EA004590B1

EA004590B1 - Способ блокировки развития, или снижения тяжести, или проявлений заболевания "трасплантат против хозяина"

Info

Publication number: EA004590B1
Application number: EA200100780A
Authority: EA
Inventors: Пол Реннерт
Original assignee: Байоджен, Инк.
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2004-06-24
Also published as: JP2004500320A; WO2000042073A1; KR20010102978A; CA2358684A1; HK1038755A1; JP5592195B2; CA2358684C; MXPA01007163A; CZ20012548A3; US20120027751A1; US8440189B2; JP2013075916A; EP1141027A1; US20020015703A1; BR0007556A; EA200100780A1; TR200102021T2; NO20013340L; EE200100372A; US20070110745A1

Abstract

Настоящее изобретение связано со способом блокировки развития, или лечения, или снижения тяжести, или проявлений заболевания «трансплантат против хозяина», а также других иммунологических заболеваний с помощью реагентов, которые модифицируют активность TWEAK и применяются в качестве терапевтических средств.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается композиций и способов, включающих в себя реагенты, которые связываются с новым белком ТАЕЛК. а также использования ТАЕАК-связывающих реагентов для предотвращения развития иммунологических заболеваний. ТАЕАКсвязывающие реагенты включают в себя моноклональные антитела, которые используются здесь для предотвращения развития хронического синдрома «трансплантат против хозяина», растворимые химерные белки «ТАЕАКрецептор-1д» или другие молекулы, которые модифицируют связывание ТАЕАК с его рецептором (рецепторами). Другие варианты настоящего изобретения включают в себя реагенты, которые связывают рецептор(ы) ТАЕАК с целью модифицирования их активности или модифицирования внутриклеточной передачи сигналов от рецептора(ов) ТАЕАК.

Предпосылки изобретения

Иммунологические заболевания представлены широкой группой заболеваний и патологий, включая аутоиммунные заболевания, острые и хронические воспалительные заболевания, отторжение органов при пересадке, синдром (реакция) «трансплантат против хозяина» (СТПХ), злокачественные новообразования лимфоидных клеток, септический и другие формы шока, снижение иммунитета, например, при ВИЧ-инфекциях и иммунодефицитных синдромах (8СШ), и утрата иммунного ответа на рост опухоли.

Многие иммунологические заболевания опосредованы аномальными или неконтролируемыми реакциями на антиген. Аутоиммунные заболевания являются результатом неправильного ответа иммунной системы на собственные антигены, что приводит к повреждениям клеток и тканей. СТПХ развивается тогда, когда донорные клетки костно-мозгового трансплантата (КМТ) реагируют на антигены реципиента (т.е. больного). Отторжение пересаживаемых органов происходит тогда, когда иммунная система больного реагирует на антигены, происходящие от пересаженного органа. Острые воспалительные заболевания, такие как гипераллергические состояния и шок, являются следствием неконтролируемого иммунного ответа на опосредующие антигены.

Для зависимых от Т-лимфоцитов иммунных ответов необходимо, чтобы Т-клетки распознавали антиген. Например, СТПХ обусловлен комплексным взаимодействием между Тклетками донора и клетками иммунной системы реципиента. Инициирующим событием является распознавание Т-клетками донора «не своих» антигенов, т.е. антигенов реципиента. Их называют аллоантигенами. Распознавание аллоантигенов данными донорными клетками обусловливает выработку иммунорегуляторных и вос палительных цитокинов и хемокинов, которые запускают и усиливают иммунный ответ донора против реципиента. Такое заболевание может развиваться либо в острой, либо в хронической форме, что зависит от регуляции комплексных сетей цитокинов, которые контролируют тип развивающегося иммунного ответа. Иммунные ответы могут быть охарактеризованы как Тй0, Т111 или Тй2, что зависит от (1) природы цитокинов и хемокинов, вырабатываемых активированными Т-лимфоцитами в процессе развития ответа, и (2) природы цитокинов и хемокинов, выработанных вспомогательными и другими клетками в ходе развития ответа. Примерами важных для иммунных ответов клеток, помимо Т-клеток, являются В-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты и макрофаги, фолликулярные дендритные клетки и эндотелиальные клетки. Вместе выработанные цитокины приводят к дифференцировке различных типов клеток, а выработанные хемокины обусловливают перемещение и локализацию клеток. Ответы Т110 характеризуются кратковременной стимуляцией ранее непростимулированных («необученных») Т-лимфоцитов. Т-клетки Т110 вырабатывают средние количества ряда цитокинов, а именно 1Ь-2 и ТЫЕ. Повторно или хронически простимулированные клетки Т110 могут дифференцироваться либо в клетки ТЫ, либо в клетки ТН2, что зависит от ряда факторов. Такими факторами являются, не ограничиваясь ими, выработка цитокинов вспомогательными клетками, уровень активности Т-клеточных рецепторов и природа вторичных сигналов, получаемых, например, опосредованно через одновременно стимулируемый рецептор ί.Ό28. В частности, действие на активированные Т-клетки цитокина 1Ь-12, выработанного в основном активированными макрофагами, поддерживает дифференцировку в Т-клетки ТЫ, в то время как действие 1Ь-4 и ΣΠ-10 поддерживает дифференцировку в Т-клетки Т112.

Т-клетки Т111 вырабатывают цитокины, такие как 1Ь-2 и γ-интерферон, которые ассоциированы с воспалительными ответами, Тклеточной цитотоксичностью и активацией макрофагов. Т-клетки ТН1 реагируют на хемокины, которые привлекают клетки в области воспаленной ткани, такие как Μίρ-1α, ΜΙΡ-1β, ВАЫТЕ8, ΕΡ-10 и ΜΙΟ. Поскольку цитотоксичные Т-клетки и активированные макрофаги активны в отношении элиминации поврежденных или инфицированных клеток, то ответ Т111 отвечает за контроль иммунного ответа на внутриклеточные патогены. Важно то, что выработка хемоаттрактантных хемокинов ТЫ, такая как выработка ΙΡ-10 и ΜΙΟ макрофагами и эндотелиальными клетками, непосредственно регулируется γ-интерфероном, который является прототипным хемокином, вырабатываемым Тклетками ТЫ. Таким образом, петли обратной связи могут образовываться между активированными Т-клетками и их окружающей средой, которые способствуют развитию конкретного типа ответа в конкретный момент времени и в конкретном месте.

Т-клетки Т112 вырабатывают цитокины, такие как 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-б и 1Ь-10, которые поддерживают развитие гуморальных иммунных ответов, включая те, для которых необходима выработка 1дЕ, 1дА и 1дС. Данные иммуноглобулиновые ответы направляются опосредованной Т-клетками активацией В-клеток, которые «переключают» свой 1д-фенотип со связанных на поверхности 1дМ и Ι§Ό на секретируемый иммуноглобулин. Секретированные иммуноглобулины в норме функционируют как регуляторы инфекции патогенов в циркуляции (1дО), на поверхности слизистых оболочек, таких как в кишечнике и ротовой полости (1дА) и в дыхательном тракте (1дЕ). Избыточная выработка 1д может приводить к заболеванию, например, при СКВ (1дС и 1дА), аллергической (1-го типа) гиперчувствительности (1дЕ) и СТПХ (1дС. 1дА и 1дЕ). Т-клетки Т112 также поддерживают активацию эозинофилов и тучных клеток, которыми могут быть опосредованы острые ответы на патогены, например, в дыхательном тракте. Тклетки Т112 реагируют на хемокины, такие как эотаксин и МЭС, выработка которых непосредственно регулируется интерлейкином-4 - прототипным цитокином, вырабатываемым клетками ΝΚ1.1 и активированными Т-лимфоцитами.

Взаимодействие Т-клеток с В-клетками является сложным и тщательно контролируемым процессом. Для запуска процесса активации В-клетки должны получить антигенный сигнал через В-клеточный рецептор антигена (мембранный 1д). Во-вторых, В-клетки должны получить специфичные сигналы, зависимые от контакта и независимые от контакта, от активированных Т-клеток. При необходимости зависимый от контакта сигнал обеспечивается за счет связывания СЭ40Ь на Т-клетках с СЭ40 на В-клетках. При необходимости независимый от контакта сигнал передается с помощью 1Ь-4, секретированного активированными Т-клетками и клетками ΝΚ1.1, связывающегося с рецептором 1Ь-4 на В-клетках. Данные сигналы, повидимому, имеют место в пределах Тклеточных областей вторичных лимфоидных органов, таких как селезенка. Селезенка, лимфатические узлы, миндалины, пейеровы бляшки и другие вторичные и третичные лимфоидные органы включают в себя отчетливо очерченные микроанатомические области, в пределах которых обычно остаются Т- и В-клетки. Все лимфоциты мигрируют из крови или из лимфы в Тклеточные области указанных органов - вначале путем преодоления слоев эндотелиальных клеток, таких как венулы с плотным эндотелием в лимфатических узлах и пейеровых бляшках и слой эндотелиальных клеток маргинального синуса селезенки. Затем В-клетки перемещаются в В-клеточные области, известные как Вклеточные фолликулы. В-клетки, которые проходят через Т-клеточную область, но не являются активированными, покидают фолликулы спустя несколько дней. Активированные Вклетки претерпевают процесс дифференцировки. Некоторые активированные В-клетки, известные как плазмоциты, секретируют большие количества антиген-специфичного низкоаффинного антитела типа 1дМ или 1дС. Обычно такие В-клетки появляются почти сразу после индукции иммунного ответа и перемещаются в красную пульпу селезенки и другие анатомические области, где они существуют в течение нескольких дней, секретируя антитела. Другие активированные В-клетки дифференцируются в пределах участка фолликула, известного под названием вторичного фолликула, или герминативного центра. Герминативные центры образуют вокруг себя сеть специализированных антиген-сохраняющих клеток, называемых фолликулярными дендритными клетками (ФДК), которые, как считается, обеспечивают представление антигена, чтобы направлять или уточнять реакцию герминативного центра. В-клетки в составе герминативного центра «переключают» свой иммуноглобулиновый фенотип и претерпевают «аффинное созревание», в результате чего они проявляют высокий уровень аффинности в отношении своего антигена-мишени. В норме антигеном-мишенью является чужеродный антиген, хотя при таких заболеваниях как хронический СТПХ и аутоиммунные заболевания иммуноглобулины распознают собственные антигены. Наконец, В-клетки покидают фолликулы, перемещаются обратно через Тклеточные области и покидают орган за счет эфферентной циркуляции в кровяное русло.

В-клетки, которые претерпели полную дифференцировку, так, чтобы экспрессировать высокоаффинные 1д, известны как бластные клетки, и они покидают В-клеточные фолликулы, чтобы «приобрести местожительство» в различных других средах, включая область красной пульпы в селезенке, костный мозг, печень или клеточные слои слизистых оболочек, выстилающих дыхательный тракт и кишечник. Некоторые из этих полностью дифференцированных В-клеток известны как клетки памяти, и они могут существовать в течение длительного времени, будучи готовыми ответить на тот же самый антиген, если он появится вновь.

Так как В-клетки перемещаются с места на место в пределах лимфоидных органов, то им необходимы специфические сигналы, которые бы направляли их, и специфические сигналы, обеспечивающие их жизнеспособность. Например, множественные сигналы необходимы для поддержания организации В-клеточных фолликулов в селезенке. Они включают в себя взаимодействие лиганда ВСА с хемокиновым ре цептором ВЬК-1, взаимодействие ΤΝΡ с ΤΝΡК55 и взаимодействие ΕΤβ с рецептором ί-Τβ-Β (обзор Сйар1ш & Ри, 1998, Сштеп! Θρίη. 1ттиηο1., 10, 298-297). Мыши, которые дефицитны по любому из таких молекулярных механизмов, утрачивают целостность В-клеточных фолликулов в селезенке. Более того, все подобные гендефицитные мыши также утрачивают способность претерпевать реакции герминативных центров в селезенке. Разрушение других молекулярных механизмов нарушает только реакции герминативных центров. Например, у мышей, дефицитных по СЭ40Р, В-клеточные фолликулы поддерживаются, а герминативные центры не образуются. Для В-клеток в пределах среды герминативного центра необходимы сигналы с участием СЭ40 для обеспечения выживаемости и для негативной регуляции 1дМ и переключения экспрессии на 1д.

В-клетки перемещаются не только в пределах фолликула и герминативного центра, но также покидают фолликул после активации и перемещаются в другие области организма. Вклетки памяти можно обнаружить в костном мозге, а В-клетки, которые экспрессируют 1дА, специфическим образом перемещаются к клеточным слоям кишечника и других областей слизистых оболочек. Предположительно другие сигналы направляют активированные Т-клетки к специфическим сайтам в пределах и между компартментами лимфатической системы. Например, цитотоксическая Т-клетка может мигрировать в сайт инфекции или иной очаг антигенной стимуляции с тем, чтобы обнаружить и лизировать свои мишени. Параметры всех сигналов, которые направляют Т- и В-клетки между их микроанатомическими локализациями, пока точно не установлены. Однако считается, что организация Т- и В-клеточных ответов на антиген происходит с участием множественных механизмов и во вторичных лимфоидных органах, и в областях инфекции или воспаления.

СТПХ является хорошо изученным примером иммунного ответа, направляемого антигенами. СТПХ часто приводит к фатальным последствиям у больных после пересадки костного мозга (ПКМ). Заболевание может протекать в острой или в хронической форме. Острые и хронические формы СТПХ являются примерами-прототипами развития антиген-специфичных ответов ΤΜ и Τ112. соответственно. Острая форма заболевания имеет место в первые 2 месяца после ПКМ и характеризуется повреждениями кожи, кишечника, печени и других органов, опосредуемыми донорскими цитотоксичными Т-клетками. Хроническая форма заболевания проявляется существенно позже (более 100 дней после ПКМ) и характеризуется сверхвыработкой иммуноглобулина (1д), включая аутоантитела, и повреждениями кожи, почек и других органов, обусловленными отложением 1д. Развитие острого СТПХ является показа тельным и позволяет предсказать последующее развитие хронического СТПХ. Таким образом, у одного и того же больного могут развиться оба заболевания, одно за другим. Приблизительно у 50% всех больных с ПКМ развивается либо острый, либо хронический СТПХ. Примерно у 90% больных с СТПХ происходит развитие хронического СТПХ. В настоящее время нет успешных способов лечения хронического СПТХ в отношении большинства больных.

СТПХ можно смоделировать на мышах с использованием режимов пересадки клеток от родителей потомкам в Р1. В модели, описываемой здесь, спленоциты от мышей линии ΌΒΑ2 инъецируют внутривенно мышам (ПВА2хС57В1/6)Р1, которые были обозначены как Β6Ό2Ρ1. Инъецированные спленоциты составляют трансплантат, а донором этого трансплантата являются мыши линии ΌΒΑ2. Мышь Р1, которая получает трансплантат, является реципиентом. Присутствующие в трансплантате донорские Т-клетки распознают половину маркеров МНС (гаплотипы) на клетках реципиента как чужеродные, потому что они происходят от другого родителя -С57В1/6. Это индуцирует ответ донорских Т-клеток против реципиента, что и приводит к СТПХ. Когда родительские спленоциты ΌΒΑ/2 инъецируют реципиенту Β6Ό2Ρ1, развивается хронический СТПХ. Напротив, когда спленоциты С57В1/6 инъецируют реципиенту Β6Ό2Ρ1, развивается острый СТПХ. Хотя остается неясным, какие механизмы лежат в основе развития различных заболеваний при применении данных двух вариантов инъекций, считается, что цитокины, экспрессируемые клетками, находящимися в спленоцитарном трансплантате ΌΒΑ/2, способствуют развитию хронического СТПХ, в то время как цитокины, экспрессируемые клетками, входящими в состав спленоцитарного трансплантата С57В1/6, способствуют развитию острого СТПХ. Реагенты, которые нарушают взаимодействие Т-клеток с антигенпредставляющими клетками (например, дендритными клетками, макрофагами, Вклетками - АПК), эффективно предотвращают и острый, и хронический СТПХ.

В ряде доказательных подходов подтверждается, что острый СТПХ является ΤΜопосредованным заболеванием (Кгепдег & Реггага, 1996, 1ттипо1. Кек., 15, 50-73; ^1Шаткоп е! а1., 1996, I. 1ттипо1., 157, 689-699). Цитотоксическая активность СИ4-позитивных и СП8позитивных Т-клеток, нативных клетоккиллеров (ΝΚ) и активированных гранулоцитов, таких как макрофаги, является точно установленным следствием ΤΜ-опосредованного Тклеточного ответа и проявляет отчетливую зависимость от экспрессии 1Ь-2 и γ-интерферона, которые являются цитокинами, типичными для ΤΡ1. Такая цитотоксичность является четкой характеристикой острого СТПХ. Более того, реагенты, которые блокируют ключевые цито

Ί кины, вовлеченные в дифференцировку Тклеток ТЫ, такие как моноклональные антитела к 1Ь-2 и 1Ь-12, предотвращают развитие острого СТПХ. Цитотоксичность может быть непосредственно клеточной (например, за счет фагоцитоза клетками реципиента) или опосредованной действием секретируемых цитокинов, таких как ΤΝΡ, которые могут индуцировать апоптоз, т.е. гибель клеток. Последствия донорской антиреципиентной цитотоксичности можно наблюдать различными способами. Во-первых, лимфоциты реципиента быстро разрушаются, в результате чего у мышей с острым СТПХ прогрессирует иммунодефицит. Во-вторых, донорские лимфоциты в составе трансплантата попадают в селезенку реципиента, и их цитотоксическая активность может быть непосредственно измерена ίη νίΐτο путем получения клеточных линий, экспрессирующих антигены донора, которые могут быть распознаны (в качестве чужеродных) донорскими клетками. Например, клеточные линии, экспрессирующие подходящие антигены, могут быть помечены радиоактивным изотопом хрома-51. Выход этого радиоактивного изотопа в культуральную среду является свидетельством гибели помеченной клетки. В-третьих, заболевание становится летальным при разрушении дополнительных тканей и клеточных популяций, и, следовательно, выживаемость является измеримым показателем заболевания.

По-видимому, хронический СТПХ является заболеванием, опосредованным Т-клетками Т112 (Эе Μί е1 а1., 1993, I. 1ттипо1., 150, 361366). В мышиной модели развитие заболевания зависит от Тй2-цитокина - 1Ь-4, и оно может быть блокировано воздействием моноклонального антитела к 1Ь-4. Такая обработка предотвращает экспансию донорских В-клеток и сопутствующую сверхвыработку 1д Развитие СТПХ может быть прослежено различными путями. Экспансия популяций Т-клеток донора и В-клеток реципиента может быть измерена с помощью индекса селезенки, являющегося отношением массы селезенки к массе тела, соотнесенным с параметрами контрольных мышей (без заболевания). Активация В-клеток у больных мышей может быть определена с помощью анализа маркеров В-клеточной активации. Наконец, проявления В-клеточной активации можно видеть в уровнях 1д в циркуляции (например, в сыворотке) или воспроизвести в культурах спленоцитов реципиента, взятых через несколько недель после индукции заболевания. Циркулирующие 1д у больных животных будут включать аутоантитела. В конечном счете больные животные не выдерживают недостаточности почек и других органов из-за накопления отложений 1д, и, следовательно, выживаемость является соответствующей мерой активности заболевания.

Авторы изобретения с использованием мышиной модели хронического СТПХ показа ли, что моноклональное антитело, специфичное в отношении ТХУЕАК, эффективно и специфически предотвращает симптомы развития СТПХ. Предотвращение развития хронического СТПХ показано как снижение индекса селезенки, утрата маркеров активации В-клеток реципиента и снижение выработки 1д у животных, которым вводили анти-Т\УЕАК-антитело.

Краткое содержание изобретения

В настоящем изобретении представлены способы предотвращения развития или лечения, или снижения тяжести или проявлений иммунологического заболевания у животного, включающие в себя введение фармацевтической композиции, которая содержит терапевтически эффективное количество средства, блокирующего ТХУЕАК, и фармацевтически приемлемый носитель. Соединение может быть антителом, специфичным в отношении лиганда ТХУЕАК; антителом, специфичным в отношении рецептора ТХУЕАК; средством, которое модифицирует связывание лиганда ТХУЕАК с рецептором ТХУЕАК; средством, которое модифицирует кластеризацию рецепторов клеточной поверхности; и средством, которое способно прерывать внутриклеточную передачу сигнала от рецептора ТХУЕАК. В предпочтительном варианте антитело является моноклональным антителом. В более предпочтительном варианте моноклональное антитело специфично в отношении лиганда клеточной поверхности ТХУЕАК. Животное может быть млекопитающим и может быть человеком. Средство, блокирующее ТХУЕАК, может являться растворимым рецептором ТХУЕАК, включающим в себя домен связывания лиганда, который способен избирательно связываться с поверхностным лигандом ТХУЕАК. В одном варианте растворимый рецептор ТХУЕАК может включать в себя домен иммуноглобулина 1дС человека. В предпочтительном варианте домен иммуноглобулина 1дС человека содержит участки, ответственные за специфичное связывание антигена.

Далее изобретение охватывает способ подавления иммунного ответа у животного, включающий в себя введение фармацевтической композиции, которая содержит эффективное количество средства, блокирующего ТХУЕАК, и фармацевтически приемлемый носитель. Иммунный ответ может являться иммунным ответом, опосредуемым клетками ТЫ или Т112, или ими обеими.

Также изобретение охватывает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество средства, блокирующего ТХУЕАК, и фармацевтически приемлемый носитель.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано сопоставление последовательностей растворимых рекомбинантных белков ТХУЕАК мыши и человека.

На фиг. 2 показаны данные анализа методом РАС8 (сортировка клеток с возбуждаемой флуоресценцией) связывания анти-ΤΨΕΆΚтЛЬ ΑΒ.Ό3 хомяка с клетками ΕΒΝΑ293, экспрессирующими белок Τ\νΕΑΚ мыши или белок Τ\νΕΑΚ человека, по сравнению со связыванием тАЬ хомяка, которое распознает посторонний белок (гемоцианин слизня).

На фиг. 3 показан ЕАС8-анализ способности тАЬ ΑΒ.Ό3 блокировать связывание ЕБАОмеченного рекомбинантного растворимого ΤνΕΑΚ человека с клетками, позитивными по рецептору ΤνΕΑΚ.

На фиг. 4 показан ЕАС8-анализ активационного состояния В-клеток у мышей с хроническим СТПХ, которым вводили анти-ΤΧνΕΛΚтАЬ АВ.Б3. анти-СБ40Б-тАЬ МЫ. контрольное тАЬ или не вводили ничего.

Подробное описание изобретения

Определения

С целью более полного понимания описываемого здесь изобретения предлагается нижеследующее подробное описание.

Термины «гуморальный ответ» и «клеточный ответ» в данном тексте указывают на иммунный ответ животного на антиген, при котором животное вырабатывает антитела к антигену или формирует цитотоксический ответ на антиген, или имеет место и то, и другое. Класс Т-хелперных лимфоцитов ТЫ важен в связи с индукцией клеточного ответа, а класс Тхелперов Τ112 важен в связи с эффективной выработкой высокоаффинных антител.

Термин «Т-хелперные клетки (ТВ)» в данном тексте означает функциональный подкласс Т-лимфоцитов, который участвует («помогает») в формировании цитотоксических Т-клеток и который кооперируется с В-клетками в связи со стимуляцией выработки антител. Хелперные Тклетки распознают антиген вместе с молекулами класса II МНС и обеспечивают контактзависимые и контакт-независимые сигналы (цитокин и хемокин) к эффекторным клеткам.

Термин «Тй1» означает подкласс Тхелперных клеток, которые вырабатывают ΤΝΕ, γ-интерферон и 1Ь-2 (и другие цитокины) и которые запускают воспалительные реакции, связанные с клеточным, т.е. не связанным с иммуноглобулинами ответом на стимул.

Термин «Τ112» означает подкласс Тхелперных клеток, которые вырабатывают 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, ГБ-10 и другие цитокины, которые связаны с иммуноглобулиновым (гуморальным) ответом на иммунный стимул.

Термин «герминативный центр» в данном тексте означает вторичный В-клеточный фолликул, который образуется после иммунизации антигеном. Возникновение данного гистологического сайта коррелирует с оптимальным формированием памяти, переключением изотипов, соматическим гипермутированием и, соответственно, приводит к созреванию аффинности ответа антитела.

Термин «клетки, вырабатывающие антитела» относится к В-клеткам, которые получили контакт-зависимые и контакт-независимые сигналы от клеток Τ11 и секретируют иммуноглобулины подклассов 1дМ, 1дО, 1дА или Ι§Ε.

Термин «домен Ес» антитела означает часть молекулы, включающую в себя шарнирный участок, домены СН2 и СН3, но лишенную антигенсвязывающих сайтов. Данный термин также призван включить в себя эквивалентные участки 1дМ или других изотипов антител.

Термин «анти-Т^БАК-антитело» означает любое антитело, которое специфически связывается по крайней мере с одним эпитопом в составе белка Т^БАК.

Термин «антитело к рецептору Т^БАК» означает любое антитело, которое специфически связывается по крайней мере с одним эпитопом рецептора Т^БАК.

Термин «сигнальные пути рецептора Т^БАК» указывает на молекулярные процессы, связанные с работой рецептора Т^БАК, и последующие молекулярные процессы, вытекающие из этого.

Термины «средство, модифицирующее Т^БАК или рецептор Т^БАК» и «реагент, модифицирующий Т^БАК или рецептор Т^БАК» означают любое средство, которое способно модифицировать связывание лиганда с рецептором Т^БАК, способно модифицировать кластеризацию рецепторов клеточной поверхности Т^БАК или сигнальные пути рецептора Т^БАК, или которое способно влиять на то, как сигнал от рецептора Т^БАК будет интерпретирован внутри клетки.

Термин «лиганд Т^БАК» или «белок Т^БАК» относится к любому мономерному, полимерному или гетеромерному комплексу Т^БАК или его производному, которые способны специфически связываться с рецептором ТАНАК.

Термин «субъект» означает животное или одну или несколько клеток, происходящих от животного. Предпочтительно животное является млекопитающим. Клетки могут находиться в любой форме, включая, но не ограничиваясь этим, клетки, остающиеся в ткани, клеточные кластеры, иммортализованные, трансфицированные или трансформированные клетки, а также клетки, происходящие от животного, которое было физически или фенотипически изменено.

Лиганд Т^БАК

Т^БАК является недавно открытым членом семейства белков ΤΝΕ (СЫсйеротйсйе с1 а1., 1997, I. Βΐο1. Сйет., 51, 32401-32410). Члены белкового семейства ΤΝΕ связываются с рецепторами, входящими в белковое семейство ΤΝΕрецепторов (ΤΝΕ-К). Взаимодействие белков семейства ΤΝΕ с соответствующими рецепторами влияет на широкий круг функций иммунной системы. Хорошо известными примерами являются белок СО40Ь, который связывается с рецептором 0Ό40 со стимуляцией дифференцировки В-клеток в клетки, вырабатывающие антитела (Сге\га1 & Р1ауе11, 1997, 1ттипо1. Век., 16, 59-70), лиганд лимфотоксин-β (ЬТ-β), который связывается с рецептором лимфотоксина-β, что влияет на гуморальные иммунные ответы за счет регуляции дифференцированного состояния фолликулярных дендритных клеток (Маскау & Вгстшпд. 1998, №11иге. 395, 26-27), и ОХ40Ь, который связывается с ОХ40рецептором с регуляцией ответа В-клеток на Тклеточные сигналы (Р1упп е! а1., 1998, 1. Ехр. Меб., 188, 297-304). Другими парами «лиганд/рецептор» в составе семейств ΤΝΡ/ΤΝΡ-Β, которые, как известно, играют ключевую роль в иммунной системе, являются ΤΝΡ/ΤΝΡ-Β55, РакЬ/Рак и СЭ27/СЭ70.

Биология ΤνΕΑΚ пока понятна лишь отчасти. Очищенный растворимый белок ΤνΕΑΚ был использован для индукции дифференцировки и/или гибели некоторых опухолевых клеточных линий, включая клетки аденокарциномы НТ29 (клеточная гибель по механизму апоптоза), клетки карциномы шейки матки НеЬа (морфологические изменения) и клетки меланомы А375 (антипролиферация). Также ΤνΕΑΚ индуцировал у клеточных линий НТ29 и А375 секрецию хемокина 1Ь-8, и такой же эффект наблюдался в отношении клеточной линии фибробластов νΐ-38 (СЫсйерогйсйе е! а1. , 1997, 1. Βίο1. Сйет., 51, 32401-32410). Кроме того, ΤνΕΑΚ индуцировал пролиферацию различных линий нормальных эндотелиальных клеток (Ьупсй е! а1., 1998, 1. 1п1егГегоп Су!окте Век., 18, Α-46).

Был описан предполагаемый рецептор для ΤνΕΑΚ (Магк!егк е! а1., 1998, Сигг. Вю1., 8, 525528). Этот рецептор, по-разному называемый ΤΒΑΜΡ, Аро3, ν8Ε-1, ΌΒ-3 или ΕΑΒΌ, входит в семейство ΤΝΡ-Β. Активация ΤΒΑΜΡ способна индуцировать апоптоз за счет запуска либо каспаза-зависимого сигнального пути клеточной гибели, либо клеточной активации по сигнальным механизмам с участием ΝΡ-кВ (Ак11кепа/1 & Όίχί!, 1998, 8с1епсе, 281, 1305-1308).

Экспрессия ΤνΕΑΚ широко представлена в тканях мыши и человека, при том, что информационная РНК (мРНК) обнаруживается, помимо других тканей, в сердце, головном мозге, легких, печени, а также во вторичных лимфоидных органах, таких как селезенка, лимфатические узлы и моноядерные клетки периферической крови (РВМС). По-видимому, ΤνΕΑΚ не экспрессирован в первичных лимфоидных органах, в которых развиваются клетки иммунной системы, таких как тимус, костный мозг и плодная печень. Таким образом, та роль, которую ΤνΕΑΚ может выполнять в иммунной системе, скорее всего, связана с иммунными отве тами, нежели с развитием собственно иммунной системы.

Взаимодействие белков-лигандов со своими рецепторами может быть модифицировано с использованием ряда специфических подходов. Например, моноклональные антитела (тЛЬ), которые специфически распознают лиганд, могут быть использованы для предотвращения или модифицирования связывания «лиганд/рецептор» за счет распознавания сайта связывания или за счет создания физических помех такому взаимодействию. Как альтернатива, тЛЬ к лигандам могут влиять на сигнал, генерируемый рецептором, вследствие влияния на связывание других лигандов в тех случаях, когда у рецептора имеются множественные лиганды. Такие сложно организованные эффекты были отмечены для тЛЬ к семейству В7 лигандов СЭ28 (Бепксйогс е! а1., 1995, 1. Εχρ. Меб. 181, 11451155). ΜЛЬ к лигандам могут иметь даже более тонкий эффект в системах, в которых для конкретного лиганда имеется множество рецепторов, например, за счет модифицирования связывания лиганда с одним рецептором, при том, что связывание с другим рецептором остается неизменным. ΜЛЬ, которые распознают рецептор, также могут быть использованы для модифицирования связывания лигандов, или же они сами по себе способны индуцировать или модифицировать сигналы от рецептора. Такие антирецепторные тЛЬ могут быть антагонистами или агонистами. Примерами тЛЬ, используемыми в мышиных или человеческих системах для модифицирования взаимодействий «лиганд/рецептор» у членов семейства ΤΝΡ/ΤΝΡ-Β, являются, помимо прочих, тЛЬ, специфичные для ΤΝΡ, для СП40Ь, для ΕΤ-Ρ, для Ρηκ-Ρ и для ΤΒ2/НVΕΜ. ΜЛЬ могут быть использованы для предотвращения инициации или развития иммунологических и других заболеваний. Например, антитела к СП40Ь были использованы в лечении системной красной волчанки (СКВ) и для контроля недостаточности пересаженных органов.

Мощные ингибиторы взаимодействия «лиганд/рецептор» также могут быть созданы путем клонирования последовательностей, которые кодируют внеклеточную часть последовательности рецептора, с последовательностями, которые кодируют тяжелую цепь иммуноглобулина (1д) человека, с последующей экспрессией гибридного гена с использованием промотора подходящего гена в подходящей клеточной линии. Очищенные химерные белки «рецептор-1д» могут быть использованы ш уйго и ш у1уо для связывания с доступным белковым лигандом, тем самым модифицируя взаимодействие лиганда с нативным рецептором, прикрепленным к клетке. Модификации могут быть осуществлены с помощью различных механизмов, сходных с таковыми, которые описаны выше для тЛЬ к лигандам. Примерами химерных белков «рецептор-1д», использованных в мышиных или человеческих системах с целью модифицирования взаимодействий «лиганд/рецептор» членов семейства ΤΝΕ/ΤΝΕ-В, являются, помимо других, ΤΝΕ-Β55-Ι& ΤΝΕ-Β75-Ι& ΕΤβ-Κ-Ι§ и 0X401д. Химерные белки «рецептор-Ц» могут быть использованы для предотвращения инициации или развития иммунологических и других заболеваний. Например, ΤΝΕ-Κ75-Ι§ был использован в лечении воспалительного заболевания кишечника (ВЗК).

В данной заявке авторы показывают, что тЛЬ, которое специфически связывается с ΤνΕΑΚ мыши и человека, предотвращает развитие обусловливаемого прототипным антигеном иммунологического заболевания - синдрома (реакции) «трансплантат против хозяина» (СТПХ). В настоящем изобретении предусматривается использование реагентов, модифицирующих ΤνΕΑΚ и рецептор (рецепторы) ΤνΕΑΚ, с целью лечения различных иммунологических заболеваний, вызываемых попаданием в организм больных чужеродного антигена, таких как СТПХ, являющихся результатом пересадки костно-мозговых или стволовых клеток, и недостаточности пересаженных органов, обусловливаемой отторжением трансплантата. Более того, настоящее изобретение связано с применением реагентов, модифицирующих ΤνΕΑΚ и рецептор (рецепторы) ΤνΕΑΚ, с целью лечения различных аутоиммунных заболеваний, таких как, помимо других примеров, СКВ, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гранулематоз Вегенера, узелковый полиартериит, ретинальный увеит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и язвенный колит. Другими возможными путями использования является лечение острых и хронических воспалительных состояний, таких как, помимо прочего, аллергическое воспаление, астма, эозинофилия, болезнь Грэйвса и болезнь Чагаса.

Материалы и методы

Мыши. Самки мышей линий ΌΒΑ/2 и С57В1/6 возраста 6-8 недель и гибриды (ΌΒΑ/2χΟ57Β1/6) Е1 были закуплены в Джексоновской лаборатории (Ваг НагЬог, ΜΕ, США); их содержали в стандартных садках с защитными барьерами, а работа с ними велась в соответствии с инструкциями лаборатории.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела, которые распознают белок ΤνΕΑΚ человека и мыши, были сформированы в организме армянских хомячков с использованием растворимого белка ΤνΕΑΚ человека, который был выработан в бакуловирусах и очищен в соответствии с описанным (Сысйерогйсйе е! а1., 1997, 1. Вю1. Сйет., 51, 32401-32410). Для первой иммунизации каждый хомячок получал 50 мкг ΤνΕΑΚ в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) путем внутрибрюшин ной инъекции. Для последующих иммунизации (через 14, 28 и 42 дня после первичной иммунизации) каждый хомячок внутрибрюшинно получал 50 мкг (14-й и 28-й дни) или 33 мкг (42-й день) ΤνΕΑΚ в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Заключительную иммунизацию перед тем, как химеризовать клетки селезенки для получения гибридом, проводили внутрибрюшинно с помощью 100 мкг ΤνΕΑΚ без адъюванта. Формирование гибридом проводили с использованием стандартных процедур (Ьетет, 1981, Уа1е 1. Βΐοΐ. Меб., 54, 387-402).

Гибридома, которая вырабатывает тΑЬ МВ1 к мышиному СО40Б (№е11е е! а1., 1992, Ргос. ИаИ. Αсаά. 8с1. ϋδΑ, 89, 6550-6554), была приобретена в АТСС (ВоскуШе, ΜΌ, США). Гибридому, которая вырабатывает тΑЬ На4/8 к гемоцианину слизня, получили от Д-ра Мендрика (Нитап Оеиоте 8аеисе8 1пс., ВоскуШе, ΜΌ, США).

Анализ активности тΑЬ методом ТИФА

ΜΑЬ к ΤνΕΑΚ человека анализировали по их способности связываться с ΤνΕΑΚ человека и мыши с помощью различных экспериментальных форматов. Некоторые таЬ, сформированные к белку ΤνΕΑΚ человека, также распознавали белок ΤνΕΑΚ мыши в процессе исходного скрининга активности тΑЬ, который был проведен в формате тестов на основе ТИФА. Белок ΤνΕΑΚ мыши был получен в бакуловирусах с использованием методов, сходных с методами, описанными для белка ΤνΕΑΚ человека (СШсйероПтсйе е! а1., 1997, 1. Вю1. Сйет., 51, 32401-32410). Очищенные белки ΤνΕΑΚ человека и мыши наносили на 96-луночные планшеты, и различные хомячковые тΑЬ тестировали по их способности связываться с данными иммобилизованными белками. Связывание хомячкового тΑЬ иммобилизованными белками ΤνΕΑΚ визуализовали с использованием ослиного антихомячкового ΙβΟ. соединенного с пероксидазой (Застои 1ттипоВе8еагсй, Vе8! Огоуе, ΡΑ, США), и проведения соответствующей зависимой от пероксидазы ферментативной реакции.

ΕΑС8-анализ активности тΑЬ

Растворимый белок ΤνΕΑΚ индуцирует апоптоз у клеток НТ29: это указывает на то, что данные клетки экспрессируют рецептор ΤνΕΑΚ (СЫсйерогйсйе е! а1., 1997, 1. Вю1. Сйет., 51, 32401-32410). Очищенные таЬ (10 мкг/мл) тестировали по их способности блокировать связывание ΕΕΑΟ-меченного ΤνΕΑΚ мыши или человека с клетками НТ29, что выявляли с помощью биотинилированного антиЕБАО-антитела, стрептавидин-пероксидазы и подходящего ферментативного субстрата.

Индукция хронического СТПХ

Самок мышей ΌΒΑ/2 и Β6Ό2Ρ1 возраста

6-8 недель умерщвляли, и селезенки удаляли в стерильных условиях. Моноклеточные суспензии приготавливали путем тщательного измель15 чения органов между матовыми предметными стеклами, удаляя крупные частички дебриса, с последующим пеллетированием осветленного надосадочного слоя. Полученный клеточный сгусток ресуспендировали в забуференном гипертоническом растворе Гейза и инкубировали на льду в течение 3 мин с целью лизиса эритроцитов. В расчете на каждую измельченную селезенку использовали 5 мл раствора Гейза. Клеточный раствор пеллетировали вновь, ресуспендировали в стерильном апирогенном ФСБ, пеллетировали и ресуспендировали второй раз в стерильном апирогенном ФСБ. Число клеток определяли с помощью гемоцитометра, и плотность клеток доводили до 2х10⁸ на 1 мл. Этот раствор затем пропускали через стерильный клеточный фильтр с порами 70 мкм и выдерживали на льду до момента использования. В качестве реципиентов использовали самок мышей Β6Ό2Ρ1 в возрасте 6-8 недель. Каждому реципиенту инъецировали 500 мкл клеток (1х10⁸) в хвостовую вену. Экспериментальные группы получали трансплантат от ΌΒΆ/2 (ΌΒΆ/2>Ρ1), в то время как группа контрольных животных получала трансплантат от Β6Ό2Ρ1 (Р1>Р1). Животных анализировали по развитию хронического СТПХ через 14 дней после инъекции.

Предотвращение хронического СТПХ

Мыши получали анти-ТЖЕАК-тАЬ ΆΒ.Ό3, анти-СБ40Е-тАЬ МК.1, контрольное тАЬ На4/8 или не получали ничего. Схема обработки включала 250 мкг тАЬ внутрибрюшинно за 4 ч до инъекции трансплантата и через 2, 4 и 6 дней после этого.

Анализ развития болезни

На 14-й день эксперимента мышей умерщвляли и взвешивали. Затем в стерильных условиях удаляли селезенку и взвешивали ее. Индекс селезенки подсчитывали как отношение массы селезенки к массе тела для каждого животного в контрольной группе Е1>Е1, и среднюю величину принимали за 1,0. Средний индекс селезенки для всех других групп соотносили с контрольной величиной. Затем спленоциты выделяли из этих селезенок в соответствии с описанным выше, после этого разбавляли до концентрации 1х10⁷ клеток на 1 мл в стерильном ФСБ. Для анализа методом ЕАС8 100 мкл клеток окрашивали для последующих маркеров клеточной поверхности. Все описанные таЬ были закуплены в Рйаттшдеп (8аи Б|сдо. СА, США). Стрептавидиновый реагент был приобретен в 8ои1йеги Β^οΐесйηο1ο§у Согр. (Βίηηίπβ113111, АЬ, США). Спленоциты окрашивали биотинилированным анти-Н-2К^Ь - гаплотипическим маркером, который может отличать донорские клетки (негативные по Н-2К^Ь) от клеток реципиента (позитивных по Н-2К^Ь), в различных сочетаниях с непосредственно соединенными с Е1ТС или РЕ-меченными анти-СБ4, анти-СБ8, анти-В220, анти-СБ69, анти-1-А', анти-Ьселектиновым и анти-Н2Б'' в ФСБ с 0,5% бычь его сывороточного альбумина (БСА), 0,1% азида натрия (ЕАС8-буфер), содержащем 10 мкг/мл ΡοΒ1οο1<^ΙΛΙ (Рйатттдеп), позволяющим предотвращать неспецифическое связывание с Есрецепторами. Клетки инкубировали с таЬ на льду в течение 1 ч. Каждый образец затем ресуспендировали с 2 мл ЕАС8-буфера с целью промывки, затем центрифугировали для пеллетирования клеток. Клетки ресуспендировали в ЕАС8-буфере, содержащем меченный СуСйтоте стрептавидин, который связывается с биотинилированным тАЬ, что предоставляет третий канал для ЕАС8-сортировки, промывали в последний раз и анализировали с использованием установки для ЕАС8-сканирования и программы С.’е11с.|ие51 Щес1оп Бюкепкоп, 8ап 1о5е, СА, США).

Для анализа секреции 1д ш уйго клетки пеллетировали и ресуспендировали в среде БМЕМ, содержащей 10% плодной телячьей сыворотки (ПТС) + 4 мМ глутамина, при концентрации 1х10⁷ клеток на 1 мл. По 1 мл на лунку наносили на 6-луночный планшет. Клеточные надосадочные фракции выделяли через 24 ч.

Источник анти-ТЖЕАК-антител

В одном варианте настоящего изобретения антитела (АЬ§), специфичные в отношении ТЖЕАК, функционировали в качестве средств, блокирующих ТЖЕАК. Антитела могут быть сформированы в отношении мономерных, димерных или тримерных форм белка ТЖЕАК, содержащих или не содержащих гетерологичные субъединицы, если таковые существуют. Более того, антитела могут быть сформированы в отношении растворимой, мутантной, измененной или химерной форм белков ТЖЕАК. Анти-ТЖЕАК-антитела согласно изобретению могут быть поликлональными или моноклональными (тАЬ) и могут быть модифицированы с целью оптимизации их способности блокировать связывание ТЖЕАК с соответствующими рецепторами, их биологической доступности ш У1уо, стабильности или других желательных свойств.

Поликлональные антисыворотки, специфичные в отношении ТЖЕАК, приготавливают с использованием стандартных методов путем подкожного инъецирования животных, таких как козы, кролики, крысы, хомячки или мыши, белком ТЖЕАК человека в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) с последующими бустерными внутрибрюшинными или подкожными инъекциями в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Поликлональные антисыворотки, содержащие желательные антитела к ТЖЕАК, подвергают скринингу с помощью стандартных иммунологических процедур.

Моноклональные антитела (тАЬ) хомячка, специфичные в отношении ТЖЕАК человека, приготавливают с использованием стандартных методов путем подкожного инъецирования ар17 мянских хомячков рекомбинантным растворимым Τ\νΕΛΙ< человека в ПАФ с последующей бустерной внутрибрюшинной или подкожной инъекцией в НАФ. Гибридомная клеточная линия (ΑΒ.Ό3.7.2), которая вырабатывает хомячковое анти-ΤVΕΑΚ-тΑЬ ΑΒ.Ό3, была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) (КоскуШе, ΜΌ) в соответствии с условиями Будапештского договора, где получила депозитарный номер АТСС. Все ограничения по открытому доступу к указанному выше депозиту АТСС будут, безусловно, сняты после выдачи патента на настоящую заявку.

Различные формы анти-Т^Е1<-антител могут также быть сформированы с использованием стандартных технологий рекомбинантных ДНК (\νίη^Γ & М1181е1и, 1991, №1Шге. 349, рр.293-299). Например, могут быть сконструированы «химерные» антитела, в составе которых антиген-связывающий домен антитела животного соединен с константным доменом человека (например, СаЬШу е! а1., патент США № 4816567; Μοττίκοη е! а1., 1984, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 81, рр.6851-6855). Химерные антитела снижают наблюдаемые иммунные ответы, вызванные антителами животных, при использовании их в клинической практике для лечения людей.

Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные «гуманизованные антитела», которые распознают ΤνΕΑΚ. Гуманизованные антитела - это химеры, включающие в основном последовательности 1дС человека, в состав которых встроены участки, ответственные за специфичное связывание антигена (например, международная патентная заявка νθ 94/04679). Животных иммунизуют желательным антигеном, выделяют соответствующие антитела и удаляют участок последовательностей вариабельного домена, ответственный за специфичное связывание антигена. Участки связывания антигена, происходящие от животного, затем клонируют в подходящее положение генов антител человека, из состава которых были делегированы антиген-связывающие участки. Гуманизованные антитела сводят к минимуму использование гетерологичных (от другого вида) последовательностей в антителах человека, поэтому менее вероятной оказывается индукция иммунных ответов у субъекта, лечение которого проводят.

Конструирование различных классов рекомбинантных анти-Т^ЕАК-антител также может быть осуществлено путем получения химерных или гуманизированных антител, включающих в себя вариабельные домены антиΤνΕΑΚ и константные домены человека (СН1, СН2, СН3), выделенные из иммуноглобулинов разных классов. Например, анти-Т^ЕАКантитела класса 1дМ с увеличенными валентностями антигенсвязывающего сайта могут быть получены рекомбинантным путем с помощью клонирования антиген-связывающего сайта в состав векторов, несущих константные домены тяжелой цепи 1дМ человека (Ати1аиаибаш е! а1., 1993, 1. Ехр. Мед., 177, рр.1439-1450; Ьаие е! а1., 1993, Еиг. 1. 1ттиио1., 22, рр. 2573-2578; Тгаииескег е! а1., 1989, Ыа!иге, 339, рр. 68-70).

Кроме того, стандартные методы рекомбинантной ДНК могут быть применены для изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с соответствующими им антигенами путем изменения аминокислотных остатков поблизости от антиген-связывающих сайтов. Аффинность по связыванию антигена у гуманизированного антитела может быть повышена с помощью мутагенеза на основании молекулярного моделирования (Оиееи е! а1., 1989, Ргос. №111. Асад. 8ск И8А, 86, рр. 10029-10033; международная патентная заявка νθ 94/04679).

Желательным может быть увеличение или уменьшение аффинности анти-Т^ЕАК-антител в отношении ΤνΕΑΚ, что зависит от типа ткани-мишени или конкретного плана лечения. Например, может иметь преимущество лечение больного с помощью постоянных уровней антиΤνΕΑΚ-антител со сниженной способностью к модификации механизма ΤνΕΑΚ с целью полупрофилактического лечения. Подобным образом анти-Т^ЕЛК-антитела с повышенной аффинностью в отношении ΤνΕΑΚ могут иметь преимущество для кратковременных курсов лечения.

Выработка хомячкового моноклонального антитела к ΤΨΕΑΚ-человека проиллюстрирована в примере 1.

Использование анти-ΤVΕΑΚ-тΑЬ для предотвращения развития хронического СТПХ, являющегося антиген-опосредуемым иммунологическим заболеванием

Здесь авторы изобретения демонстрируют влияние средства, блокирующего ΤνΕΑΚ, тΑЬ ΑΒ.Ό3 - на развитие иммунного ответа в мышиной модели синдрома «трансплантат против хозяина» (СТПХ). Способность предотвращать хронический СТПХ включает в себя влияние на активацию и пролиферацию В-клеток, а также на образование секретируемого 1дС. Мышам внутрибрюшинно (в/б) вводили 250 мкг анти-ΤVΕΑΚ-тΑЬ ΑΒ.Ό3, контрольного тАЬ На4/8 к ΚΕΗ, анти-СП40Ь-тАЬ МК1 или не вводили ничего. Через 4 ч мыши получали 1х10⁸спленоцитов, выделенных у мышей ΌΒΑ/2, в 0,5 мл инъекционного раствора, вводимого внутривенно (в/в). Инъецированные в/в спленоциты ΌΒΑ/2 представляли собой аллотрансплантат. Через 2, 4 и 6 дней после введения трансплантата мышам вновь вводили по 250 мкг анти-ΤVΕΑΚ-тΑЬ ΑΒ.Ό3, контрольного тАЬ На4/8 к ΚΕΗ или анти-СП40Ь-тАЬ МК1. Контрольная группа мышей получала 1х10⁸ спленоцитов Β6Ό2Ε1, которые не способны вызывать заболевание у реципиентов линии Β6Ό2Ε1. Как альтернатива, в качестве контроля использовали мышей Β6Ό2Ε1, которым ничего не пересаживали и не вводили. Через 14 дней после введения трансплантата мышей умерщвляли и анализировали на наличие заболевания.

У мышей-реципиентов, получавших трансплантат, но не получавших лечения, проявляются различные симптомы, указывающие на развитие хронического СТПХ. Спленомегалия (увеличение селезенки) подтверждает, что донорские Т-клетки и В-клетки реципиента перешли в активированное состояние и претерпели поликлональную экспансию, выразившуюся в резком увеличении числа клеток. Появление белков клеточной поверхности, таких как СО69, у группы В-клеток указывает на активацию Вклеток. Утрата молекул Ь-селектина СЭ4позитивными и СО8-позитивными Т-клетками подтверждает активацию Т-клеток. Секреция молекул 1д таких классов как 1дС, 1дА и 1дЕ, либо в сыворотку, либо выявляемое ίη νίίτο в ходе анализа культивирования клеток, указывает на то, что В-клетки превратились в активированные и прошли этап переключения своего класса иммуноглобулина. В связи с этим возникновение аутоантител в сыворотке или в тестах ίη νίίτο с культивируемыми клетками показывает, что выработанные иммуноглобулины характеризуются несоответствующим распознаванием аутоантигенов. Наконец, выживаемость может быть определена как показатель различных режимов лечения.

Авторы изобретения сравнили контрольных мышей с мышами, получавшими аллотрансплантат, но не получавшими лечения, с целью анализа степени спленомегалии, активации В-клеток и секреции 1д в ходе СТПХ. АнтиСО4()Ь-тАЬ МКТ использовали в данных экспериментах в качестве позитивного контроля, поскольку ранее было показано, что блокировка взаимодействия СЭ40Ь/С040 является эффективным средством для создания помех развитию хронического СТПХ (Эппс с1 а1., 1994, 1. С11П. Ιηνοκΐ., 94, 1333-1338). Хомячковое тАЬ На4/8, полученное против гемоцианина слизня (КЬН), выполняло роль негативного контроля. Результаты двух экспериментов показаны в табл. 2. В обоих экспериментах введение антиТХУЕАК-тЛЬ ΑΒ.Ό3 приводило к снижению уровня спленомегалии (по сравнению с реципиентами, получавшими аллотрансплантат, но не получавшими лечения) приблизительно на 33%. Введение тАЬ На4/8 как негативного контроля влияния не оказывало, в то время как введение анти-СО4()Ь-тАЬ МК1 подавляло спленомегалию почти на 70%. Для изучения клеточных популяций, затрагиваемых введением антиТХУЕЛК-тЛЬ ΑΒ.Ό3, ЕАС8-анализ был проведен в отношении спленоцитов, взятых у мышейреципиентов через 14 дней после введения трансплантата. Клетки селезенки, выделенные от 3-4 особей из каждой группы, объединяли. Активация В-клеток реципиента является от четливым признаком хронического СТПХ. У мышей, которым не проводили лечения или вводили контрольное тАЬ, небольшая, но отчетливая доля В200+ В-клеток экспрессировала активационный маркер СО69 (фиг. 4 и табл. 3). Напротив, по сути не было экспрессировавших СО69 В200+ В-клеток у мышей, которым вводили МК1 или АВГО3. Утрата выявляемой активации В-клеток в селезенке мышей, которым вводили АВГО3, может являться следствием работы одного или нескольких разных механизмов, включая утрату активации Т-клеток, утрату активации В-клеток или клеточную гибель (апоптоз). Далее авторы изобретения измерили общий уровень 1дС в культурах спленоцитов у мышей из различных по способу лечения групп с целью определения того, коррелирует ли утрата активационного маркера СО69 у популяций В-клеток с функциональным процессом, т.е. с выработкой 1дС. У контрольных мышей без лечения, у мышей с введением МК1 и мышей с введением АВ.Э3 вырабатывалось резко сниженное количество общего 1дС по сравнению с мышами-реципиентами аллотрансплантата, не получавшими лечения или получавшими На4/8 (табл. 4). Данный результат показывает, что секреция 1д активированными Вклетками, являющаяся отчетливым признаком хронического СТПХ, заблокирована введением анти-Т^ЕАК-тАЬ. Использование антиТХУЕАК-тАЬ для предотвращения развития хронического СТПХ проиллюстрировано в примере 2.

Другие заболевания, опосредованные антителами

Многие специфичные для отдельных органов и системные аутоиммунные заболевания вовлекают патологические ответы с образованием антител. Такими состояниями являются миастения дтау18, аутоиммунная гемолитическая анемия, болезнь Чагаса, болезнь Грейвса, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), системная красная волчанка (СКВ), гранулематоз Вегенера, узелковый полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями (из Веп)ат1П1 с1 а1., 1996, 1ттипо1оду: А 8ой Соитее, ^йеу-Ыж, Νν Уогк, 36 еб.).

Хотя этиология СКВ не установлена, изрядный объем информации имеется по иммунологическому механизму, ответственному за выявляемую патологию. По неизвестным причинам у больных с СКВ вырабатываются антитела к ядерным компонентам организма (антиядерные антитела - АЯА), в основном к нативной двухцепочечной ДНК. С клинической точки зрения присутствие таких антител четко коррелирует с почечной патологией, развивающейся при СКВ. Данные антитела образуют комплекс с ДНК, предположительно происходящей из разрывов нормальной ткани, и, как и при любых иммунологических («иммуноагрегационных») заболеваниях, такие комплексы образуют отло жения, являющиеся «ловушками» для базальной мембраны клубочков, в стенках артериол и в синовиальных пространствах суставов. Такие комплексы активируют каскад комплемента и привлекают гранулоциты. Последующая воспалительная реакция характеризуется гломерулонефритом, в результате чего повреждаются почки, что приводит к протеинурии и гематурии.

Уже в течение нескольких десятков лет СКВ изучают на мышиной модели. Развитие СКВ можно предотвратить с использованием таких реагентов как химерный белок СТЬЛ4-1д и анти-СО4()Ь. которые прерывают ключевые стадии активации Т- и В-клеток (Сге\та1 & Ε1ηνе11, 1996, 1ттипо1. Ееу., 153, 85-106). Недавно с помощью ряда моделей была оценена терапевтическая эффективность реагента, специфичного в отношении лиганда СЭ40 мыши (Мойап е! а1., 1995, 1. 1ттипо1., 154, рр. 1470-1480). Ускоренное развитие волчанки путем переноса клеток, которые индуцируют выработку патогенных антител ίη νίνο, как было показано, подавляется введением моноклонального антитела, которое блокирует взаимодействие лиганда ί.Ό40/ί.Ό40. Более того, кратковременное воздействие на волчаночных мышей антитела к лиганду СЭ40 имеет поддерживаемый положительный эффект в отношении спонтанного развития болезни в течение длительного времени после удаления антитела из организма этих мышей. Эксперименты показали, что патогенные В-клетки могут не вырабатывать антител даже через 9 месяцев после проведения лечения: это подтверждает, что имеется задержка экспансии аутоиммунных В-клеток памяти, что и проявляется в долговременном терапевтическом преимуществе. Более того, воздействие антиСЭ40Б было способно остановить или замедлить развитие уже имеющейся СКВ в мышиной модели со спонтанной встречаемостью заболевания (Ка11еб е! а1., 1998, 1. 1ттипо1., 160, 21582165). Как показано авторами изобретения, реагенты, которые модифицируют взаимодействие ТХУЕЛК и рецептора(ов) ТХУЕЛК ш тКо, подавляют активацию В-клеток и выработку 1д, поэтому реагенты согласно изобретению будут применимы для лечения или профилактики СКВ.

Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты вызывает ответы в виде выработки аутоантител, которая может становиться избыточной и составить медицинскую проблему. Одним из примеров является болезнь Чагаса - воспалительная кардиомиопатия, которая развивается у человека и экспериментальных животных при хроническом заражении трипаносомами Тгурапокота сги/ί (Τ.εΐΗζί). Недавно в ряде исследований были идентифицированы аутоантитела в сыворотке пациентов с болезнью Чагаса (Васй-Ейак е! а1., 1998, Ратакйо1. Век., 84, 796-799). Более того, индукция специфичных для сердца аутоиммун ных ответов недавно получила существенную экспериментальную поддержку как возможный механизм, вовлеченный в патогенез кардиомиопатии Чагаса у человека. В недавнем исследовании (Т1ЬЬе!!к е! а1., 1994, 1. 1гптипо1., 152, рр. 1493-1499) было установлено, что сердечные антиген-специфичные антитела вырабатываются у мышей С57В1/6, зараженных Т.сч^г с болезнью сердца. После заражения бразильским штаммом Т.спЩ у мышей С57В1/6 развивается кардиомиопатия, которая по гистологическим параметрам сходна с таковой, выявленной у хронически инфицированных людей. Антисыворотки от таких мышей взаимодействуют с тремя сердечными антигенами, в то время как у мышей С57В1/6, зараженных гайанским штаммом Т.сгиг1, у которых кардиомиопатия не развивается, подобные антитела не вырабатываются. Эти данные указывают на то, что такие антитела являются маркерами, специфичными для кардиомиопатии. Способность средств, модифицирующих Т^ЕЛК, блокировать активацию В-клеток и выработку 1д будет применима для предотвращения поражений сердца, имеющих место у пациентов с болезнью Чагаса.

Другим примером разрушения клеток под действием аутоантител, образованных как следствие некоторых инфекционных заболеваний или по другим, пока неизвестным, причинам является идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП). При этом состоянии антитела, специфичные в отношении тромбоцитов, обусловливают разрушение тромбоцитов (с участием комплемента или фагоцитирующих клеток, несущих рецептор Рс или С3Ь), что может приводить к кровотечениям. Терапевтические средства, которые будут подавлять ш νί\Ό такие аутоиммунные ответы, опосредуемые антителами, такие как средства согласно изобретению, модифицирующие Т^ЕЛК, которые подавляют образование антител, будут применимы для лечения или профилактики также и таких аутоиммунных заболеваний.

Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также может вызывать реакции гиперчувствительности, которые могут становиться избыточными и сами по себе создают медицинскую проблему. Наиболее ярким примером гиперчувствительности I типа является аллергическая реакция. Она опосредуется антителами 1дЕ, которые связываются через свои Рс-участки с рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов, опосредуя тем самым секрецию фармакологически активных средств, которые приводят к анафилаксии. Иногда считается, что ИТП и синдром Гудпасчера являются реакциями II типа, которые имеют место тогда, когда антитела 1дМ или 1дС связываются с антигеном на клеточной поверхности и активируют каскад комплемента. Затем к сайту активации привлекаются гранулоциты, и вследствие секреции литических ферментов из их гранул происходит разрушение клеток. Считается, что ревматоидный артрит обусловливается реакцией гиперчувствительности ΙΙΙ типа, опосредуемой иммунными комплексами антигена (в данном случае - ревматоидного фактора, являющегося аутоантителом типа Ι§Μ), который связывается с Ес-сегментом нормального ΙβΟ. Такие иммунные комплексы участвуют в индукции воспаления суставов и повреждений, характерных для данного заболевания. Поскольку отчасти данные патологии обусловливаются антителами, терапевтические средства, которые будут подавлять образование антител, такие как средства согласно изобретению, модифицирующие ТАЕАК, будут применимы для лечения или профилактики также и подобных заболеваний.

Дополнительными примерами заболеваний, которые приводят к опосредованным антителами повреждениям у больного, являются болезнь Грейвса и острая гемолитическая анемия. Предусматривается, что средства, модифицирующие ТАЕАК, будут проявлять эффективность в профилактике или лечении таких заболеваний.

Подавление клеточных иммунных ответов. Авторы изобретения показали, что введение реагентов, которые модифицируют активность белка ТАЕАК ίη νίνο, предотвращают развитие опосредованного антителами (гуморального) иммунологического заболевания - хронического СТПХ. Другими мощными модификаторами иммунной системы, которые способны предотвращать развитие хронического СТПХ, являются анти-СО40Ь и химерный белок СТ^А4-Iд. Данные реагенты блокируют критические стадии активации Т- и В-клеток (Сге\\'а1 & Е^е11, 1996, ^типок Кет., 153, 85-106). Следовательно, терапевтическое манипулирование такими другими мощными механизмами иммунной системы не ограничивается гуморальными иммунными ответами. Например, анти-СП40Ь и СТ^А4-Iд были использованы по отдельности и вместе друг с другом для контроля отторжения пересаживаемого органа в животных моделях (К1гк е1 а1., 1997, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 94, 8789-8794). Основная часть иммунного ответа на пересаженные органы опосредована Тлимфоцитами ТЫ и состоит из цитотоксического клеточного иммунного ответа. Такие клеточные иммунные ответы отвечают за опосредованное клетками повреждение при ряде других иммунологических заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, например, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, диабет, язвенный колит и болезнь Крона. Основываясь на способности предотвращать развитие хронического СТПХ, заявляемое изобретение предусматривает использование реагентов, модифицирующих ТАЕАК или рецептор ТАЕАК, для лечения заболеваний, связанных с клеточным иммунитетом.

Способы лечения с использованием средств, модифицирующих ТАЕАК и рецептор ТАЕАК

Композиции согласно изобретению должны быть введены эффективной дозой с целью лечения конкретного клинического состояния. Определение предпочтительного фармацевтического препарата и режима терапевтически эффективных доз для конкретного применения хорошо известно специалистам в данной области техники, причем с учетом, например, состояния и массы тела больного, степени желательного лечения и переносимости больным данного лечения.

Как ожидается, дозы примерно 5 мг/кг средства, модифицирующего ТАЕАК или рецептор ТАЕАК, будут подходящими исходными точками для оптимизации лечебных доз.

Определение терапевтически эффективной дозы также может быть проведено с помощью экспериментов ίη νίίτο, в которых измеряют концентрацию модифицирующего средства, необходимую для обволакивания клетокмишеней (клеток, позитивных по ТАЕАК или рецептору ТАЕАК, в зависимости от модифицирующего средства) в течение подходящих периодов времени (периодов лечения). Описываемые здесь ЕАС8- и ТИФА-тесты на связывание «лиганд-рецептор» могут быть использованы для контроля реакции обволакивания клеток. Основываясь на результатах таких тестов на связывание ίη νίίτο, диапазон подходящих концентраций модифицирующих средств может быть выбран для испытаний на животных.

Введение растворимых модифицирующих средств согласно изобретению по отдельности или в сочетании, включая изолированные и очищенные формы антител к ТАЕАК и к ТАЕАК-К, химерные белки «рецептор-Ιβ», другие средства, модифицирующие ТАЕАК и рецептор ТАЕАК, включая встречающиеся в естественных условиях или химически производные реагенты, а также их соли или их фармацевтически приемлемые производные, может быть осуществлено с использованием любого стандартным образом принятого пути введения средств, которые проявляют иммуносупрессорную активность.

Фармацевтические композиции, используемые в данных способах лечения, также могут находиться в различных формах. Ими являются, например, твердые, полужидкие и жидкие дозированные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы или суспензии, суппозитории и растворы для инъекций и инфузий. Предпочтительная форма зависит от выбранного пути введения и терапевтического применения. Путями введения могут являться пероральный, парентеральный, подкожный, внутривенный, внутрираневой или топический пути введения.

Средства согласно изобретению, модифицирующие Τ\νΕΑΚ и рецептор Τ\νΕΑΙ<, могут быть, например, помещены в стерильные изотонические препараты, содержащие дополнительные компоненты, которые стимулируют поглощение или стабильность, или не содержащие их. Препарат предпочтительно является жидким или может быть лиофилизованным порошком. Например, средства согласно изобретению, модифицирующие Τ\νΕΑΚ и рецептор ΤνΕΑΚ, могут быть разбавлены в препаративном буфере, содержащем 5,0 мг/мл моногидрата лимонной кислоты, 2,7 мг/мл тринатрийцитрата, 41 мг/мл маннита, 1 мг/мл глицина и 1 мг/мл полисорбата-20. Данный раствор можно лиофилизировать, хранить в холодильнике и реконституировать перед введением в стерильной воде для инъекций (И8Р).

Также предпочтительно композиции должны содержать стандартные фармацевтически приемлемые носители, которые хорошо известны в данной области техники (см., например. Кеттд!оп'к РЬагтасеи!юа1 8с1епсек, 16(Н Εάίΐίοη, Мас РиЬНкЫпд Со.). Такими фармацевтически приемлемыми носителями могут являться другие терапевтические средства, носители, генетические носители, адъюванты, наполнители и др., такие как сывороточный альбумин человека или препараты плазмы. Предпочтительно композиции имеют форму стандартной дозы и обычно должны вводиться один или несколько раз в день.

Фармацевтические композиции согласно изобретению также могут быть введены с использованием микросфер, липосом, других доставочных систем на основе микрочастиц или препаратов для непрерывной секреции, помещаемых в кровяное русло или в поврежденную ткань, рядом с ней или в какой-либо иной связи с ней. Подходящими примерами носителей с непрерывной секрецией являются полупроницаемые полимерные матриксы в виде формованных изделий, таких как суппозитории или микрокапсулы. Имплантируемыми или микрокапсулярными матриксами с непрерывной секрецией являются полилактиды (патент США № 3773319; ЕР 58481), сополимеры Ьглутаминовой кислоты и этил-Ь-глутамата (81бтап е! а1., 1985, Β^ορο1уте^к, 22, рр.547556); поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или полиэтиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., 1981, 1. Бюшей. Ма!ег. Кек., 15, рр. 167-277; Банде г, 1982, СЬет. 'ГесЬ., 12, рр.98-105).

Преимущества терапевтических композиций, содержащих средства, модифицирующие ΤνΕΑΚ или рецептор ΤνΕΑΚ

Средства согласно изобретению, модифицирующие ΤνΕΑΚ и рецептор ΤνΕΑΚ, способны подавлять иммунные ответы, на что указывает подавление активации В-клеток и выработки 1д в модели хронического СТПХ. Способность к избирательному подавлению таких иммунных ответов будет применима для лечения иммунологических заболеваний, включая различные аутоиммунные заболевания, отторжение пересаживаемых органов и острые и хронические воспалительные состояния. Лечение таких патологических иммунных заболеваний в целом основано на иммуномодулирующих и иммуносупрессирующих средствах, которые обладают плейотропным действием на широкий круг типов клеток и иммунных ответов. Такие неспецифические имуносупрессорные средства, как правило, необходимы в высоких и зачастую цитотоксичных дозах, которые обусловливают неблагоприятные побочные эффекты. Например, тремя основными применяемыми группами иммуносупрессорных средств являются стероиды, циклофосфамид и азатиопрен. Стероиды являются плейотропными противовоспалительными средствами, которые подавляют активированные макрофаги и подавляют активность антиген-представляющих клеток такими путями, которые способствуют обратимости многие патологические Т-клеточные эффекты. Циклофосфамид, являющийся алкилирующим агентом, опосредует гибель клеток за счет подавления репликации и репарации ДНК. Азатиопрен является антипролиферативным средством, которое подавляет синтез ДНК. Такие неспецифические иммуносупрессорные средства в целом необходимы в высоких дозах, которые повышают их токсичность (например, нефро- и гепато-токсичность) и приводят к неблагоприятным побочным эффектам. Следовательно, они не подходят для долговременных курсов лечения.

Таким образом, имеется насущная необходимость в дополнительных средствах и способах лечения, которые преодолевают проблемы, обусловливаемые стандартными способами лечения.

Далее следуют примеры, которые иллюстрируют анти-Τ\VΕΛI<-тΛЬ согласно изобретению, способы, использованные для характеристики данного тАЬ, и применение тАЬ для предотвращения антиген-опосредованного иммунологического заболевания. Данные примеры не должны рассматриваться как ограничивающие: примеры включены для иллюстрации настоящего изобретения, которое ограничено исключительно формулой изобретения.

Примеры

Пример 1. Выработка моноклонального антитела к белку Τ\νΕΛΚ.

Моноклональные антитела, которые распознают белок ΤVΕΑΚ человека и мыши, были сформированы в организме армянских хомячков с использованием растворимого белка Τ\VΕΛI< человека, который был получен в бакуловирусах в соответствии с описанным (СЫсЬерогЪсЬе е! а1., 1997, 1. ΒώΕ СЬет., 51, 32401-32410). Для первой иммунизации каждый хомячок получал 50 мкг ΤVΕΑΚ в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) путем внутрибрюшинной инъекции. Для последующих иммунизаций (14-й, 28-й и 42-й дни после первой иммунизации) каждый хомячок получал внутрибрюшинно 50 мкг (14-й и 28-й дни) или 33 мкг (42-й день) ТХУЕЛК в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Последняя иммунизация перед слиянием клеток селезенки с целью образования гибридом составила 100 мкг ТХУЕАК без адъюванта при внутрибрюшинном введении. Формирование гибридом проводили с использованием стандартных процедур (Ьеглег, 1981, Уа1е 1. ΒίοΙ. Меб., 54, 387402).

Исходный скрининг активности тАЬ был проведен с использованием тестов в формате ТИФА. Мышиный белок Т^ЕАК получали в бакуловирусах с использованием методов, сходных с методами, описанными для белка Т^ЕАК человека (СЫсЬерогйсЬе е1 а1., 1997, 1. Βίο1. СЬет., 51, 32401-32410). Очищенными белками ТХУЕАК человека и мыши покрывали 9б-луночные планшеты, и различные хомячковые тАЬ тестировали по их способности связываться с данными иммобилизованными белками. Связывание хомячкового тАЬ с иммобилизованными белками Т^ЕАК визуализировали с использованием соединенного с пероксидазой хрена ослиного антихомячкового 1дС (1аск§оп 1ттипоКе8еагсЬ, ХУеЧ Сгоуе, РА, США) и соответствующей ферментативной реакции. Восемь тАЬ из 23 распознавали белки Т^ЕАК и мыши, и человека (табл. 1).

Таблица 1

Клон	ТИФА: ТОЕАК человека	ТИФА: ™еак мыши	ЕАС8: блокирование лиганда	ЕАС8: связывание с ЬТОЕАК/ 293	ЕАС8: связывание с тТ^ЕАК/ 293
АВ.Э3.7.2	+++	+++	+	+	+
АА.^Β5	+++	-	+/-	+	-
АС.Н5.24	+++	+++	-	н/опр.	н/опр.
АА.О9	+++	-	+/-	+	-
АВ.Н12.1	+++	+++	-	-	-
ΒА.Е5.35.2*	+++	+++	+	+	-
	++	+++	+	+	-
ΒΕ.Ώ5	++		+/-	+	-
АЕ.Э4	++		+	+	-
АБ.О11.1*	+++	+++	+	+	+
ВЕ.В3.6.1*	++		-	+	-
ЛЛ.АС2.3.2	+++		+/-	н/опр.	н/опр.
ВВ.В12.1.31.3	++		+/-	+	-
ААЕЮ^И*	+++	+++	+	+	+
ΒΙ)..\3	++		-	-	-
ВС.В10.21*	+++	+++	+	+	+
ΒΟ.Ε8	+++		+/-	+	-
АЕ.С10.4*	+++		+	+	-
АА.ВВ4.2*	+++		+	+	-
АА.ЕС10.2*	+++		+	+	-
А^.Β5.9*	+++		-	-	-
,\Β.Ι )4.67.19	+++		-	-	-

связывание Т^ЕАК-Дад человека с клетками НТ29.

РАС8-анализ трансфектантов ЕΒNА293: кДНК ТХУЕАК человека и мыши использовали для трансфекции клеток линии ЕΒNА293, и тАЬ тестировали по реактивности спустя 3 дня.

Консерватизм антигенных эпитопов между видами не удивителен, если принять во внимание уровень белковой гомологии, выявленной между формами Т^ЕАК мыши и человека (фиг. 1). РАС8-анализ использовали для определения того, могут ли анти-Т^ЕАК-тАЬ связываться с белками Т^ЕАК, экспрессированными на поверхности клетки. Последовательности кДНК Т^ЕАК человека и мыши были клонированы в состав экспрессирующего вектора СН269 (СЫсЬерогЪсЬе е1 а1., 1997, 1. Βίο1. СЬет., 51, 32401-32410), и эти конструкции использовали для трансфекции с достижением перемежающейся экспрессии белка в клетках ЕΒNА293. Четыре тАЬ, включая АВ.О3, эффективно связывались на клетках ЕΒNА293, экспрессирующих Т^ЕАК мыши (фиг. 2). Данные четыре тАЬ также были способны предотвращать связывание Т^ЕАК человека с клетками НТ29, для которых известна экспрессия одного или нескольких рецепторов Т^ЕАК (например, фиг. 3). Взятые вместе, данные анализы методом РАС8 показали, что антиТ^ЕАК-тАЬ специфическим образом распознавали белки Т^ЕАК и могли модифицировать способность белков Т^ЕАК связываться с одним или несколькими рецепторами Т^ЕАК.

Пример 2. Использование анти-Т^ЕАКтАЬ АВ.О3 для предотвращения развития спленомегалии, активации В-клеток и выработки 1д в мышиной модели хронического СТПХ.

Хронический СТПХ индуцировали у самок мышей линии Β6Ό2Ρ1 в возрасте б-8 недель с использованием трансплантата спленоцитов в соответствии с описанным в методах. Каждому реципиенту инъецировали 500 мкл (1х10⁸) клеток в хвостовую вену. Экспериментальные группы получали трансплантат (^ΒЛ/2>Е1), в то время как группа контрольных животных получала трансплантат Β6Ό2Ρ1 (Р1>Р1). Мыши получали анти-Т^ЕАК-тАЬ ЛΒ.^3, анти-СП40Ь-тАЬ МВ1, контрольное тАЬ На4/8 или не получали ничего. Животным вводили дозы по 250 мкг тАЬ внутрибрюшинно за 4 ч до введения трансплантата и через 2, 4 и б дней после этого. На 14-й день эксперимента мышей умерщвляли, и индекс селезенки подсчитывали как отношение массы селезенки к массе тела для каждого животного в контрольной группе Е1>Е1, а среднюю величину принимали за 1,0. Средний индекс селезенки для всех других групп соотносили с контрольной величиной. Результаты, полученные в двух независимых экспериментах, показаны в табл. 2. У животных, получивших трансплантат ЭДА^

ТИФА Т^ЕАК человека: тАЬ оценивали по их способности связываться с планшетом, покрытым ТХУЕАК человека.

ТИФА Т^ЕАК мыши: тАЬ тестировали по их перекрестной реактивности с планшетом, покрытым ТХУЕАК мыши.

ЕАС8 блокирования лиганда: тАЬ тестировали по тому, способны ли они блокировать (ΌΒΑ/2>Ε1), и тех, которым ничего не вводили или вводили контрольное антитело На4/8, выявили резкое увеличение массы селезенки по сравнению с контрольной группой Р1>Р1. Этот результат отражен в индексе селезенки, который показал увеличение от нормализованного контрольного значения 1,0 до 2,6. Введение мышам анти-СО40Ь-тАЬ МВ1 снижало индекс селезенки почти до контрольных значений (1,1), а введение анти-ТХУЕАК-тАЬ ΑΒ.Ό3 снижало спленомегалию на 35% - до 1,7 (табл. 2).

Таблица 2

Введение	Эксперимент 1	Эксперимент 2	Среднее
Ρ1>Ρ1 (контроль)	1,0	1,0	1,0
ΏΒΑ/2>Ρ1, без введения	2,7	2,6	2,65
ΏΒΑ/2ΑΡ1, введено На4/8	2,9	2,6	2,75
ΏΒΑ/2ΑΡ1, введено ΜΚ4	1,1	1,1	1,1
ΏΒΑ/2ΑΡ1, введено ΑΒ.Ώ3	1,8	1,7	1,75

На 14-й день эксперимента мышей умерщвляли и взвешивали. Затем селезенку удаляли в стерильных условиях и взвешивали. Индекс селезенки подсчитывали как отношение массы селезенки к массе тела у каждого животного контрольной группы Е1>Е1, а среднюю величину принимали за 1,0. Средний индекс селезенки для всех других групп соотносили с контрольной величиной.

Анализ методом РАС8 использовали для определения активационного состояния у популяций лимфоцитов в селезенке у контрольных и больных мышей, представлявших группы с различными введениями. Исходно анализировали приживление донорских клеток, попавших в организм мышей различных групп. Донорские клетки выявляли в селезенках мышейреципиентов приблизительно с одинаковой долей (в среднем 6,2%) во всех группах обработки ΌΒΑ/2>Ρ1 (табл. 3). Этот результат показал, что введение различных тАЬ не влияет на приживление донорских клеток.

Таблица 3

Введение	% негативных по Н-2К^Ь(донорских) клеток
Ρ1>Ρ1(контроль)	0,2
ΏΒΑ/2>Ρ1, без введения	5,9
ΏΒΑ/2>Ρ1, введено На4/8	9,9
ΏΒΑ/2>Ρ1, введено ΜΚΙ	5,5
ΏΒΑ/2>Ρ1, введено ΑΒ.Ώ3	4,3

Для РАС8-анализа спленоциты от мышей каждой группы окрашивали на льду в течение 1 ч РЕ-связанным анти-Н2к^Ь и Е1ТС-связанным анти-Н-20'¹ с целью измерения экспрессии аллелей МНС. Спленоциты реципиента позитивны по обоим маркерам, в то время как донорские спленоциты негативны по Н-2к^Ь. Величины процентов отражают процессы в популяции лимфоцитов, что определено по параметрам прямого и бокового рассеяния.

Далее, использовали два маркера активации лимфоцитов: экспрессию СЭ69 на Вклетках В220+ и экспрессию Ь-селектина на СО4-позитивных и СО8-позитивных Тлимфоцитах. При сравнении контрольных мышей и мышей ΌΒΑ/2>Ε1, которым ничего не вводили, было отмечено увеличение доли Вклеток СЭ69+ с 2,5% до 6,2% (табл. 4). Такое возрастание количества СО69-позитивных Вклеток предотвращалось введением либо МК1 (3,3%), либо ΑΒ.Ό3 (2,1%), но не На4/8 (6,5%) (фиг. 4 и табл. 3). Данные двух экспериментов показаны в табл. 4.

Таблица 4

Группа введения	% Β220·ίΊ)69· (дважды позитивных) клеток
Эксперимент 1	Эксперимент 2	Среднее
Ρ1>Ρ1 (контроль)	2,5	2,0	2,25
ΏΒΑ/2>Ρ1, без введения	6,2	5,5	5,9
Ι)ΒΑ 2 1Ί, введено На4/8	6,5	4,7	5,6
Ι)ΒΑ 2 1Ί, введено МК.1	3,3	н/опр.	3,3
ΏΒΑ/2ΑΡ1, введено ΑΒ.Ώ3	2,1	3,2	2,65

Спленоциты окрашивали РЕ-меченным анти-В220 и Е1ТС-меченным анти-С069 в течение 1 ч на льду, промывали в ЕАС8-буфере и затем анализировали. Проценты основаны на событиях, имеющихся в популяции лимфоцитов, что определено по параметрам прямого и бокового рассеяния.

Для изучения секреции 1д ίη νίΐτο анализ методом ТИФА проводили на материале надосадочных фракций клеточных культур спленоцитов, происходящих от селезенок, взятых в группах с различными введениями. В табл. 5 приведены результаты второго эксперимента средние по 3 мышам из каждой группы. Введение МВ1 или ΑΒ.Ό3 предотвращало 4-6-кратное увеличение спонтанной выработки 1дС, выявленное в группах ΌΒΑ/2>Ε1, которым не вводили ничего или вводили На4/8.

Таблица 5

Группа введения	Спонтанная выработка 1«(.г ίη νίΐτο
Ρ1>Ρ1 (контроль)	125 нг/мл±20 нг/мл
ΏΒΑ/2>Ρ1, без введения	750 нг/мл±65 нг/мл
ΏΒΑ/2>Ρ1, введено На4/8	500 нг/мл±150 нг/мл
ΏΒΑ/2>Ρ1, введено МК1	0
ΏΒΑ/2>Ρ1, введено ΑΒ.Ώ3	125 нг/мл±20 нг/мл

Для анализа секреции 1д ίη νίΐτο клетки пеллетировали и ресуспендировали в среде ΌΜΕΜ, содержащей 10% плодной телячьей сыворотки (ПТС) и 4 мМ глутамина, в концентрации 1х10⁷ клеток на 1 мл. По 1 мл на лунку распределяли на 6-луночных планшетах. Клеточные надосадочные фракции выделяли через 24 ч. Величины представляют собой средние по 2 лункам на 1 мышь, причем по 3 мыши представляли каждую из групп введения.

Список последовательностей <110> ΒΙΟΟΕΝ 1пс.

<120> Реагенты, которые модифицируют активность ТМЕАК, и их применение в качестве терапевтических средств для лечения иммунологических заболеваний <130> А068РСТ <140> РСТ/и5 00/01044 <141> 14 января 2000 г.

<150> 60/116168 <151> 15 января 1999 г.

<160> 2 <170> РаДепЫп уег. 2.0 <210> 1 <211> 225 <212> белок <213> мышь <400> 1

Уа1 Ьеи Зег Ьеи СХу

Ьеи АХа

Ьеи

А1а Суз Ьеи О1у Ьеи Ьеи Ьеи Уа1

1

5

10

15

УаХ

Зег

Ьеи

С1у

Зег

Тгр

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

А1а

СХп

СХи

Рго

Зег

20

25

30

СХп

СХи

Ьеи

ТЬг

А1а

СХи

Азр

Агд

СХи

Рго

СХи

Ьеи

Авп

35

40

45

Рго

С1п

ТЬг

С1и

СХи

Зег

СХп

Азр

УаХ

Уа1

Рго

РЬе

Ьеи

С1и

СХп

Ьеи

50

55

60

Уа1

Агд

Рго

Агд

Зег

АХа

Рго

Ьув

СХу

Агд

Ьув

АХа

Агд

Рго

Агд

65

70

75

80

Агд

А1а

Не

А1а

АХа

Н1з

Туг

СХи

УаХ

Ηίβ

Рго

Агд

Рго

СХу

СХп

Аар

85

90

95

СХу

АХа

СХп

АХа

СХу

УаХ

Азр

СХу

ТЬг

Уа1

Зег

СХу

Тгр

СХи

ТЬг

100

105

НО

Ьуз

Не

Азп 115

Зег

Рго

Ьеи 120

Агд

Туг

Авр

Агд

С1п 125

Не

С1у

СХи

РЬе

ТЬг

УаХ

Не

Агд

АХа

СХу

Ьеи

Туг

Ьеи

Туг

Суз

СХп

УаХ

ΗΪ8

130

135

140

РЬе

Азр

СХи

СХу

Ьуз

АХа

УаХ

Туг

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Авр

Ьеи

Уа1

Азп

145

150

155

160

С1у

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

Агд

Суз

Ьеи

С1и

СХи

РЬе

Зег

А1а

ТЬг

А1а

165

170

175

Зег

Рго

СХу

Рго

С1п

Ьеи

Агд

Ьеи

Суз

СХп

УаХ

Зег

СХу

Ьеи

180

185

190

Рго

Ьеи

Агд

Рго

СХу

Зег

Ьеи

Агд

Не

Агд

ТЬг

Ьеи

Рго

Тгр

А1а

195

200

205

Нхз

Ьеи

Ьуз

АХа

Рго

РЬе

Ьеи

ТЬг

Туг

РЬе

СХу

Ьеи

РЬе

СХп

УаХ

210 215 220

Ηίβ

225 с210> 2 с211> 249 :212> белок :213> человек

С4ОО> 2

МвЬ 1

АХа

А1а Агд Агд Зег СХп Агд Агд Агд СХу Агд Агд СХу СХи Рго

5

10

15

СХу

ТЬг

АХа

Ьеи

УаХ

Рго

Ьеи

АХа

Ьеи

СХу

Ьеи

СХу

Ьеи

АХа

Ьеи

20

25

30

АХа

Суз

Ьеи

СХу

Ьеи

А1а

УаХ

Зег

Ьеи

СХу

Зег

Агд

АХа

35

40

45

Зег

Ьеи

Зег

АХа

СХп

С1и

Рго

АХа

О1п

С1и

СХи

Ьеи

УаХ

А1а

С1и

СХи

50

55

60

Азр

С1п

Авр

Рго

Зег

С1и

Ьеи

Азп

Рго

СХп

ТЬг

СХи

С1и

Зег

СХп

Авр

70 75 80

Ьув СХу

Агд

Ьуз ТЬг Агд АХа Агд Агд АХа Не А1а АХа Ηίβ Туг СХи

100

105

110

Уа1

Ηίβ

Рго

Агд

Рго

СХу

СХп

Азр

СХу

АХа

СХп

А1а

СХу

Уа1

Азр

С Ху

115

120

125

ТЬг

УаХ

Зег

С1у

Тгр

С1и

<31и

АХа

Агд

Не

Азп

Зег

Рго

Ьеи

130

135

140

Агд

Туг

Азп

Агд

СХп

Не

СХу

СХи

РЬе

Не

УаХ

ТЬг

Агд

АХа

СХу

Ьеи

145

150

155

160

Туг

Ьеи

Туг

Сув

СХп

УаХ

Ηίβ

РЬе

Авр

СХи

СХу

Ьуз

АХа

νβΐ

Туг

165

170

175

Ьеи

Ьув

Ьеи

Авр

Ьеи

УаХ

Авр

СХу

Уа1

Ьеи

АХа

Ьеи

Агд

Сув

Ьеи

180

185

190

СХи

РЬе

Зег

АХа

ТЬг

АХа

Зег

Ьеи

СХу

Рго

С1п

Ьеи

Агд

195

200

205

Ьеи

Сув

СХп

УаХ

Зег

СХу

Ьеи

А1а

Ьеи

Агд

Рго

СХу

Зег

Ьеи

210

215

220

Агд

Не

Агд

ТЬг

Ьеи

Рго

Тгр

АХа

Ηίβ

Ьеи

Ьуз

АХа

Рго

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

ТЬг

Туг

РЬе

СХу

Ьеи

РЬе

СХп

УаХ

Ηίβ

245

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ блокировки развития, или лечения, или снижения тяжести, или проявлений заболевания «трансплантат против хозяина», или неудачной трансплантации органа в результате отторжения трансплантата у животного, подразумевающий стадию введения указанному животному фармацевтической композиции, которая содержит терапевтически эффективное количество моноклонального антитела, направленного против полипептида ТХУЕАК. являющегося членом семейства белков ΤΝΕ, и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Способ по п.1, в котором указанное моноклональное антитело, направленное против полипептида ТХУЕАК, выбрано из группы, включающей в себя (a) химерное антитело;

(b) гуманизированное антитело и (c) рекомбинантное антитело.
3. Способ по п.1, в котором животное является млекопитающим.
4. Способ по п.3, в котором млекопитающее является человеком.
5. Способ по п.1, в котором указанное заболевание «трансплантат против хозяина» или неудачная трансплантация органа вызваны иммунным ответом, опосредованным клетками ТЫ.
6. Способ по п.1, в котором указанное заболевание «трансплантат против хозяина» или неудачная трансплантация органа вызваны иммунным ответом, опосредованным клетками ТЬ2.
7. Способ по п.1, в котором указанное заболевание «трансплантат против хозяина» или неудачная трансплантация органа вызваны комбинацией иммунных ответов, опосредованных клетками ТЫ и Т112.