KR20010102978A - 면역 질환 치료를 위한 트위크 길항약 및 트위크 수용체길항약 및 이들의 용도 - Google Patents

면역 질환 치료를 위한 트위크 길항약 및 트위크 수용체길항약 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 질환 치료를 위한 트위크(TWEAK) 활성 변형제 및 이들의 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

면역 질환 치료를 위한 트위크 길항약 및 트위크 수용체 길항약 및 이들의 용도{ANTAGONISTS OF TWEAK AND OF TWEAK RECEPTOR AND THEIR USE TO TREAT IMMUNOLOGICAL DISORDERS}
자가 면역 질병, 급성 및 만성 염증 질환, 장기 이식 거부 현상, 이식편 대 숙주 질병(Graft-Versus-Host Disease;GVHD), 림프 세포 악성 종양, 패혈성 쇼크 및 기타 형태의 쇼크, HIV 및 SCIDS에서 나타나는 면역 반응성 상실, 및 종양 성장에 대한 면역 반응의 기능 부전을 포함하는, 면역 질환은 매우 다양한 질병과 병리학적 상태로서 규명되어 있다.
다수의 면역 질환은 항원에 대한 비정상적 반응 또는 비조절적 반응에 의하여 유발된다. 자가 면역성 질환들은 세포와 조직을 손상시키는, 자기 항원에 대한 면역계의 부적절한 반응의 결과이다. GVHD는 골수 이식편(BMT)으로부터 얻은 공여 세포가 숙주(즉, 환자) 항원에 반응하는 경우 발병된다. 환자의 면역계가 이식된 장기로부터 유래된 항원에 반응하는 경우 장기 이식 거부 현상이 일어난다. 과민성 알레르기 상태 및 쇼크와 같은 급성 염증 질환은 유발된 항원에 대한 비조절적 면역 반응의 결과이다.
T 세포 의존성 면역 반응에는 항원의 T 세포 인지 과정이 필요하다. 예를 들어, GVHD는 공여 T 세포와 숙주 면역계 세포간 복합적 상호 작용으로부터 기인한다. 개시 현상은 비자기, 즉 숙주 항원의 공여 T 세포에 의하여 인지된다. 이들을 동종항원이라 한다. 상기 공여 세포에 의한 동종항원 인지의 결과 면역 조절성 및 염증성 시토킨 및 케모킨을 생성하며, 이로써 공여 항숙주 면역 반응을 발병 및 악화시킨다. 상기 질환은 급성 또는 만성 형태로 발병될 수 있는데, 이는 발병되는 면역 반응의 유형을 조절하는 복합적인 시토킨 네트워크를 조절하는 것에 좌우된다. 면역 반응은 1) 상기 반응 과정 동안 활성화된 T 세포에 의하여 생성된 시토킨 및 케모킨의 성질, 및 2) 상기 반응 과정 동안 보조 세포 및 기타 세포에 의하여 생성된 시토킨 및 케모킨의 성질에 따라서 Th0, Th1 또는 Th2로 특징지워질 수 있다. 면역 반응시 중요한 역할을 하는 T 세포 이외의 세포의 예로서는 B 세포, 수상 세포, 단핵구 및 대식세포, 여포 수상 세포 및 내피 세포가 있다. 생성된 시토킨 세포들 모두는 분화하는 다수의 세포 유형에 영향을 주고, 생성된 케모킨은 세포유영(cell trafficking) 및 국소화에 영향을 준다. Th0 반응은 미리 자극되지 않은(naive) T 세포의 단기간 자극을 특징으로 한다. Th0 T 세포는 다수의 시토킨, 특히 IL-2 및 TNF를 중간 정도의 양으로 생성한다. 반복적으로 또는 장기적으로 자극된 Th0 세포는, 다수의 인자에 따라 Th1 또는 Th2 T 세포로 분화될 수 있다. 이러한 인자들로서는 보조 세포 시토킨 생성, T 세포 수용체 결합 강도 및 예를 들어, CD28 보조자극 수용체를 통하여 수용된 2차 신호의 성질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 활성화된 대식 세포에 의하여 1차적으로 생성된, 시토킨 IL-12에 활성화된 T 세포가 노출되는 경우, Th1 T 세포로 분화되는 것을 지지하는 반면에, IL-4 및 IL-10에 노출되는 경우에는 Th2 T 세포로 분화되는 것을 지지한다.
Th1 T 세포는 염증성 반응, T 세포 세포 독성 및 대식 세포 활성화와 관련된 IL-2 및 IFN-γ와 같은 시토킨을 생성한다. Th1 T 세포는, Mip-1알파, Mip-1베타, RANTES, IP-10 및 MIG와 같이, 조직 염증 반응 위치로 세포를 유인하는 케모킨과 반응한다. 세포 독성 T 세포 및 활성화된 대식 세포들은 손상되었거나 또는 감염된 세포들을 제거하는 작용을 하기 때문에, Th1 반응은 세포내 병원체에 대한 면역 반응을 조절하는데에 기여한다. 중요한 것은, 대식 세포 및 내피 세포에 의하여 IP-10 및 MIG와 같은 Th1 주화성 케모킨의 생성, Th1 T 세포에 의하여 생성된 원형 케모킨인, IFN-y에 의하여 긴밀하게 조절된다는 것이다. 그러므로 피드백 루프는 활성화된 T 세포와 특정 시간 및 위치에서 특정 유형의 반응의 발병을 촉진하는 이의 환경 사이에서 발병될 수 있다.
Th2 T 세포는 IgE, IgA 및 IgG의 생성을 필요로 하는 면역 반응을 포함하는, 체액성 면역 반응의 발병을 지지하는, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10과 같은 시토킨을 생성한다. 이러한 Ig 반응은, 표면 결합형 IgM 및 IgD로부터 분비형 Ig으로 Ig의 표현형을 "스위치"시키는 B 세포의 T 세포 매개성 활성화에 의하여 수행된다. 분비형 Ig은 보통, 순환계(IgG), 창자 및 구강과 같은 점액성 표면(IgA) 및 호흡기(IgE)에서 병원체에 의한 감염을 억제하는 기능을 갖는다. Ig의 과다 생성은, 예를 들어 SLE(IgG 및 IgA), 알레르기성(타입Ⅰ) 과민반응(IgE) 및 GVHD(IgG, IgA 및 IgE)와 같은 질병을 유발시킬 수 있다. Th2 T 세포는 또한, 예를 들어 호흡기에서 병원균에 대한 급성 반응을 매개할 수 있는 호산구 및 비만 세포의 활성화를 지지한다. Th2 T 세포는, NK1.1 및 활성화된 T 세포에 의하여 생성되는, 원형 시토킨인 IL-4에 의하여 그 생성이 긴밀하게 조절되는 에오탁신 및 MDC와 같은 케모킨에 반응한다.
T 세포와 B 세포의 상호 작용은 복합적이며 밀접하게 조절되는 과정이다. 상기 활성화 과정을 개시하기 위하여, B 세포는 B 세포 항원 수용체(막 Ig)를 통하여 항원 시그널을 수용해야 한다. 그 다음, B 세포는 활성화된 T 세포로부터 특이적 접촉 의존성 시그널 및 특이적 접촉 독립성 시그널을 수용해야 한다. 하나의 필수적인 접촉 의존성 시그널은 T 세포상의 CD40L과 B 세포상의 CD40의 결합을 통하여 전달된다. 하나의 필수적인 접촉 독립성 시그널은 활성화 T 세포 및 B 세포상의 IL-4 수용체와 NK1.1 세포 결합에 의하여 분비된 IL-4에 의하여 전달된다. 상기 시그널은 비장과 같은 2차 림프 기관의 T 세포 지역내에서 발생하는 것으로 생각된다. 비장, 림프절, 편도선, 페이에르 판 및 기타 2차 및 3차 림프양 기관은 T 세포 및 B 세포내에 통상적으로 존재하는 뚜렷한 현미해부학적 지역을 보유한다. 모든 림프구는 림프절 및 페이에르 판의 고 내피 세정맥(High Endothelial Venules) 및 비장의 한외 시누스 내피 세포층과 같은 내피 세포층을 가로질러, 혈액 또는 림프로부터 상기 기관의 T 세포 지역으로 이동한다. 이후 B 세포는 B 세포 여포로서 공지되어 있는 B 세포 지역으로 이동한다. T 세포 지역을 횡단하지만 활성화되지는 않을 B 세포는 수일 경과후 상기 여포를 떠나게 될 것이다. 활성화된 B 세포는 분화 과정을 수행한다. 형질 세포로서 공지된, 몇몇 활성화된 B 세포는 다량의 항원 특이적, 저친화성 IgM 또는 IgG 항체를 분비한다. 상기 B 세포는 통상적으로 면역 반응 유도후 초기에 출현하며, 비장 및 기타 해부학적 지역의 적색 수질로 이동하는데, 여기서 이들은 수일 동안 지속적으로 항체를 분비한다. 기타 활성화 B 세포는 2차 여포로 알려진 여포의 특정 영역 또는 배아 중심내에서 분화한다. 배아 중심은 여포 수상 세포(FDC)로 알려진 특정화된 항원 보유 세포들의 주변 네트워크 를 형성하는데, 이는 배아 중심 반응을 수행하거나 또는 순화시키는 항원을 디스플레이할 것으로 생각된다. 상기 배아 중심내 B 세포는 이의 Ig 표현형을 "스위치"시키고, "친화력 성숙 과정"을 수행하여, 결과적으로 이의 항원 표적에 대한 높은 친화성을 디스플레이시킨다. 만성 GVHD 및 자가 면역 질환과 같은 질환에서 Ig이 자기 항원을 인지하지만, 보통 항원 표적은 외래 항원이다. 마지막으로, B 세포는 여포를 떠나서 T 세포 지역을 통해 되돌아오고, 기관을 떠나 수출성 순환에 의해 혈류로 이동한다.
완전히 분화되어 고친화성 Ig을 발현하는 B 세포를 아세포라고 하는데, 이는 B 세포 여포를 떠나서 다수의 기타 환경, 즉 비장의 적색 수질 지역, 골수, 간 또는 호흡기 및 창자를 감싸고 있는 점액 세포층내에 위치하게 된다. 이와 같이 완전히 분화된 B 세포중 몇몇을 기억 세포라 하며, 이는 오랜 시간 동안 지속적으로 존재하여 다시 동일한 항원을 만났을때 그 항원에 반응할 준비를 갖출 수 있다.
림프양 기관 내에서 특정 지역과 지역 사이를 B 세포가 이동할 때 상기 B 세포는 이를 인도해 줄 특정 시그널을 필요로 하는데, 상기 특정 시그널은 B 세포가 생존을 보장한다. 예를 들어, 복수의 시그널은 상기 비장내에서 B 세포 여포 조직을 유지시키는데에 필요하다. 상기 시그널로서는 케모킨 수용체 BLR-1과 BCA 리간드의 상호 작용, TNF와 TNF-R55의 상호 작용 및 LT베타와 LTβ-R의 상호 작용을 포함한다(Chaplin 및 Fu의 문헌,Current Opin. Immunol.10:298-297(1998)). 이와 같은 분자적 경로중 임의의 것이 결여된 마우스는 비장내 B 세포 여포의 보전성(integrity)이 상실되어 있다. 뿐만 아니라, 상기 유전자 결핍 마우스 모두는 비장내 배아 중심 반응을 수행하는 능력도 상실되어 있다. 기타 분자적 경로가 파괴되면 오로지 배아 중심 반응에만 영향을 준다. 예를 들어, CD40L이 결핍된 마우스는 B 세포 여포를 유지하지만, 배아 중심은 형성하지 않는다. 배아 중심 환경중의 B 세포는 생존을 유지하고 IgM을 하향 조절하며 Ig 발현을 스위치시키기 위해 CD40을 통한 시그널을 필요로 한다.
B 세포는 여포 및 배아 중심내에서 이동할 뿐만 아니라, 활성화 이후 상기 여포를 떠나 체내 다른 위치로 이동한다. 기억 B 세포는 골수에서 발견되며, IgA를발현하는 B 세포는 창자 및 기타 점액성 위치의 세포층으로 특이적으로 유영한다. 기타 시그널은 림프양 구획내 및 구획간 특정 위치로 활성화된 T 세포를 인도하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 세포 독성 T 세포는 감염 위치 또는 기타 항원 공격 위치로 이동하여 이의 표적을 찾아내어 분해시킬 수 있다. 상이한 현미해부학적 지역 사이에서 T 세포 및 B 세포를 인도하는 모든 시그널의 실체는 아직 공지되지 않았다. 그러나 다수의 경로가 2차 림프양 기관에서, 그리고 감염 또는 염증 위치에서, 항원에 대한 T 세포 및 B 세포 반응을 조직화하는 것으로 보인다.
GVHD는 항원 유발성 면역 반응의 널리 연구된 사례이다. GVHD는 종종 인간 환자에 있어서 골수 이식(BMT)에 치명적인 결과를 유발한다. 질병은 급성 또는 만성의 형태로 유발될 수 있다. GVHD의 급성형 및 만성형은 각각 항원 특이적 Th1 및 Th2 반응의 발병에대한 전형적인 예를 제공한다. 상기 질병의 급성형은 BMT 이후 처음 2개월 이내에 발생되는데, 이는 피부, 창자, 간 및 기타 기관에 대한 공여 세포독성 T 세포 매개성 손상을 특징으로 한다. 상기 질병의 만성형은 시간이 더욱 경과한 이후에(BMT 이후 100일 이상 경과시)에 명확해지며 자가항체를 포함하는 면역글로불린(Ig)의 과다 생성, 및 Ig 침착에 의하여 유발되는 피부, 신장 및 기타 장기의 손상을 특징으로 한다. 급성 GVHD의 발병으로 만성 GVHD의 후속 발병을 예견할 수 있다. 그러므로, 동일한 환자에 있어서는 양 질병이 순차적으로 발병될 수 있다. 모든 BMT 환자의 약 50%가 급성 또는 만성 GVHD로 계속 발병된다. 급성 GVHD 환자의 거의 90%가 만성 GVHD 를 발병시킬 수 있다. 현재 다수의 환자들중 만성 GVHD 치료가 성공적이었던 경우는 없다.
GVHD는 어버이 세포를 F1 세포로 이식시키는 방법을 이용하여 마우스에서 모델링될 수 있다. 본원에 기술된 모델에서, 마우스의 DBA2종으로부터 얻은 비장 세포는, B6D2F1으로 불리워지는 F1 마우스로 정맥내 주사된다(DBA2 ×C57B1/6). 주사된 비장 세포는 이식편을 구성하며, 상기 DBA2 마우스는 상기 이식편의 공여체가 되는 것이다. 상기 이식편을 수용한 F1 마우스가 숙주이다. 이식편에 존재하는 공여 T 세포는 숙주 세포상의 MHC 마커의 절반(단상형)을 외래 물질로서 인지하는데, 그 이유는 이들이 C57B1/6 어버이로부터 유래되기 때문이다. 이는 GVHD를 초래하는 숙주에 대한 공여 T 세포의 반응을 유도한다. DBA/2 어버이 비장 세포가 B6D2F1 숙주로 주사될 때, 만성 GVHD가 발병된다. 이와는 반대로 C57B1/6 비장 세포가 B6D2F1 숙주내로 주입되는 경우, 급성 GVHD가 발병된다. 상기 2가지 주입 방법을 사용하여 어떠한 기본 기작이 명확한 질병 상태에 기여하는지에 관하여는 알 수 없지만, DBA/2 비장 세포 이식편내 포함된 세포들에 의하여 발현되는 시토킨이 만성 GVHD 발병을 유리하게 만드는 반면에, C57B1/6 비장 세포 이식편내 포함된 세포들에 의하여 발현된 시토킨은 급성 GVHD 발병을 유리하게 만드는 것으로 생각된다. T 세포가 이것과 항원 기여 세포(예를 들어, 수상 세포, 대식 세포, B 세포:APC)와의 상호 작용을 효과적으로 방해하는 제제는 급성 및 만성 GVHD 모두를 차단한다.
다수의 증거에 의하면, 급성 GVHD는 Th1 매개성 질병인 것으로 밝혀졌다[Krenger 및 Ferrara의 문헌,Immunol. Res.15:50-73(1996), Williamson 등의 문헌,J.Immunol.157:689-699(1996)]. CD4+ 및 CD8+ T 세포, 자연 살생(NK) 세포, 및 대식세포와 같은 활성화된 과립세포에 의한 세포 독성 활성은 Th1 매개성T 세포 반응의 널리 규명된 결과로서, 전형적인 Th1 시토킨인 IL-2 및 IFN-γ의 발현에 대하여 특징적인 의존성을 나타낸다. 이러한 세포 독성은 급성 GVHD를 정의하는 특성이 된다. 더욱이, 예를 들어 IL-2 및 IL-12에 대한 mAb와 같은 Th1 T 세포 분화에 관여하는 중요한 시토킨을 차단하는 제제는 급성 GVHD의 발병을 차단시킨다. 세포 독성은 세포에 의하여 직접적으로 유발될 수도 있고(예를 들어, 숙주 세포의 식세포 작용에 의함) 또는 세포 자살이나 세포 사멸을 유도시킬 수 있는 TNF와 같은 분비형 시토킨의 작용에 의하여 유발될 수도 있다. 공여 항숙주 세포 독성의 결과는 다수의 방식으로 나타내어질 수 있다. 우선, 숙주 림프구가 급속하게 파괴되어, 급성 GVHD의 병력이 있는 마우스는 심각한 정도로 면역 억제된다. 두번째, 공여 림프구는 이식되어 숙주의 비장에서 증식되며, 이의 세포 독성 활성은, 공여 세포에 의하여 인지(외래 물질로서)될 수 있는 숙주 항원을 발현하는 세포주를 이용하여 시험관내에서 직접 측정될 수 있다. 예를 들어, 적합한 항원을 발현하는 세포주는 방사성 크롬51 동위원소로 표지할 수 있다. 상기 방사성 동위원소가 배양 배지로 방출되면 이는 곧 표지된 세포 사멸의 증거가 된다. 세째, 질병이 부가적인 조직 및 세포 군집의 파괴로 인해 치명적으로 되는 경우, 생존 여부는 질병의 측정 가능한 결과가 된다.
만성 GVHD는 Th2 T 세포 매개성 질병인 것으로 보인다(De Wit 등의 문헌,J.Immunol.150:361-366(1993)). 마우스 모델에서 만성 GVHD의 발병은 Th2 시토킨 IL4에 의존성이며, 이는 항IL4 mAb 로 처리하여 차단할 수 있다. 이러한 처리는 숙주 B 세포의 증식을 차단시키고, 부수적으로 Ig을 과다하게 생성하게 된다. GVHD의발병은 다수의 방법으로 조사할 수 있다. 공여 T 세포 및 숙주 B 세포 군집의 증식은 대조구(발병하지 않은) 마우스에 대하여 표준화된, 비장 중량 대 체중의 비율인 비장 지수로써 측정할 수 있다. 발병된 마우스에서의 B 세포의 활성화는 B 세포 활성화 마커 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 마지막으로, B 세포 활성화의 효과는 순환계(예를 들어, 혈청내)내 Ig의 수준으로 나타내어질 수 있거나 또는 발병후 수 주가 경과한 이후에 수집한 숙주 비장 세포의 배양물에 의하여 생성될 수 있다. 발병된 동물의 순환성 Ig는 항자기 항체를 포함할 것이다. 궁극적으로, 발병된 동물들은 축적된 Ig 침착으로 인해 신장 및 기타 기관이 손상되므로, 생존 여부는 질병 활성의 상대적인 척도가 된다.
지금부터 만성 GVHD의 마우스 모델을 사용하여, GVHD의 발병을 효율적이면서 특이적으로 차단시키는 트위크(TWEAK)에 특이적인 모노클로날 항체를 기술하고자 한다. 만성 GVHD의 발병을 차단시키면 항트위크 처리된 동물에서 비장 지수가 감소되며, 숙주 B 세포상의 활성화 마커가 소실되며, Ig 생성이 감소된다.
본 발명의 요약
본 발명은 동물에 있어서 면역 질환의 발병을 차단하거나, 이의 심각성 또는 효과를 치료하거나 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료학적 유효량의 트위크 차단제와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 화합물은 트위크 리간드에 대하여 유도된 항체 ; 트위크 수용체에 대하여 유도된 항체 ; 트위크 수용체에 대한 트위크 리간드의 결합을 변형시키는 제제 ; 세포 표면 수용체의 클러스터링을 변형시키는 제제 ; 및 트위크 수용체의 세포내 신호 전달을 방해할 수 있는 제제일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 모노클로날 항체는 트위크 표면 리간드에 대하여 유도된다. 동물은 포유 동물일 수 있고, 인간일 수도 있다. 상기 트위크 차단제는 표면 트위크 리간드에 선택적으로 결합할 수 있는 리간드 결합 도메인을 보유하는 가용성 트위크 수용체일 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 가용성 트위크 수용체는 인간 면역글로불린 IgG 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인간 면역글로불린 IgG 도메인은 특이적 항원 결합에 기여하는 영역을 포함한다.
본 발명은 동물에서 면역 반응을 억제하는 방법을 추가로 포함하는데, 상기 방법은 유효량의 트위크 차단제 및 약학적으로 유효한 담체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 면역 반응은 Th1 또는 Th2 세포 매개성 면역 반응이거나 또는 둘 다일 수 있다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 트위크 차단제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 보유하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 면역 질환의 발병을 차단시키는 신규의 단백질인 트위크(TWEAK)와 결합하는 제제를 포함하는 조성물 및 방법, 그리고 트위크 결합 제제의 용도에 관한 것이다. 트위크 결합 제제는 본원에 사용된 바와 같은 만성 이식편 대 숙주 질병(Graft-Versus-Host Disease)의 발병을 차단하는 모노클로날 항체, 가용성 트위크 수용체 Ig 융합 단백질, 또는 트위크가 이의 수용체(들)에 결합하는 것을 변형시키는 기타 분자를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예로서는 트위크 수용체(들)의 활성을 변형시키거나, 또는 트위크 수용체(들)의 세포내 신호전달을 변형시키는 트위크 수용체와 결합하는 제제를 포함한다.
도1은 쥐과 동물 및 인간의 가용성 재조합 트위크 단백질의 서열 배열을 나타내는 것이다.
도2는 관련이 없는 단백질(키홀 림펫 헤모시아닌)을 인지하는 햄스터 mAb의 결합과 비교한, 햄스터 항트위크 mAb AB.D3과 쥐과 동물의 트위크 단백질 또는 인간의 트위크 단백질을 발현하는 EBNA293 세포의 결합을 분석하는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석법의 결과를 나타내는 것이다.
도3은 FLAG 태깅된 재조합 가용성 인간 트위크와 트위크 수용체 양성 세포의 결합을 차단하는 mAb AB.D3의 활성을 FACS 분석법으로 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도4는 항트위크 mAb AB.D3, 항CD40L mAb MR1, 대조구로 처리된 만성 GVHD가 발병중인 마우스, 또는 처리하지 않은 마우스에서 B 세포의 활성화 상태의 FACS 분석 결과를 나타내는 것이다.
정의
본원에 기술된 본 발명을 완전히 이해하기 위하여, 이하 상세한 설명을 기술하였다.
본원에 사용된 "체액성 반응" 및 "세포성 반응"은 항원에 대한 동물의 면역학적 반응을 의미하는 것으로서, 이에 의하여 동물들은 항원에 대한 항체를 생성할수 있거나 또는 항원에 대한 세포독성 반응을 나타낼 수 있거나, 또는 둘 다 나타낼 수 있다. T 헬퍼 세포의 Th1 클래스는 세포성 반응을 유발시키는데에 중요한 역할을 하며, T 헬퍼 세포의 Th2 클래스는 고친화성 항체를 효율적으로 생성하는데에 중요한 역할을 한다.
본원에 사용된 "T 헬퍼(Th) 세포"란, 세포 독성 T 세포를 생성하는 것을 보조하고 B 세포와 협동하여 항체 생성을 자극하는 T 세포의 기능적 하위 클래스를 의미한다. 헬퍼 T 세포는 클래스Ⅱ MHC 분자와 함께 항원을 인지하여 접촉 의존성 및 접촉 독립성(시토킨 및 케모킨) 신호를 효과기 세포에 제공한다.
"Th1"이란 TNF, 인터페론-γ및 IL-2(및 기타 시토킨)를 생성하는 T 헬퍼 세포의 하위 클래스를 의미하는 것으로서 이는 공격에 대한 세포성 반응, 즉 비면역글로불린과 관련된 염증 반응을 나타낸다.
"Th2"는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 기타 시토킨을 생성하는 T 헬퍼 세포의 하위 클래스를 의미하는 것으로서, 이는 면역 공격에 대한 면역글로불린성(체액성) 반응과 관련되어 있다.
본원에 사용된 "배아 중심"이란 항원 면역화 이후에 형성된 2차 B 세포 여포를 의미한다. 이러한 해부학적 위치의 외관은 항체 반응의 최적 기억 발생, 이소타입 스위칭, 체세포성 과돌연변이 및 이로 인한 친화력 성숙 과정과 상관되어 있다.
"항체 생성 세포"란 Th 세포로부터 접촉 의존성 및 접촉 독립성 신호를 수용하는 B 세포로서, IgM, IgG, IgA 또는 IgE 하위 클래스의 면역글로불린을 분비한다.
항체의 "Fc 도메인"이란 힌지, CH2 및 CH3 도메인은 포함하나, 항원 결합 위치는 결핍된 분자의 일부를 의미한다. 상기 용어는 또한 IgM 또는 기타 항체의 이소타입의 동등한 영역을 포함하는 것을 의미한다.
"항트위크 항체"란 트위크 단백질의 1 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 의미한다.
"항트위크 수용체 항체"란 트위크 수용체의 1이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 의미한다.
"트위크 수용체 신호전달"이란 트위크 수용체 경로와 관련된 분자 반응 및 이로 인한 후속 분자 반응을 의미한다.
"트위크 또는 트위크 수용체 변형제" 및 "트위크 또는 트위크 수용체 변형제"란 트위크 수용체에 대한 리간드 결합을 변형시킬 수 있는 임의의 제제를 의미하는 것으로서, 이는 세포 표면 트위크 수용체 클러스터링 또는 트위크 수용체 신호전달을 변형시킬 수 있고, 또는 트위크 수용체 시그널이 세포내에서 해독되는 방식에 영향을 미칠 수 있다.
"트위크 리간드" 또는 "트위크 단백질"은 트위크 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 트위크 단량체성, 중합체성 또는 헤테로량체성(heteromer) 복합체 또는 이의 유도체를 의미한다.
"개체"란 동물을 의미하거나, 또는 동물로부터 유도된 1 이상의 세포를 의미한다. 동물은 포유 동물이 바람직하다. 세포는 조직, 세포 클러스터, 무한 증식성 세포, 형질감염된 세포 또는 형질 전환된 세포내에 유지되는 세포, 및 물리적으로또는 표현형적으로 변경된 동물로부터 유래된 세포를 포함하는 임의의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
트위크 리간드
최근들어 트위크는 단백질의 TNF 패밀리의 일원인 것으로 밝혀졌다 [Chicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)]. 단백질의 TNF 패밀리의 일원은 단백질의 TNF 수용체(TNF-R) 패밀리의 수용체에 결합한다. TNF 패밀리 단백질과 이의 수용체와의 상호 작용은 면역계내에서 다양한 기능에 영향을 미친다. 널리 공지된 예로서는 CD40 수용체에 결합하여 B 세포가 항체 생성 세포로 분화되는 것을 촉진시키는 CD40L 단백질[Grewal 및 Flavell의 문헌,Immunol.Res.16:59-70(1997)], 림프독소-β수용체에 결합하여 여포 수상 세포의 분화 상태를 조절함으로써 체액성 면역 반응에 영향을 미치는 림프독소-β리간드(LT-β)[Mackay 및 Browning,Nature395:26-27(1998)], 및 OX40 수용체에 결합하여 T 세포 신호에 대한 B 세포의 반응을 조절하는 OX40L[Flynn 등의 문헌,J.Exp.Med.188:297-304(1998)]을 포함한다. 면역계에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지된 TNF/TNF-R 패밀리내 기타 리간드/수용체 쌍에는 TNF/TNF-R55, FasL/Fas 및 CD27/CD70을 포함한다.
트위크에 관한 생물학은 아직 부분적으로 밖에 이해되지 않은 상태이다. 정제된 가용성 트위크 단백질은 HT29 아데노암종 세포(세포 자살을 통한 세포 사멸), HeLa 자궁 경부 암종 세포(형태학상 변형), 및 A375 흑색종 세포(항증식)를 포함하는 몇몇 종양 세포주의 분화 및/또는 사멸을 유도하는데에 사용되었다. 트위크는또한 HT29 및 A375 세포주가 케모킨 IL-8을 분비하도록 유도하며, 이는 섬유아세포주인 WI-38에 동일한 효과를 나타낸다[Chicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)]. 더욱이, 트위크는 다수의 정상적 내피 세포주의 증식을 유도한다[Lynch 등의 문헌,J.Interferon Cytokine Res.18:A-46(1998)].
트위크의 추정 수용체에 관하여는 기술된 바 있다[Marsters 등의 문헌,Curr.Biol.8:525-528(1998)]. TRAMP, Apo3, WSL-1, DR-3 또는 LARD등 여러가지로서 공지되어 있는 상기 수용체는 TNF-R 패밀리의 일원이다. TRAMP의 활성화는 카스파아제 의존성 세포 사멸 신호전달 경로 또는 NF-kB 시그널링 경로를 통한 세포 활성화를 연주시킴으로써 세포 자살을 유도할 수 있다[Ashkenazi 및 Dixit의 문헌,Science281:1305-1308(1998)].
심장, 뇌, 허파, 간, 기타 조직 및 예를 들어 비장, 림프절 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 2차 림프양 기관에서 발견되는 메신저 RNA(mRNA)로 인한 마우스 및 인간 조직내에서의 트위크 발현은 널리 알려져 있다. 트위크는 흉선, 골수 및 태아의 간과 같은, 면역계 세포가 발생하는 1차 림프양 기관에서 발현되지 않는 것으로 보인다. 그러므로 트위크가 면역계에서 담당할 수 있는 역할은, 면역계의 발생보다는 면역 반응인 것으로 보인다.
단백질 리간드 및 이의 수용체의 상호 작용은 다수의 특이적 도구를 사용하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 리간드를 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체(mAb)를 이용하여 결합 위치를 인지하거나, 또는 상호 작용을 물리적으로 방해함으로써 리간드/수용체 결합을 방지하거나 또는 변형시킬 수 있다. 또는, 수용체에 대해 다수의 리간드가 존재하는 경우, 항리간드 mAb는 기타 리간드의 결합에 영향을 미침으로써 수용체 신호전달에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 복합적 효과는 CD28 리간드의 B7 패밀리에 대한 mAb로서 주목되고 있다[Lenschow 등의 문헌,J.Exp.Med181:1145-1155(1995)]. 항리간드 mAb는, 예를 들어 하나의 수용체에 대한 리간드 결합은 변형시키되 다른 수용체에 대한 결합은 그대로 유지시킴으로써, 다수의 수용체가 특정 리간드에 대하여 존재하는 시스템에서 더욱 미묘한 효과를 나타낼 수 있다. 상기 수용체를 인지하는 mAb는 또한 리간드 결합을 변형시키는데에 사용될 수도 있으며, 또는 이 자체가 수용체 신호전달을 유도하거나 또는 변형시킬 수 있다. 그러므로 항수용체 mAb는 길항적이거나 또는 작동적일 수 있다. TNF/TNF-R 패밀리 일원들의 리간드/수용체 상호 작용을 변형시키기 위해 마우스 또는 인간 시스템에서 사용되는 mAb의 예들로서는 무엇보다도, TNF, CD40L, LT-β, Fas-L 및 TR2/HVEM에 특이적인 mAb를 포함한다. mAb는 면역 질병 및 기타 질병의 개시 및 발병을 차단시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항CD40L은 전신 루프스 홍반증(SLE)의 치료 및 장기 이식 장애의 조절에 사용되고 있다.
리간드/수용체 상호 작용의 유력한 억제제는 또한 인간 면역글로불린(Ig) 중쇄를 암호화하는 서열에 수용체 서열의 세포외 부분을 암호화하는 서열을 클로닝한후, 하이브리드 유전자를 적합한 유전자 프로모터를 사용하여 적합한 세포주에서 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 정제된 수용체-Ig 융합 단백질은 시험관내 및 생체내에서 사용할 수 있는 단백질 리간드와 결합하여, 천연의, 세포 결합형 수용체와 리간드의 상호 작용을 변형시키는데에 사용될 수 있다. 변형은 항리간드 mAb에대하여 상기 정의한 것과 유사한 다수의 기작으로 수행될 수 있다. TNF/TNF-R 패밀리 일원들의 리간드/수용체 상호 작용을 변형시키기 위해 마우스 또는 인간 시스템에서 사용된 수용체-Ig 융합 단백질의 예들로서는 무엇보다도, TNF-R55-Ig, TNF-R75-Ig, LTβ-R-Ig 및 OX40-Ig를 포함한다. 수용체-Ig 융합 단백질은 면역 질병 및 기타 질병의 개시 또는 발병을 차단하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, TNF-R75-Ig은 염증성 장 질환(IBD)의 치료에 사용되고 있다.
본 발명자는 쥐과 동물 및 인간 트위크에 특이적으로 결합하는 mAB가 원형 항원 유발성 면역 질환, 이식편 대 숙주 질병(GVHD)의 발병을 차단시킴을 입증하였다. 본 발명은 트위크 및 트위크 수용체 변형제를, 골수 또는 간(幹)세포 이식에 의하여 유발되는 GVHD 및 이식편 거부 현상으로 인한 장기 이식 장애와 같은, 환자에 외래 항원이 도입되어 유발되는 다수의 면역 질환의 치료에 사용될 것으로 기대하고 있다. 더욱이, 본 발명은 트위크 및 트위크 수용체(들)의 변형제를 사용하면 무엇보다도 SLE, 특발성 혈소판 장애 자반병, 웨그너 육아종증, 다발성 동맥염 결절, 망막성 포도막염, 급속 발병성 겸상 사구체신염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 및 궤양성 대장염과 같은, 다수의 자가 면역 질환의 치료에 유효할 것으로 기대하고 있다. 기타의 기대되는 용도로서는 무엇보다도 알레르기성 염증, 천식, 호산구증가증, 그레이브스병 및 샤가스병과 같은 급성 및 만성 염증 상태의 치료를 포함한다.
재료 및 방법
마우스
6∼8주령 DBA/2 및 C57B1/6 종의 암컷 마우스, 및 (DBA/2 ×C57B1/6)F1 교배종을 Jackson Laboratory(미국, 메인주, 바 하버 소재)로부터 구입하여, 이를 통상의 벽으로 보호하에 수용하고, 사용 지침에 따라서 취급하였다.
모노클로날 항체
바큘로바이러스에서 생성하여 기술된 바와 같이 정제된(Chicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)) 가용성 인간 트위크 단백질을 사용하여 아르메니아 햄스터에서 인간 및 쥐과 동물 트위크 단백질을 인지하는 모노클로날 항체를 제조하였다. 각 햄스터의 복강내로 프레운트 완전 보조제(CFA)중 트위크 50㎍을 주사하여 초기 면역화시켰다. 후속 면역화는(1차 면역화하고 14일, 28일 및 42일이 경과한 후) 각각의 햄스터의 복강내로 프레운트 불완전 보조제(IFA)중 트위크 50㎍(14일 및 28일 경과후) 또는 33㎍(42일 경과후)를 주사하여 수행하였다. 혼성 세포(hybridoma)를 생성하기 위하여 비장 세포를 융합시키기 이전의 최종 면역화는 보조제 없이 트위크 100㎍을 복강내로 주사하여 수행하였다. 혼성 세포 생성은 표준적인 방법을 사용하여 수행하였다[Lerner,Yale J.Biol.Med.54:387-402(1981)].
항쥐과 동물 CD40L mAb MR1을 생성하는 혼성 세포(Noelle 등의 문헌,Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:6550-6554(1992))를 ATCC로부터 분양받았다(미국 매릴랜드 록빌 소재). 항KLH mAb Ha4/8을 생성하는 혼성 세포는 Dr. Mendrick으로부터 얻었다(미국 매릴랜드 록빌에 소재하는 Human Genome Sciences, Inc.).
mAb 활성의 ELISA 분석법
다양한 종류의 실험을 통해 인간 및 쥐 트위크와 결합할 수 있는 항인간 트위크 mAb의 능력을 시험하였다. 인간 트위크 단백질에 대하여 생성된 몇몇 mAb는 또한 ELISA 방식의 분석법을 사용하여 수행되는 mAb 활성의 초기 스크리닝에서 마우스 트위크 단백질을 인지하였다. 인간 트위크 단백질에 관하여 전술된 바와 유사한 방법을 사용하여 바큘로바이러스에서 쥐과 동물 트위크 단백질을 생성하였다 (Chicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)). 정제된 인간 및 쥐과 동물 트위크 단백질을 96웰 평판상에 피복하고, 이들 고정화된 단백질에 결합할 수 있는 다수의 햄스터 mAb의 능력을 시험하였다. 고정화된 트위크 단백질에 의한 햄스터 mAb의 포획여부는 퍼옥시다제 커플링된 당나귀 항햄스터 IgG(미국 펜실배니아 웨스트그로브에 소재하는 Jackson ImmunoResearch), 및 적합한 퍼옥시다제 의존성 효소 반응을 사용하여 눈으로 확인할 수 있었다.
mAb 활성의 FACS 분석법
가용성 트위크 단백질은 HT29 세포에서 세포 자살을 유도하였는데, 이는 상기 세포가 트위크 수용체를 발현하는 것을 시사하는 것이다(Chicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)). 정제된 mAb(10㎍/㎖)는, 바이오틴화된 항FLAG 항체, 스트렙타비딘 퍼옥시다제 및 적합한 효소 기질에 의하여 검출되는 바와 같이, HT29 세포에 대한 FLAG 태깅된 쥐과 동물 또는 인간 트위크의 결합을 차단할 수 있는 그들의 능력을 시험하였다.
만성 GVHD의 유도
6∼8주령의 DBA/2 및 B6D2F1 암컷 마우스를 죽인후, 이로부터 멸균 기술을사용하여 비장을 제거하였다. 거친 유리 슬라이드 사이에서 상기 기관을 조심스럽게 분쇄하여 전체 세포 파편을 침강시킨후, 맑은 상청액을 펠렛화시켜 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 상기 세포 펠렛을 게이 완충 고장액에 재현탁시키고, 이를 3' 동안 얼음에서 항온처리하여 적혈구를 용해시켰다. 이때 파괴된 각 비장 세포당 게이 완충 고장액 5㎖를 사용하였다. 상기 세포 용액을 다시 펠렛화시키고, 이를 무발열원 멸균 PBS에 재현탁시킨후 펠렛화시키고, 다시 멸균성의 무발열원 PBS에 재현탁시켰다. 혈구계산기로 세포수를 측정한후, 세포 밀도를 2 ×108/㎖로 맞추었다. 이후 상기 용액을 70㎛ 멸균 세포 필터로 통과시키고, 사용할때까지 얼음에서 보존하였다. 6∼8주령 B6D2F1 암컷 마우스를 수용체(recipient)로 사용하였다. 각 수용체의 부수 정맥(vail vein)내에 500㎕(1×108) 세포를 주사하였다. 대조구 동물 세트가 B6D2F1 이식편을 수용한 반면에(F1 〉F1), 실험군은 DBA/2 이식편(DBA/2 〉F1)을 수용하였다. 주사 14일 경과후 동물들의 만성 GVHD의 발병 상황을 분석하였다.
만성 GVHD의 차단
마우스에 항트위크 mAb AB.D3, 항CD40L mAb MR1, 대조구 mAb Ha4/8을 투여하거나, 또는 아무것도 투여하지 않았다. 처리 스케쥴은 이식편 도입 이전 및 이후 2일, 4일 및 6일간 mAb 250㎍을 복강내 투여하였다.
질병 발병 분석법
실험의 14일째에 마우스를 죽여서 그 중량을 측정하였다. 이후 해부하여 비장을 분리해낸후 이의 중량을 측정하였다. 대조구 F1 〉F1 군에 있어서 각 동물의 체중에 대한 비장의 중량의 비율로서 비장 지수를 계산한후, 이를 평균내어 평균 값을 구하였다. 기타 군 모두에 대한 평균 비장 지수를 대조구 값으로 표준화시켰다. 이후 비장 세포를 전술한 바와 같이 상기 비장으로부터 분리한후, 멸균 PBS중 1 ×107세포/㎖의 농도로 희석시켰다. FACS 분석을 위하여 세포 100㎕를 하기 세포 표면 마커로 염색하였다. 기술된 모든 mAb는 파밍겐(미국, 캘리포니아, 샌디애고 소재)에서 구입하였다. 스트렙타비딘 시약은 서던 바이오테크놀로지 코포레이숀(미국, 알라바마주, 버밍햄 소재)으로부터 구입하였다. Fc 수용체에 비특이적으로 결합하는 것을 차단하는 비장 세포는 단상형 마커인 바이오틴화된 항H2Kb로 염색하였는데, 이 마커는 FcBlock™(파마시아) 10㎍/㎖ 를 함유하는 PBS/0.5% 소 혈청 알부민(BSA)/0.1% 나트륨 아지드(FACS 완충액)중에서 직접 결합된 FITC 또는 PE 표지된 항CD4, 항CD8, 항B220, 항CD69, 항I-Ad, 항L-셀렉틴 및 항H2Dd를 다양하게 병용하여 숙주 세포(H-2Kb+)와 공여 세포(H-2Kb-)를 구별할 수 있다. 세포를 얼음에서 1 시간 동안 mAb와 함께 항온 처리하였다. 이후 각 시료를 2㎖ FACS 완충액에 재현탁하여 세척한후 원심 분리하여 상기 세포를 펠렛화시켰다. 상기 세포들을 바이오틴화된 mAb에 결합하여 FACS 분석용 제3채널을 제공하는 CyChrome 표지된 스트렙타비딘을 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시키고, 최종적으로 세정하여, FAC스캔 기구 및 Cellquest 소프트웨어(미국, 캘리포니아, 산호세 소재, Becton Dickinson사)를 사용하여 분석하였다.
Ig 분비 세포의 시험관내 분석을 위하여, 상기 세포들을 펠렛화시킨후, 이를 10% 소 태아 혈청(FBS)/4mM 글루타민을 함유하는 DMEM중에 1 ×107세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. 웰당 1㎖씩 6개의 웰 평판에 분배하였다. 24시간 경과후 세포 상청액을 회수하였다.
항트위크 항체의 공급원
본 발명의 하나의 구체예에서, 트위크에 대해 유도된 항체(Ab)는 트위크 차단제로서 작용한다. Ab는, 이종 서브유닛이 존재하는 경우, 이들과 함께 또는 단독으로 단량체형, 이량체형 또는 삼량체형 트위크 단백질에 대하여 생성될 수 있다. 더욱이, Ab는 트위크 단백질의 가용성, 돌연변이형, 변형 또는 키메라형에 대하여 생성될 수 있다. 본 발명의 항트위크 Ab는 폴리클로날 또는 모노클로날(mAb)일 수 있으며, 이들의 트위크 수용체에 대한 트위크의 결합을 차단시킬 수 있는 능력, 이들의 생체내 생물적합성, 안정성 또는 기타 바람직한 특성을 최적화시키도록 변형될 수 있다.
트위크에 대해 유도된 폴리클로날 항체 혈청은 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마우스와 같은 동물에 프레운트 완전 보조제(CFA)중의 인간 트위크를 피하 주사하고, 이어서 프레운트 불완전 보조제(IFA)의 부스터를 복강내 또는 피하 주사하는 종래 기법을 사용하여 제조한다. 트위크에 대해 유도된 바람직한 Ab를 함유하는 폴리클로날 항혈청은 통상의 면역학적 방법으로 스크리닝된다.
아르메니아 햄스터에 CFA중의 재조합 가용성 인간 트위크를 피하 주사하고,이어서 IFA중의 부스터를 복강내 또는 피하 주사하는 통상의 방법을 사용하여 인간 트위크에 대하여 유도된 햄스터 모노클로날 항체(mAb)를 제조하였다. 햄스터 항트위크 mAb AB.D3을 생성하는 혼성 세포주(AB.D3.7.2)는 부다페스트 조약의 규정에 따라서 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)(매릴랜드, 록빌 소재)에 ____에 기탁하였으며, 이때 ATCC 수탁 번호는 ____였다. 상기 ATCC 기탁물의 공중의 이용 가능성에 대한 모든 제한은 본 출원에 대한 특허 허여시 영구적으로 소멸될 것이다.
항트위크 Ab의 다양한 형태는 또한 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수도 있다(Winter 및 Milstein,Nature, 349, pp293-299(1991)). 예를 들어, "키메라" 항체는 동물 항체로부터 얻어진 항원 결합 도메인이 인간 불변 도메인과 연결되도록 구성할 수 있다(예를 들어, Cabilly 등, 미국 특허 제4,816,567호 ; Morrison 등,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp6851-6855(1984)). 키메라 Ab는 인간의 임상 치료에 사용되는 경우 동물 Ab에 의해 유도된, 관찰된 면역 반응을 감소시킨다.
더욱이, 트위크를 인지하는 재조합 "인간화 항체"를 합성할 수 있다. 인간화 항체는 대부분 특이적 항원 결합에 기여하는 영역이 삽입된 인간 IgG 서열을 포함하는 키메라이다(예를 들어, WO 94/04679). 동물을 바람직한 항원으로 면역화시키고, 해당 Ab를 분리하여, 특이적 항원 결합에 기여하는 가변 영역 서열의 일부를 제거한다. 이후 동물 유래 항원 결합 지역을 항원 결합 영역이 결실된 인간 항체 유전자의 적합한 위치에 클로닝한다. 인간화 Ab는 인간 Ab중 이종(종간) 서열의 사용을 최소화시키며, 이는 처리된 개체에서 면역 반응을 덜 유발시키는 것으로 보인다.
또한, 상이한 클래스의 면역글로불린으로부터 분리된 항트위크 가변 도메인과 인간 불변 도메인(CH1, CH2, CH3)을 포함하는 키메라 또는 인간화 Ab를 제조함으로써 상이한 클래스의 재조합 항트위크 Ab를 구성할 수도 있다. 예를 들어, 항원 결합 위치 수가(數價)가 증가된 항트위크 IgM Ab는 항원 결합 위치를 인간 IgM 중쇄 불변 영역을 보유하는 벡터에 클로닝시켜 재조합 생산할 수 있다[Arulanadam 등의 문헌,J.Exp.Med., 177, pp1439-1450(1993); Lane 등,Eur.J.Immunol., 22, pp2573-2578(1993); Traunecker등의 문헌,Nature, 339, pp 68-70(1989)].
더욱이, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 항원 결합 위치 인접부의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 재조합 Ab와 이의 항원과의 결합 친화력을 변경시킬 수 있다. 인간화 Ab의 항원 결합 친화력은 분자 모델링을 근거로 하는 돌연변이 유발에 의하여 증가될 수도 있다[Queen 등의 문헌,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, pp10029-33(1989);WO 94/04679].
표적화된 조직 타입 또는 구체화된 특정 처리 스케쥴에 따라서 트위크에 대한 항트위크 Ab의 친화력을 증가 또는 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 유사예방학적 치료를 위하여 트위크 경로를 변형시키는 능력이 감소된 일정 수준의 항트위크 Ab로 환자를 처리하는 것이 유리할 수 있다. 이와 유사하게, 트위크에 대한 친화력이 증가된 항트위크 Ab는 단기 치료에 유리할 수 있다.
햄스터 항인간 트위크 모노클로날 항체의 제조에 관하여는 실시예 1에 기술되어 있다.
만성 GVHD, 항원 유발성 면역 질병의 발병을 차단하는 항트위크 mAb의 용도
이하, 만성 이식편 대 숙주 질병(GVHD)의 마우스 모델에서의 면역 반응 발병에 대한 트위크 차단제, mAb AB.D3의 효과를 기술하고자 한다. 만성 GVHD를 차단하는 능력은 B 세포 활성화 및 증식에 대한 효과, 및 분비형 IgG 생성에 대한 효과를 포함한다. 마우스를 항트위크 mAb AB.D3, 항KLH 대조구 mAb Ha4/8, 항CD40L mAb MR1 250㎍으로 복강내 주사하여 처리하거나, 또는 미처리 상태로 남겨두었다. 4시간 경과후 마우스에 DBA/2 마우스로부터 분리한 1 ×108비장 세포를, 0.5㎖ 정맥내 주사로 투여하였다. 정맥내 주시된 DBA/2 비장 세포는 동종 이식편을 구성하였다. 상기 이식편이 투여된지 2일, 4일 및 6일 경과후, 마우스를 항트위크 mAb AB.D3, 항KLH 대조구 mAb Ha4/8 또는 항CD40L mAb MR1 250㎍으로 다시 처리하였다. 1 ×108B6D2F1 비장 세포가 투여된 마우스 대조군은 B6D2F1 수용체에서 질병을 유발하지는 못했다. 또는, 이식되지 않은 미처리 B6D2F1 마우스를 대조구로 사용하였다. 이식편 도입 14일 경과후 마우스를 죽이고 질병의 징후를 관찰하였다.
미처리 이식편 수용 마우스는 만성 GVHD의 발병을 시사하는 다수의 징후를 나타냈다. 비장의 비대 또는 증폭은 공여 T 세포 및 숙주 B 세포가 활성화되었으며, 세포수가 상당히 증가된 폴리클로날 증폭에 대한 증거이다. B 세포의 하위 세트상의 CD69와 같은 세포 표면 단백질의 출현은 B 세포 활성화를 시사하는 것이다. CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 얻은 L-셀렉틴 분자의 상실은 T 세포가 활성화되었다는증거이다. IgG 클래스, IgA 및 IgE와 같은 Ig 분자의 혈청으로의 분비, 또는 시험관내 세포 배양 분석법에서 상기 분자의 분비는 B 세포가 활성화되었으며, 이의 Ig 클래스들을 스위치시켰음을 나타내는 것이다, 이러한 관점에서 혈청 또는 시험관내 세포 배양 분석에서 항자기Ig의 출현은 생성된 Ig이 부적합하게 자가항원을 인지하는 사실을 나타내는 것이다. 마지막으로 상이한 처리 방식의 결과로서 생존여부를 측정할 수 있었다.
GVHD 발병시 대조구 마우스를 미처리의 동종 이식편 수용 마우스와 비교하여 비대, B 세포 활성화 및 Ig 분비의 정도를 측정하였다. 항CD40L mAb MR1이 CD40L/CD40 상호작용을 차단시키면 만성 GVHD 발병이 효과적으로 차단된다는 것을 이전에 살펴보았기 때문에, 항CD40L mAb MR1을 상기 실험에서 양성 대조구로 사용하였다[Durie 등의 문헌,J.Clin.Invest.94:1333-1338(1994)]. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대하여 생성된 햄스터 mAb, Ha4/8을 음성 대조 처리구로서 사용하였다. 2개의 실험으로부터 얻어진 결과들을 표2에 나타내었다. 항트위크 mAb AB.D3로 처리한 양 실험에서 비대양은(미처리 동종 이식편 수용체와 비교하여) 약 33% 정도 감소하였다. 음성 대조구 mAb Ha4/8로 처리하였을 경우에는, 아무런 효과도 나타나지 않았으며, 반면에 항CD40L mAb MR1으로 처리하였을 경우에는 비대는 거의 70%정도까지 차단되었다. 항트위크 mAb AB.D3로 처리에 의하여 영향을 받은 세포 군집을 관찰하기 위하여, 이식편을 주입하고 14일 경과후에 수용체 마우스로부터 취한 비장세포로 FACS 분석법을 수행하였다. 군 당 3∼4 마리의 마우스로부터 비장 세포들을 분리후 풀링하였다. 수용체 B 세포의 활성화는 만성 GVHD의 눈에 띄는 특성이다. 미처리의 마우스 및 대조구 mAb로 처리한 마우스에서, 작지만 용이하게 식별할 수 있는 비율의 B200+B 세포가 활성화 마커 CD69를 발현하였다(도4 및 표3 참조). 이와는 반대로, MR1 또는 AD.B3 처리된 마우스에서는 CD69를 발현하는 B200+ B 세포는 실질적으로 없었다. AB.D3 마우스의 비장에서 측정 가능한 B 세포 활성화의 부재는 T 세포 활성화 실패, B 세포 활성화 실패, 또는 세포 사멸(세포 자살)을 포함하는, 몇몇 작용 기작중 1이상에 기인할 수 있다. 다음으로, 상이하게 처리한 마우스의 비장 세포 배양액중의 총 IgG를 측정하여, 기능성 정보, 즉 IgG 생성과 B 세포 군집으로부터 얻은 CD69 활성화 마커의 상실이 상관되었는지 여부를 결정하였다. 미처리 대조구 마우스, MR1 처리된 마우스 및 AB.D3 처리된 마우스는 처리되지 않았거나 또는 Ha4/8 처리된 동종 이식편 수용 마우스의 경우보다 총 IgG양이 훨씬 적었다(표 4). 상기 결과는 만성 GVHD의 눈에 띄는 특성인, 활성화된 B 세포에 의한 Ig 분비가 항트위크 mAb로 처리함으로써 차단됨을 나타내는 것이다. 만성 GVHD의 발병을 차단하는 항트위크 mAb의 용도를 실시예 2에 기술하였다.
기타 항체 매개성 질병
다수의 기관 특이성 및 전신성 자가 면역 질병은 병리학적 항체 반응을 포함한다. 이러한 상태로서는 다음의 것들을 포함한다. 즉, 중증근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 샤가스병, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소증 자반병(ITP), 전신성 루프스 낭창(SLE), 베그너 육아종증, 다발성 동맥염 결절 및 급속 발병성 겸상 사구체신염[Benjamini 등의 문헌,Immunology, A Short Course, Wiley-Liss, New York 3rd ed.(1996)].
비록 SLE 병인은 규명되지 않았다 하더라도, 관찰된 병변에 관련된 면역 기작에 대해서는 상당 부분 공지되어 있다. 알수 없는 이유로 인하여, SLE 환자는 신체(천연의 2본쇄 DNA에 대하여 눈에 띄는 항핵항체(ANA))의 핵 성분에 대한 항체들을 생성한다. 임상학적으로 상기 항체가 존재하는 것은 SLE에서 발병되는 신장 병변과 가장 많이 관련되어 있다. 상기 항체들은 정상 조직 분해시 명백히 유래되는 DNA와 복합체를 형성하며, 임의의 면역 응집성 질병에서, 이러한 복합체들은 소동맥벽 및 활막 공간에 사구체의 기저막에 대하여 트랩핑되는 침착물을 형성한다. 이러한 복합체들은 보체 캐스캐이드를 활성화시켜 과립백혈구를 유인한다. 후속적인 염증 반응은 결과적으로 신장을 손상시켜 단백뇨 및 혈뇨를 나타내는 사구체신염으로 특징지워진다.
SLE는 수십년간 쥐과 동물 모델에서 연구되어 왔다. SLE 발병은, T 세포 및 B 세포 활성화의 중요한 단계들을 방해하는 CTLA4-Ig 융합 단백질 및 항CD40L과 같은 시약을 사용하여 차단할 수 있다[Grewal 및 Flavell,Immunol. Rev.153:85-106(1996)]. 최근들어, 쥐과 동물 CD40 리간드에 특이적인 시약의 치료적 효능을 몇몇 모델에서 평가하였다[Mohan 등의 문헌,J.Immunol.,154,pp1470-1480(1995)]. 생체내에서 병원성 항체의 생성을 유도하는 세포를 전이시킴에 따른 루프스의 가속화는 CD40/CD40 리간드 상호작용을 차단하는 모노클로날 항체를 투여함으로써 억제되는것으로 밝혀졌다. 더욱이 루프스 마우스를 항CD40 리간드 항체로 간단히 처리하면 상기 항체들이 이들의 시스템으로부터 제거된 이후 장기간 동안 이들로 인한 자발적 질병에 대하여 유리한 효과를 지속시키게 된다. 실험에 의하면 병원성 B 세포는 치료 수행 이후 9개월이 경과하였을때 조차도 항체를 생성할 수 없었는데, 이는 자가 면역성 기억 B 세포의 증식 지연이 장기간의 치료적 이점으로 나타난다는 사실을 시사하는 것이다. 뿐만 아니라, 항 CD40L 처리는 자발적으로 발생하는 마우스 모델에서, 발병한 SLE의 발병을 정지시키거나 또는 지연시킬 수 있었다[Kalled 등의 문헌,J.Immunol.160:2158-2165(1998)]. 이미 밝혔듯이 트위크/트위크 수용체(들) 상호작용을 생체내에서 변형시키는 제제는 B 세포 활성화 및 Ig 생성을 억제하는 것으로서, 본 발명의 제제는 SLE의 치료 또는 예방에 유용할 것이다.
몇몇 병원성 감염체에 대한 정상적인 면역 반응은, 과도하게 나타날 수 있으며 의학적 문제점을 제공하는 자가항체 반응을 유발한다. 하나의 예로서 만성 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi(T.cruzi)) 감염된 인간 및 실험용 동물에서 발병되는 염증성 심근병인, 샤가스병을 들 수 있다. 최근들어, 몇몇 연구에 의하면, 샤가스병 환자의 혈청중에서 항자기 항체를 동정하였다[Bach-Elias 등의 문헌,Parasitol. Res.84:796-799(1998)]. 더욱이, 최근들어 심장 특이적 자가 면역 반응의 유도는 인간 샤가스 심근병의 병인과 관련된 가능성 있는 기작으로서 실험적으로 지지되었다. 최근 연구에 따르면(Tibbets등의 문헌,J.Immunol., 152, pp1493-1499(1994)), 심장 항원 특이적 항체들은 심장병이 있는 티.크루지 감염 C57B1/6 마우스에서 생성됨을 규명하였다. 티.크루지의 브라질 균주로 감염되면, C57B1/6 마우스에서는 만성적으로 감염된 인간에서 관찰되는 것과 해부학적으로 유사한 심근병이 발병된다. 심근병이 발병되지 않는 티.크루지의 게이어스 균주로 감염된 C57B1/6 마우스는 이러한 항체를 생성시키지 않는 반면에, 상기 마우스로부터얻은 항혈청은 3개의 심장 항원과 반응하였다. 이러한 데이터는 상기 항체가 심근병의 특이적인 마커임을 시사하는 것이다. B 세포 활성화 및 Ig 생성을 차단하는 트위크 변형제의 효능은 샤가스병 환자에서 나타나는 심장 손상을 차단시키는데에 유용할 것이다.
특정 감염성 질병의 결과로서 생성되는 자가 항체에 의한 세포 파괴 또는 기타 공지되지 않은 이유에 대한 다른 예로서는 특발성 혈소판감소증 자반병(ITP)이 있다. 이런 질병에서, 혈소판에 대하여 유도된 항체들은 출혈을 일으킬 수 있는 혈소판 파괴(Fc 또는 C3b 수용체를 보유하는 보체 또는 식세포 세포에 의함)를 초래한다. 항체 생성을 억제하는 본 발명의 트위크 변형제와 같은, 생체내 항체 매개성 자가 면역 반응을 억제하는 치료제는 또한 상기 자가 면역 질환을 치료 또는 예방하는데에 유용할 것이다.
몇몇 병원 감염체에 대한 정상적인 면역 반응은 또한 과도하게 나타날 수 있으며, 그 자체로서 의학적 문제를 일으킬 수 있는 과민성 반응을 유발할 수도 있다. 타입Ⅰ 과민성의 가장 널리 알려진 예로서는 알레르기 반응이 있다. 이런 알레르기 반응들은 과민증을 매개하는 약리학적 활성 제제의 방출을 촉발시키는 비만 세포 및 호염기구상의 수용체에 대한 Fc 부분을 통하여 결합하는 IgE 항체에 의하여 매개된다. ITP 및 굳파스퇴르 증후군은 때때로 IgM 또는 IgG 항체가 세포 표면상 항원과 결합하고, 보체 캐스케이드를 활성화시키는 경우에 발생하는 타입Ⅱ 반응인 것으로 생각된다. 이후 과립 백혈구는 활성화 위치로 유인되고, 이의 과립으로부터 방출된 분해 효소에 의해 손상되며, 결과적으로는 세포 파괴로 이어진다.류마티스성 관절염은 정상 IgG의 Fc 부분과 결합하는 항원(이러한 경우 류마티스성 인자, IgM 자가 항체)의 면역 복합체에 의하여 매개되는 타입Ⅲ 과민성 반응으로부터 기인하는 것으로 생각된다. 이러한 면역 복합체는 관절에 염증 및 상기 질병의 특징적인 손상을 일으키는데에 관여한다. 이들 병변은 부분적으로는 항체에 의하여 매개되기 때문에, 항체의 생성을 억제할 치료제, 예를 들어 본 발명의 트위크 변형제는 또한 상기 질병들을 치료 또는 예방하는데에 유용할 것이다.
환자에 심각한 항체 매개성 손상을 유발하는 질병의 추가의 예로서는 그레이브스 질병 및 급성 용혈성 빈혈을 포함한다. 트위크 변형제는 이러한 질병을 예방 또는 치료하는데에 효능을 나타낼 것으로 예상된다.
세포 면역 반응의 억제
생체내에서 트위크 단백질의 활성을 변형시키는 제제를 투여하면 항체 매개성(체액성) 면역 질병인, 만성 GVHD의 발병이 차단됨을 확인하였다. 만성 GVHD의 발병을 차단할 수 있는 기타의 유력한 면역계 변형제로서는 항CD40L 및 CTLA4-Ig 융합 단백질을 포함한다. 상기 제제는 T 세포 및 B 세포 활성화의 중요한 단계들을 차단시킨다[Grewal 및 Flavell의 문헌,Immunol. Rev.153:85-106(1996)]. 따라서 이러한 기타의 유력한 면역계 경로를 치료학적으로 조작하는 것은 체액성 면역 반응에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 항CD40L 및 CTLA4-Ig은 동물 모델에서 별도로 및 함께 장기 이식 거부 현상을 억제한다[Kirk 등의 문헌,Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 94:8789-8794(1997)]. 이식된 장기에 대한 대부분의 면역 반응은 Th1 T 세포 매개성이며, 세포 독성 세포 면역 반응으로 이루어진다. 이러한 세포 면역 반응은 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 궤양성 대장염 및 크론스병과 같은 자가 면역성 질병과 같은 기타의 다수의 면역 질환에서 세포 매개성 손상에 기여한다. 만성 GVHD의 발병을 차단하는 효능을 기초로 하여, 본 발명은 세포성 면역 질환의 치료학적 처리에 트위크 또는 트위크 수용체 변형제의 사용을 기대하고 있다.
트위크 및 트위크 수용체 변형제를 사용하는 처리
본 발명의 조성물은 상술한 특정 임상적 상태를 치료하기에 유효한 투여량으로 투여될 것이다. 사용 목적에 맞는 바람직한 약학 제형과 치료학적 유효 투여량의 결정은 예를 들어, 환자의 상태 및 체중, 바람직한 치료의 정도 및 치료에 대한 환자의 내성등을 고려하여 이루어지는데, 이는 당업자에게는 일반적인 사항이다.
트위크 또는 트위크 수용체 변형제의 약 5㎎/㎏ 투여량은 치료 투여량을 최적화시키는 적합한 개시점이 될 것으로 예상된다.
치료학적 유효 투여량의 결정은 적합한(치료학적) 시간 동안에 표적 세포(변형제 의존성인 트위크 또는 트위크 수용체 양성 세포)를 피복하는 데에 필요한 변형제의 농도를 측정하는 시험관내 실험을 수행하여 평가할 수 있다. 본원에 기술된 FACS 및 ELISA 수용체 리간드 결합 분석법을 이용하여 세포 피복 반응을 모니터한다. 이러한 시험관내 결합 분석법의 결과에 기초하여, 적합한 변형제의 농도 범위를 선택하여 동물에서 시험할 수 있다.
항트위크 및 항트위크 R 항체, 수용체 Ig 융합 단백질, 및 자연 발생적 또는 화학적으로 유도된 제제를 포함하는 기타 트위크 및 트위크 수용체 변형제의 분리정제된 형태를 포함하는, 본 발명의 가용성 변형제 및 이의 염 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 단독 투여, 또는 병용 투여는 면역 억제 활성을 나타내는 제제를 투여하는 통상의 허용된 방식중 임의의 방식을 사용하여 수행될 수 있다.
이러한 치료에 사용되는 약학 조성물은 또한 다양한 형태일 수 있다. 여기에는 예를 들어, 정제, 환약, 분말, 액상 용액 또는 현탁액, 좌약 및 주사 및 주입 가능한 주입 용액과 같은, 예를 들어 고체, 반고체 및 액체 투여 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 소정의 투여 방식 및 치료적 사용에 의존한다. 투여 방식으로는 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 복강내 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 트위크 및 트위크 수용체 변형제는, 흡수 또는 안정성을 자극하는 보조 인자가 존재하거나 또는 존재하지 않는, 예를 들어 등장성 멸균 제제내에 위치될 수 있다. 상기 제형은 바람직하게는 액체일 수 있거나, 또는 동결 건조된 분말일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 트위크 및 트위크 수용체 변형제는 시트르산 일수화물 5.0㎎/㎖, 시트르산삼나트륨 2.7㎎/㎖, 만니톨 41㎎/㎖, 글리신 1㎎/㎖ 및 폴리솔베이트 20 1㎎/㎖을 포함하는 제제 완충액으로 희석될 수 있다. 상기 용액은 동결되어, 냉장하에서 보관되며 투여하기 전에 멸균된 주사용 물(USP)로 재구성될 수 있다.
본 조성물은 또한 당 업계에 널리 공지된 통상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것이 바람직하다[예를 들어,Remington's Pharmaceutical Sciences, 제16판, 1980, Mac Publishing Company]. 이와 같이 약학적으로 허용 가능한 담체들로서는, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 혈장 제제와 같은 기타 약품 제제, 담체, 유전자 담체, 보조제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 본 조성물은 단위 투여량의 형태인 것이 바람직하고, 보통 1일에 1회 이상 투여될 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 미소구, 리포좀, 기타 미소 입자 운반 시스템을 사용하여 투여될 수도 있으며, 또는 공격 받은 조직 또는 혈류내, 이 부근 또는 이들과 소통되는 지속형 방출 제형을 사용하여 투여될 수도 있다. 지속형 방출 담체의 적합한 예로서는 좌약 또는 미소캡슐과 같은 성형 제품의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 임플란트형 또는 미소캡슐형 지속형 방출 매트릭스에는 폴리락티드(미국 특허 제3,773,319호;EP 58,481), L-글루탐산과 에틸 L-글루타메이트의 공중합체(Sidman 등의 문헌,Biopolymers, 22, pp.547-56(1985)) ; 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer 등의 문헌,J.Biomed.Mater.Res.,15 pp.167-277(1981); Langer,Chem. Tech.,12, pp.98-105(1982))를 포함한다.
트위크 또는 트위크 수용체 변형제를 포함하는 치료학적 조성물의 이점
본 발명의 트위크 및 트위크 수용체 변형제는 만성 GVHD 모델에서 B 세포 활성화 및 Ig 생성을 억제에 의해 확인할 수 있는 바와 같이, 면역 반응을 억제할 수 있다. 이러한 면역 매개성 반응을 선택적으로 억제하는 능력은 다양한 자가 면역성 질병, 장기 이식 거부 현상 및 급성 및 만성 염증성 상태를 포함하는 면역 질환의 치료에 유용할 것이다. 이러한 병리학적 면역 질환의 치료에서는 일반적으로 다양한 세포 유형 및 면역 반응에 대하여 다형질 발현성 효과를 나타내는 면역 조절제 및 면역 억제제를 사용한다. 이러한 비특이적 면역 억제제는 일반적으로 불리한 부작용을 일으키는 다량의 투여량으로 그리고 종종 세포 독성을 나타내는 투여량으로 요구된다. 예를 들어, 현재 사용되고 있는 3개의 일반적인 면역 억제제로서는 스테로이드, 시클로포스파미드 및 아자티오프린을 포함한다. 스테로이드는 다수의 병리학적 T 세포 효과를 역전시키는 방식으로, 활성화된 대식 세포를 억제하고 항원 제공 세포의 활성을 억제하는 다형질발현성 항염증제이다. 알킬화제인, 시클로포스파미드는 DNA 복제 및 수복을 억제함으로써 세포 사멸을 매개한다. 아자티오프린은 DNA 합성을 억제하는 항증식제이다. 이러한 비특이적 면역 억제제는 일반적으로 이들의 독성(예를 들어, 신장 독성 및 간 독성)을 증가시키고, 불리한 부작용을 일으키는 고투여량으로 요구된다. 그러므로 이들은 장기 치료에 부적합하다.
그러므로, 종래의 치료에 의하여 유발되는 문제점들을 극복하는 추가의 제제 및 치료제에 대한 요구가 끊임없이 지속된다.
이하에는 본 발명의 항트위크 mAb, mAb의 특성 규명에 사용되는 방법, 및 항원 유발성 면역 질환을 차단시키는 mAb의 용도를 설명하는 실시예를 기술하였다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 것으로서, 이하 실시예들은 예시용으로 포함되었으며 본 발명은 청구항에 의해서만 제한된다.
실시예 1: 트위크 단백질에 대한 모노클로날 항체의 제조
전술한 바와 같이 바큘로바이러스에서 생성된 가용성 인간 트위크 단백질을 사용하여 아르메니아 햄스터에서 인간 및 쥐과 동물의 트위크 단백질을 인지하는 모노클로날 항체를 생성하였다[Chicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)]. 각각의 햄스터에 프레운트 완전 보조제(CFA)중의 트위크 50㎍을 복강내 주사하여 1차 면역화하였다. 후속 면역화는(1차 면역화하고 14일, 28일 및 42일이 경과한 후) 각 햄스터에 프레운트 불완전 보조제(IFA)중의 트위크 50㎍(14일 및 28일) 또는 33㎍(42일)을 복강내 투여하여 수행하였다. 혼성 세포 형성을 위한 비장 세포의 융합 이전에 보조제 없이 트위크 100㎍을 복강내 투여하여 최종적으로 면역화시켰다. 표준적인 방법을 사용하여 혼성 세포를 형성시켰다[Lerner,Yale J.Biol.Med.54:387-402(1981)].
ELISA 방식 분석법을 사용하여 mAb 활성의 초기 스크리닝을 수행하였다. 인간 트위크 단백질에 관하여 기술된 바와 유사한 방법으로 쥐 트위크 단백질을 바큘로바이러스에서 생성시켰다[Clicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)]. 정제된 인간 및 쥐과 동물의 트위크 단백질들을 96웰 평판에 피복하고, 다수의 햄스터 mAb는 상기 고정화된 단백질과 결합할 수 있는 그들의 능력에 대해서 시험하였다. 고정된 트위크 단백질에 의한 햄스터 mAb의 포획 여부는 HRP 커플링된 당나귀 항햄스터 IgG(미국, 펜실배니아, 웨스트 그로브 소재, 잭슨 이뮤노리서치), 및 적합한 효소 반응을 이용하여 눈으로 확인하였다. 23개의 mAb중 8개는 쥐과 동물 및 인간 트위크 단백질 모두를 인지하였다(표 1).
클론 인간트위크ELISA 쥐과 동물트위크ELISA 리간드 차단 FACS h트위크/293에의FACS 결합 m트위크/293에의FACS 결합
A.B.D3.7.2 +++ +++ + + +
AA.DB5 +++ - +/- + -
AC.H5.24 +++ +++ - nd nd
AA.G9 +++ - +/- + -
AB.H12.1 +++ +++ - - -
BA.F5.35.2* +++ +++ + + -
BG.A12.5* ++ +++ + + -
BE.D5 ++ - +/- + -
AF.D4 ++ - + + -
AB.G11.1* +++ +++ + + +
BE.B3.6.1* ++ - - + -
AA.AC2.3.2 +++ - +/- nd nd
BB.B12.1.31.3 ++ - +/- + -
AA.DG7.14* +++ +++ + + +
BD.A3 ++ - - - -
BC.B10.21* +++ +++ + + +
BG.E8 +++ - +/- + -
AE.C10.4* +++ - + + -
AA.BB4.2* +++ - + + -
AA.EC10.2* +++ - + + -
AD.B5.9* +++ - - - -
AB.D4.67.19 +++ - - - -
인간 트위크 ELISA :mAb가 인간 트위크 피복된 평판과 결합하는 능력에 대하여 mAb를 평가하였음.쥐 트위크 ELISA :mAb의 쥐과 동물 트위크 피복된 평판상에서의 교차 반응성에 대하여 mAb를 시험하였음.리간드 차단 FACS :mAb가 HT29 세포 및 인간 트위크 플래그의 결합을 차단할 수 있는지 여부에 대하여 mAb를 시험하였음.EBNA293 형질감염체의 FACS 분석법 :인간 및 쥐과 동물 트위크의 트위크 cDNA를 EBNA293 세포를 형질감염시키는데에 사용하였으며, 이때 mAb는 3일후의 반응성에 대하여 시험되었음.
종 계통 사이의 항원 에피토프의 보존성은 트위크의 쥐과 동물형 및 인간형 트위크 사이에서 볼 수 있는 일반적으로 소정의 단백질 상동성 정도이다(도1). FACS 분석법은 항트위크 mAb가 세포 표면상에 발현되는 트위크 단백질과 결합할 수 있는지 여부를 측정하는데에 사용된다. 인간 및 쥐과 동물 트위크 cDNA 서열은 발현 벡터 CH269로 클로닝되고[Clicheportiche 등의 문헌,J.Biol.Chem.51:32401-32410(1997)], 상기 구성물은 EBNA293 세포에서 일시적으로 단백질을 발현시키는 형질 감염시 사용된다. AB.D3을 포함하는 4개의 mAb는 쥐과 동물 트위크를 발현하는 EBNA293 세포에 잘 결합하였다(도2). 상기 4개의 mAb는 또한 1이상의 트위크 수용체를 발현하는 것으로 공지된 HT29 세포에 인간 트위크가 결합하는 것을 방지할 수도 있었다(예를 들어, 도3). 이와 함께 상기 FACS 분석법을 통하여, 항트위크 mAb는 트위크 단백질을 특이적으로 인지하며, 트위크 단백질이 1이상의 트위크 수용체와 결합하는 능력을 변형시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2
만성 GVHD의 쥐과 동물 모델에서 비대증, 활성화 B 세포 및 Ig 생성의 발병을 차단시키는 항트위크 mAb AB.D3의 용도
이미 방법 부분에서 기술한 바와 같이, DBA/2 비장세포 이식편을 사용하여 6∼8주령의 B6D2F1 암컷 마우스에서 만성 GVHD를 유도하였다. 각 수용체의 꼬리 정맥에 1 ×108개의 세포 500㎕를 주사하였다. 실험군에는 DBA/2 이식편(DBA/2 〉F1)을 투여한 반면에, 대조구 동물 세트에는 B6D2F1 이식편(F1 〉F1)을 투여하였다. 마우스에 항트위크 mAb AB.D3, 항CD40L mAb MR1, 대조구 mAb Ha4/8을 투여하였거나, 또는 아무런 처리도 하지 않았다. 이식 거부 현상이 발생하기 4시간 이전에, 그리고 이후 2일, 4일 및 6일 경과시 mAb 250㎍을 복강내 투여하였다. 본 실험후 14일 경과시 마우스를 죽이고 대조구 F1 〉F1 군의 각각의 동물에 대하여 체중에 대한 비장 중량의 비율로서 비장 지수를 계산하여, 이를 하나로 평균내었다. 다른모든 군에 대한 평균 비장 지수를 표준화하여 대조구 값을 구하였다. 2회의 독립적 실험 결과들을 표2에 나타내었다. DBA/2 이식편(DBA/2 〉F1)을 수용한 동물 및 미처리된 동물 또는 대조구 mAb Ha4/8로 처리된 동물의 경우는 F1 〉F1 이식편 대조구와 비교했을때 비장 중량이 상당히 증가하였음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 비장지수에 반영되었는데, 표준화된 대조구 값이 1.0에서 2.6으로 증가된 비장 인덱스에서 알 수 있었다. 마우스를 항CD40L mAb MR1으로 처리하였을 경우 비장 지수가 거의 대조구 수준(1.1)으로 감소하였으며, 항트위크 mAb AB.D3으로 처리하였을 경우 비대증은 35% 정도 감소하여 1.7로 되었다(표2).
처리 실험 1 실험 2 평균
F1 〉F1 (대조구) 1.0 1.0 1.0
DBA/2 〉F1 (미처리) 2.7 2.6 2.65
DBA/2 〉F1 (Ha4/8 처리) 2.9 2.6 2.75
DBA/2 〉F1 (MR1 처리) 1.1 1.1 1.1
DBA/2 〉F1 (AB.D3 처리) 1.8 1.7 1.75
본 실험 수행후 14일 경과시 마우스를 죽이고 중량을 측정하였다. 이후 비장을 해부하여 분리한후 중량을 측정하였다. 대조구 F1 〉F1 군의 각각의 동물에 대하여 체중에 대한 비장의 중량 비율로서 비장 지수를 계산하여, 이를 하나로 평균내었다. 다른 모든 군에 대한 평균 비장 인덱스를 표준화하여 대조구 값을 구하였다.
FACS 분석법을 사용하여 대조구 및 다수의 처리군을 나타내는, 발병된 마우스의 비장의 림프구 군집의 활성화 상태를 분석하였다. 처음에 마우스의 다수의 군에서 공여 세포 이식 정도를 분석하였다. 모든 DBA/2 〉F1 처리군에서 거의 동일한 퍼센트(평균 = 6.2%)로 나타나는 숙주 마우스의 비장에서 공여 세포를 검출하였다(표 3). 이러한 결과는 상이한 mAb 처리가 공여 세포 이식에 영향을 주지는 않는다는 사실을 시사하는 것이다.
처리 % H-2Kb음성 (공여) 세포
F1 〉F1 (대조구) 0.2
DBA/2 〉F1 (미처리) 5.9
DBA/2 〉F1 (Ha4/8 처리) 9.9
DBA/2 〉F1 (MR1 처리) 5.5
DBA/2 〉F1 (AB.D3 처리) 4.3
FACS 분석법에 있어서 마우스의 각 군으로부터 비장을 분리하여 이를 1시간 동안 PE 커플링된 항H-2Kb및 FITC 커플링된 항H-2Db로 염색하여 MHC 대립 유전자의 발현을 측정하였다. 숙주 비장 세포는 상기 양 마커에 대하여 양성으로 사용하였으나, 공여 비장 세포는 항H-2Kb음성으로 사용하였다. %값은 산포도의 전방 및 측방에 의하여 결정하였다.
다음으로, 림프구 활성화에 있어서의 2개의 마커를 사용하였다: B220+ B 세포상의 CD69 발현, 및 CD4+와 CD8+ T 세포의 L-셀렉틴 발현. 대조구 및 미처리 DBA/2 〉F1 마우스를 비교하였을때, CD69+ B 세포가 2.5% 에서 6.2%로 증가하였음을 알 수 있었다(표 4). 이러한 CD69+ B 세포수의 증가는 MR1(3.3%) 또는 AB.D3(2.1%)로 처리함으로써 억제되었으나, Ha4/8(6.5%)로 처리한 경우에는 억제되지 않았다(도4 및 표 3). 2회의 실험으로부터 얻은 데이터를 표4에 나타내었다.
처리군 % B220+/CD69+(이중 양성) 세포
실험 1 실험 2 평균
F1 〉F1 (대조구) 2.5 2.0 2.25
DBA/2 〉F1 (미처리) 6.2 5.5 5.9
DBA/2 〉F1 (Ha4/8 처리) 6.5 4.7 5.6
DBA/2 〉F1 (MR1 처리) 3.3 nd 3.3
DBA/2 〉F1 (AB.D3 처리) 2.1 3.2 2.65
비장 세포를 PE 표지된 항B220 및 FITC 표지된 항CD69로 1시간 동안 얼음상에서 염색하고, FACS 완충액으로 세정한후, 분석하였다. 퍼센트값은 산포도의 전방 및 측방에 의하여 결정된 림프구 군집내에서 수집된 현상들을 기초로 하였다.
Ig 분비 여부를 생체내 분석하기 위하여, 다수의 처리군으로부터 수집한 비장으로부터 유래된 비장 세포 배양 상청액으로 ELISA 분석법을 수행하였다. 표5의 결과들은 제2회째 실험으로부터 얻어진 것으로서, 군당 3마리의 마우스로부터 얻은 값의 평균이다. MR1 또는 AB.D3로 처리하는 경우 미처리된 군 및 Ha4/8 처리된 DBA/2 〉F1 군에서 관찰되는 자발적 IgG 생성이 4∼6배 증가하였다.
처리군 자발적 시험관내 Ig 생성
F1 〉F1 (대조구) 125ng/㎖ +/- 20ng/㎖
DBA/2 〉F1 (미처리) 750ng/㎖ +/- 65ng/㎖
DBA/2 〉F1 (Ha4/8 처리) 500ng/㎖ +/- 150ng/㎖
DBA/2 〉F1 (MR1 처리) 0
DBA/2 〉F1 (AB.D3 처리) 125ng/㎖ +/- 20ng/㎖
Ig 분비 세포를 시험관내 분석하기 위하여, 세포를 펠렛화시키고 이를 10% 소 태아 혈청(FBS)/4mM 글루타민을 함유하는 DMEM에 농도가 1 ×107세포/㎖가 되도록 재현탁시켰다. 6개의 웰을 보유하는 평판에 각 웰당 1㎖씩 분배하였다. 24시간 경과후 세포 상청액을 회수하였다. 수치들은 3마리의 마우스로 이루어진 각 처리군에서 마우스당 2웰의 평균값을 나타내는 것이다.

Claims (22)

  1. 치료학적 유효량의 트위크(TWEAK) 차단제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 면역 질환의 발병을 차단시키거나 또는 이의 심각성 또는 효과를 치료 또는 감소시키는 방법.
  2. 유효량의 트위크 차단제 및 약학적으로 유효한 담체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 면역 반응을 억제하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트위크 차단제가
    (a) 트위크 리간드에 대해서 유도된 항체 ;
    (b) 트위크 수용체에 대해서 유도된 항체 ;
    (c) 트위크 리간드가 수용체에 결합하는 것을 변형시키는 제제 ;
    (d) 세포 표면 수용체의 클러스터링을 변형시키는 제제 ; 및
    (e) 트위크 수용체의 세포내 신호전달을 방해할 수 있는 제제
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동물이 포유 동물인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 포유 동물이 인간인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트위크 차단제가 표면 트위크 리간드에 선택적으로 결합할 수 있는 리간드 결합 도메인을 보유하는 가용성 트위크 수용체를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 가용성 트위크 수용체가 인간 면역글로불린 IgG 도메인을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인간 면역글로불린 IgG 도메인이 특이적 항원 결합에 기여하는 영역을 포함하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트위크 수용체에 대하여 유도된 항체가 모노클로날 항체를 포함하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트위크 차단제가 트위크 표면 리간드에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체가 트위크 리간드의 서브유닛에 대해 유도된 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 면역 반응이 Th1 세포 매개성 면역 반응인 방법.
  13. 제2항에 있어서, 상기 면역 반응이 Th2 세포 매개성 면역 반응인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 상기 면역 반응이 Th1 및 Th2 세포 매개성 면역 반응을 모두 포함하는 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 트위크 차단제가 트위크 수용체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 포함하는 방법.
  16. 치료학적 유효량의 트위크 차단제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 트위크 차단제가
    (a) 트위크 리간드에 대해서 유도된 항체 ;
    (b) 트위크 수용체에 대해서 유도된 항체 ;
    (c) 트위크 리간드가 수용체에 결합하는 것을 변형시키는 제제 ;
    (d) 세포 표면 수용체의 클러스터링을 변형시키는 제제 ; 및
    (e) 트위크 수용체의 세포내 신호전달을 방해할 수 있는 제제
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 트위크 차단제가 표면 트위크 리간드와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드 결합 도메인을 보유하는 가용성 트위크 수용체를 포함하는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 가용성 트위크 수용체가 특이적 항원 결합에 기여하는 영역이 삽입된 인간 면역글로불린 IgG 도메인을 포함하는 조성물.
  20. 제16항에 있어서, 상기 트위크 차단제가 트위크 수용체에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 포함하는 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 트위크 차단제가 트위크 표면 리간드에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체가 트위크 리간드의 서브유닛에 대하여 유도된 것인 조성물.
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