性受体(Isoforms of human leukocyte antigen-G and their inhibitory receptorsin human kidney allograft

)》，《人类免疫学(Human Immunology)》70，988－994(2009)。

25.A.Roghanian等人，《环磷酰胺通过调节巨噬细胞FcγR增强了癌症抗体免疫疗法在抗性骨髓巢中的表达(Cyclophosphamide Enhances Cancer AntibodyImmunotherapy in the Resistant Bone Marrow Niche by Modulating MacrophageFcgammaR Expression)》，《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》7，1876－1890(2019)。

26.E.Soderlind等人，《重组种系衍生的CDR序列以创建不同的单框架抗体库(Recombining germline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibody libraries)》，《自然生物技术(Nature biotechnology)》18，852－856(2000)。

27.A.Roghanian等人，《拮抗的人FcγRIIB(CD32B)抗体具有抗肿瘤活性，并在体内克服对抗体治疗的抗性(Antagonistic human FcgammaRIIB(CD32B)antibodies haveanti-tumor activity and overcome resistance to antibody therapy in vivo)》《癌细胞(Cancer Cell)》27，473-488(2015)。

28.N.Olsson等人，《使用亲和蛋白质组学和质谱的蛋白质组学分析和发现(Proteomic Analysis and Discovery Using Affinity Proteomics and MassSpectrometry)》，《分子与细胞蛋白质组学(Mol Cell Proteomics)》10，(2011)。

29.L.N.Dahal,A.Roghanian,S.A.Beers,M.S.Cragg，《导致成功免疫治疗的FcγR要求(FcgammaR requirements leading to successful immunotherapy)》《免疫学综述(Immunological reviews)》268，104－122(2015)。

30.A.Roghanian等人，《细丝相关TSGA10蛋白在专职抗原呈递细胞中表达并与波形蛋白相互作用(Filament-associated TSGA10 protein is expressed inprofessional antigen presenting cells and interacts with vimentin)》，《细胞免疫学(Cell Immunol)》265，120－126(2010)。

31.I.Leskov等人，《通过Myc和Bcl2的联合表达快速产生人B细胞淋巴瘤及其作为生物治疗的临床前模型的用途(Rapid generation of human B-cell lymphomas viacombined expression of Myc and Bcl2 and their use as a preclinical model forbiological therapies)》《癌基因(Oncogene)》32，1066－1072(2013)。

32.B.Langmead,C.Trapnell,M.Pop,S.L.Salzberg，《超快和记忆效率的比对短的DNA序列到人类基因组(Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNAsequences to the human genome)》，《基因组生物学(Genome Biol)》10，R25(2009)。

33.B.Li,C.N.Dewey，《RSEM：在有或没有参考基因组的情况下，从RNA-Seq数据进行精确的转录物定量(RSEM:accurate transcript quantification from RNA-Seq datawith or without a reference genome)》，《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》12，323(2011)。

34.M.D.Robinson,D.J.McCarthy,G.K.Smyth，《edgeR：一个用于数字基因表达数据差异表达分析的生物导体包(edgeR:a Bioconductor package for differentialexpression analysis of digital gene expression data)》，《生物信息学(Bioinformatics)》26，139－140(2010)。

35.D.W.Huang等人，《大卫生物信息学资源：扩展注释数据库和新算法，以更好地从大型基因列表中提取生物学(DAVID Bioinformatics Resources:expanded annotationdatabase and novel algorithms to better extract biology from large genelists)》《核酸研究(Nucleic Acids Res)》35，W169－175(2007)。

36.A.Subramanian等人，《基因集富集分析：用于解释全基因组表达谱的基于知识的方法(Gene set enrichment analysis:a knowledge-based approach forinterpreting genome-wide expression profiles)》《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci U S A)》102，15545－15550(2005)。

37.F.O.Martinez,S.Gordon,M.Locati,A.Mantovani，《人单核细胞向巨噬细胞分化和极化的转录谱分析：基因表达的新分子和模式(Transcriptional profiling of thehuman monocyte-to-macrophage differentiation and polarization:new moleculesand patterns of gene expression)》《免疫学杂志(J Immunol)》177，7303-7311(2006)。

38.A.I.Saeed等人，《TM4：一种用于微阵列数据管理和分析的自由开源系统(TM4:a free,open-source system for microarray data management and analysis)》《生物技术(Biotechniques)》34，374－378(2003)。

39.N.Tedla等人，《通过白细胞免疫球蛋白样受体7活化人嗜酸性粒细胞(Activation of human eosinophils through leukocyte immunoglobulin-likereceptor 7)》《美国科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America)》100，1174-1179(2003)。

40.D.C.Jones等人，《LILRB3和LILRA6对坏死腺上皮细胞上细胞角蛋白8相关配体的等位基因特异性识别(Allele-specific recognition by LILRB3 and LILRA6 of acytokeratin 8-associated ligand on necrotic glandular epithelial cells)》《肿瘤靶标(Oncotarget)》7，15618－15631(2016)。

41.D.Saverino等人，《CD85/LIR-1/ILT2抑制性受体由所有人T淋巴细胞表达并下调它们的功能(The CD85/LIR-1/ILT2 inhibitory receptor is expressed by allhuman T lymphocytes and down-regulates their functions)》《免疫学杂志(JImmunol)》165，3742-3755(2000)。

42.M.Shiroishi等人，《人抑制性受体Ig样转录物2(ILT2)和ILT4与CD8竞争I类MHC结合并优先结合HLA-G(Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2(ILT2)and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind preferentially toHLA-G)》《美国科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America)》100，8856-8861(2003)。

43.C.C.Chang等人，《BCL6是Ig样转录物3-Fc-诱导的CD8(+)T抑制细胞分化所必需的(BCL6 Is Required for Differentiation of Ig-Like Transcript 3-Fc-InducedCD8(+)T Suppressor Cells)》《免疫学杂志(J Immunol)》185，5714-5722(2010)。

44.R.A.Clynes,T.L.Towers,L.G.Presta,J.V.Ravetch，《抑制性Fc受体调节针对肿瘤靶标的体内细胞毒性(Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicityagainst tumor targets)》《自然医学(Nature medicine)》6，443－446(2000)。

45.C.S.Lee等人，《抑制性Fcγ受体IIB(FCGR2B，CD32B)在滤泡性淋巴瘤细胞上的表达降低对利妥昔单抗单一疗法(SAKK35/98)的应答率(Expression of the inhibitoryFc gamma receptor IIB(FCGR2B,CD32B)on follicular lymphoma cells lowers theresponse rate to rituximab monotherapy(SAKK 35/98))》《英国血液学杂志(Britishjournal of haematology)》168，145－148(2015)。

46.C.E.Hargreaves等人，《Fcγ受体：遗传变异、功能和疾病(Fcgammareceptors:genetic variation,function,and disease)》《免疫学综述(Immunologicalreviews)》268，6-24(2015)。

47.Y.Kaneko,F.Nimmerjahn,E.V.Ravetch，《由Fc唾液酸化产生的免疫球蛋白G的抗炎活性(Anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fcsialylation)》《科学(Science)》313，670－673(2006)。

48.P.M.Hogarth,G.A.Pietersz，《用于治疗炎症、癌症等的Fc受体靶向疗法(Fcreceptor-targeted therapies for the treatment of inflammation,cancer andbeyond)》《自然评论药物发现(Nat Rev Drug Discov)》11，311－331(2012)。

49.A.Roghanian等人，《环磷酰胺通过调节巨噬细胞FcγR增强了癌症抗体免疫疗法在抗性骨髓巢中的表达(Cyclophosphamide Enhances Cancer AntibodyImmunotherapy in the Resistant Bone Marrow Niche by Modulating MacrophageFcgammaR Expression)》《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》(2019)。

50.C.P.Pallasch等人，《增强保护性肿瘤微环境对抗体介导治疗的敏感性(Sensitizing protective tumor microenvironments to antibody-mediatedtherapy)》《细胞(Cell)》156，590－602(2014)。

51.F.Y.McWhorter,T.Wang,P.Nguyen,T.Chung,W.F.Liu，《通过细胞形状调节巨噬细胞表型(Modulation of macrophage phenotype by cell shape)》《美国科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica)》110，17253-17258(2013)。

52.S.Galvan-Pena,L.A.O'Neill，《巨噬细胞极化中的代谢重编程(Metabolicreprograming in macrophage polarization)》《免疫学前沿(Front Immunol)》5，420(2014)。

53.R.C.Khanolkar等人，《白细胞Ig样受体B1通过增加NF-κB调节剂ABIN1/TNIP1的表达来抑制树突细胞功能(Leukocyte Ig-Like receptor B1 restrains dendriticcell function through increased expression of the NF-kappaB regulator ABIN1/TNIP1)》《白细胞生物学期刊(J Leukoc Biol)》，(2016)。

54.A.A.Bashirova等人，《编码骨髓抑制和活化受体对的人LILRB3/A6基因座的多样性(Diversity of the human LILRB3/A6 locus encoding a myeloid inhibitory andactivating receptor pair)》《免疫遗传学(Immunogenetics)》66，1－8(2014)。

55.M.D.Pescovitz，《利妥昔单抗，一种抗cd20单克隆抗体：历史和作用机制(Rituximab,an anti-cd20 monoclonal antibody:history and mechanism of action)》《美国移植杂志(Am J Transplant)》6，859－866(2006)。

56.M.R.Lopez-Alvarez,D.C.Jones,W.Jiang,J.A.Traherne,J.Trowsdale，《脊髓单核细胞活化和抑制受体的LILR家族拷贝数和核苷酸变异(Copy number and nucleotidevariation of the LILR family of myelomonocytic cell activating and inhibitoryreceptors)》《免疫遗传学(Immunogenetics)》66，73-83(2014)。

57.C.S.Wagner等人，《人巨细胞病毒衍生的蛋白UL18改变单核细胞衍生的树突细胞的表型和功能(Human cytomegalovirus-derived protein UL18 alters thephenotype and function of monocyte-derived dendritic cells)》《白细胞生物学期刊》83，56－63(2008)。

58.J.Dietrich,M.Cella,M.Colonna，《Ig样转录物2(ILT2)/白细胞Ig样受体1(LIR1)抑制TCR信号传导和肌动蛋白细胞骨架重组(Ig-like transcript 2(ILT2)/leukocyte Ig-like receptor 1(LIR1)inhibits TCR signaling and actincytoskeleton reorganization)》《免疫学杂志(J Immunol)》166，2514-2521(2001)。

59.F.Ketroussi等人，《HLA-G对淋巴细胞周期的抑制由磷酸酶SHP-2介导，并作用于mTOR途径(Lymphocyte Cell-Cycle Inhibition by HLA-G Is Mediated byPhosphatase SHP-2and Acts on the mTOR Pathway)》《公共科学图书馆期刊》6，(2011)。

60.X.Yu等人，《表位特异性和同种型之间的复杂相互作用决定了抗人CD40抗体的生物活性(Complex Interplay between Epitope Specificity and Isotype Dictatesthe Biological Activity of Anti-human CD40 Antibodies)》《癌细胞》33，664-675e664(2018)。

61.M.Nakayama等人，《配对的Ig样受体与细菌结合并形成TLR介导的细胞因子产生(Paired Ig-like receptors bind to bacteria and shape TLR-mediated cytokineproduction)》《免疫学杂志(J Immunol)》178，4250-4259(2007)。

62.J.Zheng等人，《抑制性受体结合ANGPTL并支持血液干细胞和白血病的发展(Inhibitory receptors bind ANGPTLs and support blood stem cells and leukaemiadevelopment)》《自然(Nature)》485，656－660(2012)。

63.D.M.W.Zaiss,W.C.Gause,L.C.Osborne,D.Artis，《双调蛋白在配合免疫、炎症和组织修复中的新兴功能(Emerging functions of amphiregulin in orchestratingimmunity,inflammation,and tissue repair)》《免疫(Immunity)》42，216－226(2015)。

64.Y.L.Hsu等人，《肺肿瘤相关的树突细胞衍生的双调蛋白增加癌症进展(Lungtumor-associated dendritic cell-derived amphiregulin increased cancerprogression)》《免疫学杂志(J Immunol)》187，1733-1744(2011)。

65.P.Vlaicu等人，《单核细胞/巨噬细胞通过共分泌谱系特异性EGFR配体和STAT3激活剂支持乳腺肿瘤侵袭性(Monocytes/macrophages support mammary tumorinvasivity by co-secreting lineage-specific EGFR ligands and a STAT3activator)》《BMC癌症(BMC Cancer)》13，197(2013)。

66.B.Busser,L.Sancey,E.Brambilla,J.L.Coll,A.Hurbin，《双调蛋白在人类癌症中的多种作用(The multiple roles of amphiregulin in human cancer)》《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》1816，119－131(2011)。

67.W.van der Touw等人，《醋酸格拉默通过识别成对的Ig样受体b增强骨髓源性抑制细胞的功能(Glatiramer Acetate Enhances Myeloid-Derived Suppressor CellFunction via Recognition of Paired Ig-like Receptor B)》，《免疫学杂志》201，1727－1734(2018)。

68.M.Deng等人，《白血病细胞中的LILRB4信号传导介导T细胞抑制和肿瘤浸润(LILRB4 signalling in leukaemia cells mediates T cell suppression and tumourinfiltration)》《自然(Nature)》562，605-609(2018)。

序列表

<110> 生物发明国际公司

南安普顿大学

<120> LILRB3抗体分子及其用途

<130> BIOBX/P76238PC

<150> EP20156969.6

<151> 2020-02-12

<160> 34

<170> PatentIn 3.5版

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210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 34

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

Claims

1.一种特异性结合LILRB3(ILT5)的抗体分子，其用于治疗移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症。

2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述抗体分子是激动性抗体分子。

3.一种特异性结合LILRB3(ILT5)的抗体分子，其中所述抗体分子选自由包含CDR VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3中的1至6个的抗体分子组成的组，

4.根据权利要求3所述的抗体分子，其中所述抗体分子包含可变重链(VH)，所述VH包含以下CDR：

(i)SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2和SEQ.ID.NO:3；或

(ii)SEQ.ID.NO:9、SEQ.ID.NO:10和SEQ.ID.NO:11；或

(iii)SEQ.ID.NO:17、SEQ.ID.NO:18和SEQ.ID.NO:19；或

(iv)SEQ.ID.NO:25、SEQ.ID.NO:26和SEQ.ID.NO:27

和/或其中所述抗体分子包括可变轻链(VL)，所述VL包括以下CDR：

(v)SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5和SEQ.ID.NO:6；或

(vi)SEQ.ID.NO:12、SEQ.ID.NO:13和SEQ.ID.NO:14；或

(vii)SEQ.ID.NO:20、SEQ.ID.NO:21和SEQ.ID.NO:22；或

(viii)SEQ.ID.NO:28、SEQ.ID.NO:29和SEQ.ID.NO:30。

5.根据权利要求3或4所述的抗体分子，其中所述抗体分子包含选自由以下组成的组的可变重链(VH)氨基酸序列：SEQ.ID.NO 7、15、23和31；和/或其中所述抗体分子包含选自由以下组成的组的可变轻链(VL)氨基酸序列：SEQ.ID.NO:8、16、24和32。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子是激动性抗体分子。

7.根据权利要求1或2所述的供使用的抗体分子，或根据权利要求3至6中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子选自由野生型或Fc工程化的人IgG抗体分子、人源化IgG抗体分子和人源的IgG抗体分子组成的组。

8.根据权利要求7所述的供使用的抗体分子或根据权利要求7所述的抗体分子，其中所述抗体分子是人IgG1、IgG2或IgG4抗体。

9.根据权利要求1或2所述的供使用的抗体分子，或根据权利要求3至8中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子是单克隆抗体。

10.根据权利要求1或2所述的供使用的抗体分子，其中所述抗体是根据权利要求3至9中任一项所述的抗体。

11.根据权利要求1或2所述的供使用的抗体分子，其中所述抗体分子是能够与根据权利要求3至9中任一项所述的抗体分子竞争结合LILRB3(ILT5)的抗体分子。

12.一种编码根据权利要求3至9中任一项所述的抗体分子的分离的核苷酸序列。

13.一种包含根据权利要求12所述的核苷酸序列的质粒。

14.一种包含根据权利要求12所述的核苷酸序列或根据权利要求13所述的质粒的细胞。

15.根据权利要求3至9中任一项所述的抗体分子、根据权利要求12所述的核苷酸序列、根据权利要求13所述的质粒和/或根据权利要求14所述的细胞，其用于医学。

16.一种根据权利要求3至9中任一项所述的抗体分子、根据权利要求12所述的核苷酸序列、根据权利要求13所述的质粒和/或根据权利要求14所述的细胞在制备用于治疗移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症的药物组合物中的用途。

17.一种特异性结合LILRB3(ILT5)的抗体分子在制备用于治疗移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症的药物组合物中的用途。

18.一种药物组合物，其包含或由根据权利要求3至9中任一项所述的抗体分子、根据权利要求12所述的核苷酸序列、根据权利要求13所述的质粒和/或根据权利要求14所述的细胞，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载体、媒介物和/或赋形剂组成。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症。

20.一种用于治疗患者的移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症的方法，其包含向所述患者施用治疗有效量的特异性结合LILRB3(ILT5)的抗体分子。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗体分子是特异性结合LILRB3(ILT5)的激动性抗体分子。

22.一种用于治疗患者的移植排斥、自身免疫性病症和/或炎性病症的方法，其包含向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求3至9中任一项所述的抗体分子、根据权利要求12所述的核苷酸序列、根据权利要求13所述的质粒和/或根据权利要求14所述的细胞。