KR20220154686A - Lilrb3 항체 분자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

인간 골수 세포의 재프로그래밍을 통해 이식 거부 또는 자가면역의 치료에 사용하기 위한 작용성 항-LILRB3 항체 분자와 같은 항-LILRB3 항체 분자가 기재되어 있다. 또한, 특이적 항-LILRB3 항체 분자 및 이러한 항체 분자의 의학에서, 예를 들어 이식 거부, 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료에서의 용도가 기재되어 있다.

Description

LILRB3 항체 분자 및 이의 용도

본 발명은 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 신규 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에서 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 이러한 신규 항체 분자 또는 다른 항체 분자의 용도에 관한 것이다.

인간 면역글로불린 유사 전사체(ITL)라고도 하는 인간 백혈구 면역글로불린(Ig) 유사 수용체(LILR) 패밀리는 면역 반응을 조절하는 6개의 활성화(LILRA1-6) 및 5개의 억제(LILRB1-5) LILR을 포함한다(1, 2). 두 수용체 아형 모두 2개 또는 4개의 상동성 C-2 유형 면역글로불린(Ig) 유사 세포외 도메인을 표시하지만, 막횡단 및 세포질 영역이 다르다(3, 4). LILRA는 막횡단 도메인에 하전된 아르기닌 잔기가 있는 짧은 절단된 세포질 도메인을 가지고 있어 ITAM을 포함하는 FcεR의 γ-사슬과 결합하여 활성화 신호 전달 캐스케이드를 전파할 수 있다(5). 반대로, LILRB는 억제 신호 전달을 유도하는 SHP-1 및 SHIP-1과 같은 포스파타제를 동원하는 여러 ITIM 도메인을 함유하는 긴 세포질 도메인을 갖는다(3, 4). 인간 염색체 19q13.4에 위치한 이러한 다유전자 수용체는 LILRB3(ILT5/CD85a) 및 LILRB4(ILT3/CD85k)가 적어도 15개의 다른 변이체를 표시하면서 유의한 대립유전자 변이를 나타낸다(3. 6).

억제성 LILRB는 명백한 면역 반응을 제어하고 제한하는 면역 체크포인트 역할을 하는 것으로 제안된다(1, 2). 이와 일치하여, LILRB 발현은 억제성(대안적으로 활성화된 또는 M2로도 지칭됨) 대식세포 및 관용성 수지상 세포(DC)에서 증가한다(7-10). 단핵구에서, LILRB1(ILT2/CD85j) 및 LILRB2(ILT4/CD85d)와 FcγRI(CD64)의 공동-결찰은 SHP-1 활성화를 야기하여 다운스트림 인산화 사건 및 세포내 칼슘 동원을 감소시킨다(11). HLA 부류 I(HLA-I) 리간드와의 결찰 시, LILRB1 및 LILRB2는 DC의 이동을 방지하고 항-염증성 사이토카인의 방출을 촉진한다(1, 12). 유사하게, 악성 세포에 대한 공통 HLA-I 하위단위 β2-마이크로글로불린에 의한 대식세포에 대한 LILRB1의 결합은 그들의 식세포 잠재력을 제한한다(13). LILRB는 또한 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 DC를 관용성으로 만들어 T 세포 반응을 억제하는 것으로 나타났다(7, 8, 12, 14, 15). 이와 같이, HLA-G와 LILRB1 및 LILRB2의 결합은 임신 중 태아-모체 경계면에서 중요한 면역억제 경로이다(16-18). LILRB1은 또한 NK 세포에서 발현되며 NK 세포 세포독성을 억제하는 것으로 보고되었다(19).

마우스는 LILRB를 발현하지 않지만, 상동성 쌍 Ig 유사 수용체(PIR)-B는 면역계의 다양한 아암을 조절한다. PIR-B는 CD8 세포에서 발현되는 MHC 부류 I과의 상호작용을 통해 DC에 의한 세포독성 T-림프구의 프라이밍을 조절하며(20); 호중구와 대식세포에서 인테그린 신호 전달에 부정적인 영향을 미친다(21). 또한, PIR-B는 종양 진행을 돕는 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 분화를 조절한다(22). PIR-B와 유사하게, HLA-G와 LILRB1 사이의 상호작용은 강력한 MDSC의 확장을 통한 동종이식 생착을 지원한다(23, 24).

억제성 LILRB 중에서, 4개의 세포내 ITIM 모티프를 함유하는 LILRB3(ILT5/LIR3/CD85a)는 골수 세포에 대한 상대적 제한 및 높은 발현으로 인해 매력적인 면역조절 표적을 제시한다(2). 1990년대 후반에 발견되었음에도 불구하고, 특정 시약과 모델 시스템이 부족하여 정확한 기능과 면역조절 가능성이 완전히 결정되지 않았다.

LILRB3의 잠재적 면역조절 능력을 연구하기 위해 BioInvent International AB의 독점 n-CoDeR^® 및 F.I.R.S.T^TM 플랫폼 기술을 사용하여 LILRB3 특이적 단일클론 항체(mAb) 패널을 생성하였다. 항체는 Ig 유사 도메인 2 및 4에서 2개의 주요하지만 별개의 에피토프에 결합한다. 1차 인간 단핵구 및 대식세포에 대한 LILRB3 결찰은 옵소닌화된 암 세포의 식균 작용 및 T 세포 증식의 유의한 감소를 포함하여 시험관 내에서 표현형 및 기능적 변화 및 면역 반응의 강력한 억제를 야기하였다. 중요하게도, 인간화 마우스에서 LILRB3의 표적화는 관용성 상태를 유도하고 동종 인간 림프종 세포의 향상된 생착을 허용하였다. 우리의 연구 결과는 인간 LILRB3의 면역 조절 기능을 밝히고 이식, 감염 및 자가면역에서 잠재적인 역할과 함께 중요한 골수성 면역 체크포인트로서의 잠재력을 확인한다.

본 발명에 이르게 된 작업은 다음과 같이 구성되었다:

ㆍ 인간 단일클론 항-LILRB3 항체 작용 활성 패널의 생성 및 특징 분석

ㆍ 인간 골수 세포에 대한 LILRB3의 결찰이 항-염증성 표현형을 유도하여 T 세포 증식의 후속 억제를 유도함을 입증

ㆍ 인간 대식세포에 대한 LILRB3 결찰이 옵소닌화된 표적 세포의 식균 작용을 억제함을 입증

ㆍ 작용성 항-LILRB3 항체가 인간화 마우스에서 내성을 유도하여 동종 세포의 성공적인 생착을 가능하게 함을 입증.

따라서, 본 발명은 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 항체 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항체 분자는 CDR VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 중 1 내지 6개를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 특이적 항체 분자에 관한 것이며,

VH-CDR1은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 1, 9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VH-CDR2는 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 2, 10, 18 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VH-CDR3은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 3, 11 및 19 및 27로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VL-CDR1은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 4, 12, 20 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VL-CDR2는 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 5, 13, 21 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VL-CDR3은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 6, 14, 22 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 상기 항체 분자 중 적어도 하나를 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나, 또는 상기 플라스미드 중 적어도 하나를 포함하는 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약물에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이식 거부의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 자가면역 장애(자가면역이라고도 함)의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이식 거부의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물은 이식 거부 반응의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 또한 또는 대안적으로 자가면역 장애의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 또한 또는 대안적으로 염증성 장애의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 이식 거부를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 자가면역 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 염증성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 첨부된 설명, 실시예 및/또는 도면을 참고하여 본원에 기재된 바와 같은, 항체 분자, 사용하기 위한 항체 분자, 단리된 뉴클레오티드 서열, 사용하기 위한 단리된 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 사용하기 위한 플라스미드, 세포, 사용하기 위한 세포, 용도, 약학 조성물 또는 치료 방법에 관한 것이다.

하기 실시예에서, 다음 도면이 참조된다:
도 1. 인간 LILRB3에 대한 완전한 인간 mAb의 생성. 도 1a: 생성된 LILRB3 클론의 스크리닝. FMAT를 수행하였고 scFv 클론을 LILRB3 표적 및 LILRB1 비-표적-형질감염된 세포에 대해 스크리닝하였다. MFI는 밝은 색으로 표시된 표적 특이적 scFv와 어두운 색으로 표시된 비-표적 scFv로 계산되었다. 도 1b: 유세포 분석에 의한 LILRB3 mAb의 스크리닝. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 LILR-형질감염된 CHO-S 세포를 His-태그된 scFv 상청액과 함께 배양한 후 항-His-AF647 염색을 하였다. 형질감염된 CHO-S 세포가 사용된 경우, LILRB1- 및 LILRB2-형질감염된 CHO-S 세포가 LILRB3에 대한 비-표적으로서 사용되었다. TIBCO Spotfire 소프트웨어를 사용하여 게이트된 단핵구 및 표적 형질감염된 CHO-S 세포 둘 모두에 대해 항체 클론을 비교했으며, LILRB3 특이적 클론은 밝은 회색으로, 비-특이적 클론은 어두운 회색으로, 관련 없는 이소형 대조군은 회색으로 강조 표시하였다. 도 1c: 인간 LILR-형질감염된 2B4 세포에 대한 LILRB3 클론의 특이성. LILRB3 mAb는 유세포 분석에 의해 표시된 LILR 패밀리 구성원으로 형질감염된 세포에 대해 시험되었다; 대표 클론(A16)이 제시된다. 도 1d 및 도 1e: 유세포 분석을 통해 1차 세포에 대한 LILRB 클론의 특이성을 시험한다. PBMC(도 1d) 또는 전혈(도 1e)은 표시된 바와 같이 APC 표지된 LILRB3(클론 A16) 또는 hIgG1 이소형뿐만 아니라 다양한 백혈구 표면 마커로 염색되었다. 히스토그램은 단핵구 및 B 세포(n=12), T 세포 및 NK 세포(n=12) 및 호중구(n=6)와 같은 여러 공여자의 대표 플롯이다.
도 2. LILRB3 항체의 특성 분석. 도 2a: SPR에 의해 평가된 LILRB3 mAb 친화도. LILRB3-hFc 재조합 단백질은 고정되었고 다양한 LILRB3 mAb가 칩을 가로질러 흘렀다. KD 값은 Biacore™ T100 평가 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 대표 LILRB3 클론이 표시된다. 도 2b: LILRB3 mAb(시판 LILRB3 mAb;(클론 222821, R&D Systems, UK))의 교차 차단 결합에 대한 생성된 mAb의 능력. PBMC를 비접합 LILRB3 항체 클론으로 염색한 후 직접 접합된 시판 LILRB3 mAb로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다; 표시된 바와 같이 대표 클론이 표시된다. 이소형 대조군(iso ctrl)은 회색으로 음영 처리되어 있으며 클론 222821 단독은 검정색으로 표시되고 표시된 LILRB3 클론과 함께 회색 선으로 표시된다. 도 2c: LILRB3 도메인 에피토프 맵핑. WT LILRB3(전장 세포외 부분), LILRB3-D1-3, LILRB3-D1-2 또는 LILRB3-D1으로 형질감염된 HEK293F 세포를 LILRB3 클론으로 염색한 후 항-hIgG-PE 2차 항체 염색을 수행하였다. 생성된 도메인 작제물의 개략도 및 표시된 각 작제물의 제한 다이제스트. 표시된 바와 같이 WT(D4), D3, D2 및 D1-발현 세포에 차등적으로 결합하는 2개의 대표 클론의 염색을 보여주는 히스토그램(n=3 독립적인 실험). 도 2d: LILRB3 2B4 리포터 세포를 10 μg/ml LILRB3 항체로 밤새 처리하여 작용 또는 길항을 평가하였다. 그런 다음 GFP 발현을 유세포 분석으로 측정하였다; 대표 클론이 표시된다.
도 3. LILRB3 결찰은 T 세포 활성화 및 증식을 조절함. CFSE 표지된 PBMC는 이소형 대조군(iso ctrl) 또는 LILRB3 mAb(10 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 인간 CD3 및 CD28에 대한 항체로 자극되었고 증식은 3 내지 5일 후 CFSE 희석을 통해 측정되었다. 도 3a: 처리 후 T 세포 활성화 및 증식 평가. 배양에서 PBMC 자극 후 광학 현미경 이미지. CD8+ T 세포 증식은 CFSE 희석을 통해 평가되었다; 대표 히스토그램이 표시된다. 도 3b: LILRB3 mAb는 SDS-PAGE에 의해 확인된 바와 같이 PNGase 처리를 통해 탈당화(Degly)되었으며; 대표 클론이 표시된다. 도 3c: T 세포 증식에 대한 탈당화된 LILRB3 mAb의 효과 평가. 다양한 LILRB3 mAb로 처리된 CD8+ T 세포의 CFSE 희석은 유세포 분석에 의해 평가되었다. 항-CD3/CD28 처리된 샘플에 대해 정규화된 데이터 및 실선으로 표시된 평균; 대표 클론이 표시된다. 양측 쌍 T-검정 수행 및 별표는 iso ctrl과 비교하여 유의한 차이 수준을 나타낸다(*** p<0.005); n=13-20 독립 공여자(각 점은 개별 공여자를 나타냄).
도 4. LILRB3 결찰은 대식세포 식세포 작용을 조절함. 도 4a: 인간 MDM을 항-CD14 및 항-LILRB3(A16)으로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 도 4b: MDM을 CFSE⁺ 리툭시맙-옵소닌화 표적 세포와 공동 배양하기 전에 탈당화된 이소형 대조군(iso ctrl) 또는 LILRB3 mAb(10 μg/ml)로 처리하였으며; 식균 작용은 다음 방정식을 사용하여 총 MDM(CD16⁺ 세포)의 백분율로서 이중 양성(CD16⁺ CFSE⁺ 세포)인 게이트된 살아 있는 세포의 수로 정의되었다:
(이중 양성 MDM / 총 MDM) x 100 = % 양성 MDM
도 4c: 식균 작용에 대한 탈당화된 LILRB3 mAb의 효과. 각 공여자는 세 번 수행되었으며 평균은 실선으로 표시되며(n=4-6 건강한 공여자); 대표 클론이 표시된다. 양측 쌍 T-검정이 수행되었으며 별표는 이소형 대조군과 비교하여 유의한 차이 수준을 나타낸다(* p<0.05, *** p<0.0005). 도 4d: 공초점 현미경으로 평가한 식균 작용에 대한 탈당화된 LILRB3 mAb의 효과. LILRB3 처리된 MDM(회색)을 CFSE로 표지된 B 세포(밝은 회색)와 공동 배양하고, 4% PFA로 고정하고, 막 당단백질을 비오틴화된 WGA로 염색하였다. 그런 다음 세포를 2차 스트렙타비딘-접합된 AF635와 배양하고 공초점 현미경으로 분석하였다.
도 5. LILRB3 결찰은 생체 내에서 내성을 유도한다. 완전히 재구성된 인간화 마우스(≥50% 순환 hCD45+ 백혈구)가 생성되었고 인간 LILRB3의 발현이 CD14+ 골수 세포에서 확인되었다. 도 5a: hCD45+ 골수 hCD14⁺ 골수 세포에 대한 LILRB3 발현을 보여주는 대표적인 유세포 분석 히스토그램; 짙은 회색의 이소형 대조군, 밝은 회색의 LILRB3. 도 5b: 인간화 마우스에 200 μg LILRB3 mAb(클론 A1) 또는 이소형 매치(hIgG1) 대조군 mAb를 각각 0일차 및 4일차에 i.v. 및 복강 내(i.p.) 주사하였다. 7일차에, 마우스에 1x10⁷ 비-자가 루시퍼라제⁺ 인간 림프종 세포를 복강 내 주사하였다. 림프종 세포 성장은 IVIS 이미저를 사용하여 시간 경과에 따라 모니터링되었으며, 3개의 독립적인 실험의 대표적인 이미지가 표시되었다(n=3 마우스/그룹).
도 6. 인간 LILRB3 결찰은 인간 1차 골수 세포를 재프로그래밍한다. 새롭게 단리된 인간 말초 CD14⁺ 단핵구를 이소형 대조군(iso ctrl) 또는 인간 LILRB3 mAb(클론 A1)로 처리하였다. 도 6a: 처리 후 단핵구 형태. 배양에서 표시된 mAb로 새로 단리된 CD14⁺ 단핵구를 밤새 처리한 후 광학 현미경 이미지. 도 6b: LILRB3 처리된 단핵구의 전사체 분석. mAb 처리(~18시간) 후 세포에서 RNA를 추출하고 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 왼쪽 패널은 상당히 상향 조절된 유전자 목록을 나타내고 오른쪽 패널은 iso ctrl 처리된 세포와 비교하여 상당히 하향 조절된 유전자를 나타낸다(n=4; 각 행은 개별 공여자를 나타냄). 도 6c: 1차 인간 CD14⁺ 단핵구 상의 LILRB3의 결찰은 M2 극성화 유전자를 유도한다. GSEA 그래프는 각각 이소형 대조군에 비해 LILRB3 처리된 단핵구에서 M2 극성화 유전자에 대한 유의한 농축을 보여준다. UP; 상향 조절, NES; 정규화된 농축 점수 = -1.68; FWER; 패밀리별 오류율 p <0.001. 도 6d: 단핵구에서 LILRB3 결찰 후 선택된 유전자의 qPCR 분석. 데이터를 GAPDH mRNA 수준으로 정규화하고 이소형 대조군 처리된 단핵구 수준으로 표준화하였다. 폴드 차이 데이터는 log10으로 변환되었다. Bonferroni의 다중 비교 검정을 사용한 일방향 ANOVA가 수행되었으며, n=3 독립 공여자(** p < 0.005, *** p < 0.0005)였다. 도 6e: 'IFN-γ'(NES=-2.17; FWER p <0.001), 'IFN-α'(NES=-2.3; FWER p <0.001) 및 '동종 이식 거부'(NES=-1.58; FWER p=0.14) 신호 전달 요소와의 음의 상관 관계 및 '산화적 인산화'와 양의 상관 관계(NES=2; FWER p <0.001)를 보여주는 GSEA 분석. 도 6f: APC에 결찰 후 LILRB3의 면역억제 기능을 보여주는 개략도.

따라서, 본 발명은 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 이러한 맥락에서, 용어 "항-LILRB3 항체 분자"와 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자"(또는 각각 "항-ILT5 항체 분자" 및 "ILT5에 특이적으로 결합하는 항체 분자")는 LILRB3(ILT5)의 세포외 도메인 내 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 지칭한다. 세포 표면 항원 및 에피토프는 면역학 또는 세포 생물학의 당업자에 의해 용이하게 이해될 수 있는 용어이다.

단백질 결합 평가 방법은 생화학 또는 면역학의 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 이 방법이 항체의 표적에 대한 결합뿐만 아니라 이들 상호작용의 상대적 강도, 또는 특이성, 또는 억제, 또는 방지 또는 감소를 평가하는데 사용될 수 있다는 점을 인지할 것이다. 단백질 결합을 평가하는데 사용될 수 있는 방법의 예는 예를 들어 면역검정, Biacore, 웨스턴 블롯, 방사면역검정(RIA: radioimmunoassay) 및 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 유세포 분석법(FACS)이다. 항체 특이성에 관한 논의에 대해서는 문헌[Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336 (1989)]을 참조한다.

본 발명에 따라 항체 분자가 결합하는 LILRB3를 발현하는 표적 세포는 단핵구 및 대식세포를 포함하는 인간 골수 세포와 같은 임의의 LILRB3 발현 세포일 수 있다.

임의의 특정 메커니즘에 얽매이지 않고, 하나의 가설은 LILRB3에 대한 본 발명에 따른 항체 분자의 결합 효과가 ITIM 도메인의 인산화를 유도할 수 있다는 것이다. LILRB3은 4개의 세포내 ITIM을 함유한다. 이는 차례로 세포 활성화를 억제하고 골수 세포에 의한 면역억제 유전자의 생산을 유도한다. 이는 인간 단핵구의 RNAseq 분석을 보여주는 아래의 예에서 자명하다.

일부 실시형태에서, 작용성 활성은 LILRB3에 대한 결합 이외에 Fcγ 수용체에 결합하는 항체 분자에 의해 개선될 수 있다. 이러한 일부 실시형태에서, 작용성 비-차단 LILRB3 항체 분자는 활성화 Fcγ 수용체보다 억제성 Fcγ 수용체에 더 높은 친화도로 결합한다. 활성화 Fcγ 수용체보다 억제성 Fcγ 수용체에 대한 더 높은 친화도라는 것에, 본 발명자들은 개별 활성화 Fcγ 수용체에 비해, 예를 들어, FcγRIIA, FcγRIIIA 및 FcγRI 중 하나에 비해, 억제성 Fcγ 수용체에 더 높은 친화도로 결합하는 변이체의 의미를 포함시킨다.

마우스와 인간 FcγR 시스템 간의 비교적 높은 상동성은 종 사이에 보존된 FcγR 매개된 메커니즘의 많은 일반적인 양태를 고려한다. 그러나, 마우스 및 인간 IgG 하위부류는 동족 FcγR에 대한 친화도가 상이하여, 마우스 시스템에서 FcγR-매개 관찰을 인간 IgG-기반 치료제로 번역하여 항체, 항체 하위부류 및/또는 조작된 하위부류 변이체를 선택하는 것을 중요하게 만들고, 이는 인간 활성화 대 억제 FcγR에 대한 적절한 결합을 나타낸다. 개별 인간 FcγR에 대한 인간 항체 분자의 친화도 및/또는 결합활성(avidity)은 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 결정될 수 있다.

일부 실시형태에서, Fc 수용체에 대한 결합은 작용성 항체 분자의 Fc 영역과 Fc 수용체 사이의 정상적인 상호작용을 통해 발생한다. 이러한 일부 실시형태에서, 항체 분자는 IgG이며, 이는 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 영역을 갖는다. 이러한 일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체는 인간 억제성 FcγRIIB 및 인간 활성화 FcγRIIA 및 FcγRIIIA에 대해 유사한 중간 친화도를 갖지만, 인간 활성화 FcγRI과 생산적으로 결합하지 않는 인간 IgG2 이소형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체는 IgG2에 비해 더 높은 친화도로 FcγRIIB에 결합하지만, 더 높은 친화도로 활성화 인간 활성화 FcγRIIA, FcγRIIIA에 또한 결합하고, 활성화 FcγRI에 높은 친화도로 추가로 결합하는 인간 IgG1 이소형을 갖는다. 다른 실시형태에서, 항-LILRB3 항체는 FcγRIIB에 대한 향상된 결합을 위해 조작된(예를 들어 "SELF" 돌연변이)(문헌[Chu et al. "Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies." Mol Immunol. 2008 Sep;45(15):3926-33]) 및/또는 활성화 FcγR과 비교하여 FcγRIIB에 대한 상대적으로 향상된 결합을 위해 조작된(예를 들어, V9 또는 V11 돌연변이)(문헌[Mimoto et al. "Engineered antibody Fc variant with selectively enhanced FcγRIIb binding over both FcγRIIa^R131 and FcγRIIa^H131". Protein Eng Des Sel. 2013 Oct; 26(10): 589-598]) 인간 IgG이다. 억제성 FcγRIIB에 대한 향상된 결합을 위해서 또는 FcγRIIA가 아니라 특이적으로 억제성 FcγRIIB에 대한 특이적으로 향상된 결합 친화도를 위해서 조작된 이러한 IgG 변이체는 활성화 및 억제성 FcγR을 위해서 인간화 동물에서 CD40 작용제 항체 CP-870,893의 생체 내 작용제 활성 및 치료 활성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Dahan et al. 2016. 'Therapeutic Activity of Agonistic, Human Anti-CD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcgammaR Engagement', Cancer Cell, 29: 820-31]).

작용성 항체 분자가 LILRB3 이외에 결합할 수 있는 Fc 수용체는 골수 기원 세포, 예컨대 대식세포, 단핵구, MDCS, 호중구, 비만 세포, 호염기구, 또는 수지상 세포의 표면 상에서, 또는 림프구, 예컨대, NK 세포, B 세포, 또는 특정 T 세포의 표면 상에서 발견되는 수용체이다.

다른 실시형태에서, 항체 분자는 IgG1 항체 분자의 탈당화된 또는 비당화된 변이체와 같은 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 비당화는 예를 들어 항체 사슬에서 위치 297에서 아스파라긴의 아미노산 치환(N297X)에 의해 달성될 수 있다. 치환은 글루타민(N297Q), 또는 알라닌(N297A), 또는 글리신(N297G), 또는 아스파라긴(N297D), 또는 세린(N297S)으로 행해질 수 있다. 다른 치환은 예를 들어 문헌[Jacobsen FW et al., JBC 2017, 292, 1865-1875](예를 들어, 표 1 참조)에 기재되어 있고; 이러한 추가적인 치환은 L242C, V259C, A287C, R292C, V302C, L306C, V323C, I332C 및/또는 K334C를 포함한다.

항체는 면역학 및 분자 생물학 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 항체는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 본원에서, 본 발명자들은 때때로 이 완전한 항체 분자를 전체-크기(full-size) 또는 전장 항체라고 지칭한다. 항체의 중쇄는 1개의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)를 포함하고, 항체의 분자 경쇄는 1개의 가변 도메인(VL) 및 1개의 불변 도메인(CL)을 포함한다. 가변 도메인(때때로 집합적으로 F_V 영역으로서 지칭됨)은 항체의 표적, 또는 항원에 결합한다. 각 가변 도메인은 표적 결합을 담당하는 상보적 결정 영역(CDR)으로서 지칭되는 3개의 루프를 포함한다. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체 또는 면역글로불린은 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5가지의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 존재하고, 인간에서 이들 중 몇 가지는 하위부류(이소형): 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉜다.

항체의 또 다른 부분은 Fc 영역(달리, 단편 결정화 도메인으로서 공지됨)으로, 이는 항체의 각 중쇄의 2개의 불변 도메인을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, Fc 영역은 항체와 Fc 수용체 사이의 상호작용을 담당한다.

본원에서 사용되는 용어 항체 분자는 전장 또는 전체-크기 항체뿐 아니라 전장 항체의 기능성 단편 및 이러한 항체 분자의 유도체를 포함한다.

전체-크기 항체의 기능성 단편은 상응하는 전체-크기 항체와 동일한 항원 결합 특징을 갖고, 동일한 가변 도메인(즉, VH 및 VL 서열) 및/또는 상응하는 전체-크기 항체와 동일한 CDR 서열을 포함한다. 기능성 단편이 항상 상응하는 전체-크기 항체 중 모든 6개의 CDR을 함유하는 것은 아니다. 3개 이하의 CDR 영역(일부 경우에, 심지어 단일 CDR 또는 이의 일부)을 함유하는 분자는 CDR(들)이 유래된 항체의 항원-결합 활성을 보유할 수 있는 것으로 인지된다. 예를 들어, 문헌[Gao et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 32389-93]에서는, 전체 VL 사슬(3개의 모든 CDR 포함)이 이의 기질에 대한 높은 친화성을 갖는 것으로 기재되어 있다.

2개의 CDR 영역을 함유하는 분자가 예를 들어 문헌[Vaughan & Sollazzo 2001, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417-430]에 기재되어 있다. 418 페이지(오른쪽 열 - 3 우리의 설계 전략)에서, 프레임 영역 내 산재된 H1 및 H2 CDR 고가변 영역만을 포함하는 미니바디(minibody)가 기재되어 있다. 미니바디는 표적에 결합할 수 있는 것으로서 기재되어 있다. 문헌[Pessi et al., 1993, Nature, 362: 367-9] 및 문헌[Bianchi et al., 1994, J. Mol. Biol., 236: 649-59]은 Vaughan & Sollazzo에 의해 참조되며, H1 및 H2 미니바디 및 이것의 특성을 보다 자세히 설명한다. 문헌[Qiu et al., 2007, Nature Biotechnology, 25:921-9]에서, 2개의 연결된 CDR로 이루어진 분자가 항원을 결합할 수 있음이 입증되었다. 문헌[Quiocho 1993, Nature, 362: 293-4]은 "미니바디" 기술의 요약을 제공한다. 문헌[Ladner 2007, Nature Biotechnology, 25:875-7]은 2개의 CDR을 함유하는 분자가 항원-결합 활성을 보유할 수 있다는 점을 언급하였다.

단일 CDR 영역을 함유하는 항체 분자는 예를 들어, 문헌[Laune et al., 1997, JBC, 272: 30937-44]에 기재되어 있는데, 여기서 CDR로부터 유래된 다양한 헥사펩티드가 항원-결합 활성을 보이는 것이 입증되었고, 완전한, 단일 CDR의 합성 펩티드는 강한 결합 활성을 나타내는 것이 주목된다. 문헌[Monnet et al., 1999, JBC, 274: 3789-96]에서, 다양한 12-머 펩티드 및 연관된 프레임워크 영역이 항원-결합 활성을 갖는 것을 나타내며, CDR3-유사 펩티드 단독이 항원을 결합할 수 있다고 언급되어 있다. 문헌[Heap et al., 2005, J. Gen. Virol., 86: 1791-1800]에서는, "마이크로-항체"(단일의 CDR을 함유하는 분자)가 항원을 결합할 수 있다고 보고되어 있고, 항-HIV 항체로부터의 시클릭 펩티드가 항원-결합 활성 및 기능을 갖는 것으로 나타내어져 있다. 문헌[Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13:1882-91]에서는, 단일의 CDR이 항원-결합 활성 및 이것의 리소자임 항원에 대한 친화성을 부여할 수 있는 것으로 제시되어 있다.

따라서, 5개, 4개, 3개 또는 그보다 적은 개수의 CDR을 갖는 항체 분자는 이들이 유래된 전장 항체의 항원 결합 특성을 보유할 수 있다.

항체 분자는 또한 전장 항체의 유도체 또는 이러한 항체의 단편일 수 있다. 유도체가 사용되는 경우, 이것이 전장 항체와 표적 상 동일한 에피토프에 결합한다는 의미에서 상응하는 전장 항체와 동일한 항원 결합 특성을 가져야 한다.

따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체 분자"는 하기를 포함하는 모든 유형의 항체 분자 및 이의 기능성 단편 및 이의 유도체를 포함한다: 단일클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간 기원의 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 Fv(scFv), Fab 단편, F(ab')₂ 단편, F(ab') 단편, 디설파이드 연결된 Fv(sdFv), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄의 동종이량체, 항체 경쇄의 동종이량체, 항체 중쇄의 이종이량체, 항체 경쇄의 이종이량체, 이러한 동종이량체 및 이종이량체의 항원 결합 기능성 단편.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "항체 분자"는 달리 특별히 언급되지 않는 한, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, 및 IgE를 포함하는, 모든 부류의 항체 분자 및 기능성 단편을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 항체 분자, 인간화 항체 분자 또는 인간 기원의 항체 분자이다. 이러한 맥락에서, 인간화 항체 분자는 인간 항체와 유사성을 증가시키기 위해 변형된 원래의 비-인간 항체를 의미한다. 인간화 항체 분자는 예를 들어 원래 뮤린 항체 또는 라마 항체일 수 있다. 이러한 맥락에서, 인간 기원의 항체 분자는 원래의 인간 항체 분자가 변형된 것을 의미한다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 IgG 항체이다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 야생형 IgG 항체이다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 예를 들어 N297Q 또는 N297A 치환과 같은 위치 297에서 아스파라긴의 치환을 포함하는 것과 같은 비당화된 또는 탈당화된 IgG 항체 분자를 포함하는 상기 언급된 것과 같은 Fc 조작된 IgG 항체이다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 IgG1 항체이다. 인간 IgG1 항체는 뮤린 IgG2a 항체에 상응하므로, 인간 IgG1에 대한 뮤린 대용체가 사용되는 경우(예를 들어, 생체 내 연구의 경우), 뮤린 IgG2a 형식이 사용된다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 IgG2 항체이다. 인간 IgG2 항체는 뮤린 IgG3 항체에 상응하므로, 인간 IgG2에 대한 뮤린 대용체가 사용되는 경우(예를 들어, 생체 내 연구의 경우), 뮤린 IgG3 형식이 사용된다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 IgG4 항체이다. 인간 IgG4 항체는 뮤린 IgG1 항체에 상응하므로, 인간 IgG4에 대한 뮤린 대용체가 사용되는 경우(예를 들어, 생체 내 연구의 경우), 뮤린 IgG1 형식이 사용된다.

Fc 변형은 인간과 뮤린 분자 간 다양할 수 있으며; 예를 들어 뮤린 N297A IgG2a 항체 분자가 인간 N297Q IgG1 항체 분자의 대용체로 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체는 단일클론 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체는 다클론 항체이다.

상기에 개략된 바와 같이, 항체 분자의 상이한 유형 및 형태가 본 발명에 포함되며, 면역학 분야의 당업자에게 공지될 것이다. 치료 목적으로 사용되는 항체는 종종 항체 분자의 특성을 변형시키는 추가적인 성분으로 변형된다는 것이 널리 공지되어 있다.

따라서, 본 발명자들은 본원에 기재된 항체 분자 또는 본원에 기재된 바와 같이 사용되는 항체 분자(예를 들어, 단일클론 항체 분자 및/또는 다클론 항체 분자 및/또는 이중특이적 항체 분자)가 검출 가능한 모이어티 및/또는 세포독성 모이어티를 포함한다는 것을 포함한다.

"검출 가능한 모이어티"에, 본 발명자들은 효소; 방사성 원자; 형광 모이어티; 화학발광 모이어티; 생물발광 모이어티를 포함하는 군으로부터 하나 이상을 포함한다. 검출 가능한 모이어티는 항체 분자가 시험관 내 및/또는 생체 내 및/또는 생체 외에서 시각화될 수 있게 한다.

"세포독성 모이어티"에, 본 발명자들은 방사성 모이어티, 및/또는 효소(예를 들어, 여기서 효소는 카스파제) 및/또는 독소(예를 들어, 여기서 독소는 박테리아 독소 또는 독물임)을 포함하며; 세포독성 모이어티는 세포 용해를 유도할 수 있다.

본 발명자들은 항체 분자가 단리된 형태 및/또는 정제된 형태일 수 있고/있거나 PEG화될 수 있음을 추가로 포함한다. PEG화는 폴리에틸렌 글리콜 중합체가 항체 분자 또는 유도체와 같은 분자에 첨가되어 그 거동을 변형하는, 예를 들어 이것의 유체역학적 크기를 증가시키는 것에 의해 반감기를 연장시키고, 신장 클리어런스를 방지하는 방법이다.

상기 논의된 바와 같이, 항체의 CDR은 항체 표적에 결합한다. 본원에서 기재된 각 CDR에 아미노산을 할당하는 것은 문헌[Kabat EA et al. 1991, In "Sequences of Proteins of Immunological Interest" Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, pp xv-xvii]에 따른 정의에 따른다.

당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 아미노산을 각 CDR에 할당하기 위한 다른 방법이 또한 존재한다. 예를 들어, International ImMunoGeneTics information system(IMGT(R))(http://www.imgt.org/ and Lefranc and Lefranc "The Immunoglobulin FactsBook" published by Academic Press, 2001).

일부 실시형태에서, LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 하기 표 1에 열거된 VH-CDR1 서열 중 하나를 포함한다.

일부 실시형태에서, LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 하기 표 1에 열거된 VH-CDR2 서열 중 하나를 포함한다.

일부 실시형태에서, LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 하기 표 1에 열거된 VH-CDR3 서열 중 하나를 포함한다.

일부 실시형태에서, LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 하기 표 1에 열거된 VL-CDR1 서열 중 하나를 포함한다.

일부 실시형태에서, LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 하기 표 1에 열거된 VL-CDR2 서열 중 하나를 포함한다.

일부 실시형태에서, LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 하기 표 1에 열거된 VL-CDR3 서열 중 하나를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체 분자는 가변 중쇄(VH) 내의 3개의 CDR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 분자이다:

SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2 및 SEQ. ID. NO: 3;

SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10 및 SEQ. ID. NO: 11;

SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18 및 SEQ. ID. NO: 19; 및

SEQ. ID. NO: 25, SEQ. ID. NO: 26 및 SEQ. ID. NO: 27.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체 분자는 가변 경쇄(VL) 내의 3개의 CDR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 분자이다:

SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5 및 SEQ. ID. NO: 6;

SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13 및 SEQ. ID. NO: 14;

SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ. ID. NO: 22; 및

SEQ. ID. NO: 28, SEQ. ID. NO: 29 및 SEQ. ID. NO: 30.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체 분자는 SEQ. ID. NO: 7, 15, 23 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체 분자는 SEQ. ID. NO: 8, 16, 24 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서 항-LILRB3 항체 분자는SEQ. ID. NO: 41을 갖는 CH를 포함한다.

일부 실시형태에서 항-LILRB3 항체 분자는SEQ. ID. NO: 42를 갖는 CL을 포함한다.

상기 표 1의 서열은 모두 인간 기원이고, 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이, n-CoDeR^® 라이브러리로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 LILRB3에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 또한 하기 표 2에 열거된 불변 영역(CH 및/또는 CL) 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

상기 표 2의 CH(SEQ. ID. NO: 33) 및 (SEQ. ID. NO: 34) 서열은 인간 기원이다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 LILRB3)에 결합한다. 일부 이러한 실시형태에서, 항체 분자는 인간 LILRB3에 강하게 결합하는 것, 즉 낮은 EC50 값을 갖는 것이 바람직하다.

일부 실시형태에서, 항체 분자가 인간 LILRB3 및 사이노몰구스 원숭이 LILRB3(cmLILRB3 또는 사이노 LILRB3) 둘 모두에 결합하는 것이 유리하다. 크랩-이팅 마카크(crab-eating macaque) 또는 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)로도 지칭되는 사이노몰구스 원숭이의 세포에서 발현되는 LILRB3과의 교차 반응성이 유리할 수 있는데, 그 이유는 이것이 특히 내약성에 초점을 맞춘 대용체 항체를 사용하지 않고도 항체 분자의 동물 시험을 가능하게 할 수 있기 때문이다.

일부 실시형태에서, 마우스의 관련 생체 내 모델에서 항체 분자의 기능적 활성을 시험하기 위해 대용체 항체를 사용하는 것이 필요하다. 인간에서 항체 분자의 효과와 마우스에서 대용체 항체에 대한 생체 내 결과 간의 비교 가능성을 보장하기 위해서, 인간 항체 분자와 동일한 시험관 내 특성을 갖는 기능적으로 동등한 대용체 항체를 선택하는 것이 필수적이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 따라서 사용되는 항체 분자는 LILRB3에 대한 결합에 대해서, 본원에 제공된 특이적 항체와 경쟁할 수 있는, 예를 들어, SEQ. ID. NO: 7, 15, 23 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된 VH; 및/또는 SEQ. ID. NO: 8, 16, 24 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체 분자와 경쟁할 수 있는, 항체 분자이다.

"경쟁할 수 있는"이란, 경쟁 항체가 본원에서 정의된 바와 같은 항체 분자의 특정 표적 LILRB3에 대한 결합을 적어도 부분적으로 억제하거나 그렇지 않으면 방해할 수 있다는 것을 의미한다.

예를 들어, 이러한 경쟁 항체 분자는 LILRB3에 대한 본원에 기재된 항체 분자의 결합을 적어도 약 10%; 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%만큼 억제할 수 있다.

경쟁 결합은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 당업자에게 익히 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

ELISA 검정은 에피토프-변형 또는 차단 항체를 평가하는데 사용될 수 있다. 경쟁 항체를 동정하기에 적합한 추가적인 방법은 본원에서 참조로 포함되는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane(예를 들어, 페이지 567 내지 569, 574 내지 576, 583 및 590 내지 612, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2 참조)]에 개시되어 있다.

일부 실시형태에서, 항-LILRB3 항체 분자 자체가 아니라 이러한 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명은 상기 항-LILRB3 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

상기 기재된 항체 분자 및 뉴클레오티드 서열, 또는 다른 항-LILRB3 항체 분자 또는 이러한 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 약물에 사용될 수 있고, 이러한 항체 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 약학 조성물에 포함될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및/또는 약학 조성물은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 이식 거부의 치료에 사용될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및/또는 약학 조성물은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 자가면역 장애의 치료에 사용될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및/또는 약학 조성물은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 염증성 장애의 치료에 사용될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 이식 거부의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

항-LILRB3 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및/또는 약학 조성물은 환자에서 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서 치료적 유효량의 항-LILRB3 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및/또는 약학 조성물이 환자에게 투여된다.

본원에 개시된 바와 같이 치료될 수 있는 이식 거부 반응의 예는 수용자가 이식에서 대체되는 장기에 영향을 미치는 질환 또는 손상으로 고통받는 경우 공여자로부터 수용자에게 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 장의 이식과 같은 장기 이식 또는 기관 이식과 관련된 거부를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이 치료될 수 있는 이식 거부의 또 다른 예는 조혈 줄기 세포(HSC)와 같은 줄기 세포가 일치하는 공여자로부터 수집되어 환자에게 이식되어 질환을 억제하고 환자의 면역 체계를 회복시키는 동종 이식의 거부를 포함한다.

적어도 일부 실시형태에서, 이식편의 수용자는 이식 전에 작용성 LILRB3 mAb를 투여함으로써 사전 컨디셔닝되어야 한다. 일부 실시형태에서, 이식편의 수용자는 또한 이식 후 작용성 LILRB3 mAb로 처리되어야 한다.

본원에 기재된 항체 분자, 약학 조성물 및 치료는 수용자에 의한 새로운 장기 또는 기타 이식의 거부를 예방, 치료 또는 최소화하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이 치료될 수 있는 자가면역 장애 또는 자가면역의 예는 셀리악병, 제1형 당뇨병, 유육종증, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 쇼그렌 증후군, 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반병, 애디슨병, 류마티스 관절염(RA), 강직성 척추염, 다발성 근염(PM), 피부근염(DM) 및 다발성 경화증(MS)을 포함한다.

본원에 개시된 바와 같이 치료될 수 있는 염증성 장애의 예는 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 및 다발성 경화증(MS)과 같은 만성 염증성 장애, 및 패혈증과 같은 급성 염증성 장애 둘 모두를 포함한다.

약물은 예를 들어 이것이 신체에 의해 흡수되는 속도를 변경하도록 상이한 첨가제로 변형될 수 있고; 예를 들어 신체로의 특정 투여 경로를 허용하도록 상이한 형태로 변형될 수 있다는 점이 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

따라서, 본 발명자들은 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포가 약학 조성물 중에 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제, 비히클 및/또는 아주반트와 조합될 수 있는 것을 포함시킨다. 이러한 맥락에서, 용어 약학 조성물은 용어 약학 제제, 약학 제형, 치료 조성물, 치료 제제, 치료 제형 및 치료 엔티티와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 기재된 약학 조성물은 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 또는 세포를 포함할 수 있거나, 또는 일부 실시형태에서 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 또는 세포로 이루어질 수 있다.

본원에 기재된 약학 조성물은 일부 실시형태에서 상기에 기재된 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 이루어지거나 이것을 포함한다.

본 발명은 또한 항체 약물 접합체, 융합 단백질 등과 같은 약물의 다른 치료 양식 또는 "형상" 및 이러한 치료 양식을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.

본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약학 조성물은 항산화제 및/또는 완충제 및/또는 정균제, 및/또는 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수용성 및/또는 비수용성 멸균 주사 용액; 및/또는 현탁화제 및/또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및/또는 비수성 멸균 현탁액을 포함하는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약학 조성물은 단위 용량 또는 다회 용량 용기, 예를 들어 밀봉 앰플 및 바이알에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조(즉, 동결 건조) 조건에서 저장될 수 있다.

즉석의 주입 용액 및 현탁액은 멸균 분말 및/또는 과립 및/또는 전술한 종류의 정제로부터 제조될 수 있다.

인간 환자에 대한 비경구 투여의 경우, 항-LILRB3 항체 분자의 1일 투여량 수준은 일반적으로 1 mg/kg 환자 체중 내지 20 mg/kg일 것이거나, 또는 일부 경우에서는 단일 투여 또는 분할 투여로 심지어 100 mg/kg까지 투여될 수 있다. 더 낮은 투여량이 특별한 상황에서, 예를 들면 장기간 투여와 병용될 때 이용될 수 있다. 어떤 경우에서도 의사는 개별 환자에게 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 것이며, 이것은 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 가변적일 것이다. 상기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 장점이 되는 개별 사례가 존재할 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 있다.

전형적으로, 항체 분자를 포함하는 본원에 기재된 약학 조성물(또는 약제)은 항-LILRB3 항체 분자를 대략 2 mg/ml 내지 150 mg/ml 또는 대략 2 mg/ml 내지 200 mg/ml의 농도로 함유할 것이다.

일반적으로, 인간에서, 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약학 조성물의 경구 또는 비경구 투여가 바람직한 경로이며, 이는 가장 편리하다. 수의학적 사용을 위해서, 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약학 조성물은 일반적인 수의학적 실시에 따라서 적합하게 허용 가능한 제형으로서 투여되고, 수의사는 특정 동물에 가장 적절할 투여 요법 및 투여 경로를 결정할 것이다. 따라서, 본 발명은 (상기 기재되고 추가로 하기에 기재된 바와 같이) 다양한 병태를 치료하는데 유효한 양의 본 발명의 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약학 조성물은 정맥내(IV 또는 i.v.); 근육내(IM 또는 i.m.); 피하(SC 또는 s.c.)를 포함하는 군으로부터 선택된 경로에 의해서 전달되도록 개작된다.

본 발명은 또한 본 발명의 표적 결합 분자 또는 부분의 약학적으로 허용되는 산 또는 염기 부가염을 포함하는 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 상술된 염기 화합물의 약학적으로 허용되는 산 부가염을 제조하는데 사용된 산은 무독성 산 부가염, 즉 약리학적으로 허용 가능한 음이온을 함유하는 염, 예컨대 그중에서도 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 니트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 바이타르트레이트, 석시네이트, 말레에이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 사카레이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트 [즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3 나프토에이트)]염을 형성하는 것이다. 약학적으로 허용되는 염기 부가염이 또한 본 발명에 따른 작용제의 약학적으로 허용되는 염 형태를 생성하는데 사용될 수도 있다. 본질적으로 산성인 본 작용제의 약학적으로 허용되는 염기 염을 제조하는데 시약으로서 사용될 수 있는 화학 염기는 이러한 화합물과 무독성 염기 염을 형성하는 것이다. 이러한 무독성 염기 염은 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 이러한 약학적으로 허용되는 양이온, 예컨대 알칼리 금속 양이온(예를 들어, 포타슘 및 소듐) 및 알칼리토금속 양이온(예를 들어, 칼슘 및 마그네슘)으로부터 유래된 것, 암모늄 또는 수용성 아민 부가염, 예컨대, N-메틸글루카민-(메글루민), 및 저급 알칸올암모늄 및 약학적으로 허용되는 유기 아민의 다른 염기 염을 포함한다. 본원에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포는 저장을 위해 동결 건조될 수 있고 이용 전에 적합한 담체에 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결 건조 방법(예를 들어, 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기술을 이용할 수 있다. 동결 건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실(예를 들어, 통상적인 면역글로불린, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 갖는 경향이 있음)을 야기할 수 있다는 점 및 이용 수준이 보상하기 위해 상향 조절되어야 할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 동결 건조된(냉동 건조된) 폴리펩티드 결합 모이어티는 재수화될 때 이것의 활성(동결 건조 이전)의 약 20% 이하, 또는 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하를 손실시킨다.

본원에 기재된 항-LILRB3 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및 약학 조성물은 대상체 또는 환자에서 이식 거부 또는 자가면역의 치료에 사용될 수 있다. 본원에서, 용어 대상체 및 환자는 같은 상호 교환적으로 사용된다.

본원에 사용되는 용어 "환자"(또는 대상체)는 이식 거부 또는 자가면역을 앓고 있는 것으로 진단되고/진단되거나 이식 거부 또는 자가면역을 앓고 있는 증상을 나타내는 인간을 포함하는 동물을 지칭한다.

일부 실시형태에서, 환자(또는 대상체)는 이식 거부 또는 자가면역을 앓고 있는 것으로 진단된 인간을 포함하는 동물이다. 일부 실시형태에서, 환자(또는 대상체)는 이식을 받을 것이므로 이식 거부의 위험이 있는 인간을 포함하는 동물이며; 본원에서 논의된 치료는 그 후 예방 치료로서 또는 예방 목적으로 수행된다.

일부 실시형태에서, 환자(또는 대상체)는 이식 거부 또는 자가면역을 갖는 것으로 진단되고/진단되거나 이식 거부 또는 자가면역의 증상을 나타내는 인간을 포함하는 포유류 또는 비-포유류 동물이다.

치료는 치료 과정으로서 투여될 수 있으며, 즉 치료제가 일정 기간에 걸쳐 투여된다. 치료 과정의 시간은 다수의 인자에 따라 달라질 수 있으며, 여기에는 투여되는 치료제의 유형, 치료되는 암의 유형, 치료되는 암의 중증도 및 환자의 연령 및 건강 상태, 그중에서도 이유가 포함될 것이다.

"치료 동안"에는 환자는 현재 치료 과정을 수여받는 중이고/거나 치료제를 수여받는 중이고/거나 치료제 과정을 수여 중인 것이 포함된다.

실시예

본 발명의 특정 양태를 구현하는 구체적이고 비제한적인 예가 이제 설명될 것이다.

재료 및 방법

윤리 선언문

인간 샘플 및 마우스에 대한 모든 연구는 기관 지침, 헬싱키 선언 및 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 미국 보건 복지부 지침에 따라 수행되었다. MIT(Massachusetts Institute of Technology)의 동물 관리 위원회(Committee on Animal Care)는 여기에 설명된 연구를 검토하고 승인하였다. 모든 인간 샘플(성인 말초 혈액 및 태아 간)은 제3자의 사전 동의 하에 익명으로 수집하였으며 연구를 위해 구입하였다. 인간 말초혈액의 경우, 임상 샘플 사용에 대한 윤리적 승인은 사전 동의 제공 후 Southampton University Hospitals NHS Trust; Southampton 및 South West Hampshire 연구 윤리 위원회에서 획득하였다. 원발성 만성 림프구성 백혈병(CLL) 샘플은 LPD 연구 LREC 번호 228/02/T의 일부로 Human Tissue Authority의 허가를 받은 University of Southampton, Cancer Science Unit Tissue Bank에서 출시되었다.

조혈 줄기/전구 세포(HSPC) 단리 및 인간화 마우스 생성

인간 태아 간은 기관 윤리 가이드라인(Advanced Bioscience Resources, Inc., CA, USA)에 따라 임신 15 내지 23주에 낙태된 태아로부터 수득하였다. 모든 여성에게 연구를 위한 태아 조직 기증에 대해 서면 동의를 받았다. 임신 종료 후 2시간 이내에 태아를 채취하였다. 태아 간 조직을 먼저 작은 조각으로 절단하고 주기적 혼합과 함께 37℃에서 30분 동안 콜라게나제 VI(둘베코의 변형된 독수리 배지[DMEM] 중 2 mg/ml)로 소화시켰다. 소화된 조직을 100 μm 세포 여과기(BD Biosciences, NJ, USA)에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 제조하였다. CD34⁺ 세포는 CD34⁺ 선택 키트(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 정제되었다; CD34⁺ 세포의 순도는 90% 내지 99%였다. 살아있는 세포는 죽은 세포의 트리판 블루 배제에 의해 카운트되었다. 모든 세포는 멸균 조건에서 단리되었다.

NSG 마우스는 Jackson Laboratories(미국 메인주 바 하버)에서 구입하여 MIT의 동물 시설에서 특정 병원체가 없는 조건에서 유지하였다. 이전에 보고된 바와 같이, 생쥐를 재구성하기 위해, 갓 태어난 새끼(2일 미만)에 CD34+CD133+ 세포(약 2 × 10⁵ 세포/수용자)를 심장 내 주사한 감마선원을 사용하여 100 cGy를 조사하였다(25). 약 12주령에 인간 백혈구 재구성은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 유세포 분석에 의해 결정되었다. 키메라 현상 또는 인간 백혈구 재구성 수준은 다음과 같이 계산되었다: % CD45+ 인간 세포 / (% CD45+ 인간 세포 + % CD45+ 마우스 세포). 인간 CD45+ 백혈구가 40% 이상인 마우스를 연구에 사용하였다.

세포 배양

세포주는 37℃에서 5% CO₂가 있는 가습 배양기에서 10% 우태아 혈청(FCS)(Sigma-Aldrich, UK), 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트(Thermo Fisher Scientific, UK)가 보충된 RPMI 1640 배지, Freestyle 293F 배지(8% CO₂에서, 130 rpm에서 진탕), 또는 8 mM 글루타민을 포함하는 Freestyle CHO 배지(Thermo Fisher Scientific, UK)(8% CO₂에서, 140 rpm에서 진탕)에서 성장되었다.

항체 생성 및 생산

LILRB3 항체의 생성.

다양한 LILRB3 특이적 mAb의 선택은 n-CoDeR^® 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 수행되었다(26). 3회의 연속 패닝 라운드와 사전 패닝 단계를 수행하였다. 패닝에서, LILRB1, LILRB2 또는 LILRB3의 세포외 도메인을 함유하는 Fc 융합 단백질(LILRB-Fc)을 각각 비-표적 또는 표적으로 사용하였다. 이들 단백질은 이전에 기재된 바와 같이 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 생성된 후 단백질 A에 대하여 정제를 수행하였다(27). 다양한 LILRB 단백질을 발현하기 위해 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포도 패닝에서 표적/비-표적으로 사용되었다.

패닝 1에서, BioInvent n-CoDeR^® scFv는 경쟁이 있거나 없는 비오틴화된 사내에서 생산된 재조합 LILRB-인간(h) Fc 재조합 융합 단백질(스트렙타비딘 코팅된 Dynabeads^®로 캡처됨) 또는 에칭된 폴리스티렌 볼(Polysciences, US)/플라스틱 면역튜브에 코팅된 LILRB-hFc를 사용하여 선택되었다. 결합 파지는 트립신 소화에 의해 용리되었고 표준 절차를 사용하여 플레이트에서 증폭되었다(28). 패닝 1에서 증폭된 파지는 패닝 2에 사용되었고, 과정이 반복되었으며, 패닝 2에서 증폭된 파지는 패닝 3에 사용되었다. 그러나, 세 번째 패닝 라운드에서는 3가지 전략 모두에서 증폭된 파지가 결합되고 LILRB 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포에 대해 선택되었다.

다음으로, 패닝 3의 농축 파지 레퍼토리의 LILRB3-양성 scFv 카세트를 재클로닝하여 대장균에서 가용성 scFv 발현을 허용하였다. 개별 클론에 의해 발현된 가용성 scFv 단편은 FMAT(Fluorometric Microvolume Assay Technology)를 사용하여 LILRB-형질감염된 CHO-S 세포 그리고 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 재조합 LILRB 단백질에 대한 결합에 대해 시험되었다. 이를 통해 LILRB3에 특이적으로 결합하는 클론을 식별할 수 있었다. 그런 다음 LILRB1-3을 발현하는 CHO-S 세포 및 1차 세포(PBMC)에 대한 3차 스크린에서 클론을 추가로 감소시켰다. 단일 LILRB에 대한 특정 결합 패턴을 나타내는 클론을 시퀀싱하여 LILRB1-3-특이적 mAb를 생성하였다.

전장 IgG의 생산.

위에서 확인된 고유한 scFv는 HEK293-EBNA 세포에서 전장 IgG의 일시적인 발현을 허용하는 진핵생물 발현 시스템으로 클로닝되었다. 그 다음 항체는 이전에 기술된 바와 같이 단백질 A 기반 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양 상청액으로부터 정제되었다(29).

탈당화된 IgG의 생산.

Fc- 및 Fab-의존적 이펙터 기능의 해부를 허용하기 위해, IgG는 37℃에서 적어도 15시간 동안 0.05 U의 PNGase/μg의 IgG와 함께 PNGase F(Promega)를 사용하여 탈당화되었다. 탈당화는 SDS-PAGE 상의 중쇄의 크기 감소에 의해 확인되었다.

도메인 돌연변이 작제물의 생산

건강한 공여자 PBMC로부터 단리된 야생형 LILRB3 cDNA를 사용하여 중첩 PCR에 의해 일련의 도메인 돌연변이 DNA 작제물을 생성하여 1, 2 또는 3개의 LILRB3 Ig 유사 도메인(Uniprot의 주석을 기반으로 식별된 도메인 포함)을 발현하였다. 그런 다음 유전자 작제물을 pcDNA3에 클로닝하였다.

세포 형질감염

10x10⁶ HEK293F 세포는 Optimem 1 Media(Thermo Fisher Scientific, UK)와 233 펙틴을 사용하는 리포펙션에 의해 10 μg의 플라스미드 DNA로 일시적으로 형질감염되었다.

인간 백혈구의 준비 및 단핵구 유래 대식세포(MDM) 생성

전혈은 건강한 지원자의 사전 동의 하에 획득되었다. PBMC는 백혈구 혈액 콘(Blood Transfusion Services, Southampton General Hospital)으로부터 단리되었다. 림포프렙(Axis Shield, UK)을 사용하여 구배 밀도 원심분리에 의해 단리를 수행하였다. MDM은 이전과 같이 건강한 말초 혈액 인간 단핵구에서 생성되었다(30). 간단히 말해서, PBMC를 1% 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich, UK)과 함께 6웰 플레이트(Corning, UK)에 2x10⁷ 세포/웰로 플레이팅하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 비부착 세포를 세척하고 부착 단핵구(>90% CD14⁺)를 5% CO₂와 함께 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 100 ng/ml 인간 재조합 M-CSF(사내)를 각 웰에 첨가하였다. 배지 및 사이토카인은 배양 동안 2회 보충되었고 세포는 7 내지 8일에 수확되었다.

대식세포 식균작용 분석

상기 기재한 바와 같이 생성된 인간 MDM을 96웰 평평한 바닥 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰로 플레이팅하였다. MDM을 2시간 동안 10 μg/ml LILRB3 항체로 처리하고 세척하였다. 5 μM CFSE(Sigma-Aldrich, UK)로 표지된 원발성 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포를 4℃에서 25분 동안 리툭시맙(또는 이소형 대조군으로서 허셉틴)으로 옵소닌화하였다. 그런 다음 MDM과 표적 CLL 세포를 각각 1:5 비로 37℃에서 1시간 동안 공동 배양한 다음, 10 μg/ml CD16-APC(BioLegend, UK)로 어두운 곳서 실온에서 15분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, 수확하고, 유세포 분석에 의해 분석하고 다음과 같이 % 식균 작용을 계산하였다: (% 이중 양성 MDM) / (% 총 MDM) × 100.

유세포 분석

PBMC 또는 전혈의 세포 표면 염색을 위해, 얼음 위에서 2% 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich, UK)으로 세포를 10분 동안 차단한 다음 하기 세포 표면 마커: CD14-PE(eBioscience, UK), CD20-A488(형광 표지된 리툭시맙, 사내), CD3-PE-Cy7, CD56-APC-Cy7 또는 CD15-Pacific Blue및 CD66B-FITC mAb(모두 BioLegend, UK)와 함께 관련 APC 표지 mAb 또는 hIgG1 이소형(BioInvent, Sweden)으로 염색하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 염색한 다음 FACSCalibur 또는 FACSCanto II(BD Biosciences, USA)에서 획득하기 전에 먼저 10% 적혈구(RBC) 용해 완충액(Serotec, UK)에서 그리고 이어서 세척한 다음 FACS 세척액(PBS, 1% BSA, 10 mM NaN3)에서 2회 세척하고, FCS Express V3(De Novo Software)로 분석하였다.

mAb가 유사한 교차 차단 에피토프에 결합하는지 결정하기 위한 분석을 위해 1x10⁶ PBMC를 2% 인간 AB 혈청으로 10분 동안 차단하고 4℃에서 30분 동안 10 μg/ml 비접합 LILRB3 mAb로 염색하였다. 그런 다음 FACSCalibur를 사용하여 세척하고 획득하기 전에 세포를 4℃에서 20분 동안 직접 접합된 시판 LILRB3 mAb(클론 222821; R&D Systems, UK)로 염색하였다.

LILRB3 에피토프 매핑 연구를 위해, FACSCalibur를 사용하여 세척하고 획득하기 전에, LILRB3-도메인 돌연변이-형질감염된 HEK293F 세포를 4℃에서 25분 동안 관련 LILRB3 mAb로 염색하고, 2회 세척하고, 4℃에서 20분 동안 항-인간-PE 2차(Jackson ImmunoResearch, USA)로 염색하였다.

LILR-A1, -A2, -A5, -B1, -B2, -B3, -B4 또는 -B5(또는 형질감염되지 않은 대조군)를 발현하는 2B4 리포터 세포의 염색을 위해 세포를 10 μg/ml LILRB mAb로 염색하고 5% CO2와 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 세포를 세척하고 2차 항-hIgG 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)로 4℃에서 45분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고 FACScan(BD Biosciences, USA)을 사용하여 수집을 수행하고 Cell Quest(BD Biosciences, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다.

유세포 분석 데이터는 FCS Express V3(De Novo Software) 및 FlowJo로 분석되었다.

표면 플라즈몬 공명(SPR)

SPR은 제조사의 지침에 따라 Biacore T100(GE Healthcare, UK)으로 수행되었다. LILRB3-hFc 재조합 단백질(인간 Fc 태그가 있는 세포외 LILRB3 도메인)을 리간드로 사용하고 아민 커플링에 의해 시리즈 S 센서 칩(CM5)에 고정화하였다. 다양한 LILRB3 mAb가 "분석물"로 사용되어 칩을 가로질러 흐르고 SPR이 측정되었다. KD 값은 Biacore™ T100 평가 소프트웨어(GE Healthcare, UK)를 사용하여 Kd [1/s] / Ka [1/Ms]에 의한 1:1 결합의 'Univalent' 모델에서 계산되었다.

T 세포 증식 분석

PBMC(1 내지 2 x 10⁷)는 실온에서 10분 동안 2 μM CSFE로 표지되었다. 이어서 세포를 무혈청 CTL 배지(Immunospot, Germany)에 재현탁하고 96웰 둥근 바닥 플레이트(Corning, UK)에 1x10⁵ 세포/웰로 플레이팅하였다. 그런 다음 세포를 0.02 μg/ml CD3(클론 OKT3, Southampton 대학), 5 μg/ml CD28(클론 CD28.2; BioLegend, UK) 및 10 μg/ml LILRB3 항체 또는 관련 이소형으로 자극하였다. 그런 다음 플레이트를 37℃에서 4일 동안 배양하고, 그 후 세포를 5 μg/ml CD8-APC(클론 SK1; BioLegend, UK)로 염색하고, 수확하고, T 세포 증식에 대한 판독으로서 유세포 분석에 의해 CSFE 희석을 측정하였다.

생체 내 동종이식 분석

+완전히 재구성된 인간화 마우스(≥40% 순환 hCD45+ 백혈구)에 200 μg LILRB3 mAb(클론 A1) 또는 이소형 매치(hIgG1) 대조군을 각각 0일차 및 4일차에 i.v. 및 i.p 주사하였다. 7일차에 마우스의 코호트에 혈연관계가 아닌 공여자로부터 유래된 1x10⁷ 루시퍼라제 양성 인간 '이중-히트' B 세포 림프종(25, 31)을 i.p. 주사하였다. 림프종 세포 성장은 이전과 같이 IVIS 스펙트럼-생물발광 이미징 시스템을 사용하여 시간 경과에 따라 모니터링되었다(25).

전사체 분석

단핵구에서 LILRB3 매개 전사 변화를 평가하기 위해, EasySep™ Human Monocyte Enrichment Kit(음성 선택 세포; StemCell Technologies, USA)를 사용하여 건강한 공여자로부터 채취한 신선하게 준비된 PBMC에서 인간 말초 혈액 단핵구를 단리하였다. 세포를 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM 글루타민 및 HEPES 완충액이 보충된 CTL 배지에서 배양하고 10 μg/ml의 이소형 대조군 또는 작용성 LILRB3 mAb(클론 A1; hIgG1)로 처리하였다. 18시간 후 세포를 β-머캅토에탄올을 함유하는 RLT 용해 완충액에 용해시키고 RNeasy 마이크로 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 2100 Bioanalyzer(Agilent Inc., USA)에서 총 RNA 6000 Nano LabChip 및 SMARTer Universal Low Input RNA Kit(Clontech, USA) 및 HiSeq 2000 시스템(Illumina, USA)용 Illumina TruSeq RNA 샘플 준비 가이드에 따라 준비 및 시퀀싱된 cDNA 라이브러리를 사용하여 총 RNA의 품질을 평가하고 정량화하였다. RNAseq 출력은 Bowtie2 v2.2.3(32)을 사용하여 hg19에 정렬되었다. 맵핑된 읽기의 수는 RSEM v1.2.15(33)에 의해 정량화되었다. 처리 전과 후에 쌍을 이루는 샘플 간의 차등 발현 분석은 p <0.05 및 >2배 변화 컷오프와 함께 edgeR(34)을 사용하여 수행되었다. 차등적으로 발현된 유전자는 온라인 기능 강화 분석 도구 DAVID(http://david.ncifcrf.gov/)를 사용하여 주석을 달았다(35). 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 Broad Institute Software를 사용하여 수행되었으며(36), 유전자 목록은 edgeR 출력의 logFC 값에 따라 미리 순위가 지정되었다. 유전자 세트 발현의 비교를 위해, M1 및 M2 대식세포 유전자 세트(37)를 Molecular Signature Database(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)에서 수득하였다. 히트맵은 MeV로 시각화되었다(38).

정량적 PCR(qPCR)

프로브 기반 qPCR을 사용하여 96웰 PCR 플레이트(Bio-Rad, UK)에서 각 샘플 조건에 대해 3중으로 수행된 20 μl 반응에서 cDNA를 증폭하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 각 반응은 48 ng cDNA, 10 μl 백금 qPCR 믹스(Life Technologies, UK), 8 μl DEPC 물 및 1 μl의 유전자 특이적 20x PrimeTime 프로브/프라이머 믹스를 포함하였다. PCR 시약을 함유 96웰 플레이트를 C1000 Thermal Cycler CFX96 실시간 시스템 PCR 기계(Bio-Rad, Kidlington, UK)에서 실행하였다. CFX 관리자 소프트웨어(Bio-Rad, Kidlington, UK)는 초기에 주기 임계값(Ct)으로 기록된 유전자 발현의 데이터 수집 및 분석에 사용되었다. Ct 값은 하우스키핑 유전자 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)로 정규화되었고 이소형 대조군 처리 세포에서 유전자 발현 수준으로 표준화되었다.

통계

식세포 작용 및 T 세포 증식 데이터 둘 모두에 대해 쌍을 이루는 양측 T-검정을 수행하였다; 직선 막대는 중앙값을 나타낸다. 3회 이상의 실험이 수행된 막대 그래프에서 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. qPCR 데이터 분석을 위해 Bonferroni의 다중 비교 검정을 사용한 일방향 ANOVA를 수행하였다. GraphPadPrism(v5 또는 6)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

결과

특이적 LILRB3 mAb 패널 생성

인간 LILRB3의 단백질 발현과 기능을 연구하기 위해 인간 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 LILRB3에 대한 항체를 확인하였다. 선택은 표적 LILRB3 단백질(용액 중, 플라스틱 표면에 코팅되거나 세포에서 발현됨)을 사용하고 상동 비-표적 LILRB1 및 LILRB2 단백질에 대해 선택하여 수행되었다. 3 라운드의 파지 패닝 및 농축 후, LILRB3에 특이적인 클론의 성공적인 선택은 유세포 분석 및 ELISA에 의해 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). 이어서, 표적 특이적 파지 결합 scFv 클론을 가용성 scFv로 전환하고 FMAT 및 ELISA로 스크리닝하였다. 각 클론에 대한 형광 강도를 플롯팅하고 표적 대 비-표적 특이성을 표시하였다(도 1a). LILRB3의 결합 및 LILRB1 및 LILRB2에 대한 교차 반응성의 결여를 기반으로 성공적인 클론을 선택하였다. 그런 다음 선택한 클론을 시퀀싱하고 1차 세포 및 형질감염체에 대한 결합을 시험하였다(도 1b). 표적 특이적 클론이 선택되고 IgG로 전환되면, LILR 발현 2B4 리포터 세포주 패널에 대해 스크리닝하여 특이성을 재확인하였다(도 1c). 총 16개의 LILRB3 특이적 항체가 추가 연구를 위해 확인되었다. 이러한 LILRB3 mAb를 사용한 PBMC 또는 전혈 염색은 이전 보고와 일치하는 단핵구(도 1d) 및 호중구(도 1e)의 주된 염색을 보여주었다(39). LILRB3 특이적 클론을 추가로 시험하였으며 마우스 이종상동체인 PIR-B에 대하여 교차 반응성이 없는 것으로 확인되었다(데이터는 표시되지 않음).

LILRB3 mAb는 높은 친화도로 결합하고 다른 에피토프에 맵핑됨

그런 다음 LILRB3 특이적 mAb를 결합 특성에 대해 시험하였다. SPR 분석은 모든 LILRB3 클론이 용량 의존적 방식으로 재조합 LILRB3-hFc 단백질에 결합하고(도 2a) A16(8.16 x 10^-10)으로 표시되는 친화도 범위를 표시함을 보여주었다. 흥미롭게도, 모든 mAb는 유사한 결합 속도(~105)를 가졌지만 해리 속도는 세 자릿수(~10^-3 내지 10^-6)로 다양했다.

그런 다음 에피토프 맵핑 연구가 수행되었다. 일부 mAb는 시판 LILRB3 mAb(예를 들어, A35)의 결합을 차단할 수 있었으며, 공유 또는 근위 관련 에피토프를 시사하는 반면; 다른 곳에서는(예를 들어, A1) 결합을 표시할 수 없었다(도 2b). 결합 특이성은 HEK293F 세포에 일시적으로 형질감염된 4개의 세포외 도메인(WT), 3개, 2개 또는 1개 도메인을 모두 표시하는 일련의 LILRB3 도메인(도 2d) 돌연변이체로 추가로 확인되었다. 이들 세포에 대한 결합은 2개의 mAb 그룹: WT, D3 및 D2 발현 세포에 결합된 것들; 및 WT-형질감염된 세포에만 결합된 것들(도 2b)을 나타냈으며, 각각 D4(A1로 예시) 내에서 결합을 나타냈다(도 2c). 이러한 데이터는 LILRB3에 대해 고도로 특이적인 완전한 인간 IgG1 mAb가 발생했음을 입증한다. 에피토프 맵핑은 보존된 잔기가 4개 도메인 모두에 존재하는 것으로 보이지만 LILRB3 mAb는 각각 D2 및 D4 내에 위치한 2개의 별개의 세포외 우성 에피토프 중 하나에 결합하는 것으로 나타났다.

또한, 인간 CD3ζ 세포질 도메인과 융합된 LILRB3의 세포외 도메인으로 형질감염된 리포터 세포를 사용하여 생성된 mAb가 수용체를 가교할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이들 하이브리드 세포를 통한 신호전달은 NFAT 프로모터 하에서 GFP의 발현을 야기한다(40). 신호전달을 유도할 수 있는 그룹(예를 들어, A1)과 수용체에 결합할 때 불활성인 그룹(예를 들어, A28)의 두 가지 별개의 LILRB3 mAb 그룹을 식별할 수 있었다(도 2d).

LILRB3 결찰은 T 세포 활성화 및 증식을 조절함

다음으로, 우리는 세포 이펙터 기능에 대한 이러한 mAb의 효과를 조사하고자 하였다. LILRB1은 CD3 신호전달 캐스케이드에서 탈인산화를 일으키거나 HLA-I 결합에 대해 CD8과 경쟁함으로써 이전에 T 세포 반응을 억제하는 것으로 나타났다(41, 42). LILRB는 또한 CD8+ T 억제 세포의 유도를 통해 단핵구 및 DC와 같은 항원 제시 세포(APC)를 내성을 유발함으로써 T 세포 반응을 간접적으로 억제하는 것으로 나타났다(10, 12, 43). LILRB3의 면역 조절 가능성과 적응 면역 반응을 조절하는 능력을 조사하기 위해, PBMC 분석에서 LILRB3 mAb를 시험하여 항-CD3/CD28 자극에 대한 반응으로 T 세포 증식을 측정하였다. T 세포 활성화 및 증식은 세포 클러스터링 및 CFSE 희석에 의해 입증된 CD3 및 CD28 항체에 의해 성공적으로 유도되었다(도 3a).

Fcγ 수용체(FcγR)는 인간 IgG의 효과를 매개하는 것으로 알려져 있으며(29, 44-46), 따라서, T 세포 증식에 대한 LILRB3 mAb의 직접적인 F(ab):수용체 매개 효과를 연구하기 위해, 이들은 먼저 FcγR-IgG 상호작용에 의해 매개되는 효과를 제거하기 위해 탈당화되었다(47). SDS-PAGE는 성공적인 탈당화를 나타내는 야생형(WT) 대조군과 비교하여 탈당화된 mAb(Degly)의 분자량 감소를 확인하였다(도 3b). 그런 다음 mAb를 상기 기재한 T 세포 증식 분석에 도입하였다. CD3 및 CD28 항체에 의해 유도된 성공적인 T 세포 증식은 대조군과 비교하여 CD8+ T 세포 증식의 유의한 증가를 나타내는 20명의 다른 공여자에서 평가되었다(p<0.0001)(도 3c). 대부분의 LILRB3 mAb는 인간 IgG1 이소형 대조군과 비교할 때 클론 A1로 표시되는 CD8+ T 세포 증식을 유의하게 억제하였다(p=0.0001; 도 3c). A28도 증식 억제 경향을 보였으나 A16은 억제 효과가 없는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 LILRB3을 표적으로 하는 것이 A1과 같은 LILR3B 작용성 특성(향상된 억제)을 전달하면서 명확한 mAb 특이적 방식으로 어느 방향으로든 T 세포 반응을 조절할 수 있음을 보여준다. 동일한 방식으로 단리된 T 세포를 사용하여 분석을 반복했을 때, PBMC 내의 APC, 아마도 단핵구인 것이 관찰된 효과에 대한 책임이 있음을 확인하는 억제가 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 이 결과는 T 세포에 대한 LILR3B의 발현 부족을 고려할 때 예상된 것이었다.

LILRB3 mAb는 대식세포 이펙터 기능을 조절한다

상기 발견은 LILRB3 mAb가 아마도 APC 기능 조절을 통해 T 세포 증식을 조절하기 위해 LILRB3에 작용하거나 길항할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 대식세포도 높은 수준의 LILRB를 발현하고, 이에 의해 조절되는 것으로 알려져 있기 때문에(13), 대식세포 식균 작용에 대한 LILRB3 결찰의 효과를 연구하였다. 대표 LILRB3 mAb에 의한 염색은 인간 MDM에서 LILRB3의 높은 발현 수준이 확인하였다(도 4a). 이펙터 기능의 임의의 조절을 평가하기 위해, CFSE 표지된 1차 CLL B 세포를 항-CD20 mAb(리툭시맙)으로 옵소닌화하고 식균 작용 분석에서 대식세포의 표적으로 사용하였다(도 4b 내지 도 4c). 탈당화된 항-LILRB3 클론은 식균 작용의 정도를 유의하게 감소시켰다(모든 경우에서 p<0.05)(도 4c). 이러한 발견은 공초점 현미경에 의해 추가로 확인되었으며, 이소형 대조군과 비교하여 LILRB3 처리된 대식세포에서 더 적은 수의 CFSE+ 표적 세포를 보여준다(도 4d). 이러한 데이터는 대부분의 LILRB3 mAb가 대식세포 이펙터 기능을 감소시키는 억제 신호를 전달했음을 입증한다. 중요하게는, LILRB3 mAb는 탈당화되어 Fc:FcγR 상호 작용의 결과로 발생하는 합병증 없이 Fab 의존적 효과만을 매개할 수 있다(48).

LILRB3 결찰은 인간화 마우스에서 면역 내성을 유도함

LILRB3 결찰 후 적응(T 세포) 및 선천(골수성) 활동이 모두 억제될 수 있음을 보여주는 이러한 데이터를 감안할 때, 우리는 다음으로 인간화 마우스(1차 인간 HSC로 재구성됨)를 사용하여 동종 생착 모델에서 LILRB3 조절의 가능한 효과를 시험하였다. 인간화 마우스의 특성 분석은 LILRB3이 인간 말초 혈액과 유사한 방식으로 골수 세포에서 발현되었음을 입증하였다(도 5a). 동종 인간 림프종 세포는 HLA 미스매치로 인해 인간화 마우스에서 쉽게 거부된다(데이터는 표시되지 않음; 49). 동종 면역 반응을 억제하는 LILRB3 결찰의 가능성을 시험하기 위해, 우리는 재구성된 성인 인간화 마우스를 작용성 LILRB3 mAb(A1)로 사전 처리하고 혈연관계가 아닌 공여자로부터 유래된 동종 인간 '이중-히트' B 세포 림프종 세포(31, 50)의 생착을 평가하였다. LILRB3 mAb 처리는 마우스에서 내성 상태를 유도할 수 있었고 인간 림프종 세포의 성공적인 생착을 유도하였다(도 5b). LILRB3 처리된 종양 보유 마우스는 높은 종양 부담으로 인해 인도적으로 도태되어야 하는 반면, 이소형 대조군 처리된 마우스는 이환율 없이 림프종 세포를 쉽게 거부하였다. 이러한 관찰은 우리의 시험관 내 기능 분석을 더욱 확증하고 면역 반응 동안 골수 세포의 주요 조절인자인 LILRB3를 식별한다.

LILRB3 결찰은 인간 APC의 전사 변형 및 M2 왜곡으로 이어짐

LILRB3 매개 면역억제와 관련된 경로 및 요인을 조사하기 위해 LILRB3 참여 후 1차 APC의 전사체 변화를 조사한다. 작용성 LILRB3 mAb(A1)를 사용한 단리된 인간 말초 CD14+ 단핵구의 단기(~18시간) 시험관 내 처리는 표현형의 극적인 변화를 일으켰으며(도 6a), 세포는 면역 억제된 IL4/IL-13 처리된 대식세포인 "M2"와 유사한 연장된 형태를 나타냈다(51). RNAseq 분석은 단핵구에서 LILRB3의 결찰이 "M2" 편향된 면역억제성 대식세포와 유사한 시그니처를 유도함을 보여주었다(도 6b). 마찬가지로, "M1" 편향된 면역자극 대식세포와 관련된 유전자의 발현은 이소형 대조군 처리 단핵구와 비교하여 LILRB3 mAb 처리에서 하향 조절되었다(도 6b 내지 도 6c). 우리는 차등적으로 조절되는 유전자의 선택된 수에 대해 추가 3명의 공여자에 대해 qPCR을 수행하여 이러한 데이터를 확인하였다(도 6d). 더 적은/비-작용성 LILRB3 mAb(A28)를 사용한 단핵구의 처리는 단핵구 표현형 및 유전자 발현에 영향을 미치지 않았다(데이터는 제시되지 않았음 및 도 6c). 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 억제성 대식세포(예를 들어, 산화적 인산화)에 대해 보고된 유전자 시그니처와 양의 상관 관계를 보여주었다(52). 반대로, LILRB3 결찰 단핵구 유전자 특징은 염증성 대식세포, 예를 들어 IFN-γ 및 IFN-α 반응성 요소 및 동종이식 거부에 대해 보고된 유전자 시그니처와 음의 상관 관계가 있었다(도 6e). 종합하면, 이러한 데이터는 LILRB3 활성화가 단핵구와 같은 APC에서 상당한 표현형 및 전사 변경을 야기하여 다운스트림 면역 반응의 강력한 억제를 유도한다는 것을 확인한다(도 6f).

고찰

우리는 이전에 인간 단핵구에서 LILRB1의 결찰이 관용성 표현형을 유도하여 후속적으로 T 세포 반응을 방해한다는 것을 입증하였(12, 53). 이 연구에서, 우리는 적합한 시약과 실험 시스템의 부족으로 인해 기능이 아직 결정되지 않은 또 다른 LILR 계열 구성원인 LILRB3을 조사하였다. 따라서, 우리는 LILRB3에 대한 특이성을 가진 완전한 인간 mAb의 광범위한 패널을 생성하고 특성 분석하였다. 특정 mAb을 사용한 다른 백혈구 집단의 염색은 LILRB3가 주로 인간 골수 세포로 제한된다는 것을 확인하였다(3). 이것은 여러 독립 공여자에서 확인되었으며, 이러한 수용체가 다형성이기는 하지만(LILRB3은 적어도 10개의 변이체를 가짐(3, 54)), 항체는 치료 용도를 위한 이러한 시약의 개발에 중요한 모든 변이체는 아니더라도 많은 변이체를 인식함을 시사한다. 후속 분석은 LILRB3 mAb가 다양한 친화도를 나타내는 것으로 나타났으며, 이들 모두는 유사한 온-레이트(on-rate)를 갖는 나노몰(nM) 범위에 있었지만 오프-레이트(off-rate)는 세 자릿수 이상 차이가 났다. 낮은 nM 범위의 KD 값은 일반적으로 실행 가능한 약물 후보로 간주되며; 예를 들어, 리툭시맙은 표적인 CD20에 대해 8 nM 친화도를 갖는다(55). 이는 여기서 생성된 LILRB3 mAb가 치료제로서의 잠재력을 가지고 있음을 시사한다. 선택된 LILRB3 클론 중 일부는 다른 인간 LILR-형질감염체에 대해 예상치 못한 교차 반응성을 보여 후속 분석에서 제외되었다. 그러나, LILR3B는 세포외 도메인에서 LILRA6과 >95% 서열 상동성을 공유하므로, LILRB3 mAb는 공동 발현되는 경우 LILRA6과 잘 상호작용할 수 있다(56). 또한, 에피토프 맵핑 실험은 Ig 유사 세포외 도메인 2 또는 4에 결합하기 때문에 2개의 별개의 에피토프에 대해 특정 LILRB3 mAb가 생성되었음을 보여주었다. 생성된 LILRB3 mAb 중 어느 것도 도메인 1 또는 3에 결합하지 않았으며, 이는 이러한 도메인이 보존된 고유 에피토프를 포함하지 않을 수 있음을 시사한다.

T 세포 반응에 영향을 미치는 LILRB3 mAb의 능력은 증식의 억제 또는 향상을 통해 관찰되었으며, 이는 각각 작용 또는 길항 특성을 나타낸다. LILRB1(12, 13, 57)과 유사하게, 이는 APC가 배양물에서 LILRB3을 발현하는 유일한 세포이기 때문에 APC에 대한 영향을 통해 가능하다. LILRB1(42, 53, 583, 59)과 달리 LILRB3은 T 세포에서 발현되지 않으며 T 세포 반응에만 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. LILRB3 발현 패턴 및 PBMC 배양 내 세포의 빈도에 기초하여, 단핵구는 영향을 받을 가능성이 가장 높은 세포 유형을 나타낸다. 이를 뒷받침하기 위해, 작용성 LILRB3 mAb는 단핵구가 없을 때 T 세포 증식을 억제하지 않았다. 결합 에피토프는 많은 시스템에서 수용체 기능을 조절하는 mAb의 능력에 영향을 미치므로(29, 60) LILRB3 mAb가 반대 기능을 할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아니었다. LILRB3의 제2 Ig 유사 도메인에 결합된 대부분의 LILRB3 mAb는 T 세포 증식을 억제할 수 있었다. 반대로, 도메인 4에 결합된 일부 클론은 증식을 향상시켰다. 그러나, D4-결합 mAb(A1)는 증식의 가장 강력한 억제제 중 하나였으며 다른 D4-결합(A28)은 억제 효과를 덜 유도하였다. 따라서, 도메인 특이적 에피토프는 LILRB3 mAb 매개 이펙터 세포 기능과 직접적으로 상관 관계가 있는 것으로 보이지 않는다.

LILRB3 mAb가 T 세포 증식을 억제하거나 향상시키는 능력에서 변이를 나타내기는 했지만, 대다수의 클론은 대식세포에 의한 식균 작용을 억제하거나 영향을 미치지 않았다. 이는 대부분의 mAb가 T 세포 반응의 억제와 유사한 억제 신호 전달을 자극하고 이펙터 기능을 억제하는 이러한 맥락에서 작용성임을 시사한다.

LILR3B의 다운스트림 면역억제 활성을 보여주는 우리의 관찰은 재구성된 인간화 마우스 모델에서 추가로 확인되었다. LILRB3가 단핵구 세포에만 존재하는 이 시스템에서, 동종 림프종 세포의 생착 전 LILRB3의 작용성 LILRB3 mAb와의 결찰(31)은 생체 내에서 내성을 유도하고 후속 종양 성장을 가능하게 하였다. 이는 면역 관용의 유도가 도움이 될 자가면역 및 이식과 같은 치료 환경에서 이용될 수 있는 심오한 면역억제 효과를 발휘하는 LILRB3의 능력을 입증한다. 고아 수용체로 간주되었지만, LILRB3는 사이토케라틴(CK) 관련 단백질(괴사성 암 세포에 노출됨), 안지오포이에틴 유사 단백질 5 및 황색포도상구균(S. aureus)과 같은 박테리아와 관련이 있다고 제안되었다(40, 61, 62). 따라서, 우리의 기능 데이터는 특정 병원체(61)가 활성 반응 동안 LILRB3를 능동적으로 연결함으로써 면역 반응을 전복시킬 수 있음을 시사한다.

LILRB3 매개 면역억제에 관여하는 경로 및 요인을 조사하기 위해, LILRB3 활성화 후 단리된 말초 골수 세포의 전사체 변화를 조사하였다. 100개 이상의 유전자가 LILRB3 결찰 후 1차 인간 단핵구에서 차등적으로 조절되었으며, 그 중 일부는 M2 대식세포와 TAM에서 조절되는 것으로 알려져 있다. 암피레귤린은 LILRB3 결찰 단핵구에서 발현이 유의하게 상향 조절된 유전자 중 하나였다. 암피레귤린은 Treg 활성의 향상을 포함한 다양한 메커니즘을 통해 내성 및 면역 억제를 유도하는 표피 성장 인자 유사 성장 인자이다(63). 또한, 암피레귤린은 종양 관련 DC(64) 및 억제/M2 대식세포(65)에서 과발현되며 면역억제 및 암 진행(66)에서 중요한 역할을 하는 것으로 시사되었다. 이러한 LILRB3 유도성 요인은 T 세포 분석에서 관찰된 억제의 원인일 수 있다. 우리의 지속적인 노력은 이것을 시험하고 골수 세포의 LILRB3 매개 억제를 담당하는 메커니즘을 완전히 이해하는 것을 목표로 한다. 자가면역을 개선하는 재발 완화형 다발성 경화증 환자를 치료하는 데 사용되는 펩티드 기반 약물인 글라티라머 아세테이트(Copaxone)의 작용 방식을 조사한 최근 연구에서 LILRB2와 LILRB3가 잠재적 리간드로 확인되었다(67). 인간 골수 세포에서 길항 mAb로 인간 LILRB2를 표적으로 하는 것은 그들의 염증유발성 활성을 촉진하고 생체 내 항종양 반응을 향상시킬 수 있다(13). 뿐만 아니라, Zhang과 동료들의 최근 데이터는 백혈병 세포에서 LILRB4 신호전달이 T 세포 억제를 매개하여 말단 기관으로의 종양 세포 보급을 지원한다는 것을 시사한다(68). 이러한 데이터는 인간 LILRB의 활성화가 골수 세포 재프로그래밍을 통해 면역 억제를 유도한다는 것을 입증하는 우리의 발견을 더욱 뒷받침한다(즉, M1 유사 성숙 감소 및 MDSC 억제 기능 촉진).

여기에 제시된 결과는 함께 1차 인간 골수 세포에 대한 LILRB3 활성화가 강력한 면역억제 기능을 발휘하고 LILRB3-특이적 mAb가 이식에서 자가면역, 염증성 장애 및 그 이상에 이르기까지 광범위한 적용을 통해 잠재적으로 강력한 면역조절제임을 보여준다.

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SEQUENCE LISTING <110> BioInvent International AB University of Southampton <120> LILRB3 ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF <130> BIOBX/P76238PC <150> EP20156969.6 <151> 2020-02-12 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Arg Arg Lys Lys Arg Glu Arg Gly Phe Ser Gly Asn Asp Pro Val 1 5 10 15 Gly Ala Ile Asp Val 20 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val 1 5 10 <210> 7 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 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Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Arg Gly Leu Ala Thr Tyr Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His His Val Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Asn Ser Leu Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val 1 5 10 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 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Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asp Trp Gly Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 33 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 34 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (22)

1. 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 항체 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 분자가 작용성 항체 분자인 항체 분자.
3. LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 항체 분자로서, CDR VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 중 1 내지 6개를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 분자:
   VH-CDR1은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 1, 9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VH-CDR2는 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 2, 10, 18 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VH-CDR3은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 3, 11 및 19 및 27로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VL-CDR1은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 4, 12, 20 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VL-CDR2는 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 5, 13, 21 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VL-CDR3은 존재하는 경우 SEQ. ID. NO: 6, 14, 22 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택됨.
4. 제3항에 있어서, 항체 분자는 하기 CDR을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함하고/포함하거나:
   (i) SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2 및 SEQ. ID. NO: 3; 또는
   (ii) SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10 및 SEQ. ID. NO: 11; 또는
   (iii) SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18 및 SEQ. ID. NO: 19; 또는
   (iv) SEQ. ID. NO: 25, SEQ. ID. NO: 26 및 SEQ. ID. NO: 27
   항체 분자는 하기 CDR을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체 분자:
   (v) SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5 및 SEQ. ID. NO: 6; 또는
   (vi) SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13 및 SEQ. ID. NO: 14; 또는
   (vii) SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ. ID. NO: 22; 또는
   (viii) SEQ. ID. NO: 28, SEQ. ID. NO: 29 및 SEQ. ID. NO: 30.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 항체 분자는 SEQ. ID. NO: 7, 15, 23 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄(VH) 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 항체 분자는 SEQ. ID. NO: 8, 16, 24 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄(VL) 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 작용성 항체 분자인 항체 분자.
7. 제1항 또는 제2항에 따라 사용하기 위한 항체 분자, 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자로서, 항체 분자는 야생형 또는 Fc 조작된 인간 IgG 항체 분자, 인간화 IgG 항체 분자, 및 인간 기원의 IgG 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 항체 분자 또는 항체 분자.
8. 제7항에 따라 사용하기 위한 항체 분자 또는 제7항에 따른 항체 분자로서, 항체 분자는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체인, 사용하기 위한 항체 분자 또는 항체 분자.
9. 제1항 또는 제2항에 따라 사용하기 위한 항체 분자, 또는 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자로서, 항체 분자는 단일클론 항체인, 사용하기 위한 항체 분자 또는 항체 분자.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체는 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체인, 사용하기 위한 항체 분자.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자와 LILRB3(ILT5)에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있는 항체 분자인, 사용하기 위한 항체 분자.
12. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자를 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
13. 제12항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.
14. 제12항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 제13항에 정의된 바와 같은 플라스미드를 포함하는 세포.
15. 약물에 사용하기 위한 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자, 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제13항에 따른 플라스미드 및/또는 제14항에 따른 세포.
16. 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제13항에 따른 플라스미드 및/또는 제14항에 따른 세포의 용도.
17. 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 항체 분자의 용도.
18. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제13항에 따른 플라스미드 및/또는 제14항에 따른 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학 조성물.
19. 제18항에 있어서, 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
20. 치료적 유효량의 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애를 치료하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 항체 분자는 LILRB3(ILT5)에 특이적으로 결합하는 작용성 항체 분자인, 방법.
22. 치료적 유효량의 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제13항에 따른 플라스미드 및/또는 제14항에 따른 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 이식 거부, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애를 치료하는 방법.

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