ES2298896T3 - Composiciones y procedimientos para el tratamiento de tumores. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado que tiene: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No: 2); o que tiene al menos un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con respecto a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (b) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 1); (c) la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 1); y (d) la secuencia codificante de longitud completa de DNA128451-2739, depositada bajo el número de acceso de ATCC PTA-618; en el que la identidad de secuencia de ácidos nucleicos se establece utilizando el programa ALIGN-2 y en el que dicho ácido nucleico se amplifica en el tumor de pulmón y/o colon.
Description
Composiciones y procedimientos para el
tratamiento de tumores.
La presente invención hace referencia a las
composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de
tumores.
Los tumores malignos (cáncer) son la segunda
causa de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades
del corazón (Boring et al., CA Cancer J Clin., 43:7
[(1993]).
El cáncer está caracterizado por un aumento en
el número de células anómalas o neoplásicas derivadas de un tejido
normal que prolifera hasta formar una masa tumoral, por la invasión
de los tejidos adyacentes por estas células neoplásicas tumorales,
y por la generación de células malignas que eventualmente se
propagan por la sangre o el sistema linfático a los nódulos
linfáticos regionales y los sitios distantes (metástasis). En un
estado canceroso, una célula prolifera en condiciones tales, en las
que una célula normal no crecería. El cáncer se manifiesta en una
gran variedad de formas que se caracterizan por grados distintos de
invasión y agresividad.
La alteración en la expresión génica está
íntimamente relacionada con el crecimiento celular incontrolado y
la re-diferenciación que es una característica común
de todos los cánceres. Los genomas de ciertos tumores bien
estudiados han demostrado presentar una expresión disminuida de
genes recesivos, referidos generalmente como genes supresores de
tumores, que normalmente funcionan para prevenir el crecimiento de
las células malignas, y/o la sobreexpresión de ciertos genes
dominantes, como los oncogenes, que actúan para promover el
crecimiento maligno. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser
responsable de aportar algunas de estas características que, en
conjunto, representan el fenotipo neoplásico completo (Hunter, Cell,
64:1129 [1991] y Bishop, Cell, 64:235-248
[1991]).
Un mecanismo bien conocido de la sobreexpresión
(por ejemplo de un oncogen) en las células cancerosas es la
amplificación génica. Este es un proceso que implica la replicación
no programada de la región del cromosoma que comprende el gen,
seguido de la recombinación de los segmentos replicados en el
cromosoma (Alitalo et al., Adv. Cancer Res.,
47:235-281 [1986]). Se cree que la sobreexpresión de
genes es paralela a la amplificación génica, es decir, es
proporcional al número de copias realizadas.
Se han identificado protooncogenes que codifican
factores de crecimiento y receptores de los factores de
crecimiento, los cuales desempeñan un papel importante en la
patogénesis de diversos procesos malignos, incluyendo el cáncer de
mama. Por ejemplo, se ha hallado que el gen ErbB2 (erbB2, también
denominado her2, o c-erbB-2) que
codifica un receptor glicoproteína transmembrana de 185 KD
(p185HER2; HER) y que está relacionado con el receptor del factor
de crecimiento epitelial EGFR) se sobreexpresa en aproximadamente el
25%-30% de cánceres de mama (Slamon et al., Science,
235:177-182 [1987]; Slamon et al., Science,
244:707-712 [1989]).
Se ha publicado que la amplificación génica de
un proto-oncogen es un evento típicamente implicado
en las formas más malignas de cáncer, y podría actuar como un
predictor del resultado clínico (Schwab et al., Genes
Chromosomes Cancer, 1:181-193 [1990]; Alitalo et
al., supra). Por ello, la sobreexpresión de erbB2 se
considera generalmente como un indicador de mal pronóstico,
especialmente en pacientes con enfermedad primaria que implica los
nódulos linfáticos axilares (Slamon et al., [1987] y [1989],
supra; Ravdin y Chamness, Gene, 159:19-27
[1995]; y Hynes y Stern, Biochim. Biophys. Acta,
1198:165-184 [1994]), y que se ha relacionado con
la sensibilidad y/o resistencia a la terapia hormonal y los
regímenes de terapia y quimioterapia, incluyendo el CMF
(ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracil) y las antraciclinas
(Baselga et al., Oncology, 11 (3, Suppl.
43-48 [1997]). Sin embargo, a pesar de la asociación
de la sobreexpresión de erbB2 con un pronóstico pobre, la
probabilidad de mejoría en los pacientes HER2 positivos que
responden clínicamente al tratamiento con taxanos fue tres veces
superior a la de los pacientes HER-2 negativos
(ibid). Un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2
(anti-HER) humanizado recombinante (una versión
humanizada del anticuerpo anti-ErbB2 murino, 4D5,
referido como rhuMAb HER2 o Herceptina^{TM}) ha sido activo
clínicamente en pacientes con cáncer de mama metastásico que
sobreexpresan ErbB2 y que habían recibido con anterioridad una
terapia anticancerosa extensa. (Baselga et al., J. Clin.
Oncol., 14:737-744
[1996]).
[1996]).
A la luz de los apartados anteriores, existe un
interés obvio en la identificación de nuevos procedimientos y
composiciones que sean de utilidad para el diagnóstico y tratamiento
de tumores, que estén asociados con la amplificación génica.
La presente invención se refiere a composiciones
y procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento del
crecimiento y proliferación de células neoplásicas en mamíferos,
incluyendo humanos. La presente invención se basa en la
identificación de genes que se amplifican en el genoma de células
tumorales. Dicha amplificación de genes se espera que esté asociada
con la sobreexpresión del producto génico y contribuya a la
tumorigénesis. Por consiguiente, las proteínas codificadas por los
genes amplificados se creen que son dianas útiles para el
diagnóstico y/o el tratamiento (incluyendo la prevención) de ciertos
cánceres y pueden actuar como factores de predicción del pronóstico
del tratamiento de tumores.
En una realización, la presente invención se
refiere a un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido
desigando en la presente invención como polipéptido PRO7133. En un
aspecto, el anticuerpo aislado se une específicamente a un
polipéptido PRO7133. A menudo, una célula que expresa el polipéptido
PRO7133 es una célula tumoral que sobreexpresa el polipéptido en
comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. En aún
otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, que
preferiblemente tiene residuos de una región determinante de
complementariedad (CDR) no humana y residuos de una región
estructural (FR) humana. El anticuerpo puede estar marcado y puede
inmovilizarse en un soporte sólido. En aún otro aspecto, el
anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena
única, o un anticuerpo humanizado que se une, preferiblemente de
manera específica, a un polipéptido PRO7133.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una composición de materia que comprende un anticuerpo
que se une, preferiblemente de manera específica, a un polipéptido
PRO7133 en una mezcla con un portador. Preferiblemente, la
composición es estéril.
En una realización adicional, la presente
invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican anticuerpos anti-PRO7133 y vectores y
células huésped recombinantes que comprenden dichas moléculas de
ácidos nucleicos.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo
anti-PRO7133, en el que el procedimiento comprende
el cultivo de una célula huésped transformada con una molécula de
ácido nucleico que codifica el anticuerpo en condiciones suficientes
para permitir una expresión del anticuerpo y la recuperación del
anticuerpo del cultivo celular.
La presente invención permite la producción de
polipéptido PRO7133 que inhibe una o más de las funciones o
actividades biológicas y/o inmunológicas de un polipéptido
PRO7133.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que
se hibrida a una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido PRO7133 o el complemento de la misma. La molécula de
ácido nucleico aislada es preferiblemente ADN, y la hibridación
tiene lugar preferiblemente en condiciones de hibridación y lavado
astrigentes. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden actuar como
moléculas antisentido de los genes amplificados identificados en la
presente invención que, a su vez, pueden ser útiles en la
modulación de la transcripción y/o traducción de los genes
amplificados respectivamente, o como cebadores antisentido en
reacciones de amplificación. Además, dichas secuencias se pueden
utilizar como parte de una secuencia de ribozimas y/o una secuencia
de triple hélice que, a su vez, se pueden utilizar en la regulación
de genes amplificados.
En otra realización, la presente invención
proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un
polipéptido PRO7133 en una muestra sospechosa de contener un
polipéptido PRO7133, en el que el procedimiento comprende la
exposición de la muestra a un anticuerpo
anti-PRO7133 y la determinación de la unión del
anticuerpo a un polipéptido PRO7133 en la muestra. En otra
realización, la presente invención proporciona un procedimiento
para determinar la presencia de un polipéptido PRO7133 en una
célula, en el que el procedimiento comprende la exposición de la
célula a un anticuerpo anti-PRO7133 y la
determinación de la unión del anticuerpo a la célula.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un procedimiento de diagnóstico de un tumor en un
mamífero, que comprende la detección del nivel de expresión de un
gen que codifica un polipéptido PRO7133 (a) en una muestra a
analizar de células del tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una
muestra control de células de tejido normal del mismo tipo celular,
en donde un nivel de expresión superior en la muestra a analizar
respecto a la muestra control es indicativo de la presencia del
tumor en el mamífero del cual se obtienen las células procedentes
del tejido determinado.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un procedimiento de diagnóstico tumoral en un mamífero, y
comprende (a) el contacto de un anticuerpo
anti-PRO7133 con una muestra a analizar de las
células del tejido obtenido del mamífero, y (b) la detección de la
formación de un complejo entre el anticuerpo
anti-PRO7133 y un polipéptido PRO7133 en la muestra
a analizar, en donde la formación de un complejo es indicativo de la
presencia de un tumor en dicho animal. La detección puede ser
cualitativa o cuantitativa, y puede realizarse por comparación con
la monitorización de la formación del complejo en una muestra
control de células de tejido normal conocido del mismo tipo
celular. Una gran cantidad de complejos formados en la muestra a
analizar indica la presencia del tumor en el mamífero del cual se
han obtenido las células del tejido a analizar. El anticuerpo tiene
preferentemente un marcaje detectable. La formación del complejo
puede monitorizarse, por ejemplo, mediante microscopía, citometría
de flujo, fluorimetría, u otras técnicas conocidas en la
materia.
La muestra a analizar se obtiene generalmente de
un individuo sospechoso de presentar un crecimiento o proliferación
de células neoplásicsas (por ejemplo, células cancerosas).
En otra realización, la presente invención hace
referencia a un equipo de diagnóstico para el cáncer que comprende
un anticuerpo anti-PRO7133 y un portador (por
ejemplo un tampón) empaquetados de forma adecuada. El equipo
contiene preferentemente las instrucciones para utilizar el
anticuerpo con el fin de detectar la presencia de un polipéptido
PRO7133 en una muestra sospechosa de contener el mismo.
En otras realizaciones de la presente invención,
la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico
aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido PRO7133.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico
comprende una secuencia nucleotídica que tiene por lo menos el 80%
de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 81% de
identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 82% de
identidad de secuencia, aún más preferentemente al menos un 83% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 84%
de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un
85% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos
un 86% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al
menos un 87% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
al menos un 88% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente al menos un 89% de identidad de secuencia, todavía
más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente al menos un 91% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente al menos un 92% de identidad
de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 93% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 94%
de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un
95% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos
un 96% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al
menos un 97% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
al menos un 98% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente al menos un 99% de identidad de secuencia con (a)
una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO7133 con una
secuencia aminoacídica completa tal como se describe aquí, una
secuencia aminoacídica carente del péptido señal tal como se
describe aquí, un dominio extracelular de una proteína
transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe
aquí o cualquier otro fragmento definido específicamente de la
secuencia aminoacídica completa tal como se describe aquí, o (b) el
complemento de la molécula de ADN de (a).
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende una secuencia nucleotídica con al menos un 80% de
identidad de secuencia, preferentemente con al menos un 81% de
identidad de secuencia, más preferentemente con al menos un 82% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
83% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 84% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 85% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 86% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 87% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 88% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
89% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 90% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 91% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 92% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 93% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 94% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
95% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 96% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 97% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 98% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 99% de identidad de
secuencia con (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia
codificante de un ADNc de un polipéptido de longitud completa
PRO7133 tal como se describe aquí, la secuencia codificante de un
polipéptido PRO7133 carente del péptido señal tal como se describe
aquí, la secuencia codificante de un dominio extracelular de un
polipéptido transmembrana PRO7133, con o sin el péptido señal, tal
como se describe aquí o la secuencia codificante de cualquier otro
fragmento específicamente definido de la secuencia aminoacídica de
longitud completa, tal como se describe aquí, o (b) la
complementaria de la molécula de ADN de (a).
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 80% de
identidad de secuencia, preferiblemente con al menos
aproximadamente un 81% de identidad de secuencia, más
preferiblemente con al menos aproximadamente un 82% de identidad de
secuencia, todavía más preferiblemente con al menos aproximadamente
un 83% de identidad de secuencia, todavía más preferiblemente con al
menos aproximadamente un 84% de identidad de secuencia, todavía más
preferiblemente con al menos aproximadamente un 85% de identidad de
secuencia, todavía más preferiblemente con al menos aproximadamente
un 86% de identidad de secuencia, todavía más preferiblemente con
al menos aproximadamente un 87% de identidad de secuencia, todavía
más preferiblemente con al menos aproximadamente un 88% de
identidad de secuencia, todavía más preferiblemente con al menos
aproximadamente un 89% de identidad de secuencia, todavía más
preferiblemente con al menos aproximadamente un 90% de identidad de
secuencia, todavía más preferiblemente con al menos aproximadamente
un 91% de identidad de secuencia, todavía más preferiblemente con
al menos aproximadamente un 92% de identidad de secuencia, todavía
más preferiblemente con al menos aproximadamente un 93% de
identidad de secuencia, todavía más preferiblemente con al menos
aproximadamente un 94% de identidad de secuencia, todavía más
preferiblemente con al menos aproximadamente un 95% de identidad de
secuencia, todavía más preferiblemente con al menos aproximadamente
un 96% de identidad de secuencia, todavía más preferiblemente con
al menos aproximadamente un 97% de identidad de secuencia, todavía
más preferiblemente con al menos aproximadamente un 98% de
identidad de secuencia, y todavía más preferiblemente con al menos
aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con (a) una
molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado
por cualquier ADNc de proteína humana depositado en el ATCC tal
como se describe en la presente invención, o (b) el complemento de
la molécula de ADN de (a).
Otro aspecto de la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO7133 al
que se ha eliminado el dominio transmembrana o bien, se ha
inactivado el dominio transmembrana, o es complementaria a dicha
secuencia de nucleótidos codificante, en la que el dominio o
dominios transmembrana de dicho polipéptido se describen en la
presente invención. Por lo tanto, se contemplan los dominios
extracelulares solubles de los polipéptidos PRO7133 descritos en la
presente invención.
Otra realización se refiere a fragmentos de una
secuencia codificante del polipéptido PRO7133, o de la
complementaria de la misma, que se pueden utilizar como, por
ejemplo, sondas de hibridación, para los fragmentos codificantes de
un polipéptido PRO7133 que pueden opcionalmente codificar un
polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo
anti-PRO7133 o como sondas de oligonucleótidos
antisentido. Dichos fragmentos de ácido nucleico son generalmente
de al menos aproximadamente unos 20 nucleótidos de longitud,
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 30 nucleótidos de
longitud, más preferiblemente de al menos aproximadamente unos 40
nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al menos
aproximadamente unos 50 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 60 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 70 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente unos 80 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 90 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 100 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente unos 110 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 120 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 130 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente unos 140 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 150 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 160 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente unos 170 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 180 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 190 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente unos 200 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 250 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 300 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente unos 350 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 400 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos unos
aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos unos aproximadamente 500 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos unos
aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 700 nucleótidos de
longitud, todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente
unos 800 nucleótidos de longitud, todavía más preferiblemente de al
menos unos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, todavía más
preferiblemente de al menos aproximadamente unos 1000 nucleótidos de
longitud, en donde en este contexto el término
"aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de
nucleótidos a la que se hace referencia más o menos el 10% de la
longitud de referencia. Cabe indicar que los fragmentos nuevos de
una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PRO7133
pueden determinarse de forma rutinaria mediante el alineamiento de
la secuencia de nucléotidos que codifica el polipéptido PRO7133 con
otras secuencias de nucleótidos conocidas mediante la utilización
de cualquiera de los programas de alineamiento de secuencia
conocidos y la determinación de qué fragmentos de secuencia de
nucleótidos codificante del polipéptido PRO7133 son nuevos. Todas
dichas secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido
PRO7133 se contemplan en la presente invención. También se
contemplan los fragmentos del polipéptido PRO7133 codificados por
estos fragmentos de moléculas de nucleótidos, preferiblemente
aquellos fragmentos de polipéptido PRO7133 que comprenden un sitio
de unión para un anticuerpo anti-PRO7133.
En otra realización, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO7133 aislado codificado por
cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas
identificadas anteriormente en la presente invención.
En un determinado aspecto, la invención hace
referencia a un polipéptido PRO7133 aislado, que comprende una
secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de identidad de
secuencia, preferentemente con al menos un 81% de identidad de
secuencia, más preferentemente con al menos un 82% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 83% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
84% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 85% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 86% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 87% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 88% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 89% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
90% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 91% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 92% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 93% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 94% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 95% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
96% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 97% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 98% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 99% de identidad de secuencia con
un polipéptido PRO7133 que tiene una secuencia aminoacídica de
longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia
aminoacídica carente del péptido señal tal como se describe aquí,
un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el
péptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento
definido específicamente de secuencia aminoacídica de longitud
completa tal como se describe aquí. En otro aspecto, la invención
hace referencia a un polipéptido PRO7133 aislado que comprende una
secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de identidad de
secuencia, preferentemente con al menos un 81% de identidad de
secuencia, más preferentemente con al menos un 82% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 83% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
84% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 85% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 86% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 87% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 88% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 89% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
90% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 91% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 92% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 93% de identidad de secuencia,
todavía más preferentemente con al menos un 94% de identidad de
secuencia, todavía más preferentemente con al menos un 95% de
identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al menos un
96% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente con al
menos un 97% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente
con al menos un 98% de identidad de secuencia, todavía más
preferentemente con al menos un 99% de identidad de secuencia con
una secuencia aminoacídica codificada por cualquiera de los ADNcs
de proteínas humanas depositados en el ATCC tal como se describe
aquí.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
un polipéptido PRO7133 aislado que comprende una secuencia
aminoacídica que presenta una valoración de al menos un 80% de
valores positivos, preferentemente al menos un 81% de positivos,
más preferentemente al menos un 82% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 83% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 84% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 85% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 86% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 87% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 88% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 89% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 90% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 91% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 92% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 93% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 94% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 95% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 96% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 97% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 98% de positivos, todavía más
preferentemente al menos un 99% de positivos cuando se compara la
secuencia aminoacídica de un polipéptido PRO7133 que tiene una
secuencia aminoacídica de longitud completa tal como se describe
aquí, una secuencia aminoacídica carente del péptido señal tal como
se describe aquí, un dominio extracelular de una proteína
transmembrana, con o sin un péptido señal, tal como se describe
aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de la
secuencia aminoacídica de longitud completa tal como se describe
aquí.
En un aspecto específico, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO7133 aislado sin la secuencia señal
N-terminal y/o la metionina de iniciación y está
codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha
secuencia de aminoácidos tal como se ha descrito anteriormente en la
presente invención. Los procesos para la producción del mismo
también se describe en la presente invención, donde estos procesos
comprenden el cultivo de una célula huésped que comprende un vector
el cual comprende la molécula de ácido nucleico codificante
adecuada en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido
PRO7133 y la recuperación del polipéptido PRO7133 del cultivo
celular.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un polipéptido PRO7133 aislado al que se ha eliminado
el dominio transmembrana o bien, se ha inactivado el dominio
transmembrana. Los procesos para la producción del mismo también se
describen en la presente invención, donde estos procesos comprenden
el cultivo de una célula huésped que comprende un vector el cual
comprende la molécula de ácido nucleico codificante adecuada en
condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido PRO7133 y
la recuperación del polipéptido PRO7133 del cultivo celular.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a una composición de materia que comprende un
polipéptido PRO7133 o un anticuerpo anti-PRO7133 en
combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un
portador farmacéuticamente aceptable.
En otras realizaciones de la presente invención,
la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica
cualquiera de los polipéptidos aquí descritos. También se
proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de dichos
vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células
CHO, células de E. coli, levaduras, o células de insecto
infectadas con Baculovirus. Se proporciona además un proceso
para la producción de cualquiera de los polipéptidos aquí descritos
y comprende el cultivo de células huésped en condiciones adecuadas
para la expresión del polipéptido deseado y la recuperación del
polipéptido deseado del cultivo celular.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los
polipéptidos descritos en la presente invención fusionados a un
polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. Los ejemplos de
dichas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los
polipéptidos aquí descritos fusionados con una secuencia etiquetada
con un epitopo o una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención
proporciona un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera
de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente.
Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un
anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de
cadena única.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona sondas de oligonucleótidos útiles para el aislamiento
de secuencias de nucleótidos genómicas y de ADNc o como sondas
antisentido, donde estas sondas pueden derivar de cualquiera de las
secuencias de nucleótidos descritas anterior o posteriormente.
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEC ID NO: 1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos
que codifica una secuencia nativa PRO7133, en donde la secuencia de
nucleótidos (SEC ID NO: 1) es un clon denominado en la presente
invención como DNA128451-2739. También se han
representado en negrita y subrayadas las posiciones de los codones
respectivos de inicio y de parada.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID NO: 2) de un polipéptido PRO7133 de secuencia nativa
derivado de la secuencia codificante SED ID NO: 1 que se muestra en
la Figura 1.
Los términos "amplificación génica" y
"duplicación génica" se utilizan de modo intercambiable y hacen
referencia a un proceso mediante el cual se forman copias múltiples
de un gen o de un fragmento génico en una célula o línea celular
determinada. La región duplicada (un fragmento del ADN amplificado)
es referida a menudo como "amplicón". Generalmente, la
cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de
expresión génica, también aumenta en proporción con el número de
copias generadas del gen determinado expresado.
"Tumor", tal como se utiliza aquí, hace
referencia al crecimiento de células neoplásicas y a la
proliferación, bien sea maligno o benigno, y a todas las células y
tejidos precancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso"
hacen referencia a, o describen la condición fisiológica en los
mamíferos que se caracteriza por un crecimiento celular no regulado.
Ejemplos de cáncer incluyen, aunque no se limitan a éstos, el
carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma, y la leucemia.
Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen el cáncer de
mama, de próstata, de colon, el cáncer de células escamosas, de
células pequeñas de pulmón, de células no pequeñas de pulmón, el
cáncer gastrointestinal, el pancreático, el glioblastoma, el
cervical, el ovárico, el hepático, el renal, el hepatoma, el
colorectal, el carcinoma endometrial, el carcinoma de glándulas
salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de riñón, el cáncer de
vulva, el de tiroides, el carcinoma hepático, y diversos tipos de
cáncer de cabeza y cuello.
El término "tratamiento" es una
intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o
la alteración de la patología de una enfermedad. Según ello,
"tratamiento" hace referencia tanto al tratamiento terapéutico
como al profiláctico o a sus medidas preventivas. Aquellos que
necesiten un tratamiento incluyen los que ya han desarrollado el
trastorno y en los que se prevé su aparición. En el tratamiento de
un tumor (por ejemplo un cáncer), un agente terapéutico puede
disminuir directamente la patología de las células tumorales, o
convertir el tumor en más susceptible al tratamiento por otros
agentes terapéuticos, por ejemplo, la radiación y/o la
quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todos los
fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Ello incluye,
sin limitación, el crecimiento anómalo o incontrolado de la célula,
la metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de las
células vecinas, la liberación de citocinas u otros productos
secretores a niveles anómalos, la supresión o la agravación de la
respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
El término "mamífero" con el propósito de
tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de
granja, del zoo, los animales deportivos o los animales de
compañía, como los perros, caballos, gatos, vacas, cerdos, ovejas,
etc. Preferentemente, el mamífero es el hombre.
"Portadors" tal como se utiliza aquí,
incluyen los portadors farmacéuticamente aceptables, los
excipientes, o los estabilizantes que no son tóxicos a la célula o
al mamífero que se expone a dicho portador a las dosificaciones y
concentraciones utilizadas. A menudo, el portador fisiológicamente
aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Ejemplos de
portadors aceptables fisiológicamente incluyen tampones como los
fosfatos, el citrato, y otros ácido orgánicos; los antioxidantes
incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular
(inferiores a 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la
gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la
asparragina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y
otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las
dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de
azúcar como el manitol o el sorbitol; los iones contrarrestadores
formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos
como el TWEEN^{TM}, el polietilén glicol (PEG) y el
PLURONICS^{TM}.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos incluyen la administración simultánea
(a la vez) y consecutiva en cualquier orden.
El término "agente citotóxico" tal como se
utiliza aquí hace referencia a una sustancia que inhibe o previene
la función de las células y/o causa la destrucción de las células.
El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo,
I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes
quimioterapéuticos, y toxinas como las toxinas activas
enzimáticamente derivadas de bacterias, hongos, plantas o animales o
fragmentos de lo mismo.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de
agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, la doxorubicina,
el 5-fluorouracilo, la citosina arabinósido
("Ara-C"), la ciclofosfamida, el tiotepa, el
busulfán, el citoxín, los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel
(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ), y el doxetaxel (Taxotere, Rhone-PoulencRorer,
Antony, Francia), el toxotere, el metotrexato, la cisplatina, el
melfalan, la vinblastina, la bleomicina, el etoposido, la
ifosfamida, la mitomicina C, el mitoxantreno, la vincristina, la
vinorelbina, la carboplatina, el tenipósido, la dauromicina, la
carminomicina, la aminopterina, la dactinomicina, las mitomicinas,
las esperamicinas (véase la patente americana 4.675.187),
5-FU, 6-tioguanina,
6-mercaptopurina, la actinomicina D,
VP-16, el clorambucil, el melfalan y otras mostazas
nitrogenadas. También se incluyen en esta definición, los agentes
hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de la
hormona sobre los tumores como el tamoxifeno o la onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se utiliza aquí hace referencia a un compuesto o composición
que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente de células
cancerosas que sobreexpresan cualquiera de los genes aquí
identificados, bien in vivo o in vitro. Por tanto, un
agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce el porcentaje
de las células que sobreexpresan dichos genes en la fase S. Ejemplos
de agentes inhibidores del crecimiento incluyen los agentes que
bloquean la progresión del ciclo celular (en un momento distinto a
la fase S), como los agentes que inducen un paro en fase G1 y fase
M. Los bloqueantes típicos de fase M incluyen las vincas
(vincristina y vinblastina), el taxol, y los inhibidores de la topo
II como la doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido y
bleomicina. Estos agentes que bloquean en fase G1 también prolongan
su acción provocando un paro en la fase S, por ejemplo, los agentes
alquilantes del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la
dacarbazina, la mecloretamina, la cisplatina, el metotrexato, el
5-fluorouracil, y la ara-C.
Información adicional puede hallarse en The Molecular Basis of
Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell
Cycle Regulation, oncogens and antineoplastic drugs" por Murakami
et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente en
la página
13.
13.
La "doxorubicina" es un antibiótico
antraciclina. El nombre químico completo es la doxorubicina
(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-tihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,
12-naftacenediona.
12-naftacenediona.
El término "citocina" es un término
genérico para las proteínas liberadas por una población celular que
actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de
dichas citocinas son las linfocinas, las monocinas y las hormonas
polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citocinas, las
hormonas del crecimiento como la hormona del crecimiento humano, la
hormona N-metionil del crecimiento humano y la
hormona del crecimiento bovino; la hormona paratiroidea; la
tiroxina; la insulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas
glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (HSF), la
hormona estimulante del tiroides (HST), y la hormona luteinizante
(HL); el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento de
fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placental; el factor de
crecimiento de fibroblastos; el factor-\alpha y el
\beta de necrosis tumoral; la sustancia inhibidora mülleriana; el
péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la
activina; el factor endotelial vascular; la integrina; la
trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso como el
NGF-\beta; el factor de crecimiento de plaquetas;
los factores de crecimiento transformantes (TGFs) como el
TGF-\alpha y el TGF-\beta; el
factor de crecimiento de tipo insulina-I y -II; la
eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; los interferones
como el interferón \alpha, \beta y \gamma, los factores
estimuladores de colonias (CSFs) como el CSF de macrófagos
(M-CSF); el CSF de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y
el CSF de granulocitos (G-CSF); las interleucinas
(ILs) como la IL-1, la IL-1a,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-11,
IL-12; un factor de necrosis tumoral como el
TNF-\alpha o el TNF-\beta; y
otros factores polipeptídicos incluyendo el LIF y el ligando del
equipo (KL). Tal como se utiliza aquí, el término citocina incluye
proteínas de fuentes naturales o del cultivo de células
recombinantes y los equivalentes biológicamente activos de las
citocinas de secuencia nativa.
El término "profármaco", tal como se
utiliza aquí en esta aplicación, hace referencia a un precursor o
derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos
citotóxica para las células tumorales comparadas con el fármaco
parental y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en
la forma parental más activa, véase, por ejemplo, Willman, Prodrugs
in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions,
14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986), y Stella
et al., Prodrugs: A Chemical approach to targeted drug
delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.)
pp. 147-267, Humana Press (1985). Los profármacos de
la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos
que contienen fosfato, tiosfosfato, sulfato, o péptidos. Los
pro-fármacos modificados por
D-aminoácidos, los profármacos glicosilados, los que
contienen \beta-lactama, opcionalmente los
sustituidos con fenoxiacetamidas u opcionalmente fenilacetamidas,
los profármacos 5-fluorocitosina y otros
5-fluorouridina que pueden convertirse en un fármaco
libre más citotóxico y activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que
pueden derivarse en profármacos para su utilización en la presente
invención, pero no se limitan a ellos, son los agentes
quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido
descrito aquí o un antagonista de lo mismo, respecto al crecimiento
de células neoplásicas, el crecimiento tumoral o el crecimiento de
una célula cancerosa, es una cantidad capaz de inhibir, en cierta
magnitud, el crecimiento de células diana. El término incluye una
cantidad capaz de invocar un efecto inhibidor, citostático y/o
citotóxico y/o apoptótico del crecimiento de las células diana. Una
"cantidad efectiva" de un antagonista del polipéptido PRO para
los propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas, el
crecimiento del tumor o el crecimiento de células cancerosas, puede
determinarse empíricamente y de forma rutinaria.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva",
respecto al tratamiento del tumor, se refiere a una cantidad capaz
de provocar uno o más de los efectos siguientes: (1) inhibición, en
cierta magnitud, del crecimiento tumoral, incluyendo, la
ralentización y el completo paro del crecimiento; (2) la reducción
en el número de células tumorales; (3) la reducción en el tamaño
del tumor; (4) la inhibición (es decir, la reducción, la
ralentización o el completo paro) de la infiltración de células
tumorales en los órganos periféricos; (5) la inhibición (es decir,
la reducción, la ralentización o el completo paro del crecimiento)
de metástasis; (6) aumento de la respuesta inmune
anti-tumoral, lo cual puede, aunque no es requisito,
dar como resultado la regresión o el rechazo del tumor; y/o (7)
alivio, en cierta magnitud, de uno o más síntomas asociados con el
trastorno. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un
antagonista del polipéptido PRO7133 para propósitos de tratamiento
del tumor puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento"
de un antagonista de PRO es una cantidad capaz de inhibir el
crecimiento de una célula, por ejemplo, célula cancerosa, bien in
vivo o in vitro. Una "cantidad inhibidora del
crecimiento" de un antagonista de PRO con el propósito de inhibir
el crecimiento de una célula neoplásica puede determinarse
empíricamente y de forma rutinaria.
Una "cantidad citotóxica" de un antagonista
de PRO es una cantidad capaz de causar la destrucción de una
célula, especialmente tumoral, por ejemplo las células cancerosas,
ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad
citotóxica" de un antagonista de PRO con el propósito de inhibir
el crecimiento de una célula neoplásica puede determinarse
empíricamente y de forma rutinaria.
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO"
tal como se utilizan aquí y cuando se prosiguen inmediatamente por
una denominación numérica hacen referencia a diversos polipéptidos,
en donde la denominación completa (es decir, PRO/número) hace
referencia a secuencias polipeptídicas específicas tal como se
describe aquí. Los términos "polipéptido PRO/número" y
"PRO/número" en donde el término "número", que se
proporciona como una denominación numérica real tal como se utiliza
aquí, abarca los polipéptidos de secuencia nativa y las variantes
polipeptídicas (que se describen más adelante en la presente
invención). Los polipéptidos PRO descritos aquí pueden aislarse de
diversas fuentes, tales como tejidos humanos varios o de otras
fuentes, o prepararse mediante procedimientos recombinantes o
sintéticos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoacídica
que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza.
Dichos polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden aislarse de la
naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o
sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa"
abarca específicamente las formas truncadas o secretadas de la
naturaleza del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una
secuencia de dominio extracelular), formas variantes de la
naturaleza (por ejemplo, formas ayustadas alternativamente) y
variantes alélicas que ocurren de forma natural. En varias
realizaciones de la invención, los polipéptidos PRO de secuencia
nativa descritos aquí son polipéptidos de secuencia madura o nativa
de longitud completa que comprenden las secuencias aminoacídicas de
longitud completa que se muestran en las figuras acompañantes. Los
codones de inicio y parada se muestran en negrita y en subrayado en
las figuras. Sin embargo, mientras que el polipéptido PRO descrito
en las figuras acompañantes se inicia en los residuos metionina
denominados aquí como aminoácido en la posición 1 en las figuras, es
posible que otros residuos metionina localizados cadena arriba o
cadena abajo de la posición 1 aminoacídica en las figuras puedan
utilizarse como el residuos aminoacídico de los polipéptidos
PRO.
El "dominio extracelular" del polipéptido
PRO o "variante extracelular" o "ECD" hace referencia a
una forma del polipéptido PRO que carece de los dominios
transmembrana y citoplasmático. Generalmente, un ECD del
polipéptido PRO tendrá menos del 1% de dichos dominios transmembrana
y/o citoplasmático y preferentemente, tendrá menos del 0,5% de
dichos dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembrana
identificado para los polipéptidos PRO de la presente invención se
identifican siguiendo los criterios utilizados habitualmente en la
materia para la identificación del tipo de dominio hidrofóbico. Los
límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero en
no más de 5 aminoácidos por cada extremo del dominio tal como
inicialmente se identificó aquí. Opcionalmente, un dominio
extracelular de un polipéptido PRO puede contener desde
aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cada extremo de los
límites del dominio transmembrana/dominio extracelular tal como se
identifica en los Ejemplos o especificaciones y dichos polipéptidos,
con o sin el péptido señal asociado, y el ácido nucleico que los
codifica, están contemplados por la presente invención.
La localización aproximada del "péptido
señal" de diversos polipéptidos PRO descritos aquí se muestran
en la presente memoria y/o las figuras acompañantes. Se ha de
remarcar, sin embargo, que el límite C-terminal de
un péptido señal puede variar, pero en no más de 5 aminoácidos en
cualquiera de los extremos del C-terminal del
péptido señal tal como se identificó inicialmente aquí, en donde el
límite C-terminal del péptido señal puede
identificarse según un criterio utilizado de forma rutinaria en la
materia para identificar el tipo de elemento de secuencia
aminoacídica (por ejemplo, Nielsen et al., Prot Eng,
10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl
Acids Res, 14:4683-4690 (1986)). Además, también se
ha reconocido, que en algunos casos, el corte de una secuencia
señal de un polipéptido secretado no es totalmente uniforme, dando
como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos
maduros, cuando su péptido señal se corta en no más de 5 aminoácidos
por cualquier lado del límite C-terminal del
péptido señal identificado aquí, y los polinucleótidos que los
codifican, están contemplados por la presente invención.
"Variante de polipéptido PRO" significa un
polipéptido PRO activo tal como se define más arriba o más adelante
que tiene por lo menos el 80% de identidad de secuencia con una
secuencia nativa de longitud completa tal como se describe aquí,
una secuencia de polipéptido PRO carente de la secuencia señal tal
como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido
PRO, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí, un
dominio extracelular de un polipéptido PRO tal como se describe
aquí. Dichas variantes de polipéptido PRO incluyen, por ejemplo,
los polipéptidos PRO en donde uno o más residuos aminoacídicos se
añaden, o delecionan, en el extremo N- o C-terminal
de la secuencia aminoacídica nativa de longitud completa.
Generalmente, una variante de polipéptido PRO tendrá al menos un
80% de identidad de secuencia aminoacídica, preferentemente al
menos un 81% de identidad de secuencia aminoacídica, más
preferentemente al menos un 82% de identidad de secuencia
aminoacídica, más preferentemente al menos un 83% de identidad de
secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos un 84% de
identidad de secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos un
85% de identidad de secuencia aminoacídica, más preferentemente al
menos un 86% de identidad de secuencia aminoacídica, más
preferentemente al menos un 87% de identidad de secuencia
aminoacídica, más preferentemente al menos un 88% de identidad de
secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos un 89% de
identidad de secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos
un 90% de identidad de secuencia aminoacídica, más preferentemente
al menos un 91% de identidad de secuencia aminoacídica, más
preferentemente al menos un 92% de identidad de secuencia
aminoacídica, más preferentemente al menos un 93% de identidad de
secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos un 94% de
identidad de secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos
un 95% de identidad de secuencia aminoacídica, más preferentemente
al menos un 96% de identidad de secuencia aminoacídica, más
preferentemente al menos un 97% de identidad de secuencia
aminoacídica, más preferentemente al menos un 98% de identidad de
secuencia aminoacídica, más preferentemente al menos un 99% de
identidad de secuencia aminoacídica con una secuencia de un
polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal como
se describe aquí, una secuencia de polipéptido PRO carente de un
péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de
un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se
describe aquí o cualquier otro fragmento definido específicamente de
una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se
describe aquí. Generalmente, los polipéptidos variantes de PRO
tienen una longitud de al menos 10 aminoácidos, a menudo de por lo
menos 20 aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos 30
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos 30 aminoácidos
de longitud, más a menudo de por lo menos 40 aminoácidos de
longitud, más a menudo de por lo menos 50 aminoácidos de longitud,
más a menudo de por lo menos 60 aminoácidos de longitud, más a
menudo de por lo menos 70 aminoácidos de longitud, más a menudo de
por lo menos 80 aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo
menos 90 aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos 100
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos 150
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos 200
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos 300
aminoácidos de longitud, o más.
Tal como se muestra más adelante, la Tabla 1
proporciona el código de fuente completo para el programa
informático de comparación de secuencias por
ALIGN-2. Este código de fuente puede ser recopilado
para utilizarse en un sistema operativo UNIX para proporcionar el
programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2.
Además, las tablas 2A-2D
muestran las ejemplificaciones hipotéticas para utilizar el
procedimiento descrito más abajo para la determinación del % de
identidad de secuencia aminoacídica (tablas 2A-2B) y
el % de identidad de secuencia de ácido nucleico (Tablas
2C-2D) mediante la utilización del programa
informático de comparación de secuencias ALIGN-2,
en donde "PRO" representa la secuencia aminoacídica de un
polipéptido hipotético PRO de interés. "Proteína de
comparación" representa la secuencia aminoacídica de un
polipéptido con la que se compara el polipéptido "PRO" de
interés. "PRO-ADN" representa una secuencia
hipotética de ácido nucleico codificante de PRO de interés. "ADN
de comparación" representa la secuencia nucleotídica de una
molécula de ácido nucleico con la que se compara la molécula de
ácido nucleico "PRO-ADN" de interés, las letras
"X", "Y" y "Z" representan cada una los residuos
aminoacídicos hipotéticos distintos y "N", "L" y "V"
los nucleótidos hipotéticos distintos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Porcentaje (%) de "identidad de secuencia
aminoacídica" respecto a las secuencias polipéptidicas PRO
identificadas aquí se define como el porcentaje de residuos
aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos con los
residuos de una secuencia PRO, después del alineamiento de las
secuencias y la introducción de huecos, si fuera necesario, para
lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin
considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de
la identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de
determinar el porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica
puede lograrse de diversas maneras bien conocidas por los expertos
en la materia, por ejemplo, mediante la utilización de un programa
informático de disponibilidad pública como el BLAST,
BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, o el
programa Megalign (ADNSTAR). Los expertos en la materia pueden
determinar los parámetros adecuados para cuantificar el alineamiento
incluyendo los algoritmos que se requieran para lograr el máximo
alineamiento a lo largo de las secuencias de longitud completa que
se compararan. Para los propósitos de la presente invención, los
valores de identidad de secuencia aminoacídica en % se obtienen tal
como se describe más adelante mediante la utilización de un programa
informático de comparación de secuencias ALIGN-2,
en donde el código fuente completo para el programa
ALIGN-2 se proporciona en la
Tabla-1. El programa informático de comparación de
secuencias ALIGN-2 fue realizado por Genentech,
Inc., y el código fuente que se muestra en la Tabla 1 se ha
rellenado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos
de Autor de U.S., Washington D.C., 20559, en donde se ha registrado
con el No. TXU510087. El programa ALIGN-2 es de
disponibilidad pública gracias a Genentech, Inc., South San
Francisco, California o puede editarse a partir del código fuente
proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2
debería editarse para utilizarse en un sistema operativo UNIX,
preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de
comparación de secuencias están determinados por el programa
ALIGN-2 y no varían.
Para los propósitos de la presente invención, el
% de identidad de secuencia aminoacídica de una secuencia
aminoacídica dada A respecto a o, o con, una secuencia aminoacídica
dada B (que alternativamente puede formularse como una secuencia
aminoacídica dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad
de secuencia aminoacídica respecto a, con, una secuencia
aminoacídica dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 veces la fracción
X/Y
Donde X es el número de residuos
aminoacídicos valorados con una concordancia completa por el
programa ALIGN-2 de alineamiento de secuencias, en
donde se alinean A y B e Y es el número total de residuos
aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia
aminoacídica A no es igual a la de B, el % de identidad de
secuencia aminoacídica de A respecto a B no será igual al % de
identidad de secuencia aminoacídica de B respecto a A. Como
ejemplos de % cálculos de identidad de secuencia aminoacídica, en
las Tablas 2A-2B se demuestra cómo calcular el % de
identidad de secuencia aminoacídica de la secuencia aminoacídica
denominada "Proteína de Comparación" respecto a la secuencia
aminoacídica denominada
"PRO".
Salvo que se especifique lo contrario, todos los
valores en % de identidad de secuencia aminoacídica utilizados aquí
se obtuvieron tal como se describió anteriormente mediante la
utilización del programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia
aminoacídica también puede determinarse mediante la utilización de
un programa de comparación NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias
NCBI-NLAST2 puede descargarse de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCBI-BLAS2
utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos estos
parámetros de búsqueda están determinados a ciertos valores por
defecto que incluyen, por ejemplo, no enmascarar (unmask) =
si, cadena (strand) = todas, ocurrencias esperadas
(occurrences expected)= 10, longitud mínima de complejidad
baja (minimum low complexity length) = 15/5,
multipases valor-e (multi-pass
e-value) = 0,01, constante para multipase
(multi-pass) = 25, declinar gradualmente
(dropoff for final gapped alignment) para el alineamiento
con huecos final = 25 y matriz de valoración (scoring matrix)
= BLOSUM62.
En situaciones en donde se utilice
NCBI-BLAST2 para la comparación de secuencias
aminoacídicas, el % de identidad de secuencia aminoacídica de una
secuencia aminoacídica A respecto, con, una secuencia aminoacídica
dad B (la cual puede alternativamente formularse como una secuencia
aminoacídica dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad
de secuencia aminoacídica respecto a, con, una secuencia
aminoacídica dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 veces la fracción
X/Y
Donde X es el número de residuos
aminoacídicos valorados con una concordancia completa por el
programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2
en donde se alinean las secuencias A y B, y en donde Y es el número
total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la
longitud aminoacídica de A no es igual a la de la secuencia
aminoacídica de B, el % de identidad de secuencia aminoacídica de A
respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia
aminoacídica de B respecto a
A.
Además, el % de identidad de secuencia
aminoacídica también puede determinarse mediante la utilización del
programa informático WU-BLAST-2
(Altschul et al., Methods in Enzymology,
266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros
de búsqueda de WU-BLAST-2 se ajustan
a los valores por defecto. Los no ajustados a los valores por
defecto, es decir, los parámetros ajustables, se determinan con los
valores siguientes: extensión del solapamiento (overlap
span) = 1, fracción de solapamiento (overlap fraction) =
0,125, letra del umbral (word threshold) (T) = 11, y matriz
de valoración (scoring matrix) =BLOSUM62. Para los propósitos
de la presente invención, un valor de % de identidad de secuencia
aminoacídica se determina dividiendo (a) por el número de residuos
aminoacídicos concordantes entre la secuencia aminoacídica del
polipéptido PRO de interés con una secuencia derivada del
polipéptido PRO nativo y la comparación de la secuencia aminoacídica
de interés (es decir, la secuencia contra quien se compara el
polipéptido PRO de interés que puede ser un polipéptido variante de
PRO) tal como se determina por
WU-BLAST-2 por (b) el número total
de residuos aminoacídicos del polipéptido PRO de interés. Por
ejemplo, en la presente invención "un polipéptido que comprende
una secuencia aminoacídica A que tiene, o tiene al menos un 80% de
identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica
B", la secuencia aminoacídica A es la secuencia aminoacídica de
comparación de interés y la secuencia aminoacídica B es la
secuencia aminoacídica del polipéptido PRO de
interés.
interés.
"Polipéptido variante PRO" o "secuencia
de ácido nucleico variante de PRO" quiere decir una molécula de
ácido nucleico que codifica una polipéptido PRO activo tal como se
define más adelante y que tiene por lo menos un 80% de identidad de
secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud
completa tal como se describe aquí, una secuencia de polipéptido
PRO de secuencia nativa y longitud completa carente del péptido
señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un
polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se describe
aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO
de longitud completa tal como se describe aquí. Generalmente, un
polinucleótido variante de PRO tendrá por lo menos un 80% de
identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al
menos un 81% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más
preferentemente al menos un 82% de identidad de secuencia de ácido
nucleico, más preferentemente al menos un 83% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al menos un 84% de
identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al
menos un 85% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más
preferentemente al menos un 86% de identidad de secuencia de ácido
nucleico, más preferentemente al menos un 87% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al menos un 88% de
identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al
menos un 89% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más
preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia de ácido
nucleico, más preferentemente al menos un 91% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al menos un 92% de
identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al
menos un 93% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más
preferentemente al menos un 94% de identidad de secuencia de ácido
nucleico, más preferentemente al menos un 95% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al menos un 96% de
identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al
menos un 97% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más
preferentemente al menos un 98% de identidad de secuencia de ácido
nucleico, más preferentemente al menos un 99% de identidad de
secuencia de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico que
codifica una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y
longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de
polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa carente del
péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de
un polipéptido PRO, con o sin la secuencia señal, tal como se
describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia de
polipéptido PRO de longitud completa tal como se describe aquí. Las
variantes no abarcan la secuencia nucleotídica nativa.
Generalmente, los polinucleótidos variantes de
PRO son de al menos 30 nucleótidos de longitud, a menudo de
aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos
90 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos 120
nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos 150 nucleótidos de
longitud, más a menudo de al menos 180 nucleótidos de longitud, más
a menudo de al menos 210 nucleótidos de longitud, más a menudo de
al menos 240 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos 270
nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos 300 nucleótidos
de longitud, más a menudo de al menos 450 nucleótidos de longitud,
más a menudo de al menos 600 nucleótidos de longitud, más a menudo
de al menos 900 nucleótidos de longitud, o más.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de
ácido nucleico" respecto a la secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido PRO identificada aquí se define como el
porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son
idénticos con los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido PRO, después de alinear las secuencias e
introducir los huecos, si fuera necesario, para lograr el % máximo
de identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de
determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido
nucleico puede lograrse de diversas formas que se hallan dentro del
ámbito de la materia, por ejemplo, mediante la utilización de un
programa informático disponible públicamente como BLAST,
BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, o el
programa Megalign (ADNSTAR). Los expertos en la materia pueden
determinar los parámetros adecuados para la cuantificación del
alineamiento, incluyendo cualquiera de los algoritmos que se
requieren para lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de
la secuencia a comparar. Sin embargo, para los propósitos de la
presente invención, los valores en % de identidad de secuencia de
ácido nucleico se obtienen tal como se describe más adelante
mediante la utilización del programa informático de comparación de
secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente
completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en
la Tabla 1. El programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2 se generó por Genentech Inc., y el código
fuente que se muestra en la Tabla 1 se ha rellenado con la
documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de
U.S., Washington D.C., 20559, donde se registró con el Nº
TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible
públicamente gracias a Genentech Inc., South San Francisco,
California, o puede ser editado a partir del código fuente
proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2
debería editarse para su utilización en un sistema operativo UNIX,
preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de
comparación de secuencias están determinados por el programa
ALIGN-2 y no varían.
Para los propósitos de la presente invención, el
% de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de
ácido nucleico dada C respecto a, con, una secuencia de ácido
nucleico dada D (la cual puede formularse alternativamente como una
secuencia de ácido nucleico dada C que tiene o comprende un cierto %
de identidad de secuencia de ácido nucleico con, respecto a, una
secuencia de ácido nucleico dada D) se calcula de la manera
siguiente:
100 veces el cociente
W/Z
En donde W es el número de
nucleótidos valorados como completamente concordantes por el
programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2, en
donde se alinean las secuencias C y D, y Z es el número total de
nucleótidos en D. Se apreciará que si la longitud de la secuencia
de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de
ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico
de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de
ácido nucleico de D respecto a C. En las tablas
2C-2D se muestran ejemplos del cálculo del % de
identidad de secuencia de ácido nucleico, y se demuestra cómo
calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la
secuencia de ácido nucleico denominada "ADN de comparación"
respecto a la secuencia de ácido nucleico denominada
"PRO-ADN".
Salvo que se especifique lo contrario, todos los
valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico que se
utilizan aquí se obtienen tal como se describió utilizando el
programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia
de ácido nucleico también puede determinarse mediante la
utilización del programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids
Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de
comparación de secuencias NCBI-BLAST2 puede
descargarse de http:www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda,
donde todos estos parámetros de búsqueda están determinados a
ciertos valores por defecto que incluyen, por ejemplo, no enmascarar
(unmask) = si, cadena (strand) = todas, ocurrencias
esperadas (expected occurrences) = 10, longitud mínima de
complejidad baja (minimum low complexity length) = 15/5,
multipases valor-e = 0,01, constante para multipase
(constant for multi-pass) = 25,
declinar gradualmente para el alineamiento con huecos final
(dropoff for final gapped alignment) = 25 y matriz de
valoración (scoring matrix) = BLOSUM62.
En situaciones donde NCBI-BLAST2
se utiliza para la comparación de secuencias, el % de identidad de
secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico dada
C respecto a, con, una secuencia de ácido nucleico dada D (que
alternativamente puede enunciarse como una secuencia de ácido
nucleico dad C que tiene o comprende un cierto % de identidad de
secuencia con, respecto a, una secuencia de ácido nucleico dada D)
se calcula de la manera siguiente:
100 veces el cociente
W/Z
En donde W es el número de
nucleótidos valorados como completamente concordantes por el
programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2,
en donde se alinean las secuencias C y D, y Z es el número total de
nucleótidos en D. Se apreciará que si la longitud de la secuencia
de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de
ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico
de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de
ácido nucleico de D respecto a
C.
Además, los valores del % de identidad de
secuencia de ácido nucleico también pueden generarse utilizando el
programa informático WU-BLAST-2
(Altschul et al., Methods in Enzymology,
266:460-480) (1996)). La mayoría de los parámetros
de búsqueda de WU-BLAST-2 están
ajustados a los valores por defecto. Los no ajustados a los valores
por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se determinan con
los valores siguientes: extensión del solapamiento (ovelap
span) = 1, fracción de solapamiento (overlap fraction) =
0,125, letra del umbral (word threshold) (T) = 11, y matriz
de valoración (scoring matrix) =BLOSUM62. Para los propósitos
de la presente invención, un valor de % de identidad de secuencia
de ácido nucleico se determina dividiendo (a) por el número de
nucleótidos concordantes entre la secuencia de ácido nucleico
codificante del polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia
derivada del ácido nucleico codificante del polipéptido PRO y la
molécula de ácido nucleico de interés de comparación (es decir, la
secuencia contra quien se compara la molécula de ácido nucleico
condificante del polipéptido PRO de interés, la cual puede ser un
polinucleótido PRO variante), tal como se determina por
WU-BLAST-2, por (b) el número total
de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico codificante del
polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la presente invención
"una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una
secuencia de ácido nucleico A, la cual tiene o comprende al menos un
80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la secuencia de
ácido nucleico B", la secuencia de ácido nucleico A es la
secuencia de ácido nucleico de comparación de interés y la secuencia
de ácido nucleico B es la secuencia de ácido nucleico de la
molécula de ácido nucleico codificante del polipéptido PRO de
interés.
En otras realizaciones, los polinucleótidos
variantes PRO son moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido PRO activo y que son capaces de hibridar,
preferentemente en condiciones astringentes de hibridación y
lavado, con las secuencias nucleotídicas que codifican el
polipéptido PRO de longitud completa que se muestra en la Figura 2
(SEC ID NO:2). Los polipéptidos variantes de PRO pueden ser aquellos
codificados por un polinucleótido variante PRO.
El término "positivos", en el contexto de
comparaciones de identidad de secuencia aminoacídica realizadas tal
como se describe más arriba, incluye residuos aminoacídicos en las
secuencias comparadas que no solamente son idénticos, sino que
además tienen propiedades similares. Los residuos aminoacídicos que
presentan un valor positivo respecto a un residuo aminoacídico de
interés son aquellos que son idénticos al residuo aminoacídico de
interés o son una sustitución preferida (tal como se define en la
Tabla 3 de más adelante) del residuo aminoacídico de interés.
Para el propósito de la presente invención, el %
de positivos de una secuencia aminoacídica dada A respecto a, con,
un cierto % de valores positivos respecto a, con, una secuencia
aminoacídica dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 veces la fracción
X/Y
En donde X es el número de residuos
aminoacídicos con una valoración positiva tal como se definió más
arriba por el programa de alineamiento de secuencias
ALIGN-2 en donde se alinean las secuencias A y B, e
Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará
que si la longitud de la secuencia aminoacídica A no es igual a la
longitud de la secuencia aminoacídica B, el % de positivos de A
respecto a B no será igual al % de positivos de B respecto a
A.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos aquí descritos, significa que
el polipéptido se ha identificado y separado y/o recuperado de un
componente de su entorno natural. Preferentemente, el polipéptido
aislado no presenta asociación con ninguno de los componentes
normalmente asociados en la naturaleza. Los componentes
contaminantes de su entorno natural son materiales que interfieren
típicamente con las utilizaciones diagnósticas o terapéuticas para
el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos
proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el
polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener
por lo menos 15 residuos del extremo N-terminal o de
la secuencia interna aminoacídica mediante la utilización de un
secuenciador de taza giratoria, o (2) a homogeneidad mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras o
no-reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye
polipéptidos in situ dentro de las células recombinantes, ya
que al menos un componente del entorno natural de PRO no estará
presente. Por lo general, sin embargo, el polipéptido aislado se
preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Una molécula de "ácido nucleico" que
codifica un polipéptido PRO o un ácido nucleico "aislado" que
codifica un anticuerpo PRO, es una molécula de ácido nucleico que se
identifica y separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico
contaminante con la que normalmente está asociada en la fuente
natural del ácido que codifica PRO o del ácido nucleico que
codifica anti-PRO. Preferentemente, el ácido
nucleico aislado está libre de toda asociación con cualquier
componente de los que normalmente está asociado en la naturaleza.
Una molécula de ácido nucleico que codifica PRO o una molécula de
ácido nucleico que codifica anti-PRO son distintas
tanto en la forma como en su disposición de la que se halla en la
naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se diferencian
en consecuencia de la molécula de ácido nucleico que codifica PRO, o
de la molécula de ácido nucleico que codifica
anti-PRO tal como existen en la naturaleza. Sin
embargo, una molécula de ácido nucleico aislado, que codifica un
polipéptido PRO o un anticuerpo anti-PRO incluye
moléculas de ácido nucleico y moléculas de ácido nucleico
anti-PRO contenidas en células que ordinariamente
expresan polipéptidos PRO o que expresan anticuerpos
anti-PRO, si, por ejemplo, la molécula de ácido
nucleico se halla en una localización cromosómica distinta a la de
las células naturales.
El término "secuencias control" hace
referencia a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped.
Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, incluyen
por ejemplo un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un
sitio de unión a ribosomas. Las células eucariotas son conocidas
por utilizar promotores, señales de poliadenilación e
intensificadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando se le coloca en una relación funcional con
otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN de
un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa
en la secreción del polipéptido; un promotor o un intensificador
está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está
unido operativamente a una secuencia codificante si está localizado
para facilitar la traducción. Por lo general, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen
son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la
misma fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen
porque ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en las
dianas de restricción convenientes. Si dichas dianas no existieran,
se utilizarían adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o
enlazadores de acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido amplio y abarca específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales (incluyendo antagonistas, y anticuerpos
neutralizantes), composiciones de anticuerpos
anti-PRO7133 con especificidad poliepitópica,
anticuerpos anti-PRO7133 de cadena sencilla, y
fragmentos de anticuerpos anti-PRO7133 (véase más
adelante). El término "anticuerpo monoclonal" tal como se
utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos
salvo por mutaciones posibles que ocurren en la naturaleza y que
pueden estar presentes en cantidades menores.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se determina fácilmente por el experto en la materia, y
en general es un cálculo aproximado dependiente de la longitud de la
sonda, temperatura de lavado, y concentración salina. Por lo
general, sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para
una hibridación adecuada, mientras que sondas más cortas necesitan
temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la
capacidad del ADN desnaturalizado para renaturalizarse cuando se
hallan presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo
de la temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología
deseado entre la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la
temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado,
temperaturas relativamente superiores favorecerán que las
condiciones de reacción sean más astringentes, mientras que
temperaturas inferiores favorecerán condiciones de reacción menos
astringentes. Para detalles adicionales y una explicación de la
astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers, (1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones
de astringencia elevada", tal como se define aquí, pueden
identificarse por: (1) utilizar una temperatura elevada y una fuerza
iónica baja para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico
0,015M/citrato sódico 0,0015M/sodio dodecil sulfato al 0,1% a 50ºC;
(2) utilizar un agente desnaturalizante durante la hibridación,
como la formamida, por ejemplo, formamida (v/v) al 50% con albúmina
sérica bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al
0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750
mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizar formamida al 50%,
5XSSC (NaCl 0,75M, citrato sódico 0,075M), fosfato sódico 50 mM (pH
6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5X solución de Denhardts, ADN de
esperma de salmón sonicado (50\mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de
dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2X SSC (cloruro
sódico/citrato sódico) y formamida al 50%, seguido de un lavado a
astringencia elevada que consiste en 0,1XSSC con EDTA a 55ºC.
"Condiciones de astringencia moderada"
pueden identificarse tal como se describe por Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold
Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una
solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, la
temperatura, la fuerza iónica y el % de SDS) menos astringentes que
las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones de astringencia
moderada es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una
solución que comprende: formamida al 29%, 5XSSC (NaCl 150 mM,
citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de
5X Denhardt, sulfato de dextran al 10% y ADN de esperma de salmón
desmenuzado y desnaturalizado a 20 mg/ml, seguido de lavados de los
filtros en 1XSSC a aproximadamente 35-50ºC. El
experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza
iónica, etc., tanto como sea necesario para adaptar factores como
la longitud de la sonda y otros.
El término "etiquetado epitópicamente"
cuando se utiliza aquí hace referencia a un polipéptido quimérico
que comprende un polipéptido PRO7133 fusionado con un "polipéptido
etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos
para proporcionar un epitopo contra el cual se genera un anticuerpo,
y es lo suficientemente corto para no interferir con la actividad
del polipéptido con el que se fusiona. El polipéptido etiqueta
también es preferentemente único, de modo que el anticuerpo no
reacciona de forma cruzada con otros epitopos. Los polipéptidos
etiqueta adecuados tienen por lo menos 6 residuos aminoacídicos y
generalmente se hallan entre 8 y 50 residuos aminoacídicos
(preferentemente entre 10 y 20 residuos aminoacídicos).
"Activo" o "actividad" para el
propósito de la presente invención hace referencia a la
forma(s) de los polipéptidos PRO7133 que retienen una
actividad/propiedad biológica y/o inmunológica de un polipéptido
PRO7133 nativo o que ocurre en la naturaleza, en donde
"actividad" biológica hace referencia a una función
(inhibidora o estimuladora) causada por un polipéptido PRO7133
nativo o que ocurre de forma natural distinta a la capacidad para
inducir la producción de un anticuerpo contra un epitopo antigénico
que forma parte de un polipéptido PRO7133 nativo o que ocurre de
forma natural y una actividad "inmunológica" hace referencia a
la capacidad para inducir un anticuerpo contra un epitopo antigénico
contenido por un polipéptido PRO7133 que ocurre de forma
natural.
"Actividad biológica" en el contexto de un
anticuerpo u otra molécula antagonista que puede identificarse
mediante ensayos de cribado descritos aquí (por ejemplo, una
molécula pequeña orgánica o inorgánica, péptido, etc.) se utiliza
para referirse a la capacidad de dichas moléculas para unirse o
formar complejos con los polipéptidos codificados por los genes
amplificados identificados aquí, o que interfieren con la
interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas
celulares o que interfieren con la transcripción o traducción de un
polipéptido PRO7133. Una actividad biológica preferida es la
inhibición del crecimiento de una célula tumoral. Otra actividad
biológica preferida es la actividad citotóxica que resulta en la
muerte de las células tumorales.
El término "actividad biológica" en el
contexto de un polipéptido PRO7133 hace referencia a la capacidad
de un polipéptido PRO7133 para inducir el crecimiento de células
neoplásicas o del crecimiento celular incontrolado.
El término "actividad inmunológica" hace
referencia a la reactividad cruzada inmunológica con por lo menos
un epitopo de un polipéptido PRO7133.
El término "reactividad inmunológica
cruzada" tal como se utiliza aquí hace referencia a que el
polipéptido candidato es capaz de inhibir competitivamente la
actividad biológica cualitativa de un polipéptido PRO7133 que tiene
esta actividad con el antisuero policlonal generado contra el
polipéptido PRO7133 activo conocido. Dicho antisuero se prepara de
manera convencional mediante inyección de cabras o conejos, por
ejemplo, subcutáneamente con el análogo activo conocido en
adyuvante completo de Freund, seguido de una inyección de recuerdo
intraperitoneal o subcutánea en adyuvante incompleto de Freund. La
reactividad cruzada es preferentemente "específica", lo que
hace referencia a que la afinidad de unión de la molécula
identificada que reacciona inmunológicamente de forma cruzada (por
ejemplo el anticuerpo), con respecto al polipéptido PRO7133
correspondiente es significativamente superior (preferentemente de
por lo menos 2 veces, más preferentemente de al menos 4 veces, aún
más preferentemente de al menos 8 veces, más preferentemente de al
menos 10 veces superior) que la afinidad de unión de dicha molécula
con cualquier otro polipéptido nativo conocido.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea
parcial o completamente, inhibe o neutraliza una actividad biológica
de un polipéptido PRO7133 nativo descrito en la presente invención
o la transcripción o traducción del mismo. Entre las moléculas
antagonistas adecuadas se incluyen específicamente los anticuerpos
o los fragmentos de anticuerpos, los péptidos, las moléculas
orgánicas pequeñas, los ácidos nucleicos
anti-sentido, etc. antagonistas. Se incluyen
procedimientos para identificar antagonistas de un polipéptido
PRO7133 con una molécula antagonista candidata y medir un cambio
detectable en una o más actividades biológicas normalmente
asociadas con el polipéptido PRO7133.
Una "molécula pequeña" se define aquí con
un peso molecular de aproximadamente 500 Daltons.
"Anticuerpos" (Abs) e
"inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las
mismas características. Mientras que los anticuerpos presentan una
especificidad de unión con un antígeno específico, las
inmunoglobulinas incluyen ambos anticuerpos y otras moléculas de
tipo anticuerpo que carecen de la especificidad del antígeno. Los
polipéptidos del último tipo son, por ejemplo, producidos a niveles
bajos por el sistema linfático y a niveles aumentados por mielomas.
El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y
abarca específicamente, sin limitación, anticuerpos monoclonales
intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos
(por ejemplo, anticuerpo biespecíficos) formados a partir de dos
anticuerpos intactos por lo menos, y fragmentos de anticuerpos
siempre que presenten la actividad biológica deseada.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas
nativas" son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente
150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y
dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a
una cadena pesada por enlace disulfuro covalente, mientras que el
número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de
isotopos distintos de inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada
también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados
regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio
variable (V_{H}) seguido por un número de dominios constantes.
Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo
(V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio
constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio
constante, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con
el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos aminoacídicos
particulares se cree que forman una interfaz entre los dominios
variables de cadena ligera y pesada.
El término "variable" hace referencia al
hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en
la especificidad de unión de cada anticuerpo particular para su
antígeno de interés. Sin embargo, la variabilidad no está
distribuida uniformemente entre los dominios variables de los
anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones
determinantes de la complementariedad (CDRs) o regiones
hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera
como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de
los dominios variables se denominan las regiones estructurales
(FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas
comprenden cada una 4 regiones FR, que adoptan una configuración en
lámina \beta, conectada por los tres CDRs, que forman bucles de
conexión y en algunos casos forman parte de la estructura en lámina
\beta. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha
proximidad por medio de las regiones y, con las CDRs de la otra
cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno
de los anticuerpos (véase Kabat et al., NIH Publ. No.
91-3242, vol. I, páginas 647-669
(1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en
la unión del anticuerpo con el antígeno, pero presentan diversas
funciones, como la participación del anticuerpo en la toxicidad
celular dependiente del anticuerpo.
El término "región hipervariable" cuando se
utiliza aquí hace referencia a los residuos aminoacídicos de un
anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región
hipervariable comprende residuos aminoacídicos de una "región
determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir,
residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y
89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y
31-35 (H1), 50-65 (H2) y
95-102 (H3) en el dominio variable de cadena
pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institute of
Health, Bethesda, MD. [1991]) y/o los residuos de un "bucle
hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (L1),
50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el
dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1),
53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Clothia y Lesk, J. Mole. Biol.
196:901-917 [1987]). Los residuos de
"estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio
variable distintos a los residuos de la región hipervariable tal
como se define aquí.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden
una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de
unión el antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos
de fragmentos de anticuerpo incluyen el Fab, Fab',
F(ab')_{2} y los fragmentos Fv; los diacuerpos; los
anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng.,
8(10):1057-1062 [1995]); moléculas de
anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos
formados por fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos de unión idénticos, denominados fragmentos
"Fab", cada uno con un sitio de unión antigénico único, y un
fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para
cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un
fragmento (Fab')_{2} que tiene dos sitios de combinación
antigénica y es capaz de unirse de forma cruzada con el
antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento y un sitio de unión
completos. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable
de una cadena pesada-una cadena ligera en estrecha
asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs
de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión
antigénico en la superficie del dímero VH-VL.
Colectivamente, las seis CDRs confieren especificidad de unión
antigénica al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable
único (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicas
para el antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al
antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión
entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el dominio constante (CH1) de la
cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren fragmentos Fab' mediante
la adición de unos pocos residuos en el extremo
carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada
incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo,
Fab'-SH es la denominación para Fab' en la que los
residuos cisteína de los dominios constantes contienen un tercer
grupo tiol libre, los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2}
se producen originalmente como parejas de fragmentos Fab' con una
bisagra de cisteínas entre ambos. Otras uniones químicas de
fragmentos de anticuerpos se muestran también aquí.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden
asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados
kappa (К) y lambda (\lambda), según las secuencias
aminoacídicas de sus dominios constantes.
Las inmunogloblinas pueden agruparse en cinco
clases diferentes en función de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cinco clases
principales de inmunoglobulinas son: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y
algunas de ellas pueden a su vez dividirse en subclases (o
isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los
dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las
diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan respectivamente
\alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu. Las
estructuras de las subunidades y las configuraciones
tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son
bien conocidas.
El término "anticuerpo monoclonal" se usa
aquí para denominar un anticuerpo obtenido de una población de
anticuerpos esencialmente homogéneos, por ejemplo los anticuerpos
individuales de los que consta una población son idénticos excepto
si existen posibles mutaciones naturales que se presentan en una
cantidad mínima. Los anticuerpos monoclonales son altamente
específicos, ya que están dirigidos contra un único lugar
antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de
anticuerpos convencionales (policlonales), que incluyen anticuerpos
dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada
anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante
antigénico. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales
presentan la ventaja de ser sintetizados en un cultivo de
hibridoma, sin contaminación por otras inmunoglobulinas. El
calificativo "monoclonal" indica así el carácter del
anticuerpo obtenido de una población esencialmente homogénea de
anticuerpos, y no requiere un procedimiento particular para su
producción. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan
de acuerdo con la presente invención, pueden obtenerse por el
procedimiento del hibridoma descrito primeramente por Kohler et
al., Nature, 256:495 [1975], o por procedimientos de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, la patente americana U.S. No.
4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden
aislarse, por ejemplo, de bibliotecas de anticuerpos en fagos según
las técnicas descritas en Clackson et al., Nature,
352:624-628 [1991] y Marks et al., J. Mol.
Biol., 222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales descritos aquí,
específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada o
ligera es idéntica a, o, homóloga a las secuencias correspondientes
de anticuerpos derivados de una especie particular, o pertenecen a
una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras el resto de
la cadena(s) es idéntica a, u, homóloga a las secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o
pertenecientes a otras clases de anticuerpos o subclases, así como
los fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la
actividad biológica deseada (Patente U.S. No. 4,816,567; Morrison
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 6851-6855
[1984]).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo los murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de éstas (como Fv, Fab,
Fab', F(ab')_{2}) u otras subsecuencias de unión al
antígeno de los anticuerpos) que contienen secuencias mínimas
derivadas de inmunoglobulinas no humanas. La mayor parte de los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos
receptores) en los que los residuos de un CDR del receptor es
reemplazado por los residuos de un CDR de una especies no humana
(anticuerpo donante) por ejemplo de ratón, rata o conejo, con la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los
residuos Fv FR residuos de la inmunoglobulina humana se reemplazan
por los correspondientes residuos no humanos. Además, los
anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se
encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en
las secuencias de estructura. Estas modificaciones se hacen para
realizar un mejor ajuste y maximizar el comportamiento del
anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado puede incluir al
menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todas o
esencialmente todas las regiones CDR corresponden a las de
inmunoglobulinas no humanas y todas o esencialmente todas las
regiones FR a las secuencias de inmunoglobulinas humanas. Para ser
óptimo, el anticuerpo humanizado también debe incluir al menos una
porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc),
típicamente de una inmunoglobulina humana. Para más detalles,
véase, Jones et al., Nature, 321:522-525
(1986); Reichmann et al., Nature, 332;
323-329 [1988]; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2; 593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye
un anticuerpo PRIMATIZADO^{TM} en el que la región de unión al
antígeno deriva de un anticuerpo producido por inmunización de
monos macacos con el antígeno de interés.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola
cadena " o "sFv" incluyen los dominios V_{H} y V_{L}
del anticuerpo, dominios que se presentan como cadena polipeptídica
única. Preferentemente, el polipéptido Fv además incluye un
enlazador polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L} que
permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del
antígeno. Para una revisión sobre sFv véase Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and
Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
fragmentos pequeños de anticuerpos que contienen dos lugares de
unión antigénica y que poseen un dominio variable de cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL).
Utilizando un enlazador suficientemente corto, que permita el
emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza
al emparejamiento con el dominio complementario en la otra cadena y
se crean así dos lugares de unión al antígeno. Los diacuerpos se
describen más extensamente en, por ejemplo, la patente europea EP
404,097; la patente internacional WO 93/11161; y Hollinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448
(1993).
Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha
sido identificado y separado y/o recuperado de los componentes de
su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente
natural son materiales que podrían interferir en su posible uso
diagnóstico y terapéutico y puede tratarse de enzimas, hormonas u
otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones
preferentes, el anticuerpo se purifica (1) en más del 95% en peso
según se determina por el procedimiento de Lowry y (2)
preferiblemente en más del 99% en peso a un grado suficiente para
obtener al menos 15 residuos del N-terminal o de la
secuencia interna de aminoácidos que permita el uso de un
secuenciador de taza rotatoria o, (3) a homogeneidad mediante
separación en SDS-PAGE en condiciones reductoras o
no reductoras y tinción con azul de Coomassie o preferentemente con
tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in
situ sin células recombinantes y sin que se encuentre presente
ninguno de los componentes del ambiente natural. No obstante, en
general, para preparar anticuerpo aislado, es necesario al menos un
paso de purificación.
La palabra "marcador", cuando se usa aquí,
se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga
directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un
anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí
mismo (por ejemplo marcadores radioisotópicos o marcadores
fluorescentes) o, en el caso del marcador enzimático, pueden
catalizar la alteración química de un compuesto o composición
detectables que actúan como sustrato. Entre los radionucleidos, que
son marcadores detectables, se incluyen por ejemplo,
I-131, I-123, I-125,
Y-90, Re-188,
Re-186, At-211,
Cu-67, Bi-212 y
Pd-109. Así mismo el marcador puede ser una entidad
no detectable como es el caso de una toxina.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente
invención. Ejemplos de fases sólidas incluidas aquí son aquellas
entera o parcialmente compuestas de vidrio (por ejemplo, vidrio de
poro controlado), de polisacáridos (por ejemplo, agarosa), de
poliacrilamidas, de poliestireno, de polivinil alcohol y de
siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede referirse al pocillo de una placa de ensayo; en
otras, a la purificación en columna (por ejemplo, una columna de
cromatrografía por afinidad). Este término también incluye las fases
sólidas discontinuas de partículas discretas tal como las descritas
en la patente americana U.S. 4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que resulta útil para la administración de un compuesto a un
mamífero (tal como el polipéptido PRO7133 o el anticuerpo contra
éste, y opcionalmente, un agente quimioterapéutico). Los componentes
del liposoma están dispuestos generalmente en una formación de
bicapa, de manera similar a las membranas biológicas.
El término "inmunoadhesina", tal como se
utiliza aquí, designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan la
especificidad de unión de una proteína heteróloga (una
"adhesina") con las funciones efectoras de los dominios
constantes de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas se componen de la fusión de una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada y que es distinta
del sitio de reconocimiento antigénico y del lugar de unión de un
anticuerpo (es decir es "heteróloga"), y de una secuencia del
dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de adhesina de
una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia
contigua de aminoácidos que incluye al menos el sitio de unión de un
receptor a un ligando. La secuencia del dominio constante de la
inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de
cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos
IgG-1, IgG-2, IgG-3
o IgG-4, IgA (incluidos IgA-1 y
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
los polipéptidos a los que se refiere la presente solicitud como
PRO7133. En particular, se ha identificado y aislado el ADNc que
codifica los polipéptidos PRO7133 tal y como se detalla en los
Ejemplos siguientes. Cabe indicar que las proteínas producidas en
rondas separadas de expresión pueden dar diferentes números de PRO,
pero el número UNQ es único para cualquier ADN determinado y la
proteína codificada y no cambiará. Sin embargo, para simplificar,
en la presente memoria las proteínas codificadas por las secuencias
de ácidos nucleicos descritas aquí, así como las homólogas nativas
y variantes incluidas en la anterior definición de PRO7133, serán
referidas como "PRO7133" con independencia de su origen y forma
de preparación.
Tal como se describe en los Ejemplos de más
adelante, los clones de ADNc se han depositado en el ATCC. La
secuencia nucleotídica real de los clones puede determinarse por un
técnico en la materia mediante la secuenciación del clon depositado
y siguiendo los procedimientos de rutina propios de la materia. Para
los polipéptidos PRO7133 y los ácidos nucleicos que los codifican,
descritos aquí, los solicitantes han identificado las que se cree
son las mejores pautas de lectura identificables con la información
de secuencia disponible hasta el momento.
Además de los polipéptidos PRO7133 de la
secuencia nativa completa descritos aquí, se contempla la
preparación de las variantes de PRO7133. Las variantes de PRO7133 se
pueden preparar mediante la introducción de cambios apropiados en
el ADN de PRO7133 y/o por la síntesis del polipéptido de PRO7133
deseado. Los expertos en la materia sabrán que los cambios de
aminoácidos pueden alterar el proceso
post-traduccional del PRO7133 como por ejemplo
cambios en el número y la posición de los sitios de glicosilación o
la alteración de sus características de anclaje en la membrana.
Las variaciones en la secuencia nativa de
PRO7133 de longitud completa o en varios de los dominios descritos
aquí, pueden hacerse, por ejemplo, mediante alguna de las técnicas y
guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras que se
encuentran, por ejemplo, en la patente americana U.S. 5.364.934. Las
variaciones pueden generarse por substitución, deleción o inserción
de uno o más codones que codifican PRO7133, lo que resulta en
cambios en la secuencia aminoacídica de PRO7133 comparada con la
secuencia nativa de PRO7133. Opcionalmente la variante se genera
por substitución de al menos uno de los aminoácidos por otro
aminoácido cualquiera en uno o más de los dominios de PRO7133. Una
ayuda para la determinación de cuál es el residuo aminoacídico que
debe insertarse, substituirse o delecionarse sin afectar de forma
adversa la actividad deseada, puede hallarse en la comparación de
la secuencia de PRO7133 con la de moléculas de proteicas homólogas
conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de
aminoácidos a realizar en regiones con alta homología. Las
substituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar
un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades similares
estructurales o químicas, tal como el reemplazo de una leucina por
una serina, es decir, reemplazos de aminoácidos conservados. Las
inserciones o deleciones pueden ser opcionalmente de entre 1 y 5
aminoácidos. La variación permitida se puede determinar mediante
inserciones, deleciones o substituciones de aminoácidos realizadas
sistemáticamente en la secuencia y examinan-
do las variantes resultantes por la actividad que exhiban respecto a la secuencia nativa madura o de longitud completa.
do las variantes resultantes por la actividad que exhiban respecto a la secuencia nativa madura o de longitud completa.
Se proporcionan aquí fragmentos del polipéptido
PRO7133. Estos fragmentos, por ejemplo, pueden estar truncados en
su extremo N-terminal o C-terminal,
o pueden carecer de residuos internos, cuando se comparan con la
secuencia nativa madura o de longitud completa. Algunos fragmentos
pierden residuos de aminoácidos que no son esenciales para una
actividad biológica deseada del polipéptido PRO7133.
Los fragmentos de PRO7133 pueden prepararse
mediante cualquiera de las técnicas convencionales. Así, los
fragmentos peptídicos deseados pueden ser sintetizados químicamente.
Un enfoque alternativo implica la generación de fragmentos PRO7133
por digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una
enzima conocida que corta las proteínas en lugares definidos por
residuos aminoacídicos particulares, o por digestión del ADN con
enzimas de restricción adecuadas y aislamiento del fragmento
deseado. Aún más, otra técnica adecuada, incluye el aislamiento y
la amplificación de un fragmento de ADN que codifica para el
fragmento polipeptídico deseado mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen las terminaciones
deseadas del fragmento de ADN se emplean en los extremos 5'y 3' de
los cebadores en la PCR. Preferentemente, los fragmentos del
polipéptido PRO7133 comparten al menos una actividad biológica o
inmunológica con el polipéptido nativo PRO7133.
En realizaciones particulares, las
substituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 3
bajo el título correspondiente de substituciones preferentes. Como
resultado de estas substituciones se produce un cambio en la
actividad biológica, se introducen más cambios esenciales
denominados ejemplos de substituciones en la Tabla 3, o tal como se
describe más abajo en referencia a las clases de aminoácidos; y
posteriormente se criban dichos productos.
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Las modificaciones esenciales de la función o de
la identidad inmunológica del polipéptido se consiguen por medio de
la selección de substituciones que difieren significativamente en su
efecto sobre (a) el mantenimiento de la estructura del esqueleto
polipeptídico en la zona de la substitución, por ejemplo, en la
conformación helicoidal o en lámina; (b) la carga o hidrofobicidad
de la molécula; (c) el conjunto de la cadena lateral. Los residuos
que se encuentran de forma natural se dividen en grupos en base a
las propiedades comunes de sus cadenas laterales:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val,
leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr,
(3) acídicos: asp, glu;
(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influencian la orientación de
la cadena: gly, pro, y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las substituciones no conservadoras suponen el
intercambio de un miembro de una de estas clases por otra. Estas
substituciones se pueden introducir en sitios de substitución
conservadores o más preferentemente, en el resto de sitios no
conservadores.
Las variantes se pueden hacer utilizando
procedimientos conocidos en la materia tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (de sitio-dirigida), el
cribado de alaninas, y la mutagénesis por PCR. La mutagénesis
lugar-dirigida [Carter et al., Nucl. Acid.
Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,
10:6487 (1987)], mutagénesis en casete [Wells et al., Gene,
34:315 (1985)], la mutagénesis de selección por restricción [Wells
et al., Philos. Trans. R. Soc. SerA, 317:415 (1986)] u otras
técnicas conocidas se realizan en el ADN clonado para producir las
variante del ADN de PRO7133.
El análisis de aminoácidos por cribado también
se puede utilizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia continua. Para este tipo de análisis, son
preferibles los aminoácidos pequeños y los neutros. Entre estos
aminoácidos se incluyen la alanina, la glicina, la serina, y la
cisteína. La alanina es típicamente el aminoácido preferido para
este análisis debido a que elimina la cadena lateral entre el
carbono beta y se altera menos la conformación principal de la
variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085
(1989)]. La alanina también es el aminoácido preferido porque es el
aminoácido más común. Además, es posibles encontrarlo
frecuentemente en posiciones tanto protegidas como expuestas
[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia,
J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la substitución por alaninas no
produce cantidades adecuadas de la variante, se puede utilizar
también un aminoácido isostérico.
Las modificaciones covalentes de PRO7133 se
incluyen en el ámbito de la presente invención. Un tipo de
modificación covalente consiste en la reacción de los residuos
aminoacídicos diana de un polipéptido PRO7133 con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con una cadena
lateral seleccionada o con los residuos N- o
C-terminales de PRO7133. La derivatización con
agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para el
entrecruzamiento de PRO7133 con una matriz soporte insoluble en agua
o una superficie para su uso en la purificación de anticuerpos
anti-PRO7133 y vice-versa.
Entre los agentes entrecruzadores más comunes, se incluyen, por
ejemplo el
1,1-bis(diazoacetil)-2-fenitethano,
el glutaraldehido, los ésteres de
N-hidroxisuccinimida, los ésteres con 4-ácido
salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo los ésteres
de disuccinimidil como el
3'-3-dithiobis
(succinimidilpropionato), las maleimidas bifuncionales como el
bis-N.-maleimido-1,8-octono
y agentes como el
metil-3-[(p-azidofenil)dithio]propioimidato.
Otras posibles modificaciones incluyen la
desamidación de residuos glutaminil y asparraguinil hasta los
correspondientes residuos glutamil y aspartil, respectivamente, y la
hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de los
grupos hidroxilo de los residuos seril othreonil, la metilación de
grupos \alpha-amino de lisina, arginina y cadenas
laterales de histidina [T. Creighton, Proteínas: Estructura y
Propiedades Moleculares Moleculares, W.H. Freeman & Co., San
Francisco, pp, 79-88 (1983)], la acetilación de la
amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo
carboxilo N-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO7133 comprendida en el ámbito de la presente
invención, incluye la "alteración del modelo de glicosilación
nativa" del polipéptido. La alteración del patrón de
glicosilación nativa se prevé para propósitos de deleción de una o
más porciones de carbohidratos que se encuentran en la secuencia
nativa de PRO7133 (tanto por la eliminación de sitios de
glicosilación subyacentes como por la deleción de la glicosilación
por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más
sitios de glicosilación que no estén presentes en la secuencia
nativa de PRO7133. Además, se pueden incluir cambios cualitativos
en la glicosilación de las proteínas nativas, que impliquen cambios
en la naturaleza y en la proporción de las diversas porciones de
carbohidratos presentes.
También puede conseguirse la adición de sitios
de glicosilación en el polipéptido PRO7133 por alteración de la
secuencia de aminoácidos. La alteración se realiza, por ejemplo, por
la adición de, o substitución por uno o más residuos serina o
treonina en la secuencia nativa de PRO7133, (para obtener sitios de
O-glicosilación). Así mismo, la secuencia de
aminoácidos PRO7133 puede opcionalmente alterarse por cambios a
nivel del ADN, particularmente por la mutación del ADN que codifica
el polipéptido PRO7133 en bases preseleccionadas y así los codones
generados se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otra manera de aumentar el número de porciones
de carbohidratos en el polipéptido PRO7133 es por unión química o
enzimática de glicósidos con el polipéptido. Estos procedimientos se
describen en la materia, por ejemplo en la patente internacional WO
87/05.330 publicada el 11 Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston,
CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
También pueden extraerse las porciones de
carbohidratos presentes en el polipéptido PRO7133 por tratamiento
químico o enzimático o por substitución mutacional de codones que
codifican los residuos de aminoácidos que sean dianas para la
glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química se conocen
en la materia y se han describen, por ejemplo, por Hakimuddin,
et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge
et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La rotura enzimática
de porciones de carbohidratos de los polipéptidos se consigue
mediante una variedad de endo- y exo-glicosilasas
tal como describió Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350
(1987).
Otro tipo de modificación covalente de PRO7133
comprende la unión del polipéptido PRO7133 a una variedad de
polímeros no proteicos, por ejemplo, el polietilel glicol (PEG), el
polipropilen glicol, los orpolioxiaquilenos, en la forma descrita
en las patentes americanas U.S. No. 4.640.835; 4.301.144; 4.791.192
o 4.179.337.
El PRO7133 de la presente invención también se
puede modificar de manera que forma una molécula quimérica que
comprende un PRO7133 fusionado a un polipéptido o una secuencia
aminoacídica heterólogos.
En una realización, dicha molécula quimérica
comprende una fusión del PRO7133 con un polipéptido etiqueta que
proporciona un epitopo al que se puede unir selectivamente un
anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epitópica
generalmente está colocada en el extremo amino o carboxilo del
PRO7133. La presencia de dichas formas etiquetadas con epítopo de
PRO7133 puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el
polipéptido etiqueta. Además, la presencia de etiqueta epitópica
permite purificar fácilmente el PRO7133 por afinidad utilizando un
anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de
afinidad que se une a la etiqueta epitópica. Los diferentes
polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien
conocidos en la técnica. Entre los ejemplos se incluyen las
etiquetas de poli-histidina
(poli-His) o
poli-histidina-glicina
(poli-His-gly); el polipéptido
etiqueta del virus de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field
et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165
(1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos contra
ella, 8F9, 3C7, 6E10, E4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular
and Cellular Biology, 5.3610-3616 (1985)]; y la
etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus Herpes simplex y su
anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering,
36(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos
etiqueta incluyen el péptido-Flag [Hopp et
al., Bio-Technology, 6.1204 (1988)]; el péptido
epitópico KT3 [Martin et al., Science,
255:192-194 (1992)]; y un epitopo del péptido de la
\alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol.
Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta
peptídica de la proteína 10 del gen T7
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
USA, 87:6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del PRO7133 con una
inmunoglobulina o con una región particular de una inmunoglobulina.
Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida
como "inmunoadhesina"), la fusión puede realizarse con una
región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones Ig preferentemente
incluyen la substitución de una forma soluble (un dominio
transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO7133 en
lugar de al menos una región variable de la molécula de Ig. En una
realización particularmente preferente, la fusión de la
inmunoglobulina incluye la bisagra, las regiones CH2 y CH3, o la
bisagra, las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para
la producción de las fusiones de inmunoglobulina véase también, la
patente americana U.S. 5.428.130 publicada el Junio 27 de 1995.
La descripción de más abajo se refiere
principalmente a la producción de PRO7133 por medio de un cultivo
de célula transformadas o transfectadas con un vector que contiene
el ácido nucleico que codifica PRO7133. Se contempla también, que
puedan emplearse procedimientos alternativos bien conocidos en la
materia, para la preparación de PRO7133. Por ejemplo, la secuencia
de PRO7133 o porciones de la misma, pueden producirse por síntesis
directa del péptido mediante técnicas de fase sólida [véase, por
ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide
Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Ca (1969); Merrifield, J.
Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis
de proteínas in vitro puede realizarse mediante técnicas
manuales o automáticas. La síntesis automática puede realizarse,
por ejemplo, mediante un sintetizador de péptidos de Applied
Biosystems (Foster City, CA) según las instrucciones del
fabricante. Varias porciones de PRO7133 se sintetizan por separado
químicamente y se combinan mediante procedimientos químicos o
enzimáticos para producir el PRO7133 de longitud completa.
El ADN que codifica PRO7133 puede obtenerse a
partir de una biblioteca de ADNc preparada de un tejido que exprese
el ARNm de PRO7133 a un nivel detectable. Por consiguiente el ADN
del PRO7133 humano, se obtiene de una biblioteca de ADNc preparada
de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. También se
obtiene PRO7133 de una biblioteca genómica o mediante la síntesis
de oligonucleótidos.
Las bibliotecas puede cribarse con sondas (como
por ejemplo, anticuerpos contra el polipéptido PRO7133, u
oligonucleótidos de al menos 20-80 bases) diseñadas
para identificar genes de interés o proteínas codificadas por
éstos. El cribado del ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda
seleccionada se realiza mediante procedimientos estándares, como
los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Una manera alternativa de aislar el gen que codifica para
PRO7133 es usar la metodología de la PCR [Sambrook et al.,
supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos de más adelante, describen técnicas
de cribado de bibliotecas de ADNc. Las secuencias de
oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben tener la suficiente
longitud y carecer de ambigüedades con tal de minimizar los falsos
positivos. Preferentemente, los oligonucleótidos se marcan para que
poder detectar su hibridación con el ADN de la biblioteca y
realizar el cribado. Los procedimientos de marcado son bien
conocidos en la materia e incluyen el uso de radiomarcadores como el
ATP marcado con P^{32}, la biotinilación o el marcaje enzimático.
Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada
y alta, se proporcionan en Sambrook et al.,
supra.
Mediante los procedimientos de cribado, se
identifican en la biblioteca, secuencias que pueden ser comparadas
y alineadas con otras secuencias que están depositadas y disponibles
en los bancos de datos públicos como el GenBank u otras bases de
datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (tanto a
nivel de aminoácido como del nucleótido) en las regiones definidas
de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa
pueden determinare mediante procedimientos bien conocidos en la
materia, y tal como se describe aquí.
El ácido nucleico que tiene la secuencia que
codifica la proteína puede obtenerse por cribado de bibliotecas de
ADNc o genómicas a partir de la secuencia aminoacídica deducida y
descrita aquí por primera vez, y si es necesario, mediante
cebadores convencionales en procedimientos de extensión, tal como se
describe en Sambrook et al., supra, para detectar
precursores e intermediarios del ARNm que no se hallan transcrito de
forma inversa a ADNc.
Las células huéspedes se transforman o
transfectan con los vectores de clonación y expresión descritos
aquí para PRO7133. Su producción y cultivo se realiza en medios
convencionales con los nutrientes modificados según sea apropiado
para inducir promotores, seleccionar transformantes, y amplificar
los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, tipo de medio, temperatura, pH y demás condiciones, se
seleccionan por personas expertas en la materia sin excesiva
experimentación. En general, principios, protocolos, y técnicas
prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares
se pueden encontrar en Mammlian Cell Biotechnology: A Practical
Approach. Butlder, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al.,
supra.
Los procedimientos para las transfecciones de
células eucariotas y las transformaciones de células procariotas
son conocidos por los entendidos en la materia, por ejemplo aquellos
mediados por CaCl_{2}, CaPO_{4}, liposomas y electroporación.
Según el huésped utilizado, se escogen las técnicas estándares
apropiadas para las células. Generalmente para procariotas se
utiliza el tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, tal
como se describe en Sambrook et al., supra, o la
electroporación. La infección con Agrobacterium tumefaciens
se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas tal
como se describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y la
patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989.
Para células de mamíferos sin paredes celulares, se puede utilizar
el procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico de Graham
y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los
aspectos generales de los sistemas de transfección de células
huéspedes de mamíferos se han descrito en la patente americana U.S.
4.399.216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo
típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et
al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, se pueden
utilizar otros procedimientos para introducir el ADN en las
células, tal como la microinyección nuclear, la electroporación, la
fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o
policationes, por ejemplo polibreno y piornitina. Para varias
técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown et
al., Methods in Enzymnology, 185:527-537 (1990)
y Mansour et al., Nature, 336:348-352
(1988).
Las células huéspedes adecuadas incluyen las
procariotas, las levaduras o las eucariotas, para el clonación o la
expresión del ADN en vectores. Las células procariotas adecuadas
incluyen pero no se limitan a las eubacterias, los organismos
Gram-negativos o Gram-positivos, por
ejemplo, las Enterobacteriaceas como las cepas de E. coli de
disponibilidad pública como la cepa de E. coli K12 MM294
(ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli
31,537); la cepa E. coli W3110 (ATCC 27,325) y la cepa de
E. coli K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huéspedes
procariotas adecuadas incluyen las enterobacteriáceas como
Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella
typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcesans y
Shighella, así como Bacilli como B. ubtilis y
B. licheniformis (i.e., B. licheniformis 41P descrito
en la patente DD 266.710 publicada el 12 de Abril de 1989),
Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que
limitantes. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o
huésped parental porque es una cepa huésped común para
fermentaciones de productos del ADN recombinante. Preferentemente,
la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas
proteolíticas. La cepa W3110, puede ser modificada por efecto de
mutaciones genéticas en los genes que codifican las proteínas
endógenas del huésped, como ejemplos, de tales huéspedes se incluyen
la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo
tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110 que tiene el
genotipo completo tonA ptr3; la cepa 27C7 de E. coli
W3110 (ATCC 55,244) que tiene el genotipo completo tonA ptr3
phoA E15 (argF-lac)169 degP onepT
kan^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110 que tiene el
genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG
kan^{r}; la cepa 40B4 de E. coli W3110 que es una cepa
derivada de 37D6 con una mutación por deleción degP que
comporta la no resistencia a la kanamicina; y una cepa E.
coli que tiene una proteasa periplasmática mutante descrita en
la patente americana U.S. 4.946.783 publicada el 7 de Agosto de
1990. Alternativamente, también son adecuados los procedimientos de
clonación in vitro, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de
la polimerasa de ácidos nucleicos.
Además de los procariotas, algunos microbios
eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son
adecuados como huéspedes para el clonación o expresión de vectores
que codifican PRO7133. Saccharomyces cerevisiae es un
eucariota inferior utilizado comúnmente como microorganismo huésped.
Entre otros se incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y
Nurse, Nature, 290:140 [1981]; patente europea EP 139,383 publicada
el 2 de Mayo de 1985); el huésped Kluyveromyces (Patente
U.S. Mo. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo K.
lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt
et al., J. Bacteriol., 737 [1983]). K. fragilis (ATCC
12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii
(ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K.
drosophilarum (ATCC 36,906; Vanden Berg et al.,
Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K.
marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP
183,070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol.,
28:265-278 [1988]; Candida; Trichoderma
reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces
occidentalis (patente europea EP 394.538 publicada el 31 de
Octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como por ejemplo,
Nuerospora, Penicilium, Tolypocladium (patente internacional WO
91/00357 publicada el 10 de Enero de1991), y Aspergillus
como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys.
Res. Communm. 112:284-289 [1983]; Tiburn et
al., Gene, 26; 205-221 [1983]; Yelton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474
(1984)) y A. niger (Keelly y Hynes, EMBO J.,
4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotróficas son
adecuadas aquí e incluyen, pero no se limitan a, las levaduras
capaces de crecer en metanol seleccionadas a partir del género de
Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces,
Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies
específicos que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede
encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269
(1982).
Para la expresión de PRO7133 glicosilado las
células huéspedes adecuada derivan de organismos multicelulares.
Como ejemplos de células de invertebrados se incluyen las células de
insectos como las de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9,
así como las células de plantas. Ejemplos de líneas celulares
huéspedes de mamíferos de utilidad son las células de ovario de
hámster chino (CHO) y las células COS. Más ejemplos específicos
incluyen la línea de riñón de mono CV1 transformada con SV40
(COS-7, ATCC, CRL 1651); la línea de riñón
embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el
crecimiento de cultivos en suspensión, Graham et al., J. Gen.
Virol. 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino (-DHFR
(CHO), Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77; 4216
(1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138,
ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y un tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de una
célula huésped apropiada es competencia del experto en la
materia.
El ácido nucleico (por ejemplo el ADNc o el ADN
genómico) que codifica PRO7133 puede insertarse en un vector
replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su
expresión. Varios vectores son de disponibilidad pública. El vector
puede ser un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia
de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector
mediante diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en
una(s) diana(s) de reconocimiento por nucleasas de
restricción utilizando técnicas conocidas en la materia. Los
componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a,
uno o más secuencia señal, un origen de replicación, uno o más
genes marcadores, un elemento intensificador de la transcripción,
un promotor, y una secuencia terminadora de la transcripción. Para
la construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de
esos componentes, se emplean técnicas estándares de ligación que son
conocidas por los expertos en la materia.
El PRO7133 puede producirse de forma
recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido
de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia
señal u otro polipéptido con una diana de corte específica en el
extremo N-terminal de la proteína o polipéptido
madurosa. En general, la secuencia señal puede ser un componente
del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el
PRO-7133 y que se inserta en el vector. La
secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota
seleccionada, por ejemplo de entre el grupo de la fosfatasa
alcalina, la penicilanase, el lpp, o la enterotoxina II estable al
calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede
ser, por ejemplo, la secuencia líder de la invertasa de levadura,
la secuencia líder del factor alfa de Saccharomyces y del
factor \alpha de Kluyveromyces, la última descrita en la
patente americana U.S. 5.010.182) o la secuencia de la fosfatasa
ácida, la secuencia de la flucoamilasa C. albicans (patente
europea EP 362.179 publicada el 4 de Abril de 1990), o la secuencia
señal descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el
15 de Noviembre de 1990. Para la expresión en células de mamífero
pueden utilizarse secuencias señal de mamífero para dirigir la
secreción de la proteína, como las secuencias señal de polipéptidos
secretados de las mismas especies o relacionadas, por ejemplo los
líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como de
clonación, contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al
vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas.
Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuando para la mayoría de las bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para las levaduras y varios orígenes virales (SV40,
poliomas, adenovirus, VSV, BPV) son adecuados para el clonación de
vectores en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación contienen
típicamente un gen de selección, también denominado marcador
seleccionable. Los genes de selección más corrientes incluyen
proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras
toxinas, por ejemplo ampicilina, nenomicina, metotrexate, o
tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
aportan nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos,
por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina
racemasa de Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de las células competentes que incorporan el ácido
nucleico que codifica PRO7133, como el DHFR o la timidina quinasa.
Una célula huésped adecuada cuando se emplea el DHFR de tipo salvaje
es la línea celular CHO deficiente en la actividad DHFR, que se
prepara y propaga tal como se describe en Urlaub et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección
adecuado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en
el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature,
282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979);
Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1
proporciona un marcador de selección para la cepa mutante de
levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano. ATCC
No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12
(1977)].
Los vectores de expresión y clonación contienen
normalmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica PRO7133 para dirigir la síntesis del
ARNm. Se conocen promotores reconocidos por una gran variedad de
células huéspedes potenciales. Entre los promotores adecuados para
su uso con los huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de
promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa
[Chan et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,
Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, el sistema promotor
del triptófano (trp) [Goeddel, Nuceic Acids Res., 8:4057 (1980); EP
36,776], y promotores híbridos como el promotor tac [deBoer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 80: 21-25
(1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia Dalgarno (S.D.) operativamente
unida al ADN que codifica el PRO7133.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para su uso en huéspedes de levadura se incluyen los
promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
[Hitzemanm et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980] u otros
enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149
(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la
enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato
dehidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfatoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosefosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la
glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, son los
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de controlar
la transcripción según las condiciones de crecimiento, entre ellos
están las regiones promotoras para la alcohol
dehidrogenasa-3, el isocitocromo C, la fosfatasa
ácida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del
nitrógeno, la metalotioneina, la
gliceraldehido-3-fosfato
dehidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de
maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso
en la expresión en levaduras se describen más extensamente en la
patente europea EP 73.657.
La transcripción de vectores que poseen PRO7133
en células huéspedes de mamíferos se controla, por ejemplo,
mediante promotores obtenidos de genomas víricos como el virus del
polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK 2.211.504
publicada el 5 de Julio de 1989), del adenovirus, (como el
Adenovirus 2), del virus del papiloma bovino, del virus del sarcoma
aviar, el citomegalovirus, el retrovirus, el virus de la
hepatitis-B y del virus del simio 40 (SV40), o los
promotores heterólogos de mamíferos que proporcionan promotores que
son compatibles con los sistemas de la célula huésped, por ejemplo,
el promotor de la actina o el de la inmunoglobulina y los
promotores de choque térmico.
La transcripción del ADN que codifica PRO7133 en
eucariotas superiores puede aumentarse por la inserción de una
secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son
elementos que actúan en cis sobre el ADN, normalmente alrededor de
10 a 300 bp, y actúan en un promotor para aumentar su transcripción.
Muchas secuencias intensificadoras son conocidas en los genes de
mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, se
usa frecuentemente una secuencia intensificadora de un virus de
célula eucariota. Como ejemplos se incluyen la secuencia
intensificadora del origen tardío de la replicación del virus SV40
(bp 100-270), la secuencia intensificadora del
promotor temprano de citomegalovirus, la secuencia intensificadora
del origen tardío de replicación del polioma y las secuencias
intensificadoras de adenovirus. La secuencia intensificadora puede
introducirse en el vector en posición 5'o 3'de la secuencia
codificante de PRO7133, pero preferentemente en el extremo 5'del
promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) contienen también secuencias necesarias para la
finalización de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Estas secuencias están dispuestas comúnmente desde el extremo 5'y
ocasionalmente desde el extremo 3' de las regiones no traducidas de
los ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen
secuencias de nucleótidos transcritas como fragmentos
poliadenilados en la porción 3' no traducida del ARNm que codifica
PRO7133.
Otros procedimientos, vectores y células
huéspedes adecuados para su adaptación a la síntesis de PRO7133 en
cultivos de células recombinantes de vertebrados se describen en
Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981):
Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979);
patente europea EP 117.060; y patente europea EP 117.058.
La amplificación y/o expresión pueden
cuantificarse directamente en la muestra, por ejemplo, mediante
transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia
de mancha (para análisis del ADN), o hibridación in situ
mediante sondas marcadas apropiadas basadas en las secuencias
proporcionadas aquí. De forma alternativa, se pueden utilizar
anticuerpos para el reconocimiento de dúplex específicos, incluyendo
el dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos
ADN-ARN o ADN-proteína. Los
anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo
con el dúplex unido a una superficie, de forma que después de la
formación del dúplex en la superficie, se pueda detectar la
presencia del anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica también puede cuantificarse
por procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica
de células y de secciones de tejidos y por ensayo de cultivo
celular o fluidos corporales para la cuantificación directa de la
expresión del producto génico. Los anticuerpos adecuados para la
tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras de fluido, pueden
ser tanto monoclonales como policlonales y pueden prepararse de
cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se preparan
contra una secuencia nativa del polipéptido PRO7133 o contra un
péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en
la presente invención o contra secuencias exógenas unidas al ADN de
PRO7133 y que codifican un epitopo específico del anticuerpo.
Las formas diversas del RPO7133 pueden
recuperarse del medio de cultivo o de los lisados de las células
huéspedes. Si está unido a membrana, debe de liberarse de la
membrana mediante una solución detergente adecuada (por ejemplo,
Tritón-X-100) o por digestión
enzimática. Las células empleadas en la expresión de PRO7133 se
pueden romper por varios procedimientos físicos o químicos, como por
ejemplo ciclos de congelación, sonicación, disrupción mecánica o
agentes que provocan la lisis celular.
Puede desearse la purificación de PRO7133 a
partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los
siguientes procesos son ejemplos de procedimientos de purificación
adecuados: por fraccionamiento en columnas de intercambio iónico;
precipitación en etanol; HPLC de fase inversa, cromatografía en
sílice o resina de intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque;
SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónio;
filtración en gel, utilizando por ejemplo Sephadex
G-75; columnas de proteína A Sepharose para extraer
contaminantes como las IgG; y columnas de quelantes de metales que
unen las formas etiquetadas de PRO7133. Se pueden emplear varios
procedimientos de purificación de proteínas que son bien conocidos
en la materia y se han descrito por ejemplo en Deutscher, Methods
in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Purificación de Proteínas:
Principios y Práctica, Springer-Verlag, New York,
(1982). Los pasos de purificación que se seleccionen, dependerán,
por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y
del PRO7133 particular producido.
La presente invención se basa en la
identificación y caracterización de genes que se amplifican en
ciertas células cancerosas.
El genoma de organismos procariotas y eucariotas
está sometido aparentemente a dos requerimientos en conflicto. El
primero es la preservación de la propagación del ADN como
información genética en su forma original, para garantizar la
herencia estable a través de múltiples generaciones. Y el segundo,
que las células o los organismos han de ser capaces de adaptarse a
cambios ambientales constantes. Los mecanismos adaptativos pueden
incluir modificaciones cualitativas o cuantitativas de su material
genético. Las modificaciones cualitativas incluyen las mutaciones
de ADN, en las que las secuencias codificantes son alteradas
resultando en una proteína estructural o funcionalmente diferente.
La amplificación génica es la modificación cuantitativa, por la cual
el número actual de secuencia codificante completa, es decir un
gen, aumenta, llevando a un aumento en el número de moldes
disponibles para la transcripción, un número aumentado de
transcritos traducibles y, finalmente, a un aumento en la
abundancia de la proteína codificada por el gen amplificado.
El fenómeno de la amplificación y sus mecanismos
subyacentes han sido investigados in vitro en algunos
sistemas de cultivo de procariotas y ecuariotas. El ejemplo mejor
caracterizado de amplificación génica se refiere al cultivo de
células eucariotas en medio que contienen concentraciones variables
de un compuesto citotóxico, como el metotrexate (MTX). El MTX es un
análogo del ácido fólico que interfiere en la síntesis de ADN al
bloquear la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). Durante la
exposición inicial a bajas concentraciones de MTX, la mayoría de
las células (>99,9%) morirán. Un pequeño número de células
sobrevive y son capaces de crecer en concentraciones en aumento de
MTX al producir cantidades mayores de ARN y proteína DHFR. La base
de esta sobreproducción es la amplificación de un gen único, el
DHFR. Las copias adicionales del gen se encuentran en copias
extracromosomales en la forma de pequeños, cromosomas
supernumerarios (dobles minutos) o como copias integradas en los
cromosomas.
La amplificación génica conlleva generalmente el
desarrollo de la resistencia a compuestos citotóxicos (antibióticos
para bacterias y agentes quimioterapéuticos para células eucariotas)
y la transformación neoplásica. La transformación de células
eucariotas como un acontecimiento espontáneo o debido a una
exposición viral o químico/ambiental está asociada típicamente a
cambios en el material genético de esas células. Uno de los cambios
genéticos observados comúnmente en los procesos malignos en humanos
son las mutaciones de la proteína p53. La proteína p53 controla la
transición de células de la fase estacionaria (G1) a la fase
replicativa (S) y evita esta transición en presencia de daño en el
ADN. En otras palabras, una de las consecuencias principales de la
inutilización de p53 por mutación es la acumulación y propagación
del daño en el ADN, por ejemplo, cambios genéticos. Los tipos de
cambios genéticos más comunes en células neoplásica son, además de
las mutaciones puntuales, las amplificaciones y las alteraciones
estructurales mayores, como son las translocaciones.
La amplificación de las secuencias de ADN puede
indicar requerimientos específicos funcionales ilustrados en el
sistema experimental de DHFR. Por tanto, la amplificación de ciertos
oncogenes en los procesos malignos indicaría un papel causal de
estos genes en el proceso de transformación maligna y mantenimiento
del fenotipo transformado. Esta hipótesis ha ganado soporte en
estudios recientes. Por ejemplo, la proteína bcl-2
se ha hallado amplificada en ciertos tipos de linfoma de no
Hodgkin. Esta proteína inhibe la apoptosis y lleva a la acumulación
progresiva de células neoplásicas. Los miembros de esta familia
génica de receptores de factores de crecimiento se han encontrado
amplificados en varios tipos de cánceres y se ha sugerido que su
sobreexpresión puede convertir las células neoplásicas en menos
susceptibles a cantidades limitantes de factores de crecimiento
disponible. Los ejemplos incluyen la amplificación del receptor de
andrógenos en el cáncer de próstata recurrente durante la terapia
de deprivación de andrógenos y la amplificación del receptor de
factor de crecimiento homólogo, ERB2, en cáncer de mama.
Últimamente, los genes implicados en la señalización intracelular y
el control de la progresión del ciclo celular sufrir amplificación
durante la transformación maligna. Esto queda ilustrado por la
amplificación de bcl-I y ras en varias neoplasias
epiteliales o linfoides.
Estos primeros estudios ilustran la posibilidad
de identificar las secuencias de ADN amplificadas en neoplasias,
este enfoque puede identificar genes importantes para la
transformación maligna. El caso de ERB2 también demuestra la
posibilidad de un punto de partida terapéutico, ya que las proteínas
transformantes pueden representar dianas novedosas y específicas
para la terapia tumoral.
Se utilizan diferentes técnicas para demostrar
la amplificación de secuencias genómicas. El análisis clásico
citogenético de preparaciones cromosómicas obtenidas a partir de
células cancerosas es adecuado para la identificación de
alteraciones estructurales mayores, como translocaciones, deleciones
e inversiones. Las regiones genómicas amplificadas pueden
visualizarse sólo si están implicadas regiones amplias con un número
alto de copias o si está presente material extracromosómico. La
citogenética ha sido la primera técnica en demostrar la asociación
consistente en cambios cromosómicos específicos con neoplasias
particulares pero no es adecuada para la identificación y el
aislamiento de secuencias manejables de ADN. La técnica desarrollada
más recientemente de la hibridación genómica comparativa (CGH) ha
podido ilustrar el fenómeno extendido de la amplificación genómica
en las neoplasias. En ésta, el ADN tumoral o normal se hibrida
simultáneamente en las metafases de células normales y todo el
genoma puede ser cribado mediante análisis de imagen para detectar
las secuencias de ADN que están presentes en el tumor con una
frecuencia aumentada. (Patente internacional WO93/18.186); Gray
et al., Radiation Res., 137:275-289 [1994].
Como procedimiento de cribado, este tipo de análisis ha revelado un
gran número de amplicones recurrentes (tramo de ADN amplificado) en
una variedad de neoplasias humanos. Aunque la CGH es más sensible
que el análisis citogenético clásico en la identificación de los
tramos de ADN amplificados, no permite una identificación rápida y
aislamiento de secuencias codificantes en el amplicón por las
técnicas estándares de genética molecular.
Los procedimientos más sensibles para detectar
la amplificación génica son los ensayos basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Estos ensayos utilizan una cantidad
muy pequeña de ADN tumoral como material de partida, son
exquisitamente sensibles, proporcionan ADN que es susceptible de un
análisis ulterior, por ejemplo por secuenciación, y son adecuados
para el análisis de volúmenes con gran rendimiento.
Los ensayos arriba mencionados no son mutuamente
excluyentes y frecuentemente se usan en combinación para
identificar amplificaciones en neoplasias. Mientras el análisis
citogenético y la CGH representan procedimientos de cribado para
estudiar regiones amplificadas en el genoma entero, los ensayos
basados en la PCR son los más adecuados para la identificación
final de las secuencias codificantes, es decir los genes en las
regiones amplificadas.
De acuerdo con la presente invención, tales
genes han sido identificados por PCR cuantitativa (S. Gelmini et
al., Clin. Chem., 43:752 [1997]), por comparación del ADN de una
variedad de tumores primarios, incluyendo mama, pulmón, colon,
próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículo,
ovario, útero, etc., tumor o líneas celulares tumorales, con el ADN
combinado de donantes sanos. La PCR cuantitativa se lleva a cabo en
un instrumento TaqMan^{TM} (ABI). Los cebadores específicos de los
genes y las sondas fluorogénicas se diseñan en función de las
secuencias codificantes de los ADNs.
Las líneas celulares de carcinoma de pulmón
humano incluyen A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769),
Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772),
H460(SRCC773), SKMES-1(SRCC774),
SW900(SRCC775), H522(SRCC832)y
H810(SRCC833), están todas disponibles en el ATCC. Las
células primarias de tumores humanos de pulmón normalmente derivan
de adenocarcionamas, carcinomas de célula escamosa, carcinomas de
célula grande, carcinomas de célula no pequeña, carcinomas de
célula pequeña, y carcinomas bronco alveolares, e incluyen, por
ejemplo, SRCC724 (adenocarcinoma, abreviado como
"AdenoCa")(LT1), SECC725(carcinoma de célula escamosa,
abreviado como "SqCCA"(LT1A), SRCC726 (adenocarcinoma)(LT2),
SECC727 (adenocarcinoma)(LT3), SRCC728 (adenocarcinoma)(LT4),
SRCC729 (carcinoma de célula escamosa)(LT6), SECC730 (carcinoma de
célula adeno/escamosa)(LT7), SRCC731 (adenocarcinoma)(LT9), SRCC732
(carcinoma de célula escamosa)(LT10), SRCC733/carcinoma de célula
escamosa)(LT11), SRCC734 (adenocarcinoma)(LT12), SRCC735 (carcinoma
de célula adeno/escamosa) (LT13), SRCC736 (carcinoma de célula
escamosa)(LT15), SRCC737 (carcinoma de célula escamosa)(LT16),
SRCC738 (carcinoma de célula escamosa)(LT17), SRCC739 (carcinoma de
célula escamosa)(LT18), SRCC740 (carcinoma de célula
escamosa)(LT19), SRCC741 (carcinoma de célula de pulmón, abreviado
como "LCCa")(LT21), SRCC811 (adenocarcinoma)(LT22), SRCC825
(adenocarcinoma)(LT8), SRCC886 (adenocarcinoma)
(LT25), SRCC887 (carcinoma de célula escamosa) (LT26), SRCC888 (carcinoma adeno-BAC) (LT27), SRCC889 (carcinoma de célula escamosa)(LT28), SRCC890 (carcinoma de célula escamosa)(LT29), SRCC891 (adenocarcinoma)(LT30), SRCC892 (carcinoma de célula escamosa)(LT31), SRCC894 (adenocarcinoma) (LT33). También se incluyen tumores de pulmón humano denominados como SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129[HF-000643], SRCC1133[HF-000840], SRCC1135[HF-000842], SRCC1227[HF-001291], SRCC1229[HF-001293], SRCC11230[HF-001294], SRCC1231[HF-001295], SRCC1232[HF-001296], SRCC1233[HF-001297], SRCC1235[HF-001299] y SRCC1236[HF-001300].
(LT25), SRCC887 (carcinoma de célula escamosa) (LT26), SRCC888 (carcinoma adeno-BAC) (LT27), SRCC889 (carcinoma de célula escamosa)(LT28), SRCC890 (carcinoma de célula escamosa)(LT29), SRCC891 (adenocarcinoma)(LT30), SRCC892 (carcinoma de célula escamosa)(LT31), SRCC894 (adenocarcinoma) (LT33). También se incluyen tumores de pulmón humano denominados como SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129[HF-000643], SRCC1133[HF-000840], SRCC1135[HF-000842], SRCC1227[HF-001291], SRCC1229[HF-001293], SRCC11230[HF-001294], SRCC1231[HF-001295], SRCC1232[HF-001296], SRCC1233[HF-001297], SRCC1235[HF-001299] y SRCC1236[HF-001300].
Las líneas celulares de cáncer de colon
incluyen, por ejemplo, las líneas celulares de la ATCC SW480
(adenocarcinoma, SRCC776), SW620 (metástasis de nódulos linfáticos
de adenocarcinoma de colon, SRCC777), Colo320 (carcinoma, SRCC778),
HT29 (adenocarcinoma, SRCC779), HM7 (una variante de la línea
celular de adenocarcinoma de colon del ATCC altamente productora de
mucina, SRCC780, obtenida del Dr. Robert Warren, UCSF), CaWiDr
(adenocarcinoma, SRCC781 HCT116 (carcinoma, SRCC782), SKCO1
(adenocarcinoma, SRCC783), SW403 (adenocarcinoma, SRCC784), LS174T
(carcinoma, SRCC785), Colo205 (carcinoma, SRCC828), HCT15
(carcinoma, SRCC829), HCC2998 (carcinoma, SECC830), y KM12
(carcinoma, SRCC831). Los tumores de colon primarios incluyen los
adenocarcinomas de colon denominados como CT2 (SRCC742), CT3
(SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC754), CT12 (SRCC746), CT14
(SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1
(SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7
(SRCC755), CT9 (SRCC756), CT1 (SRCC757), CT18 (SRCC758), CT19
(adenocarcinoma, SRCC906), CT20 (adenocarcinoma, SRCC907), CT21
(adenocarcinoma, SRCC908), CT22 (adenocarcinoma, SRCC909), CT23
(adenocarcinoma, SRCC910), CT24 (adenocarcinoma, SRCC911), CT25
(adenocarcinoma, SRCC912), CT26 (adenocarcinoma, SRCC913), CT27
(adenocarcinoma, SRCC914), CT28 (adenocarecinoma, SRCC915), CT29
(adenocarcinoma, SRCC916), CT30 (adenocarcinoma, SRCC917), CT31
(adenocarcinoma, SRCC918), CT32 (adenocarcinoma, SRCC919), CT33
(adenocarcinoma, SRCC920), CT35 (adenocarcinoma, SRCC921), y CT36
(adenocarcinoma, SRCC922). También se incluyen los derivados de
tumores de colon humanos denominados como SRCC 1051
[HF-000499], SRCC1052 [HF-000539],
SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054
[HF-000698], SRCC1059 [HF-000755],
SRCC1060 [HF-000756], SRCC 1142
[HF-000762], SRCC1144 [HF-000789],
SRCC1146 [HF-000795] y SRCC1148
[HF-000811].
Las líneas celulares de carcinoma de mama humano
incluyen, por ejemplo, HBL100 (SRCC759), MB435s
(SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB 175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765). MCF7 (SRCC760) y SKBR3 (SRCC767), y de tumores de mama humano designados como SRCC1057 [HF-000545]. También se incluyen los tumores de mama humanos designados como SRCC1094, SRCC 1095, SRCC1096,
SRCC1097, SRCC10980, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y tumor de mama-met-pulmón humano designado como SRCC893 [LT32].
(SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB 175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765). MCF7 (SRCC760) y SKBR3 (SRCC767), y de tumores de mama humano designados como SRCC1057 [HF-000545]. También se incluyen los tumores de mama humanos designados como SRCC1094, SRCC 1095, SRCC1096,
SRCC1097, SRCC10980, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y tumor de mama-met-pulmón humano designado como SRCC893 [LT32].
Los tumores de recto humano incluyen SRCC989
[HF-000550] y SRCC982
[HF-000551].
Los tumores de riñón humano incluyen SRCC989
[HF-000611] y SRCC1014
[HF-000613].
Los tumores de testículo humano incluyen
SRCC1001 [HF-000733] y el tumor marginal del
testículo SRCC999 [HF-000716].
Los tumores de paratiroides humana incluyen
SRCC1002 [HF-000831] y SRC1003 [000832].
Los tumores de nódulo linfático humano incluyen
el SRCC 1004 [HF-000854], SRCC1005
[HF-000855] y
SRCC1006 [000856].
SRCC1006 [000856].
Los resultados de los ensayos de amplificación
génica de la presente invención pueden ser verificados
posteriormente mediante otros análisis, tal como la determinación de
la expresión de ARNm en varios tejidos humanos.
Como se ha indicado antes, la amplificación
génica o/y la expresión génica en varios tejidos puede
cuantificarse por técnicas convencionales como la transferencia de
Southern, la transferencia de Northern para cuantificar la
expresión del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:5201-5205 [1980]), la transferencia de mancha
(análisis del ADN), o la hibridación in situ, utilizando una
sonda adecuada, basada en las secuencias que se proporcionan aquí.
De forma alternativa, los anticuerpos pueden emplearse para el
reconocimiento de dúplex específicos, incluidos los dúplex de ADN,
de ARN, de híbridos ADN-ARN o de
ADN-proteína.
La expresión génica en varios tejidos también
puede cuantificarse mediante procedimiento inmunológicos, como la
tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo del
cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente
la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la
tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo en muestras de fluidos
pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y pueden preparase
en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden
prepararse contra la secuencia nativa del polipéptido PRO7133 o
contra el péptido sintético basado en las secuencias proporcionadas
aquí o contra la secuencia exógena unida a la secuencia de ADN
PRO7133 y que codifica para el epitopo del anticuerpo específico.
Las técnicas generales, para generar anticuerpos, y protocolos
especiales para la transferencia de Northern e hibridación in
situ se proporcionan aquí más abajo.
Si la amplificación de un gen dado es relevante
funcionalmente, el gen debería amplificarse más que las regiones
genómicas vecinas que no son tan importantes para la supervivencia
del tumor. Para su comprobación, el gen puede ser localizado en un
cromosoma determinado, por ejemplo, mediante el ensayo de híbridos
de radiación. El nivel de amplificación se determina entonces en la
localización identificada, y en las regiones vecinas. La
amplificación selectiva o preferente en la región genómica en la que
el gen se ha localizado es consistente con la posibilidad de que la
amplificación génica observada promueva el crecimiento tumoral o su
supervivencia. El mapeo cromosómico incluye tanto la región de
trabajo determinada como el el epicentro. Para más detalles véase,
por ejemplo, Stewart et al., Genome Research,
7:422-433 (1997).
Los resultados del estudio de amplificación
génica pueden además verificarse mediante estudios de unión de
anticuerpos, en los que se analiza la capacidad de los anticuerpos
anti-PRO577 para inhibir la expresión de los
polipéptidos PRO7133 en las células del tumor (cáncer). Ejemplos de
anticuerpos son el policlonal, monoclonal, humanizado,
biespecífico, y heteroconjugado, la preparación de los cuales se
describe aquí más adelante.
Los resultados del estudio de amplificación
génica pueden además llevarse a cabo con cualquier procedimiento de
ensayo conocido, como los ensayos de unión competitiva, ensayos en
sánwich directo o indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación.
Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.
147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la
capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la
muestra a analizar por la unión con una cantidad limitada de
anticuerpo. La cantidad de proteína diana (codificada por un gen
amplificado en una célula tumoral) en la muestra a analizar es
inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une al
anticuerpo. Para facilitar la determinación de la cantidad de
estándar que resulta unido, preferentemente, los anticuerpos se
insolubilizan antes o después de la competición, así el estándar y
el analito unidos al anticuerpo pueden separarse de forma adecuada
del estándar y del analito que permanecen sin unir.
Los ensayos sándwich implican el uso de dos
anticuerpos, cada uno capaz de unirse a diferentes regiones
inmunogénicas o epítopos de la proteína a detectar. En un ensayo de
sándwich, el analito de la muestra a analizar se une a un primer
anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y a
continuación un segundo anticuerpo se une al analito, formando así
un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, la patente
americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado
con un grupo detectable (ensayos sándwich directos) o puede medirse
usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que esté
marcado con un grupo detectable (ensayos sándwich indirectos). Por
ejemplo, un ensayo de sándwich es un ensayo de inmunoabsorción
enzimática ELISA, en cuyo caso el grupo detectable es una
enzima.
Para inmunohistoquímica, la muestra tumoral debe
ser fresca o congelada o puede estar embebida en parafina y fijada
con un conservante como formalina, por ejemplo.
Se pueden usar ensayos basados en células y
modelos animales para tumores (por ejemplo, cánceres) para
verificar los hallazgos del ensayo de amplificación génica, y
mejorar el conocimiento de la relación entre los genes
identificados aquí y el desarrollo de la patogénesis del crecimiento
celular neoplásico. El papel de los productos génicos identificados
aquí en el desarrollo y la patología de un tumor o cáncer puede
analizarse usando células tumorales primarias o líneas celulares en
las que se haya observado amplificación de dichos genes. Tales
células incluyen, por ejemplo, células de cáncer de mama, colon y
pulmón y las líneas celulares indicadas anteriormente.
En una aproximación diferente, se transfectan
células de un tipo celular del que se conoce su implicación en un
tumor en particular con los ADNcs aquí descritos y se analiza la
capacidad de estos ADNcs de inducir un crecimiento desmedido. Entre
las células adecuadas se incluyen, por ejemplo, líneas celulares
tumorales estables tales como la línea celular
B104-1-1 (línea celular
NIH-3T3 transfectada de forma estable con el
protooncogen neu) y células NIH-3T3
transfectadas con ras, que pueden ser transfectadas con el gen
deseado y controladas respecto a su crecimiento tumorigénico.
Dichas líneas celulares transfectadas pueden ser usadas para
analizar la capacidad de anticuerpos poli o monoclonales o de
mezclas de anticuerpos para inhibir el crecimiento celular
tumorigénico al ejercer una acción citostática o citotóxica sobre el
crecimiento de las células transformadas, o mediante la
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Las células
transfectadas con las secuencias codificantes de los genes
identificados aquí pueden usarse además para la identificación de
fármacos candidatos para el tratamiento del
cáncer.
cáncer.
Además, pueden usarse los cultivos primarios
derivados de tumores en animales transgénicos (tal como se describe
más adelante) en los ensayos basados en células aquí descritos,
aunque se prefieren las líneas celulares estables. Son bien
conocidas en el área las técnicas para obtener líneas celulares
continuas a partir de animales transgénicos (véase, por ejemplo,
Small et al., Mol. Cell. Biol. 5:642-618
[1985]).
Es posible utilizar una variedad de modelos
animales bien conocidos para entender en mayor profundidad el papel
de los genes identificados aquí en el desarrollo y la patogénesis
tumoral, y para analizar la eficacia de los agentes terapéuticos
candidatos, incluyendo anticuerpos y otros antagonistas de los
polipéptidos nativos, incluyendo moléculas pequeñas que actúan como
antagonistas. La naturaleza in vivo de dichos modelos los
hace particularmente útiles para predecir respuestas en pacientes
humanos. Entre los modelos animales de tumores y canceres (por
ejemplo, cáncer de mama, de colon, de próstata, de pulmón, etc.) se
incluyen tanto animales no recombinantes como recombinantes
(transgénicos). Entre los modelos animales no recombinantes se
incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos murinos.
Tales modelos pueden generarse introduciendo células tumorales en
ratones singénicos usando técnicas habituales, por ejemplo,
inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación
en el bazo, implantación intraperitoneal, implantación bajo la
cápsula renal, o implantación ortotópica, por ejemplo, células de
cáncer de colon implantadas en un tejido colónico (véase, por
ejemplo, la publicación PCT de la patente internacional WO97/33551,
publicada el 18 de Septiembre de 1997).
Probablemente, la especie animal más
frecuentemente utilizada en estudios oncológicos son ratones
inmunodeficientes y, en particular, ratones nude. La
observación de que los ratones nude con hipo/aplasia pueden actuar
con éxito como un huésped para xenoinjertos de tumores humanos ha
llevado a su uso generalizado para este propósito. El gen
autosómico recesivo nu se ha introducido en un gran número de
distintas cepas congénitas de ratones desnudos, incluyendo, por
ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA,
DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII, y S
JL. Además, se han criado y usado como receptores de xenoinjertos
tumorales una amplia variedad de otros animales con defectos
inmunológicos heredados distintos a parte del ratón nude. Para más
detalles véase, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology Research, E.
Boven and B. Winograd, eds., CRC Press, Inc., 1991.
Las células introducidas en dichos animales
pueden derivarse de líneas celulares de un tumor/cáncer conocido,
tales como, cualquiera de las líneas celulares tumorales enumeradas
anteriormente, y, por ejemplo, la línea celular
B104-1-1 (la línea celular
NIH-3T3 transfectada de forma estable con el
protooncogen neu); células NIH-3T3
transfectadas con ras; Caco-2 (ATCC
HTB-37); una línea celular de adenocarcinoma de
colon humano de grado II moderadamente bien diferenciado, las
HT-29 (ATCC HTB-38), o a partir de
tumores y cánceres. Las muestras de células tumorales o cancerosas
pueden obtenerse a partir de pacientes que van a someterse a una
cirugía, usando condiciones estándar, que implican congelación y
almacenamiento en nitrógeno líquido (Karmali et al., Br. J.
Cancer, 48:689-696 [1983]).
Las células tumorales pueden introducirse en
animales, tales como ratones nude, mediante una variedad de
procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratón es muy
apropiado para la implantación de tumores. Los tumores pueden
transplantarse s.c. como bloques sólidos, como biopsias con aguja
usando un trócar o como suspensiones celulares. Para bloques
sólidos o implantaciones por trócar, fragmentos de tejido tumoral de
un tamaño adecuado se introducen en el espacio s.c. Las
suspensiones celulares se preparan en fresco a partir de tumores
primarios o de líneas celulares tumorales estables, y se inyectan
subcutáneamente. Las células tumorales pueden inyectarse como
implantes subdérmicos. En esta localización, el inóculo se deposita
entre la parte inferior del tejido conectivo dérmico y el tejido
s.c. Boven y Winograd (1991), supra.
Se pueden generar modelos animales de cáncer de
mama, por ejemplo, mediante la implantación de células de
neuroblastoma de rata (de las cuales se aisló inicialmente el
oncogen neu) o de células NIH-3T3
transformadas con neu en animales nude, esencialmente
tal como describe Drebin et al., PNAS USA,
83:9129-9133 (1986).
Análogamente, se pueden generar modelos animales
de cáncer de colon transfiriendo células de cáncer de colon a
animales, por ejemplo, ratones nude, lo que lleva a la
aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de
transplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones
nude, por ejemplo por Wang et al., Cancer Research,
54:4726-4728 (1994) y Too et al., Cancer
Research, 55:681-684 (1995). Este modelo se basa en
el llamado "METAMOUSE" vendido por AntiCancer, Inc., (San
Diego, California).
Los tumores que se generan en los animales
pueden extraerse y cultivarse in vitro. Las células
procedentes de los cultivos in vitro pueden transferirse a
animales. Dichos tumores pueden servir como dianas para análisis
adicionales o para el análisis de fármacos. Alternativamente, los
tumores resultantes de la transferencia pueden aislarse y se puede
analizar el ARN procedente de las células antes de la transferencia
y de las células aisladas después de una o más rondas de
transferencia para determinar la expresión diferencial de los genes
de interés. Dichas técnicas de transferencia pueden realizase con
cualquier línea celular tumoral o cancerosa conocida.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, y
WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente en
ratones hembra BALB/c (DeLeo et al., J. Exp. Med.,
146:720[1977]), que proporcionan un sistema modelo altamente
controlable para el estudio de las actividades antitumorales de
diversos agentes (Palladino et al., J.
Immuno.,138:4023-4032[1987]. Brevemente, se
propagan células tumorales in vitro en cultivo celular. Antes
de la inyección en los animales, las líneas celulares se lavan y se
resuspenden en tampón, a una densidad celular de alrededor de
10x10^{6} a 10x10^{7} cel/ml. Los animales se infectan entonces
subcutáneamente con de 10 a 100 \mul de la suspensión celular,
permitiendo la aparición de un tumor al cabo de una a tres
semanas.
Además, el carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de
ratón, que es uno de los tumores experimentales más ampliamente
estudiados, puede utilizarse como un modelo tumoral investigacional.
La eficacia de este modelo tumoral se ha correlacionado con los
efectos beneficiosos en el tratamiento de pacientes humanos
diagnosticados con carcinoma de células pequeñas de pulmón (SCCL).
Este tumor puede introducirse en ratones normales mediante
inyección de fragmentos de tumor de un ratón afectado o de células
mantenidas en cultivo (Zupi et al., Br. J. Cancer,41:
suppl.4:309 [1980]), y existen evidencias que indican que los
tumores pueden iniciarse a partir de la inyección de incluso una
única célula y que una proporción muy alta de células tumorales
infectadas sobreviven. Para más información sobre este modelo
tumoral véase, Zacharski, Haemostasis, 16:300-320
[1986].
Una manera de evaluar la eficacia de un
compuesto a analizar en un modelo animal sobre un tumor implantado
es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento.
Tradicionalmente, se ha medido el tamaño de los tumores implantados
con un portaobjetos calibrador en dos o tres dimensiones. La medida
limitada a dos dimensiones no refleja de forma precisa el tamaño
del tumor, por tanto, habitualmente se convierte en el volumen
correspondiente usando una fórmula matemática. Sin embargo, la
medida del tamaño del tumor es muy poco precisa. Los efectos
terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor como
el retraso en el crecimiento inducido por el tratamiento y el
retraso específico del crecimiento. Otra variable importante en la
descripción del crecimiento del tumor es el tiempo de duplicación
del volumen del tumor. Están disponibles programas informáticos
para el cálculo y la descripción del crecimiento tumoral, tales como
el programa descrito por Rygaard y Spang-Thomsen,
Proc. 6th Int Workshop on Immune-Deficient Animals.
Wu and Sheng eds., Basel, 1989, 301. Cabe destacar, sin embargo,
que al menos inicialmente, procesos de necrosis y respuestas
inflamatorias pueden realmente dar lugar a un aumento del tamaño
del tumor tras el tratamiento. Por tanto, estos cambios deber ser
supervisados cuidadosamente, mediante una combinación de
procedimientos morfométricos y análisis por citometría de flujo.
Se pueden generar modelos animales recombinantes
(transgénicos) introduciendo la región codificante de los genes
identificados aquí en el genoma de los animales de interés, usando
técnicas estándar para la producción de animales transgénicos.
Entre los animales que pueden ser objeto de manipulación transgénica
se incluyen, sin limitaciones, ratones, ratas, conejos, cobayas,
cordero, cabras, cerdos y primatos no humanos, e.j., babuinos,
chimpancés y monos. Entre las técnicas conocidas en el área para
introducir un transgen en dichos animales se incluye la
microinyección pronuclear (Hoppe y Wanger, patente americana U.S.
4.873.191); la transferencia génica en líneas germinales mediante
retrovirus (e.j., Van der Putten et al., Proc Natl. Aca.
Sci. USA, 82:6148-615[1985]; la recombinación
homóloga en células madre embrionarias (Thompson et al.,
Cell, 56:313-321 [1989]); la electroporación de
embriones (Lo, Mol. Cell Biol., 3:1803-1814 [1983]);
la transferencia génica mediante esperma (Lavitrano et al.,
Cell, 57:717-73 [1989]). Véase, por ejemplo, la
patente americana U.S. 4.736.866 para revisar el tema.
Para el objetivo de la presente invención, en
los animales transgénicos se incluyen también aquellos que portan
el transgen sólo en una parte de sus células (animales mosaico). El
transgen puede integrarse como un único transgen, o en
concatámeros, por ejemplo, tándem cabeza-cabeza,
cabeza-cola. La introducción selectiva de un
transgen en un tipo de célula en particular también es posible
siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:6232-636 (1992).
La expresión del transgen en los animales
transgénicos puede controlarse mediante técnicas estándar. Por
ejemplo, puede utilizarse el análisis de transferencia de Southern o
la amplificación por PCR para verificar la integración del
transgen. El nivel de expresión de ARNm puede analizarse entonces
usando técnicas como la hibridación in situ, el análisis por
transferencia de Northern, la PCR, o la inmunocitoquímica. Los
animales se examinan además para determinar signos de desarrollo
canceroso o tumoral.
Alternativamente, se pueden generar animales
genéticamente deficientes, los cuales tienen un gen anormal o
alterado que codifica para un polipéptido PRO7133 identificado aquí,
como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno
que codifica por el polipéptido y un ADN genómico alterado que
codifica por el mismo polipéptido introducido en una célula
embriónica del animal. Por ejemplo, puede usarse el ADNc que
codifica por el polipéptido PRO7133 para clonar el ADN genómico que
codifica este polipéptido según técnicas establecidas. Una fracción
del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO7133 en particular
puede ser eliminada o reemplazada por otro gen, tal como un gen que
codifique un marcador seleccionable que puede utilizarse para hacer
un seguimiento de la integración. Típicamente, se incluyen en el
vector varias kilobases de ADN flanqueante no modificado (tanto en
los extremos 5' como 3') [véase, por ejemplo, Thomas and Capecchi,
Cell, 51:503 (1987) para la descripción de la recombinación
homóloga de vectores]. El vector se introduce en una línea de
células madre embrionarias (por ejemplo, por electroporación) y se
seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha
recombinado homólogamente con el ADN endógeno [véase, por ejemplo,
Li et al., Cell, 69:915(1992)]. Las células
seleccionadas se inyectan entonces en un blastocito de un animal
(por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de
agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinormas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed.
(IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. A continuación un
embrión quimérico puede implantarse en un animal adoptivo
apropiado, una hembra seudopreñada, y el embrión puede llevarse a
término para crear un animal genéticamente deficiente o
"knock-out". La progenie que presenta el ADN
recombinado homólogamente en sus células germinales puede
identificarse mediante técnicas estándares y usarse para criar
animales en los que todas las células del animal contengan el ADN
recombinado homólogamente. Los animales knock-out
pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse
contra ciertas condiciones patológicas y por el desarrollo de
condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido
PRO7133.
La eficacia de anticuerpos que se unen
específicamente a los polipéptidos aquí identificados y a otros
fármacos candidatos, puede analizarse también para el tratamiento de
tumores animales espontáneos. Una diana adecuada para dichos
estudios es el carcinoma oral felino de células escamosas (SCC). El
SCC oral felino es un tumor maligno altamente invasivo, es el tumor
oral más común en gatos, ya que supone un 60% de los tumores orales
descritos en esta especie. Raramente metastatiza en regiones
distales, aunque esta baja incidencia de metástasis puede ser un
mero reflejo del corto tiempo de supervivencia que muestran los
gatos con este tumor. Habitualmente, estos tumores no son
susceptibles de cirugía, principalmente debido a la anatomía de la
cavidad oral del felino. En la actualidad, no existe un tratamiento
efectivo para este tumor. Antes de entrar en el estudio, cada gato
se somete a un examen clínico completo, a biopsia y es escaneado
mediante tomografía computerizada (CT). Los gatos a los que se les
diagnostica un tumor oral sublingual de células escamosas se
excluyen del estudio. La lengua puede llegar a paralizarse como
resultado de dicho tumor, e incluso si el tratamiento destruye el
tumor, los animales pueden no ser capaces de alimentarse por sí
solos. Cada gato se trata de forma repetida, durante un largo
período de tiempo. Se toman fotografías de los tumores diariamente
durante el período de tratamiento, y en cada chequeo subsecuente.
Tras el tratamiento, cada gato se somete a otro escaner CT. A
partir de entonces, los escáneres por CT y las radiografías
torácicas se evalúan cada 8 semanas. Se analizan los datos en busca
de diferencias en la supervivencia, la respuesta y la toxicidad en
comparación con los grupos control. Una repuesta positiva puede
requerir evidencias de la regresión tumoral, preferentemente con
una mejora en la calidad de vida/o un aumento en el tiempo de
vida.
Además también pueden analizarse otros tumores
animales espontáneos, tales como el fibrosarcoma, el
adenocarcinoma, el linfoma, el condroma, el leiomiosarcoma de
perros, gatos y babuinos. De estos, el adenocarcinoma mamario en
perros y gatos es el modelo preferido ya que su apariencia y
comportamiento es muy similar al de los humanos. Sin embargo, el
uso de este modelo está limitado por la baja incidencia de este tipo
de tumores en animales.
Los ensayos de cribado de fármacos candidatos
están diseñados para identificar compuestos que se unan o formen
complejos con los polipéptidos codificados por los genes
identificados aquí, o de otro modo interfieran en la interacción de
los polipéptidos con otras proteínas celulares. Tales ensayos de
cribado incluirán ensayos susceptibles de estudios a gran escala o
bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para la
identificación de pequeñas moléculas como fármacos candidatos. Entre
las pequeñas moléculas contempladas se incluyen compuestos
sintéticos orgánicos o inorgánicos, incluyendo péptidos,
preferentemente péptidos solubles, fusiones de
(poli)péptidos e inmunoglobulinas, y, en particular,
anticuerpos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli y
monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola
cadena, anticuerpos antiidiotípicos, y versiones quiméricas o
humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos
humanos y fragmentos de los mismos. Los ensayos pueden realizarse
en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión de
proteína-proteína, ensayos bioquímicos,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en el área.
Todos los ensayos tienen en común que requieren
el contacto del fármaco candidato con un polipéptido codificado por
un ácido nucleico aquí identificado en condiciones adecuadas y
durante un tiempo suficiente como para permitir que estos dos
componentes interaccionen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado puede así aislarse o detectarse en la mezcla
de reacción. En una realización en particular, el polipéptido
codificado por el gen identificado aquí o el fármaco candidato se
inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, en una microplaca,
mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente
generalmente se consigue mediante el recubrimiento de una
superficie sólida con una solución del polipéptido y dejándolo
secar. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo,
un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido a ser
inmovilizado puede usarse para fijarlo a una superficie sólida. El
ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, que
puede ser marcado con un marcaje detectable, al componente
inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el
componente fijado. Cuando la reacción se ha completado, se eliminan
los componentes que no han reaccionado, por ejemplo, lavando, y se
detectan los complejos fijados en la superficie sólida. Cuando el
componente no inmovilizado en un principio lleva un marcaje
detectable, la detección del marcaje inmovilizado en la superficie
indica que el complejo se ha formado. Si el componente no
inmovilizado en un principio no lleva un marcaje, la formación del
complejo debe detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado
que se una específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona pero no
se une a un polipéptido PRO7133 en particular codificado por un gen
identificado aquí, su interacción con este polipéptido debe ser
analizada mediante procedimientos bien conocidos para detectar
interacciones proteína- proteína. Dichos ensayos incluyen
aproximaciones tradicionales, tales como el entrecruzamiento, la
coinmunoprecipitación, y la copurificación a través de gradientes o
en columnas cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína pueden controlarse mediante un
sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y
colaboradores [Fields and Song, Nature, 340:245-246
(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88:9578-9582 (1991)] como se describe en Chevray and
Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793
(1991)]. Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de
levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente
discretos, uno que actúa como el dominio de unión a ADN, mientras
el otro funciona como el dominio de activación de la transcripción.
El sistema de expresión en levadura descrito en las publicaciones
antes mencionadas (generalmente denominados como "sistema del
doble híbrido") toma ventaja de esta propiedad, y utiliza dos
proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está fusionada
al dominio de unión del ADN de GAL4, y otra en la que las que
proteínas activadoras candidatas se fusionan al dominio de
activación. La expresión de un gen reportero GAL1/lacZ bajo
el control de un promotor activado por GAL4, depende de la
reconstitución de la actividad GAL4 a través de la interacción
proteína-proteína. Las colonias que contienen
polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato
cromogénico para la \beta-galactosidasa. Existe
un equipo reactivo completo (MATCHMAKER^{TM}) disponible
comercialmente por Clontech para la identificación de interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
usando la técnica del doble híbrido. Este sistema también puede
utilizarse para localizar dominios proteicos implicados en
interacciones proteicas específicas así como para señalar los
residuos aminoacídicos que son cruciales para estas
interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen identificado aquí que codifica PRO7133,
PRO313, y otros componentes intra o extracelulares pueden ser
analizados como sigue: habitualmente una mezcla de reacción se
prepara conteniendo el producto del gen amplificado y el componente
intra o extracelular en condiciones tales y durante un tiempos
suficiente que se permita la interacción y la unión de los dos
productos. Para determinar la capacidad de un compuesto a analizar
de inhibir la unión, la reacción se realiza en ausencia y en
presencia del compuesto a analizar. Además, puede añadirse un
placebo a una tercera mezcla de reacción, para utilizarla como
control positivo. La unión (formación del complejo) entre el
compuesto a analizar y el componente intra o extracelular presente
en la mezcla se controla tal como se describió anteriormente. La
formación de un complejo en la(s) reacción(es) control
pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto a
analizar indica que dicho compuesto interfiere en su interacción con
su pareja de reacción.
Para analizar antagonistas, el polipéptido
PRO7133 puede añadirse a una célula junto con el compuesto a
analizar para una actividad en particular, y la capacidad del
compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del
polipéptido PRO7133 indica que el compuesto es un antagonista del
polipéptido PRO7133. Alternativamente, se pueden detectar
antagonistas mediante la combinación del polipéptido PRO7133 y un
potencial antagonista con receptores del polipéptido PRO7133 unidos
a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones adecuadas
para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO7133
puede marcarse, mediante por ejemplo radioactividad, de forma que
el número de moléculas del polipéptido PRO7133 unidas al receptor
pueden usarse para determinar la eficacia del potencial
antagonista. El gen que codifica el receptor puede identificarse
mediante numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la
materia, por ejemplo, utilización de un panel de ligandos y
separación por FACS. Coligan et al., Current Protocolos in
Immun., 1(2): capítulo 5(1991). Preferentemente, se
emplea el clonación de expresión en donde se prepara ARN
poliadenilado a partir de una célula que responde al polipéptido
PRO7133 y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se
divide en grupos y se usa para transfectar células COS u otras
células que no responden al polipéptido PRO7133. Las células
transfectadas que han crecido en portaobjetos de cristal se exponen
al polipéptido PRO7133 marcado. El polipéptido PRO7133 puede
marcarse mediante distintos sistemas incluyendo la yodinación o la
inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa
de unión sitio-específica. Tras la fijación e
incubación, los portaobjetos se someten a un análisis
autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican y se preparan
subgrupos y se retransfectan usando un subagrupamiento interactivo
y un nuevo proceso de análisis dando lugar, eventualmente, a un
único clon que codifica para el receptor putativo.
Como una aproximación alternativa para la
identificación de un receptor, el polipéptido PRO7133 marcado puede
unirse por fotoafinidad con preparaciones de membrana celular o
extractos que expresan la molécula del receptor. El material
entrecruzado se resuelve por PAGE y se expone a una película de
rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede
cortarse, separarse en pequeños fragmentos y someterse a
microsecuenciación de proteínas. La secuencia aminoacídica obtenida
por microsecuenciación sería usada para diseñar un conjunto de
sondas de oligonucleótidos degenerados para analizar una biblioteca
de ADNc e identificar el gen que codifica el receptor putativo.
En otro ensayo para identificar antagonistas, se
incubarían células de mamífero o una preparación de membrana que
expresen el receptor con el polipéptido PRO7133 marcado en presencia
del compuesto candidato. Puede así medirse la capacidad del
compuesto de aumentar o bloquear esta interacción.
Ejemplos más específicos sobre potenciales
antagonistas incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con el polipéptido PRO7133 y, en particular,
anticuerpos incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli y
monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena
sencilla, anticuerpos antiidiotípicos, y versiones quiméricas o
humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de estos anticuerpos.
Alternativamente, un potencial antagonista puede ser una proteína
estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del
polipéptido PRO7133 que reconozca el receptor pero que no ejerza
ningún efecto, por tanto, inhibiendo competitivamente la acción del
polipéptido PRO7133.
Otro antagonista potencial del polipéptido
PRO7133 es una construcción antisentido de ARN o ADN preparada
usando la tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una
molécula de ADN o ARN antisentido actúa bloqueando directamente la
traducción de un ARNm mediante la hibridación con el ARNm diana y
evitando la traducción de la proteína. La tecnología antisentido
puede usarse para controlar la expresión génica a través de la
formación de una triple hélice o del ADN o ARN antisentido, ambos
procedimientos basados en la unión de un polinucleótido al ADN o al
ARN. Por ejemplo, la región codificante 5' de la secuencia
polinucleotídica, que codifica por el polipéptido maduro PRO7133 de
esta invención se usa para diseñar un oligonucleótido antisentido de
ARN de alrededor de 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña
un oligonucleótido de ADN que sea complementario a una región del
gen implicado en la transcripción (triple hélice- véase, Lee et
al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al.,
Science, 241:456 (1988): Dervan et al., Science, 251:1360
(1991)], evitando así la transcripción y la producción del
polipéptido PRO7133. El oligonucleótido antisentido de ARN hibrida
con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula
de ARNm en el polipéptido PRO7133
(antisentido-Okano, Neurochem., 56:560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresión (CRC
Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos
anteriormente pueden también liberarse a células de forma que el
ARN o ADN antisentido puede ser expresado in vivo para
inhibir la producción del polipéptido PRO7133. Cuando se usa un ADN
antisentido, se prefieren oligodesoxiribonucleótidos derivados a
partir de la región de inicio de la traducción, por ejemplo, entre
las posiciones de aproximadamente -10 a +10 de la secuencia
nucleotídica del gen diana.
Las moléculas de ADN o ARN antisentido tienen
generalmente una longitud de al menos aproximadamente 5 bases, de
aproximadamente 10 bases, de aproximadamente 15 bases, de
aproximadamente 20 bases, de aproximadamente 25 bases, de
aproximadamente 30 bases, de aproximadamente 35 bases, de
aproximadamente 40 bases, de aproximadamente 45 bases, de
aproximadamente 50 bases, de aproximadamente 55 bases, de
aproximadamente 60 bases, de aproximadamente 65 bases, de
aproximadamente 70 bases, de aproximadamente 75 bases, de
aproximadamente 80 bases, de aproximadamente 85 bases, de
aproximadamente 90 bases, de aproximadamente 95 bases, de
aproximadamente 100 bases, o más.
Entre los potenciales antagonistas se incluyen
moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, al sitio de unión
al receptor, o del factor de crecimiento u otro sitio de unión
relevante del polipéptido PRO7133, bloqueando así la actividad
biológica normal del polipéptido PRO7133. Entre los ejemplos de
pequeñas moléculas se incluyen, pero no está limitado a, pequeños
péptidos o moléculas de tipo peptídico, preferentemente, péptidos
solubles, y compuestos sintéticos orgánicos no peptídicos o
inorgánicos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la fragmentación específica del ARN. Las
ribozimas actúan mediante hibridación a secuencias específicas del
ARN diana complementario, seguido por el corte endonucleolítico.
Los sitios de corte de la ribozima dentro de un potencial ARN diana
se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para más
detalles véase, por ejemplo, Rossi Current Biology, 4:
469-471 (1994), y la publicación PCT de la patente
internacional 97/33.551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucléico en formación de
triple hélice usadas para inhibir la transcripción deberán ser de
cadena sencilla y compuestas por desoxinucleótidos. La composición
de bases de estos oligonucleótidos se diseña de forma que se
promueva la formación de la triple hélice a través de las reglas de
apareamiento de bases de Hoogsteen, las cuales generalmente
requieren considerables tramos de purinas o pirimidinas en una
cadena del dúplex. Para más detalles véase, por ejemplo, la
publicación PCT de la patente internacional WO 97/33551,
supra.
Estas pequeñas moléculas pueden identificarse
mediante uno o más de los ensayos de análisis descritos aquí
anteriormente y/o mediante cualquier otra técnica de análisis bien
conocida por los expertos en la materia.
Las composiciones útiles en el tratamiento de
tumores asociados con la amplificación de los genes identificados
aquí, incluyen sin limitación, anticuerpos, pequeñas moléculas
orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas de
ribozima antisentido, moléculas de triple hélice, etc, que inhiban
la expresión y/o la actividad del producto del gen diana.
Por ejemplo, moléculas de ARN y ARNs antisentido
actúan para bloquear directamente la traducción del ARNm mediante
la hibridación al ARNm diana y evitando así la traducción proteica.
Cuando se usa un ADN antisentido, se prefieren
oligodesoxiribonucleótidos derivados a partir del sitio de inicio de
la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente de la posición
-10 a la +10 de la secuencia nucleotídica del gen diana.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la fragmentación específica del ARN. Las
ribozimas actúan mediante hibridación a secuencias específicas del
ARN diana complementario, seguido por el corte endonucleolítico.
Los sitios de corte específicos de la ribozima dentro de un
potencial ARN diana se pueden identificar mediante técnicas
conocidas. Para más detalles véase, por ejemplo, Rossi, Current
Biology, 4:469-471 (1994), y la publicación PCT de
la patente internacional WO 97/33.551 (publicada el 18 de Septiembre
de 1997).
Las moléculas de ácidos nucléicos en formación
de triple hélice usadas para inhibir la transcripción suelen ser de
cadena sencilla y compuestas por desoxinucleótidos. La composición
de bases de estos oligonucleótidos se diseña de forma que promueva
la formación de la triple hélice a través de las reglas de
apareamiento de bases de Hoogsteen, las cuales generalmente
requieren considerables tramos de purinas o pirimidinas en una
cadena de un dúplex. Para más detalles véase, por ejemplo, la
publicación PCT de patente internacional WO 97/33.551,
supra.
Estas moléculas pueden identificarse mediante
una o más de los ensayos de análisis descritos aquí anteriormente
y/o mediante cualquier otra técnica de análisis bien conocida para
aquellos expertos en el área.
Algunos de los fármacos candidatos más
prometedores según la presente invención son anticuerpos y
fragmentos de anticuerpos que pueden inhibir la producción o el
producto del gen de los genes amplificados identificados aquí y/o
reducir la actividad de los productos del gen.
Los procedimientos para la preparación de
anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos. Los
anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por
ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y,
si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el
adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples
inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante
puede incluir el polipéptido PRO7133 o una fusión proteica del
mismo. Puede ser útil la conjugación del agente inmunizante a una
proteína de la que se conoce su poder inmunogénico en el mamífero
que va a ser inmunizado. Entre los ejemplos de dichas proteínas
inmunogénicas se incluyen, pero sin limitarse a, la hemocianina de
lapa, la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina, y el inhibidor de
la tripsina de soja. Entre los ejemplos de los adyuvantes que
pueden ser utilizados se incluyen el adyuvante completo de Freund's
y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A,
dicorinomicolato síntetico de trehalosa). El protocolo de
inmunización puede seleccionarse por los expertos en la materia sin
excesiva experimentación.
Los anticuerpos contra el PRO7133 pueden ser,
alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse usando procedimientos del hibridoma,
como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495
(1975). En un procedimiento del hibridoma, un ratón, un hámster, u
otro animal huésped apropiado, es típicamente inmunizado con un
agente inmunizante que da lugar a linfocitos que producen o son
capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente con
el agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser
inmunizados in vitro.
El agente inmunizante típicamente incluirá el
polipéptido PRO7133, incluyendo fragmentos, o una proteína de
fusión de dicha proteína o un fragmento de los mismos. Generalmente,
se usan tanto linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se
desean células de origen humano, como células de bazo o de nódulos
linfáticos si se desean fuentes mamíferas no humanas. Los
linfocitos se fusionan entonces con una línea celular inmortalizada
usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para
formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.
59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son
habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente
células de mieloma de origen murino, bovino y humano.
Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o
ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de
cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más substancias
que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células
inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas
incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio
"HAT"), substancias que evitan el crecimiento de las células
deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquellas que se fusionan de forma eficiente, soportan un nivel
de expresión elevado y estable del anticuerpo por las células
productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio
como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más
preferibles son líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por
ejemplo, a partir del Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, California y a partir del American Type Culture Collection
(ATCC), Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano
de heteromieloma ratón-humano también se han
descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos
[Kozbor, J. Immunol.,133:3001 (1984); Brodeur et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel
Dekker, Inc., New Cork, (1987) pp. 51-63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede analizarse para determinar la presencia
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO7133.
Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
por inmunoprecipitación o mediante ensayos de unión in vitro
como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunoabsorción
enzimática (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en el
área. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por
ejemplo, determinarse a través del análisis de Scatchard de Munson y
Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, es posible subclonar los clones mediante procedimientos
de selección por dilución limitante y crecerlos mediante
procedimientos estándares [Goding, supra]. Entre los medios
de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo,
el Dulbecco's Modified Eagle's Médium y el medio
RPMI-1640. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden crecerse in vivo como ascitas en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de
cultivo o del fluído ascítico mediante procedimientos convencionales
de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo,
proteína A-Sepharose, cromatografía de
hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía
de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los
descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El ADN que
codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede
aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que
son capaces de unirse específicamente a genes que codifican la
cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos murinos). Las
células de hibridoma de la invención sirven como una fuente
preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse
en vectores de expresión, que son transfectados a continuación en
células huésped, tales como las células COS de simio, las células de
ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de lo
contrario no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la
síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped
recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo,
sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de
las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias
murinas homólogas [Patente americana U.S. 4.816.567; Morrison et
al., supra] o mediante unión covalente a la secuencia
codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia
codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido
no inmunoglobulínico puede sustituirse por los dominios constantes
de un anticuerpo de la invención o puede sustituirse por los
dominios variables de una región de un sitio de combinación con el
antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo
bivalente
quimérico.
quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
de una inmunoglobulina y la modificación de la cadena pesada. La
cadena pesada generalmente se trunca en cualquier punto de la
región Fc para prevenir el entrecruzamiento de la cadena pesada.
Alternativamente, los residuos cisteína relevantes son sustituidos
por otro residuo aminoacídico o se eliminan para prevenir el
entrecruzamiento.
Para la preparación de anticuerpos monovalentes
también son apropiados procedimientos in vitro. Puede
conseguirse la digestión de anticuerpos para producir fragmentos de
los mismos, particularmente, fragmentos Fab, usando técnicas
rutinarias conocidas la materia.
Los anticuerpos contra el PRO7133 pueden además
comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Formas
humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son las
inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o
fragmentos de los mismos (como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u
otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que
contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no
humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se
sustituyen residuos de una región determinante de la
complementariedad (CDR) del receptor por los correspondientes
residuos no humanos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo
donante) como ratón, rata o conejo que tengan la especificidad,
afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos Fv de la
región de estructura de la inmunoglobulina humana se sustituyen por
los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos
humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran
ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado ni en las
secuencias de la región de estructura. En general, el anticuerpo
humanizado comprenderá substancialmente todos o al menos uno, y
típicamente dos, dominios variables, en los que todas o
substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una
inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones
FR son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana.
Óptimamente, el anticuerpo humanizado comprenderá al menos una
porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc),
típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et
al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Los procedimientos para la preparación de
anticuerpos humanizados no humanos son bien conocidos en el área.
Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más de un residuo
aminoacídico introducido en él a partir de una fuente que no es
humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos se denominan
frecuentemente como residuos "importados", que típicamente se
toman a partir de un dominio variable "importado". La
humanización puede realizarse esencialmente, siguiendo el
procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al.,
Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et
al., Science,239:1534-1536 (1988)), y por
substitución de secuencias CDR o CDRs de roedores por las secuencias
correspondientes de un anticuerpo humano. En concordancia, tales
anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente
americana U.S. 4.816.567), en donde substancialmente menos de un
dominio variable humano intacto se han substituido por la secuencia
correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los
anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los
que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se
substituyen por residuos de regiones análogas en anticuerpos de
roedores.
Los anticuerpos humanos pueden producirse
también usando diversas técnicas conocidas en la materia,
incluyendo bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter,
J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol.Biol.,
222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al., y Boerner et
al., también están disponibles para la preparación de
anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner
et al., J. Immunol., 147(1): 86-95
(1991)]. Análogamente, los anticuerpos humanos pueden prepararse
introduciendo los loci de inmunoglobulinas humanas en animales
transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes endógenos
de las inmunoglobulinas se han inactivado parcial o totalmente.
Tras el estímulo, se observa la producción del anticuerpo humano, lo
que refleja estrechamente lo observado en humanos en todos los
sentidos, incluyendo el reordenamiento génico, el ensamblaje, y el
repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe, por
ejemplo, en las patentes americanas U.S. 5.545.807; 5.545.806;
5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes
publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology,
10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature,
368:856-859 (1994); Morrison, Nature,
368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature
Biotechnology,14:845-51 (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev.
Immunol., 13:65-93 (1995).
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a un enzima
activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo,
un agente quimioterapéutico de tipo peptidilo, véase patente
internacional WO 81/01.145) en un fármaco anticanceroso activo.
Véase, por ejemplo, la patente internacional WO 88/07.378 y la
patente americana U.S. 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado
útil para la ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre
un profármaco de manera que lo convierta en su forma más activa y
citotóxica.
Entre las enzimas que son útiles en el
procedimiento de esta invención se incluyen, pero no está limitado
a, la glicosidasa, la glucosa oxidasa, la lisozima humana, la
glucuronidasa humana, la fosfatasa alcalina útil por convertir
profármacos que contienen fosfato en los fármacos libres; la
arilsulfatasa útil por convertir profármacos que contienen sulfato
en los fármacos libres; citosina deaminasa útil por convertir la
5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco
anticanceroso 5-fluorouracilo; proteasas, tales como
la proteasa de Serratia, la termolisina, la subtilisina,
carboxipeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y
carboxipeptidasa A) y las catepsinas (tales como las catepsinas B y
L), que son útiles por convertir profármacos que contienen péptidos
en los fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas,
útiles por convertir profármacos que contienen substituyentes de
tipo D-aminoácido; las enzimas que hidrolizan
carbohidratos como la \beta-galactosidasa y la
neuraminidasa útiles por convertir profármacos glicosilados en
fármacos libres; la \beta-lactamasa útil por
convertir fármacos derivatizados con
\beta-lactámicos en los fármacos libres; y las
penicilin amidasas; tales como la penicilin varnidasa o la
penicilin G amidasa, útiles por convertir fármacos derivatizados en
sus aminas nitrogenadas con grupos fenoxiacetil o la fenilacetil,
respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden
usarse anticuerpos con actividad enzimática también conocidos en el
área como "abzimas" para convertir los profármacos de la
invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey,
Nature, 328:457-458 (1987)). Los conjugados
anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe
aquí para la liberación del abzima de una población de células
tumorales.
Los enzimas de esta invención pueden unirse
covalentemente a los anticuerpos contra el PRO7133 mediante
técnicas bien conocidas en la materia como el uso de agentes de
entrecruzamiento heterobifuncionales descritos anteriormente.
Alternativamente, pueden generarse proteínas de fusión que
comprendan al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo
de la invención unido a al menos una porción funcionalmente activa
de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante
bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Neuberger et
al., Nature, 312:604-608 (1984)).
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En
el caso presente, una de las especificidades de unión es para el
PRO7133 y la otra para cualquier otro antígeno, y preferentemente
por una proteína de superficie celular o por un receptor o
subunidad de un receptor.
Son conocidos en la materia los procedimientos
para la preparación de anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente,
la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en
la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen distintas
especificidades (Milstein y Cuello, Nature,
305:537-539 [1983]). Debido a la reordenación
aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina,
estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas de anticuerpo distintas, de los cuales sólo una presenta
la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se consigue habitualmente mediante procedimientos de
cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en
la patente internacional WO 93/08.829, publicada el 13 de Mayo de
1993, y en Traunecker et al., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables de un anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias
de dominios constantes de una inmunoglobulina. La fusión
preferentemente es con un dominio constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprenda al menos parte de las regiones
bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener presente la primera región
constante de la cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario
para la unión de la cadena ligera en al menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de la
inmunoglobulina y, si se prefiere, la cadena ligera de la
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se co-transfectan en un organismo huésped
apropiado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos
biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
Enzymology, 121:210 (1986).
Según otra aproximación descrita en la patente
internacional WO 96/27.011, es posible diseñar la interfaz entre un
par de moléculas de anticuerpo con el fin de maximizar el porcentaje
de heterodímeros a recuperar a partir de un cultivo celular
recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte de
la región CH3 de un dominio constante de un anticuerpo. En este
procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos
de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplaza por
cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano).
Se crean "cavidades compensatorias" de tamaño idéntico o
similar al de las cadena(s) laterales más grandes en la
interfaz de la segunda molécula de anticuerpo mediante la
sustitución de las cadenas laterales aminoacídicas más grandes por
otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto
proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del
heterodímero frente a otros productos finales no deseados como los
homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse
como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de
anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos
F(ab')_{2}). Se han descrito en la literatura técnicas
para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar
anticuerpos biespecíficos usando ligamiento químico. Brennan et
al., Science, 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde
anticuerpos intactos se rompen proteolíticamente para generar
fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en
presencia del agente acomplejante ditiol y del arsenito sódico para
estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuros
intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten a
continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los
derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación en
el tiol-Fab' a través de la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otros
derivados Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden
usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Se pueden recuperar fragmentos Fab' de E.
coli directamente y acoplarlos químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med.,
175:217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 totalmente
humanizado. Cada fragmento Fab' se secreta separadamente a partir
de E. coli y se somete a acoplamiento químico directo in
vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo
biespecífico así formado es capaz de unirse a células que
sobreexpresen el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así
como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos
humanos contra los tumores diana de mama humano.
Se han descrito también varias técnicas para
preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente a partir de cultivo de células recombinante. Por
ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando
cremalleras de leucinas. Kostelny et al., J.
Immunol.,148(5):1547-1553 (1992). Los
péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se
unen a las regiones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante
fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se reducen en la
región bisagra para formar monómeros y entonces oxidarse de nuevo
para forma los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento
puede utilizarse también para la producción de homodímeros de
anticuerpos. La tecnología de "diacuerpos" descrita por
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos.
Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) mediante un enlazador que sea lo suficientemente corto
como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la
misma cadena. En concordancia, los dominios (V_{H}) y (V_{L})
de un fragmento se ven forzados a emparejarse con los dominios
(V_{H}) y (V_{L}) complementarios de otro fragmento, formando
así dos sitios de unión al antígeno. Se ha descrito otra estrategia
para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el
uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase, Gruber et
al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos típicos pueden
unirse a dos epítopos diferentes en un polipéptido determinado.
Alternativamente, un brazo de un anti-polipéptido
puede combinarse con un brazo que se una a una molécula activadora
de un leucocito como una molécula del receptor de células T (por
ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fc para IgG
(Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y
Fc\gammaRIII (CD16) para así dirigir los mecanismos de defensa
celular hacia la célula que expresa el polipéptido en particular.
Los anticuerpos biespecíficos pueden usarse también para localizar
agentes citotóxicos para las células que expresan un polipéptido en
particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión del
polipéptido y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un
quelante radionucleico, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro
anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido y además se
une al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados se componen de
dos anticuerpos unidos convalentemente. Se ha propuesto que dichos
anticuerpos, por ejemplo, dirigen las células del sistema inmune
contra las células no deseadas [patente americana U.S. 4.676.980],
y sirven para el tratamiento de la infección por VIH [patentes
internacionales WO 91/00360; WO 92/200.373; patente europea EP
03.089]. Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in
vitro usando procedimientos conocidos en la química sintética de
proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes de
entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden generar inmunotoxinas
usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un
enlace tioéter. Entre los ejemplos de agentes apropiados para este
objetivo se incluye el iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y
aquellos descritos, por ejemplo, en la patente americana U.S.
4.676.980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la
invención con respecto a la función efectora, de manera que se
incremente la efectividad del anticuerpo para el tratamiento del
cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, se pueden introducir
residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la
formación de enlaces disulfuro entre las cadenas en esta región. El
anticuerpo homodimérico así generado puede presentar una mejora en
la capacidad de internalización y/o un incremento de la capacidad
de muerte celular mediada por el complemento y de la citotoxicidad
celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase, Caron et
al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y
Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Los
anticuerpos homodiméricos que muestran un incremento en la
actividad antitumoral pueden prepararse también usando agentes de
entrecruzamiento heterobifuncionales, tal como se describe en Wolf
et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993).
Alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que tenga
regiones Fc duales y que puedan por tanto mostrar un incremento en
las capacidades de lisis mediada por el complemento y de ADCC.
Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug
Design, 3:219-230 (1989).
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La invención también se refiere a
inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un
agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina
(por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen
bacteriano, fúngico, de animales o plantas, o fragmentos de los
mismos, o una pequeña molécula de toxina), o un isótopo radioactivo
(por ejemplo, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la
generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente.
Entre las toxinas proteicas enzimáticamente activas y los
fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la
cadena A de difteria, fragmentos activos no unidos de la toxina
difterica, la toxina colérica, la toxina botulínica, la cadena A de
la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la
ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la
alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites
fordii, las proteínas diantina, las proteínas de Phytolaca
americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor
de la Momordica charantia, la curcina, la crotina, el
inhibidor de Sapaonaria officinalis, la gelonina, la
saponina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la
enomicina y los tricotesenos. Las pequeñas moléculas de toxinas
incluyen, por ejemplo, caliqueamicinas, maitansinoides, palitoxina y
CC1065. Para la producción de anticuerpos radioconjugados están
disponibles una gran variedad de radionucleidos. Entre los ejemplos
se incluyen Bi^{212}, I^{131}, In^{131}, Y^{90},
Re^{186}.
Se pueden preparar conjugados del anticuerpo y
del agente citotóxico usando una variedad de agentes de
acoplamiento de proteínas bifuncionales como el propionato de
N-succinimidil-3-(2-piridiltiol)
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres,
(tal como el clorhidrato de dimetiladipimidato), ésteres activos
(tal como el disuccinimidil suberato), aldehídos (tal como el
glutaraldehído), compuestos bis-azido (como el
bis(p-azidobenzoil)hexanediamina),
derivados de bis-diazonio (como el
bis-(p-diazo-niumbenzoil)-etilenediantino
diisocianatos (tal como el tolueno
2,6-diisocianato), y compuestos de fluorina
bi-activos (tal como el
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal como
se describe en Viletta et al., Science, 238:1098 (1987). Un
ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleido
al anticuerpo es el ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen
triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con
carbono-14. Véase, la patente internacional
WO94/11.026.
En otra realización, el anticuerpo puede
conjugarse a un "receptor" (tal como la estreptavidina) para
ser utilizado en el marcaje de tumores en donde el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación
usando un agente aclarante y administrando a continuación un
"ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente
tóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
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Los anticuerpos descritos aquí pueden formularse
también en forma de inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el
anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la
materia, tales como los descritos por Epstein et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y las patentes americanas
U.S. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas que presentan un aumento
en el tiempo de circulación se describen en la patente americana nº
5013556.
Se pueden generar liposomas particularmente
útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase reversa con
una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol
y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG
(PEG-PE). Los liposomas se extrusionan a través de
filtros de poro definido para dar lugar a liposomas con el diámetro
deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab' del anticuerpo de la
presente invención con los liposomas tal y como se describe en
Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288
(1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro.
Opcionalmente, el liposoma puede contener un agente
quimioterapéutico (tal como la doxorubicina). Véase, Gabizon et
al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989).
Se pueden administrar los anticuerpos unidos
específicamente al producto de un gen amplificado identificado
aquí, así como otras moléculas identificadas en los estudios de
análisis descritos aquí anteriormente, para el tratamiento de
tumores, incluyendo cánceres, en forma de composiciones
farmacéuticas.
Si la proteína codificada por el gen amplificado
es intracelular y se usan los anticuerpos completos como
inhibidores, se prefieren anticuerpos que se internalicen. Sin
embargo, se pueden utilizar también lipofecciones o liposomas para
vehiculizar el anticuerpo, o un fragmento del anticuerpo al interior
de las células. En donde se usan los fragmentos de anticuerpo, se
prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se una
específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por
ejemplo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que retengan la
capacidad de unirse a la secuencia protéica diana basándose en las
secuencias de la región variable de un anticuerpo. Dichos péptidos
pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante la
tecnología del ADN recombinante (véase, por ejemplo, Marasco et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893
[(1993]).
Se preparan formulaciones terapéuticas del
anticuerpo para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que
presenta el grado deseado de pureza con portadors opcionales
farmacéuticamente aceptables, con excipientes o con estabilizantes
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed.
[1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones
acuosas. Los portadors, excipientes o estabilizantes aceptables no
han de ser tóxicos para el receptor a las dosis y concentraciones
empleadas, e incluyen tampones como el fosfato, el citrato y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico y la
metionina; conservantes (tales como el cloruro de
octadecildimetilbenzil amonio, el cloruro de hexametonio; el cloruro
de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el alcohol fenólico,
butílico o benzílico; los alquil parabenos tales como el metil o
propil parabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el
3-pentanol; y m-cresol);
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina, o
las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como al
polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la
glutamina, la asparragina, la histidina, la arginina, o la lisina;
monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la
glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes tales como
el EDTA; azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el
sorbitol; contrarrestadores de iones formadores de sales tales como
el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, el complejos de
proteína-Zn); y/o surfactantes no iónicos tales
como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o el polietilenglicol
(PEG).
De forma análoga, se pueden formular compuestos,
que no son anticuerpos y que se han identificado mediante los
ensayos de análisis de la presente invención, usando técnicas
estándares bien conocidas en la materia.
La formulación aquí descrita también puede
contener más de un compuesto activo si es necesario para la
indicación en particular que vaya a ser tratada, preferentemente
aquellos con actividades complementarias que no se afecten de forma
adversa el uno con el otro. Alternativamente, o además, la
composición puede comprender un agente citotóxico, una citoquina o
un agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes
de manera adecuadamente en combinación con cantidades que sean
efectivas para el propósito que se pretende.
Los ingredientes activos pueden también
encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por
ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas coloidales de liberación de fármacos (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed.
(1980).
Las formulaciones que van a usarse para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de
polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo,
matrices que están en forma de artículos con formas determinadas,
por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de
matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles
(por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente americana U.S.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
etil-L-glutamato, acetato de
etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido
láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON
DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de un copolímero
de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido
poli-D-(-)3-hidroxibutírico.
Mientras polímeros como el acetato de etilen-vinilo
y el de ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas
durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos
encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo
prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la
exposición a la humedad a 37ºC, lo que se traduce en una pérdida de
actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad.
Deben idearse estrategias racionales para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que
el mecanismo de agregación se produce a través de la formación de
un enlace S-S intermolecular a través de un
intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede
lograrse modificando los residuos sulfidrilos, liofilizando a partir
de soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, usando
aditivos adecuados, y desarrollando composiciones específicas de
matrices poliméricas.
Se contempla que los anticuerpos y otros
compuestos antitumorales de la presente invención pueden utilizarse
para el tratamiento de varias condiciones, incluyendo aquellas
caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de genes
amplificados identificados aquí. Ejemplos de las condiciones o
trastorno a ser tratados con dichos anticuerpos y otros
compuestos, incluyendo, pero no limitándose a, pequeñas moléculas
orgánicas e inorgánicas, péptidos, moléculas antisentido, etc., se
incluyen los tumores benignos o malignos (por ejemplo, el carcinomas
renal, el hepático, el de riñón, el de vejiga, el de mama, el
gástrico, el ovárico, el colorectal, el de próstata, el
pancreático, el pulmonar, el vulval, el tiroideo, el hepático; los
sarcomas; los glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y
cuello); las leucemias y los tumores linfoides; otros trastornos de
origen neuronal, glial, astrocital, hipotálamico y otros trastornos
glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos;
y trastornos inflamatorios angiogénicos e inmunológicos.
Los agentes antitumorales de la presente
invención, por ejemplo, anticuerpos, se administran en mamíferos,
preferentemente en humanos, según procedimientos conocidos, tales
como la administración intravenosa como un bolo o mediante infusión
continua durante un periodo de tiempo determinado, mediante vía
intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea,
intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o
inhalatoria. Se prefiere la administración intravenosa para la
administración del anticuerpo.
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse
con la administración de agentes anti-cancerosos,
por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo,
el paciente a ser tratado con dichos agentes
anti-cancerosos puede también recibir terapia de
radiación. Alternativa o adicionalmente, puede administrarse al
paciente un agente quimioterapéutico. Como guías para la preparación
y administración de dosis de dichos agentes quimioterapéuticos
pueden utilizarse las normas de acuerdo con las instrucciones del
fabricante o según el criterio del experto en la materia. Las guías
para la preparación y administración de dosis de dicho
quimioterapéutico también se describen en Chemotherapy Service, Ed.,
M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimores, MD (1992). El
agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración
del agente anti-tumoral, por ejemplo el anticuerpo,
o puede administrarse simultáneamente. El anticuerpo puede
combinarse con un compuesto anti-estrogénico como
el tamoxifeno o uno anti-progesterona como la
onapristona (véase la patente europea EP 616.812) en dosificaciones
conocidas para dichas moléculas.
Puede ser deseable administrar también
anticuerpos contra otros antígenos asociados a tumores, tales como
los anticuerpos que se unen al ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o al
factor endotelial vascular (VEGF). Alternativa o adicionalmente,
dos o más anticuerpos que se unen a los mismos o dos o más antígenos
diferentes descritos aquí pueden coadministrarse al paciente. A
veces, puede ser beneficioso administrar también una o más citocinas
al paciente. En una realización preferida, los anticuerpos de la
presente invención se coadministran con un agente inhibidor del
crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede
administrarse en primer lugar, seguido de un anticuerpo de la
presente invención. Sin embargo, la administración simultánea o la
administración del anticuerpo de la presente invención en primer
lugar también se contempla en la presente invención. Dosis
adecuadas del agente inhibidor del crecimiento son las utilizadas en
la presente y pueden disminuirse debido a la acción combinada
(sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del anticuerpo de
la presente invención.
Para la prevención o tratamiento de la
enfermedad, la dosis adecuada de un agente
anti-tumoral, por ejemplo, un anticuerpo de la
presente invención dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal
como se definió anteriormente, de la gravedad y del transcurso de
la enfermedad tanto si el agente se administra con propósitos
preventivos o terapéuticos, de terapias previas, del historial
clínico del paciente y de la respuesta al agente y de la discreción
del médico responsable. El agente se administra de forma adecuada al
paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de
la enfermedad, una dosis candidata inicial para la administración
al paciente será de aproximadamente 1 \mug/Kg a 15 mg/Kg (por
ejemplo 0,1-20 mg/Kg) de anticuerpo, bien mediante,
por ejemplo, una o más administraciones por separado, o mediante
infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar entre
aproximadamente 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los
factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas
durante varios días o más, dependiendo de la condición, el
tratamiento se prolonga hasta la supresión deseada de los síntomas
de la enfermedad. Sin embargo, otros regimenes de dosificación
pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza
fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
En otra realización de la invención, se
proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales de
utilidad para el diagnóstico o el tratamiento de las enfermedades
descritas anteriormente. El artículo de fabricación comprende un
recipiente y una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen, por
ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los
recipientes pueden estar formados de muy diversos materiales como
por ejemplo el vidrio o el plástico. El recipiente contiene una
composición que es efectiva para el diagnóstico o el tratamiento de
la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo,
el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial
con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica).
El agente activo en la composición es generalmente un agente
anti-tumoral capaz de interferir con la actividad
de un producto génico identificado aquí, por ejemplo, un anticuerpo.
La etiqueta sobre el recipiente, o en su interior, indica que la
composición se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la
condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender
además un segundo recipiente que comprende un tampón
farmacéuticamente aceptable, tal como el tampón fosfato salino, la
solución de Ringer y la solución de dextrosa. Puede además incluir
otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del
usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas,
jeringas y prospectos con las instrucciones para su utilización.
Mientras que las proteínas de superficie
celular, como los receptores del crecimiento sobreexpresados en
ciertos tumores son dianas excelentes como fármacos candidatos o
para el tratamiento de tumores (por ejemplo el cáncer), las mismas
proteínas junto con proteínas secretadas codificadas por genes
amplificados en células tumorales hallan una utilización adicional
en el diagnóstico y pronóstico de tumores. Por ejemplo, los
anticuerpos dirigidos contra productos proteicos de genes
amplificados en células tumorales pueden utilizarse para el
diagnóstico y pronóstico de tumores.
Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo los
fragmentos de anticuerpos, pueden utilizarse para detectar
cualitativa o cuantitativamente la expresión de proteínas
codificadas por los genes amplificados ("productos de genes
marcadores"). El anticuerpo está equipado preferentemente con un
marcador detectable, por ejemplo un marcador fluorescente, y la
unión puede monitorizarse mediante microscopía, citometría de flujo,
fluorimetría u otras técnicas conocidas en la materia. Estas
técnicas son particularmente adecuadas, si el gen amplificado
codifica una proteína de superficie celular, por ejemplo, un factor
de crecimiento. Dichos ensayos de unión se realizan esencialmente
tal como se describe en la sección 5 de más arriba.
La detección in situ de la unión del
anticuerpo con los productos del gen marcador puede realizarse, por
ejemplo, mediante microscopía de inmunofluorescencia o
microelectrónica. Para dicho propósito, se obtiene un espécimen
histológico del paciente, y se aplica el anticuerpo marcado a éste,
preferentemente poniendo el anticuerpo sobre la muestra biológica.
Este procedimiento también permite la determinación de la
distribución del producto del gen marcador en el tejido examinado.
Será evidente para aquellos expertos en la materia que una gran
diversidad de procedimientos histológicos está fácilmente disponible
para la detección in situ.
Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente
con motivo ilustrativo, y no con intención de limitar de ninguna
manera el ámbito de la presente invención.
Todas las referencias de patentes y de la
literatura citadas en la presente solicitud se incorporan en su
totalidad en la presente invención por referencia.
Los reactivos disponibles comercialmente
referidos en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante salvo que se indique lo contrario. La
fuente de las células se han identificado en los ejemplos
siguientes, y a través de las especificaciones, por los números de
acceso ATCC que corresponden al American Type Culture Collection,
1081 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209.
Todos los depósitos originales referidos en la presente solicitud
se generaron según las indicaciones del Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el
Propósito de Procedimientos de Patentes y las Regulaciones que se
desprenden (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de
un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del
depósito. El depósito estará disponible por el ATCC bajo los
términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre
Genentech Inc., y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y
no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público
bajo expedición de la patente americana pertinente o tras poner a
disposición pública de cualquier solicitud de patente U.S. o
extranjera, cualquiera que sea la primera, y asegurar la
disponibilidad de la progenie por la persona determinada por el
Comisionado U.S. de Patentes y Marcas Registradas de acuerdo con la
norma 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisionado según lo
acordado (incluyendo 37 CFR \NAK 1.14 con particular referencia a
886 OG 638).
Salvo que se especifique lo contrario, la
presente invención utiliza procedimientos estándares de tecnología
del ADN recombinante, tal como los descritos anteriormente y los
descritos en los libros de texto siguientes: Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley
Intersciences, N.Y., 1989; Innis et al., PCR Protocols: A
Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y. 1990;
Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Oligonucleotide
Synthesis, IRL Press Oxford, 1984; R.I., Freshney, Animal Cell
Culture, 1987; Colligan et al., Current Protocols in
Immunology, 1991.
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Ejemplo
1
Las secuencias del dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia de señal secretora, si la hubiera) desde
aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de
datos Swiss-Prot se utilizaron para buscar bases de
datos EST. Las bases de datos de EST incluyeron las bases públicas
(por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y las bases de datos privadas (por
ejemplo, LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticalas, Palo Alto, CA). La
búsqueda se realizó utilizando el programa informático BLAST o
BLAST-2 (Altschul et al., Methods in
Enzymology, 266:460-480 (1996)) como una
comparación de las secuencias proteicas de ECD a 6 pautas de
traducción de las proteínas EST. Aquellas comparaciones con una
valoración de 70 (o en algunos casos 90) o superior que no codifican
proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN
consenso con el programa "phrap" (Phil Green, Universtity of
Washington, Seattle, Washington).
Mediante la utilización de este cribado por
homología del dominio extracelular, se ensamblaron las secuencias
consenso de ADN en relación con otras secuencias EST identificadas
utilizando phrap. Además, las secuencias de ADN consenso obtenidas
a menudo (pero no siempre) se ampliaron utilizando ciclos repetidos
de BLAST o BLAST-2 y phrap para prolongar la
secuencia consenso tan lejos como fuera posible mediante la
utilización de fuentes de secuencias EST tal como se indicó más
arriba.
A continuación, se sintetizaron los
oligonucleótidos basados en las secuencias consenso obtenidas tal
como se describió más arriba, y se utilizaron para identificar
mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía las secuencia de
interés y para utilizar como sondas para aislar un clon de la
secuencia codificante de longitud completa para un polipéptido PRO.
Los cebadores de PCR de sentido de transcripción 5' y 3' se hallaron
generalmente en el intervalo de 20 a 30 nucleótidos y a menudo se
diseñan para proporcionar un producto de PCR de aproximadamente
100-1000 pb de longitud. Las secuencias de la sonda
son típicamente de una longitud de 40-55 pb. En
algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la
secuencia consenso es superior a aproximadamente
1-1,5 Kb. Con el fin de cribar diversas bibliotecas
para un clon de longitud completa, el ADN de las bibliotecas se
rastreó mediante amplificación de ADN, tal como se especifica por
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con
la pareja de cebadores. Una biblioteca positiva se utilizó a
continuación para aislar los clones que codifican el gen de interés
mediante la utilización del oligonucleótido de la sonda y uno de
los cebadores de la pareja.
Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar
los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos
estándares mediante la utilización comercial de los reactivos
disponibles tal como los de Invitrogen, San Diego, CA. Los ADNcs se
cebaron con el oligodT que contenía una diana NotI, unida por
extremos romos con adaptadores semifosforilados SalI, cortados con
NotI, de tamaño comprobado por electroforesis en gel y clonados en
una orientación definida en un vector adecuado de clonación (como
pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene la
diana SfI; véase Holmes et al., Science,
253:1278-1280 (1991)) en las dianas únicas XhoI y
NotI.
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Ejemplo
2
Se identificaron diversas secuencias de ácido
nucleico que codifican los diversos polipéptidos mediante la
aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia señal
desarrollado por Genentech, Inc., (South San Francisco, CA) para
ESTs así como para los fragmentos de EST agrupados y ensamblados a
partir de bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank) y/o
privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA).
El algoritmo de secuencia señal computa una valoración de secuencia
señal basado en el carácter de los nucleótidos del ADN que rodean
el primer(os) y opcionalmente el segundo(s) codón
(codones) metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o el
fragmento de secuencia a considerar. Los nucleótidos siguientes al
primer(o codón ATG deben codificar para al menos 35
aminoácidos no ambiguos sin ningún codón de parada. Si la primera
pauta de lectura con el primer ATG contiene los aminoácidos
requeridos, la segunda ya no se examina. Sin ninguna alcanza los
requerimientos, la secuencia candidata no se valora. Con el fin de
determinar si la secuencia EST contiene una secuencia señal
auténtica, el ADN y las secuencias aminoacídicas correspondientes
que rodena el codón ATG se valoran utilizando un grupo de siete
sensores (parámetros de evaluación) conocidos por estar asociados
con las señales de secreción. La utilización de este algoritmo dio
como resultado la identificación de numerosas secuencias de ácido
nucleico que codifican los
polipéptidos.
polipéptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El clon DNA 128450-2739 se
extrajo mediante un cribado homólogo de CARD y la secuencia se
utilizó como sonda para aislar un clon de la secuencia codificante
de longitud completa para PRO7133 utilizando baja astringencia e
hibridación tradicional. Para identificar el ORF completo para el
ADNc de PRO7133, la molécula que contiene el dominio CARD; un
fragmento de ADNc que codifica la parte N-terminal
de SOCA-1; se utilizó para cribar una biblioteca
de riñón fetal humano. Se recogieron varios clones positivos y el
ADN se preparó y se secuenció.
cebador directo,
\newpage
cebador
inverso:
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN sonda (soca-I) tenía la
siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación del ADN reveló que uno de los
clones de ADNc contiene un ORF de longitud completa que codifica
una proteína significativamente homóloga a la proteína Sab humana:
el polipéptido PRO7133 (designado en la presente invención como DNA
128451-2739 [Figura 1, SEC ID No: 1] y la secuencia
de proteína derivada para este polipéptido PRO7133.
El clon DNA 128451-2739 contiene
un marco de lectura abierto único con un sitio de iniciación
traduccional aparente en las posiciones de nucleótidos
501-503 y finalización en el codón de parada en las
posiciones de nucleótidos 1680-1682 (figura 33). El
precursor del polipéptido previsto tiene 393 aminoácidos de longitud
(figura 2: SEC ID No: 2). La proteína PRO7133 de longitud completa
mostrada en la figura 2 tiene un peso molecular estimado de
aproximadamente 43.499 daltons y un pI de aproximadamente 4,75. El
análisis de la secuencia de PRO7133 de longitud completa que se
muestra en la Figura 2 (SEC ID No: 2) pone en evidencia la presencia
de una variedad de dominios de polipéptido importantes, en los que
las localizaciones proporcionadas para estos dominios de
polipéptido importantes son aproximadamente tal como se ha descrito
anteriormente. El análisis de la secuencia de PRO7133 de longitud
completa que se muestra en la Figura 2 pone en evidencia la
presencia de lo siguiente: sitios de fosforilación de proteína
quinasa dependiente de AMPc y GMPc desde aproximadamente el
aminoácido 287 hasta aproximadamente el aminoácido 291 y desde
aproximadamente el aminoácido 375 hasta aproximadamente el
aminoácido 379; sitios de N-miristoilación desde
aproximadamente el aminoácido 37 hasta aproximadamente el
aminoácido 43, desde aproximadamente el aminoácido 38 hasta
aproximadamente el aminoácido 44, desde aproximadamente el
aminoácido 39 hasta aproximadamente el aminoácido 45, desde
aproximadamente el aminoácido 40 hasta aproximadamente el
aminoácido 46, desde aproximadamente el aminoácido 103 hasta
aproximadamente el aminoácido 109, desde aproximadamente el
aminoácido 307 hasta aproximadamente el aminoácido 313, desde
aproximadamente el aminoácido 310 hasta aproximadamente el
aminoácido 316, desde aproximadamente el aminoácido 315 hasta
aproximadamente el aminoácido 321, desde aproximadamente el
aminoácido 365 hasta aproximadamente el aminoácido 371, desde
aproximadamente el aminoácido 369 hasta aproximadamente el
aminoácido 375, desde aproximadamente el aminoácido 373 hasta
aproximadamente el aminoácido 379, desde aproximadamente el
aminoácido 377 hasta aproximadamente el aminoácido 383, desde
aproximadamente el aminoácido 380 hasta aproximadamente el
aminoácido 386, desde aproximadamente el aminoácido 381 hasta
aproximadamente el aminoácido 387; y un sitio de amidación desde
aproximadamente el aminoácido 373 hasta aproximadamente el
aminoácido 377. El clon DNA 128451-2739 se ha
depositado con ATCC el 31 de agosto de 1999 y se asigna el depósito
ATCC no. PTA-618.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo muestra que los genes que codifican
PRO7133 se amplifican en el genoma de ciertos cánceres y/o líneas
celulares humanas de pulmón, colon y/o mama. La amplificación se
asocia con la sobreexpresión del producto génico, lo que indica que
los polipéptidos son dianas útiles para la intervención terapéutica
en algunos cánceres como el colon, pulmón, mama y otros cánceres.
Los agentes terapéuticos pueden tomar la forma de antagonistas de
polipéptidos PRO7133, por ejemplo, anticuerpos quiméricos
murinos-humanos, humanizados o humanos contra un
polipéptido PRO7133.
El material de inicio para el cribado fue el ADN
genómico aislado a partir de diversos cánceres. El ADN se
cuantifica de forma precisa, por ejemplo, fluorimétricamente. Como
un control negativo, el ADN se aisló de las células de 10
individuos sanos normales que se agruparon y utilizaron como
controles del ensayo para la copia génica en individuos sanos
(datos no mostrados). El ensayo de la nucleasa 5' (por ejemplo
TaqMan^{TM}) y la PCR cuantitativa a tiempo real (por ejemplo,
ABI Prism 7700 Sequence Detection System^{TM} (Perkin Elmer,
Applied Biosystems Division, Foster City, CA)) se utilizaron para
hallar genes potencialmente amplificados en algunos cánceres. Los
resultados se utilizaron para determinar si el ADN que codifica
PRO7133 está sobreexpresado en cualquiera de los cánceres primarios
de pulmón o colon, las líneas celulares de dichos cánceres o las
líneas celulares de cáncer de mama que se cribaron. Los cánceres
primarios de pulmón se obtuvieron de individuos con tumores del
tipo y estadio tal como se indicó en la Tabla 6. Una explicación
sobre las abreviaciones utilizadas para la denominación de los
tumores primarios listados en la Tabla 6 y en los tumores primarios
y las líneas celulares referidas en este ejemplo ya se ha
proporcionado más arriba en la presente invención.
Los resultados de la TaqMan^{TM} se expresan
en unidades Ct delta (\Delta). Una unidad corresponde a 1 ciclo
de PCR o a aproximadamente una amplificación de 2 veces respecto a
la normal, dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades a una
amplificación de 8 veces y así sucesivamente. La cuantificación se
obtuvo utilizando cebadores y una sonda fluorescente TaqMan^{TM}
derivada del gen codificante del PRO7133. Las regiones de PRO7133
que seguramente contienen secuencias de ácido nucleico único y que
son las menos probables de tener intrones ayustados son las
preferidas para el cebador y derivar la sonda, por ejemplo, las
regiones 3' no traducidas. Las secuencias para los cebadores y las
sondas (directo, inverso y sonda) utilizadas para el análisis de
amplificación del gen de PRO7133 fueron las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7133 (DNA
129451-2739):
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción del ensayo de la nucleasa 5' es una
técnica basada en la PCR fluorescente que utiliza la actividad
5'-exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para
monitorizar la amplificación a tiempo real. Se utilizan dos
cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una
reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para
detectar una secuencia nucleotídica localizada entre los dos
cebadores. La sonda no es extensible por la enzima Taq ADN
polimerasa, y se marca con colorante fluorescente y un colorante
fluorescente secuestrador. Cualquier emisión inducida por láser a
partir del colorante reportero se secuestra por el colorante
secuestrador cuando los dos colorantes se localizan estrechamente
próximos como lo están en la sonda. Durante la reacción de
amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa corta la sonda de forma
dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se
disocian en solución, y la señal del colorante reportero se libera
del efecto secuestrante del segundo fluoróforo. Una molécula del
colorante reportero se libera de cada nueva molécula sintetizada, y
la detección del colorante reportero no secuestrado proporciona la
base para la interpretación cuantitativa de los resultados.
El procedimiento de la nucleasa 5' se realiza en
un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real como el de ABI
Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste en un
termociclador, un láser, una cámara de dispositivo acoplado a la
carga (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica las muestras en un
formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la
amplificación, la señal fluorescente inducida por el láser se recoge
a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96
pocillos, y se detecta en la CCD. El sistema incluye el programa
para poner en marcha el instrumento y para analizar los
resultados.
Los resultados del ensayo nucleasa 5' se
expresan inicialmente como Ct, o el umbral del ciclo. Ello se
define como el ciclo en donde se acumula la señal del reportero
sobre el nivel de fondo de la fluorescencia. Los valores de
\DeltaCt se utilizan como cuantificación cuantitativa del número
relativo o del número de copias iniciales de una secuencia dada
particular en una muestra de ácido nucleico cuando se comparan los
resultados del ADN del cáncer con los resultados del ADN humano
normal.
La Tabla 6 describe la etapa, etapa T y etapa N
de diversos tumores primarios que se utilizaron para cribar el
compuesto PRO7133 de la presente invención.
El ADN se preparó a partir de líneas celulares
cultivadas, tumores primarios y sangre humana normal. El
aislamiento se realizó utilizando el equipo de purificación, tampón
y proteasas y todo el resto de Qiagen, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y la descripción de más adelante.
Las células se lavaron y tripsinizaron a una
concentración de 7,5 x 108 por punto y se sedimentaron mediante
centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC, seguido de un
nuevo lavado con ½ volumen de PBS y recentrifugación. Los
sedimentos se lavaron una tercera vez, las células resuspendidas se
recogieron y lavaron 2x con PBS. Las células se resuspendieron a
continuación en 10 ml de PBS. El tampón C1 se equilibró a 4ºC. La
proteasa de Qiagen #19155 se diluyó en 6,25 ml de ddH_{2}O fría a
una concentración final de 20 mg/ml y se equilibró a 4ºC. Se
prepararon 10 ml de tampón G2 diluyendo la solución madre de ARNsa
de Qiagen (10 mg/ml) a una concentración final de 200
\mug/ml.
El tampón C1 (10 ml, 4ºC) y ddH_{2}O (40 ml,
4ºC) se añadieron a continuación a los 10 ml de suspensión celular,
se mezclaron mediante inversión y se incubaron en hielo durante 10
minutos. Los núcleos celulares se sedimentaron mediante
centrifugación en un rotor basculante Beckman a 2500 rpm a 4ºC
durante 15 minutos. El sobrenadante se descartó y los núcleos se
resuspendieron con un vórtex en 2 ml de tampón C1 (a 4ºC) y 6 ml de
ddH2O, seguido de una centrifugación a 4ºC a 2500 rpm durante 15
minutos. Los núcleos se resuspendieron a continuación en el tampón
residual con 200 \mul por punto. Se añadió el tampón G2 (10 ml) a
los núcleos resuspendidos mediante agitación suave con el vórtex.
Después de finalizar la adición del tampón, se aplicó un vórtex
vigoroso durante 30 minutos. Se añadió la proteasa de Qiagen (200
\mul, preparada tal como se indicó más arriba) y se incubó a 50ºC
durante 60 minutos. La incubación y la centrifugación se repitieron
hasta que los lisados estuvieron claros (por ejemplo, mediante una
incubación adicional de 30-60 minutos,
sedimentación a 3000xg durante 10 min, 4ºC).
Las muestras de tumor se pesaron y colocaron en
50 ml de tubos cónicos y se mantuvieron en hielo. El procesamiento
se limitó a no más de 250 mg de tejido por preparación (1
\mul/preparación). La solución de proteasa se preparó
extemporáneamente mediante dilución en 6,25 ml de ddH2O fría a una
concentración final de 20 mg/ml y se guardó a 4ºC. El tampón G2 (20
ml) se preparó mediante dilución de la ADNsa A a una concentración
final de 200 mg/ml (a partir de una solución madre de 100 mg/ml). El
tejido tumoral se homogeneizó en 19 ml de tampón G2 durante 60
segundos mediante la utilización de la punta grande del politrón en
una campana de flujo laminar TC con el fin de evitar inhalaciones
de los aerosoles, y se mantuvo a temperatura ambiente. Entre las
muestras, el politrón se lavó mediante centrifugación rápida 2x30
segundos cada en 2 l ddH2O, seguido de tampón G2 (50ml). Si todavía
había tejido en la punta del generador, el aparato se desmontó y
limpió.
Se añadió proteasa de Qiagen (preparada tal como
se indicó anteriormente, 1,0 ml), seguido de un vórtex e incubación
a 50ºC durante 3 horas. La incubación y la centrifugación se
repitieron hasta que los lisados estuvieron limpios (por ejemplo,
incubando 30-60 minutos adicionales, sedimentando a
3000xg durante 10 min, a 4ºC).
La sangre se obtuvo de voluntarios sanos
mediante la utilización de protocolos estériles estándares y
adición de citrato en el tubo para muestras de 10 ml. La proteasa de
Qiagen se preparó extemporáneamente mediante dilución en 6,25 ml de
ddH2O fría a una concentración final de 20 mg/ml y se guardó a 4ºC.
El tampón G2 se preparó mediante dilución de la ARNsa a una
concentración final de 200 \mug/ml a partir de la solución madre
de 100 mg/ml. La sangre (10 ml) se colocó en un tubo cónico de 50 ml
y se añadieron 10 ml de tampón C1 y 30 ml de ddH2O (previamente
equilibrados a 4ºC), se mezcló todo mediante inversión y se mantuvo
en hielo durante 10 minutos. Los núcleos se sedimentaron con un
rotor basculante Beckman a 2500 rpm, 4ºC durante 15 minutos y se
descartaron los sobrenadantes. Con ayuda del vórtex, se
resuspendieron los núcleos en 2 ml de tampón C1 (4ºC) y 6 ml de
ddH2O (4ºC). Se volvió a mezclar con ayuda del vórtex tantas veces
como fue necesario hasta lograr que el sedimento fuera blanco. A
continuación, se resuspendieron los núcleos en el tampón residual
con una punta de 200 \mul. Se añadió tampón G2 (10 ml) a los
núcleos resuspendidos mientras se agitaba suavemente con ayuda del
vórtex, seguido de un vigoroso vórtex de 30 segundos. Se añadió la
proteasa de Qiagen (200 \mul) y se incubó a 50ºC durante 60
minutos. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que
los lisados estuvieron claros (por ejemplo, incubando
30-60 minutos adicionales, sedimentando a 3000xg
durante 10 min, 4ºC).
(1) Aislamiento del ADN genómico:
El ADN genómico se equilibró (1 muestra por
preparación de maxi) con 10 ml de tampón QBT. El tampón de elución
QF se equilibró a 50ºC. Las muestras se agitaron con ayuda del
vórtex durante 30 s, luego se cargaron en columnas equilibradas y
se dejaron caer por gravedad. Las columnas se lavaron con 2x15 ml de
tampón QC. El ADN se eluyó en tubos Corex de 30 ml, silanizados y
autoclavados, con 15 ml de tampón QF (50ºC). Se añadió isopropanol
(10,5 ml) a cada muestra, se taparon los tubos con película de
parafina y se mezclaron repetidamente mediante inversión hasta que
el ADN estuviera precipitado. Las muestras se sedimentaron mediante
centrifugación en el rotor SS34 a 15.000 rpm durante 10 min a 4ºC.
Se marcó la localización del sedimento, se descartó el sobrenadante
y se añadieron 10 ml de etanol al 70% (4ºC). Las muestras se
sedimentaron de nuevo por centrifugación en el rotor SS34 a 10.000
rpm durante 10 minutos a 4ºC. La localización del sedimento se marcó
y se eliminó el sobrenadante. Los tubos se colocaron en su rejilla
de secado durante 10 minutos a 37ºC, teniendo cuidado de no secar
excesivamente las muestras.
Después del secado, los sedimentos se
disolvieron en 1,0 ml de TE (pH 8,5) y se colocaron a 50ºC durante
1-2 horas. Las muestras se mantuvieron a 4ºC
mientras continuó la disolución. La solución de ADN se transfirió a
continuación a tubos de 1,5 ml con una aguja de diámetro 26 en una
jeringa de tuberculina. La transferencia se repitió 5x con el fin
de desmenuzar el ADN. Las muestras se colocaron a continuación a
50ºC durante 1-2 horas.
(2) Cuantificación de ADN genómico y
preparación del ensayo de amplificación génica:
Los niveles de ADN en cada tubo se cuantificaron
mediante espectrofotometría A260/A280 a una dilución 1:20 (5 \mul
de ADN + 95 \mul de ddH2O) mediante la utilización de cubetas de
cuarzo de 0,1 ml en el espectrofotómetro Beckman DU640. Los
cocientes A260/A280 se hallaron en el intervalo de
1,8-1,9. Cada muestra de ADN se diluyó
posteriormente a aproximadamente 200 ng/ml en TE (pH 8,5). Si el
material original estaba altamente concentrado (aproximadamente 700
ng/\mul), el material se colocó a 50ºC durante varias horas hasta
su resuspensión.
La cuantificación del ADN fluorimétrica se
realizó sobre el material diluido (20-600 ng/ml)
según las instrucciones del fabricante tal como se modificaron más
adelante. Ello se logró permitiendo que un fluorímetro Hoeffer DyNa
Quant 200 se calentara durante aproximadamente 15 minutos. La
solución de trabajo del colorante Hoechst (#H33258, 10 \mul,
preparada en las 12 horas de su uso) se diluyó en 100 ml x tampón
TNE. Se rellenó una cubeta de 2 ml con la solución del fluorímetro,
se colocó en la máquina y se estableció el cero. Se añadió pGEM
3Zf(+) (2 \mul, lote #360851026) a 2 ml de la solución del
fluorímetro y se calibró a 200 unidades. Se analizaron a
continuación 2 \mul más del ADN de pGEM 3Zf(+) y la lectura se
confirmó a 400 +/-10 unidades. Cada muestra se leyó a continuación
por triplicado. Cuando las tres muestras se hallaron entre el 10%
unas de otras, se calculó el promedio y dicho valor se utilizó como
el valor de cuantificación.
La concentración determinada por fluorimetría se
utilizó para diluir cada muestra a 10 ng/\mul en ddH2O. Ello se
realizó simultáneamente en todas las muestras del molde para una
sola placa de ensayo TaqMan^{TM}, y con material suficiente para
realizar de 500-1000 ensayos. Estas muestras se
analizaron por triplicado con cebadores TaqMan^{TM} y se probaron
con \beta-actina y GAPDH en una sola placa con ADN
humano normal y controles sin molde. Las muestras diluidas se
utilizaron siempre que el valor CT del ADN humano normal sustraído
del ADN a analizar fuera +/- 1 Ct. El ADN genómico cualificado del
lote y diluido se almacenó en alícuotas de 1,0 ml a -80ºC. Las
alícuotas se que a continuación iban a utilizarse en los ensayos de
amplificación génica se guardaron a 4ºC. Cada alícuota de 1 ml es
suficiente para 8-9 placas o 64 tests.
Los compuestos PRO7133 de la presente invención
se cribaron en los tumores primarios siguientes y los valores de
\DeltaCt resultantes se indican en la Tabla 7B.
PRO7133
(DNA128451-2739):
Los valores \DeltaCt para el
DNA128451-2739 en diversos tumores están indicados
en la Tabla 7B. Un \DeltaCt>1 se utilizó de forma habitual
como el valor umbral para la valoración de la amplificación, ya que
representa doblar el número de copias génicas. La Tabla 7B indica
que la amplificación significativa del ácido nucleico
DNA128451-2739 que codifica PRO7133 tuvo lugar en:
(1) en tumores primarios de pulmón: HF-000840 y
HF-001296; y (2) en centros de tumores primarios de
colon: HF-000795 y HF-000811.
Debido a que la amplificación del
DNA128451-2739 tiene lugar en diversos tumores, es
altamente probable que desempeñe un papel importante en la
formación o crecimiento del tumor. Como consecuencia, sería lógico
esperar que los antagonistas (por ejemplo, los anticuerpos)
dirigidos contra la proteína codificada por el
DNA128451-2739 (PRO7133) sean útiles en la terapia
contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La hibridación in situ es una técnica
potente y versátil para la detección y localización de secuencias
de ácido nucleico dentro de la célula o en preparaciones de tejido.
Puede ser útil, por ejemplo, identificar los sitios de la expresión
génica, analizar la distribución tisular de la transcripción,
identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en
la síntesis del ARNm específico y ayudar en el mapeo
cromosómico.
La hibridación in situ se realizó según
una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell
Vision, 1:169-176 (1994), utilizando ribosondas
marcadas con ^{33}P y generadas por PCR. En resumen, los tejidos
humanos embebidos en parafina y fijados con formalina se
seccionaron, desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20
mg/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y después se procesaron para la
hibridación in situ tal como se describió por Lu y Gillett,
supra. Una ribosonda antisentido marcada con
UTP-^{33}P se generó a partir de un producto de
PCR y se hibridó a 55ºC durante toda la noche. Los portaobjetos se
sumergieron en una emulsión de rastreo nuclear NTB2 de Kodak y se
expusieron durante 4 semanas.
Se secaron al vacío 6,0 \mul (125 mCi) de
UTP-^{33}P (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol).
A cada uno de los tubos que contenía el
UTP-^{33}P seco se añadieron los ingredientes
siguientes:
20 \mul de tampón de transcripción 5X
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla NTP (2,5 mM: 10 \mul de
cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP + 10 \mul H2O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul de ARNsin
1,0 \mul de ADN plantilla (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de
PCR T3 = AS, T7 = S, generalmente)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora.
Se añadió un total de 1,0 \mul de RQ1 ADNsa, seguido de
incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadió un total de 90
\mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0), y la mezcla se
pipeteó en papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad
de ultrafiltración MICROCON-50^{TM}, y se
centrifugó con el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración
se invirtió en un segundo tubo y se centrifugó con el programa 2 (3
minutos). Después de la centrifugación de recuperación final, se
añadieron un total de 100 \mul de TE, a continuación se pipeteó 1
\mul del producto final en papel DE81 y se contaron en 6 ml de
BIOFLUOR II^{TM}.
La sonda se migró en un gel de TBE/urea. Un
total de 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN
Mrk III se añadieron a 3 \mul de tampón de carga. Después de
calentar en un bloque térmico a 95ºC durante 3 minutos, el gel se
colocó inmediatamente en hielo. Los pocillos del gel se nivelaron, y
la muestra se cargó y se migró a 180-250 voltios
durante 45 minutos. El gel se envolvió con un plástico (marca
SARAN^{TM}) y se expuso a una película XAR con una pantalla
intensificadora en un congelador a -70ºC durante una hora toda la
noche.
Las preparaciones se sacaron del congelador, se
colocaron en bandejas de aluminio, y se descongelaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en un
incubador a 55ºC durante 5 minutos para reducir la condensación.
Las preparaciones se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehido
al 4% en hielo en la campana de extracción de vapores, y se lavaron
en 0,5XSSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de
20XSSC + 975 ml H_{2}O SQ). Después de la desproteinización en 0,5
\mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de
una solución madre a 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa libre de
ARNsa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10
minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en
etanol al 70%, 95% y 100% durante 2 minutos cada uno.
Las preparaciones se desparafinaron, se
colocaron en H_{2}O SQ, y se enjuagaron dos veces en 2XSSC a
temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se
desproteinizaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10
mg/ml en 250 ml de tampón de ARNsa libre de ARNsa a 37ºC, 15 min)
para el tejido embrionario humano, o 8 x proteinasa K (100 \mul
en 250 ml de tampón ARNsa, 37ºC, 30 min) para tejidos en formalina.
Los siguientes enjuagues en 0,5XSSC y la deshidratación se
realizaron tal como se ha descrito anteriormente.
Las preparaciones se colocaron en una caja de
plástico recubierta con papel de filtro saturado en tampón Box
(4XSSC, formamida al 50%). El tejido se cubrió con 50 \mul de
tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de
H_{2}O SQ), se agitó vigorosamente, y se calentó en el microondas
durante 2 minutos con la tapa semiabierta. Después de enfriarse en
hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20XSSC y 9 ml
de H_{2}O SQ, y el tejido se agitó vigorosamente y se incubó a
42ºC durante 1-4 horas.
Se calentaron a 95ºC durante 3 minutos,
1,0x10^{6} cpm de la sonda y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml de
solución madre). Las preparaciones se enfriaron en hielo y se
añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por preparación.
Después de la agitación, se añadieron 50 \mul de mezcla de
^{33}P a 50 \mul de prehibridación en la preparación. Las
preparaciones se incubaron durante toda la noche a 55ºC.
Los lavados se realizaron durante 2x10 min con
2XSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml e 20xSSC +16 ml de EDTA
0,25 M, V_{f}=4L), seguido por un tratamiento con ARNsa A a 37ºC
durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón
ARNsa = 20 \mug/ml). Las preparaciones se lavaron 2x10 min con
2XSSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de astringencia
de los lavados fueron: 2 horas a 55ºC, 0,1XSSC, EDTA (20 ml de
20XSSC + 16 ml EDTA, V_{f}=4L).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El procedimiento siguiente describe la
utilización de una secuencia nucleotídica que codifica un
polipéptido PRO7133 como una sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de
un polipéptido de longitud completa o maduro tal como se describe
aquí y/o los fragmentos del mismo pueden utilizarse como una sonda
para cribar los ADNs homólogos (como los que codifican variantes
naturales en las bibliotecas de ADNc de tejido humano o las
bibliotecas genómicas de tejidos humanos.
La hibridación y lavado de los filtros que
contienen los ADNs de las bibliotecas se realizan en las siguientes
condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la sonda
radiomarcada a los filtros se realiza en una solución de formamida
al 50%, 5XSSC, SDS al 0,1%, pirosfosfato sódico al 0,1%, fosfato
sódico 50 mM, pH 6,8, 2 x solución de Denhardt y sulfato de
dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros
se realiza en una solución acuosa de 0,1XSSC y SDS al 0,1% a
42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia
deseada con el ADN que codifica la secuencia nativa de longitud
completa pueden entonces identificarse mediante técnicas estándares
conocidas en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de PRO7133 mediante expresión recombinante en E.
coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
PRO de interés se amplificó inicialmente con cebadores de PCR
seleccionados. Los cebadores deben contener dianas de enzimas de
restricción que corresponden con las dianas de enzimas de
restricción en el vector de expresión seleccionado. Pueden
utilizarse diversos vectores de expresión. Un ejemplo de un vector
es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar et al.,
Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a
ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con la enzima de
restricción y se desfosforila. Las secuencias de PCR amplificadas se
ligan a continuación en el vector. El vector incluirá
preferentemente secuencias que codifican un gen de resistencia a un
antibiótico, un promotor trp, un líder poli-His
(incluyendo los 6 primeros codones STII, la secuencia
poli-His, y la diana de clonación), la región
codificante de PRO7133, el terminador transcripcional de lambda y un
gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza a continuación
para transformar una cepa de E. coli mediante procedimientos
descritos en Sambrook et al., supra. Los
transformantes se identificaron por su capacidad para crecer en
placas de LB y a continuación se seleccionaron las colonias
resistentes al antibiótico. El ADN plasmídico puede aislarse,
comprobarse por análisis de restricción y secuenciarse.
Los clones seleccionados pueden crecerse durante
toda la noche en un medio de cultivo líquido como el LB
suplementado con antibióticos. Los cultivos de toda la noche pueden
consiguientemente utilizarse para inocular un cultivo a mayor
escala. Las células se crecen a la densidad óptica deseada, tiempo
durante el cual se activa el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante unas
horas más, éstas pueden cosecharse mediante centrifugación. El
sedimento celular obtenido por la centrifugación puede solubilizarse
con diversos agentes conocidos en la materia, y la proteína PRO7133
puede a continuación purificarse con una columna quelante de metales
en condiciones que permitan la unión fuerte de la proteína.
La proteína PRO puede expresarse de forma
satisfactoria en E. coli en una forma etiquetada con una
poli-His según el procedimiento siguiente. El ADN
codificante se amplifica inicialmente con cebadores de PCR
seleccionados. Los cebadores contienen dianas de enzimas de
restricción que corresponden con las dianas de enzimas de
restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras
secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción
eficiente y fiable, una purificación rápida en una columna de
quelación de metales y la extracción proteolítica con
enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con
poli-His amplificadas por PCR se ligan a
continuación en un vector de expresión, que se utiliza para
transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110
fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)
clpP(laclq). Los transformantes se crecen en primer lugar en
LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30ºC con agitación hasta
alcanzar una D.O. de 3-5 a 600 nm. Los cultivos se
diluyen entonces 50-100 veces en medio CRAP
(preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
0,71 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de
extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml
de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y
MgSO_{4} 7 mM) y se crecieron durante aproximadamente
20-30 horas a 30ºC con agitación. Se tomaron
muestras para verificar la expresión mediante análisis de
SDS-PAGE, y se centrifugó todo el cultivo para
sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelaron
hasta la purificación y replegamiento.
La pasta de E. coli de fermentaciones de
0,5-1 L (6-10 g de sedimentos) se
resuspendieron en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM,
tampón pH 8. Se añadieron sulfito sódico sólido y tetrationato
sódico hasta concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M,
respectivamente, y la solución se agitó durante toda la noche a
4ºC. Esta etapa dio lugar a una proteína desnaturalizada con todos
los residuos de cisteína bloqueados por la sulfitolización. La
solución se centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman
durante 30 min. El sobrenadante se diluyó con 3-5
volúmenes de tampón de columna quelante de metales (guanidina 6M,
Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micras
para aclararse. El extracto aclarado se cargó en una columna de
quelante de metales de 5 ml de Qiagen Ni^{2+}-NTA
equilibrada en el tampón de la columna quelante de metales. La
columna se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM
(Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. Las proteínas se eluyeron con
tampón que contenía imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían
la proteína deseada se agruparon y guardaron a 4ºC. La concentración
de proteínas se estimó por su absorbancia a 280 nm utilizando el
coeficiente de extinción calculado según su secuencia de
aminoácidos.
La proteína se repliega diluyendo la muestra
lentamente en tampón de replegamiento recién preparado que consiste
en: Tis 20 mM, pH 8,6; NaCl 0,3 M; urea 2,5 M; cisteína 5 mM,
glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se eligen
para que la concentración final se halle entre 50 y 100
microgramos/ml. La solución de replegamiento se agita suavemente a
4ºC durante 12-36 horas. La reacción de
replegamiento se desactiva mediante adición de TFA hasta una
concentración final del 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la
purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a
través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta
una concentración final del 2-10%. La proteína
replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros
R1/H con un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente
de acetonitrilo del 10 al 80%. Se analizan alícuotas de fracciones
con una absorbancia A_{280} en geles de
poliacrilamida-SDS y se agrupan las fracciones que
contienen la proteína replegada homogénea. Por lo general, las
especies replegadas de manera adecuada de muchas proteínas se
eluyen a concentraciones inferiores de acetonitrilo, ya que estas
especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos
resguardados de la interacción con la resina de fase inversa. Las
especies agregadas se eluyen generalmente a concentraciones de
acetonitrilo superiores. Además de resolver las formas mal
replegadas de las proteínas de la forma deseada, la etapa de fase
inversa también elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen la proteína
replegada deseada se agrupan y se elimina el acetonitrilo con una
corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas
se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y
manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel con
resinas Superfine G25 (Pharmacia) equilibrada en el tampón de
formulación y filtrada estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
de glicosilación potencial de PRO7133 mediante la expresión
recombinante de las células de mamífero.
El vector, pRK5 (véase la patente europea EP
307.247, publicada el 15 de Marzo de 1989), se utilizó como vector
de expresión. Opcionalmente, el ADN de PRO7133 se ligó en pRK5 con
enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del
ADN de PRO7133 utilizando los procedimientos de ligación como los
descritos por Sambrook et al., supra. El vector
resultante se denominó pRK5-PRO7133.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se crecieron hasta la confluencia en placas de cultivo
celular en medio como el DMEM suplementado con suero de ternera
fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos.
Aproximadamente 10 \mug del ADN de pRK5-PRO7133
se mezclaron con aproximadamente 1 mg del ADN que codifica el gen VA
ARN [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disolvió
en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM,
CaCl_{2} 0,277 M. A esta mezcla se añadió, gota a gota 500 \mul
de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se
permitió la formación de un precipitado durante 10 min a 25ºC. El
precipitado se resuspendió y se añadió a las células 293 y se dejó
reposar durante aproximadamente 4 horas a 37ºC. El medio de cultivo
se aspiró y se añadieron 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30
s. Las células 293 se lavaron a continuación con medio sin suero,
se añadió medio nuevo y se incubaron las células durante
aproximadamente 5 días.
Al cabo de aproximadamente 24 horas después de
las transfecciones, se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó
con medio (sólo) o con medio y 200 \muCi/ml de
cisteína-S^{35} y 200 \muCi/ml de
metionina-S^{35}. Al cabo de 12 horas de
incubación, el medio condicionado se recogió, se concentró en un
filtro de centrifugación, se cargó en un gel al 15% de SDS. El gel
procesado puede secarse y exponerse a una película durante un
período de tiempo para poner en evidencia la presencia del
polipéptido PRO7133. Los cultivos que contenían células
transfectadas pueden incubarse durante más tiempo (en medio sin
suero) y el medio se analiza en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el ADN de PRO7133
puede introducirse en células 293 de forma transitoria gracias al
procedimiento del dextrano de sulfato descrito por Somparvac et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se
crecieron a una densidad máxima en un frasco para centrifugado y se
añadieron 700 \mug del ADN PRK5-PRO7133. Las
células se concentraron en primer lugar a partir del frasco
centrifugador mediante centrifugación y se lavaron con PBS. El
precipitado de ADN-dextrano se incubó con el
precipitado celular durante 4 horas. Las células se trataron con
glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavaron con medio de
cultivo de tejidos y se re-incubaron en el frasco de
centrifugado que contenía medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml
de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo
de 4 días, el medio condicionado se centrifugó y se filtró para
eliminar las células y los restos celulares. La muestra que contenía
el PRO7133 expresado puede a continuación expresarse y purificarse
mediante un procedimiento seleccionado, como la diálisis y/o la
cromatografía en columna.
En otra realización, el PRO7133 puede expresarse
en células CHO. El vector pRK5-PRO7133 puede
transfectarse en células CHO utilizando reactivos como CAPO_{4} o
DEAE-dextrano. Tal como se describió más arriba, los
cultivos celulares pueden incubarse y el medio puede reemplazarse
con medio de cultivo (sólo) o medio que contenga un marcaje
radioactivo como la metionina S-35. Después de
determinar la presencia del polipéptido PRO7133, el medio de
cultivo puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los
cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y luego el
medio condicionado se cosecha. El medio que contenía el PRO7133
expresado puede concentrarse a continuación y purificarse mediante
el procedimiento seleccionado.
El PRO7133 etiquetado epitópicamente puede
también expresarse en células CHO. El PRO7133 puede subclonarse
fuera del vector pRK5. A continuación, mediante PCR se puede
fusionar el inserto del subclón en la misma pauta de lectura con
una etiqueta epitópica como una etiqueta poli-His en
un vector de expresión en Baculovirus. El inserto PRO7133
etiquetado epitópicamente con poli-His puede
subclonarse en un vector dirigido por SV40 con un marcador de
selección como el DHFR para la selección de clones estables. Por
último, las células CHO pueden transfectarse (tal como se describió
anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcaje puede
realizarse, tal como se describió anteriormente, para verificar la
expresión. El medio de cultivo que contenía el PRO7133 etiquetado
con poli-His puede concentrarse y purificarse
mediante un procedimiento seleccionado, como por ejemplo
cromatografía de afinidad con quelato de Ni^{2+}. La expresión de
CHO y/o de células COS puede también lograrse mediante un
procedimiento de expresión transitoria.
La proteína PRO puede expresarse en células CHO
mediante un procedimiento de expresión o mediante un procedimiento
transitorio. La expresión estable en células CHO se realiza mediante
el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan como una
construcción de IgG (inmunoadhesina), en la cual las secuencias
codificantes para las formas solubles (por ejemplo, dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una
secuencia de región constante de IgG que contiene la bisagra, los
dominios CH2 y CH2 y/o una forma etiquetada con
poli-His.
Después de la amplificación por PCR, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO mediante
técnicas estándares tal como se describe en Ausubel et al.,
Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and
Sons (1997). Los vectores de expresión en CHO se construyen para
tener dianas de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés
para permitir el traslado conveniente de los ADNcs. El vector
utilizado para la expresión en células CHO es tal como se describe
en Lucas et al., Nucl. Acids. Res., 24:9
(1774-1779, (1996)), y utiliza el promotor temprano
de SV40/potenciador para conducir la expresión del ADNc de interés
y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la
selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la
transfección.
Se introducen 12 \mug del ADN plasmídico en
aproximadamente 10 millones de células CHO por medio de reactivos
de transfección disponibles comercialmente, Superfect® (Qiagen),
Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se desarrollan
tal como se describe en Lucas et al., supra.
Aproximadamente, 3x10^{7} células se congelan en un vial para su
posterior crecimiento y producción tal como se describe más
adelante.
Los viales que contienen el ADN plasmídico se
descongelan colocándolos en un baño de agua y se mezclan con
agitación vigorosa. Los contenidos se pipetean en un tubo de
centrífuga con 10 ml de medio y se centrifugan a 1000 rpm durante 5
min. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml
de medio selectivo (PS20 filtrado con filtro de 0,2 \mum y suero
bovino fetal diafiltrado con filtro de 0,2 \mum). A continuación,
las células se ponen en alícuotas en frascos de centrifugación de
100 ml con 90 ml de medio selectivo. Al cabo de 1-2
días, las células se transfieren a frascos de centrifugación de 250
ml con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incuban a
37ºC. Al cabo de otros 2-3 días, se sembraron
frascos de centrifugación de 250 ml, 500 ml y 2000 ml con
3x10^{5} células/ml. El medio celular se intercambia por medio
nuevo mediante centrifugación y resuspensión en medio de
producción. Aunque puede utilizarse cualquier medio CHO adecuado,
se prefiere un medio de producción descrito en la patente americana
U.S. 5.122.469, publicada el 16 de Junio de 1992. Se siembra un
frasco de centrifugación de 3 L con 1,2x10^{6} células/ml. El día
cero, se determina el número de células y el pH. El día 1, se toma
una muestra del frasco de centrifugación y se inicia la introducción
de aire filtrado. El día 2, se toma una muestra del frasco de
centrifugación, la temperatura se desplaza hasta 33ºC y se añaden
30 ml de glucosa a 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por
ejemplo, una emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, emulsión de
grado médico Dow Corning 365). Durante la producción, el pH se
ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Al
cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad disminuya por debajo del
70%, el cultivo celular se recoge por centrifugación y se filtra a
través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o
se carga inmediatamente en columnas para su purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, las proteínas se purifican utilizando una
columna Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la
purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea en una
columna Ni^{2+}-NTA equilibrada con Hepes 20 mM,
pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una
velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de
la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio adicional y
se eluye la proteína con tampón de equilibrio que contiene imidazol
0,25 M. La proteína altamente purificada se desala a continuación en
un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y
manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine
(Pharmacia) y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purifican a partir del medio condicionado de la
manera siguiente. El medio condicionado se bombea en una columna de
Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón
fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava
extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido
cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen
275 \mul de Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se
desala posteriormente en tampón de almacenamiento tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. Se valora la homogeneidad mediante geles
de poliacrilamida-SDS y mediante la secuenciación
de aminoácidos N-terminal por degradación de
Edman.
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Ejemplo
9
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de PRO7133 en levaduras.
En primer lugar, los vectores de expresión se
construyeron para la producción intracelular o la secreción de
PRO7133 a partir del promotor ADH2/GADPH. El ADN que codifica
PRO7133 y el promotor se insertaron en las dianas de restricción
adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular de pRO7133. Para la secreción, el ADN que codifica
PRO7133 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN
que codifica el promotor ADH2/GADPH, un péptido señal de PRO7133
nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, una
secuencia líder/señal del factor alfa de levaduras, o de la
invertasa secretora, y secuencias enlazadoras (si fuera necesario)
para la expresión de PRO7133.
Las células de levaduras como la cepa de
levadura AB110, puede transformarse con los plásmidos de expresión
descritos anteriormente en el medio de fermentación seleccionado.
Los sobrenadantes de levaduras transformadas pueden analizarse
mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y por
separado mediante PAGE-SDS, seguido de una tinción
de los geles con azul de Coomassie.
El PRO7133 recombinante puede a continuación
aislarse y purificarse extrayendo las células de levaduras del
medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentración
del medio con filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que
contiene PRO7133 puede a continuación purificarse mediante resinas
seleccionadas de cromatografía en columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de células de insecto infectadas con Baculovirus.
La secuencia codificante para PRO7133 se fusiona
cadena arriba de una etiqueta epitópica contenida en un vector de
expresión de Baculovirus. Dichas etiquetas epitópicas incluyen las
etiquetas de poli-His y las etiquetas de
inmunoglobulina (como por ejemplo las regiones Fc de IgG). Puede
utilizarse una variedad de plásmidos, incluyendo los derivados de
plásmidos disponibles comercialmente como pVL 1393 (Novagen). En
resumen, la secuencia codificante de PRO7133 o la porción deseada de
la secuencia codificante de PRO7133 [tal como la secuencia
codificante del dominio extracelular de una proteína transmembrana o
la secuencia codificante de la proteína madura si la proteína es
extracelular] se amplifica mediante PCR con cebadores
complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede
incorporar dianas de restricción flanqueantes (seleccionadas). El
producto se digiere a continuación con las enzimas de restricción
seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se generó mediante
co-transfección del plásmido anterior y del ADN del
visur BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) mediante la utilización
de lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO BRL). Al cabo de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección
viral y la expresión de proteínas se realizaron tal como se
describe en O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors:
A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
A continuación, es posible purificar el PRO7133
etiquetado con poli-His, por ejemplo mediante
cromatografía de afinidad con quelato-Ni^{2+} de
la manera siguiente. Se preparan los extractos a partir de las
células Sf9 infectadas con el virus tal como se describe por Rupert
et al., Nature, 362:175-179 (1993). En
resumen, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de
sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM;
glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M), y se
sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se
clarifican por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces
en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH
7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara
una columna de agarosa NTA-Ni2+ (disponible
comercialmente por Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava
con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de lavado. El
extracto celular se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La
columna se lava al nivel basal A_{280} con tampón de carga, en
cuyo punto de fracción se inicia la recolección. A continuación, se
lava la columna con un segundo tampón de lavado (fosfato 50 mM,
NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína unida
inespecíficamente. Después de alcanzar el nivel basal A280 de
nuevo, la columna se revela con un gradiente de imidazol de 0 a 500
mM en el segundo tampón de lavado. Se recogen fracciones de 1 l y
se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o
transferencia de Western con NTA-Ni2+ conjugado con
fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el eluido
de PRO7133 etiquetado con poli-His, respectivamente,
se agrupan y dializan contra el tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del PRO7133
etiquetado con IgG (o Fc) puede realizarse mediante técnicas de
cromatografía, incluyendo por ejemplo, columnas de cromatografía con
Proteína A o proteína G.
Mientras que la expresión se realiza en realidad
a una escala de 0,5-2 L, puede realizarse fácilmente
a escalas mayores (por ejemplo, 8 L). Las proteínas se expresan
como una construcción IgG (inmunoadhesina) en la que la región
extracelular de la proteína se fusiona a una secuencia de región
constante de IgG1 que contiene la bisagra, los dominios CH2 y CH3
y/o las formas etiquetadas con poli-His.
Después de la amplificación por PCR, las
secuencias codificantes respectivas se subclonaron en un vector de
expresión de baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones IgG y pb.PH.His.c
para proteínas etiquetadas con poli-His) y el
vector y ADN de baculovirus Baculogold® (Pharmigen) se
cotransfectaron en 10^{5} células de Spodoptera frugiperda
("Sf9") (ATCC CRL 1711), utilizando Lipofectin (Gibcol BRL).
Pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión de
baculovirus disponible comercialmente pVL1393 (Pharmigen), con
regiones polienlazadoras modificadas para incluir las secuencias
etiqueta His o Fc. Las células se crecieron en medio Hink
TNM-FH suplementado con FBS al 10% 8Hycoone). Las
células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se
recogió y a continuación se utilizó para la primera amplificación
viral mediante infección de células Sf9 en medio Hinks
TNM-FH suplementado con FBS al 10% a una
multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10. Las células
se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y la
expresión de las construcciones en el vector de expresión de
baculovirus se determinó mediante unión del lote de 1 ml de
sobrenadante a 25 l de bolas de NÇTA-Ni2+ (Qiagen)
para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas de
Protein-A Sepharose CL-4B
(Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG seguido de un
análisis por SDS-PAGE comparado con una
concentración conocida de proteína estándar por tinción de azul de
Coomassie.
El sobrenadante de la primera amplificación
viral se utilizó para infectar un cultivo en recipiente de
centrifugación (500 ml) de células Sf9 crecidas en medio
ESF-921 (Expression Systems LLC) a aproximadamente
una MOI de 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El
sobrenadante se recogió y filtró. La unión por lotes y el análisis
por SDA-PAGE se repitieron tantas veces como fue
necesario, hasta confirmar la expresión del cultivo en el
recipiente de centrifugación.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 L) se recogió por centrifugación para
eliminar las células y se filtró a través de filtros de 0,22
\mum. Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, la construcción de la proteína se
purificó con una columna NTA-Ni2+ (Qiagen). Antes de
la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una
columna de NTA-Ni2+ de 6 ml equilibrada con Hepes 20
mM, pH 7,4, con NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo
de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de la carga, la
columna se lavó con tampón adicional de equilibrio y la proteína se
eluyó con tampón de equilibrio que contenía imidazol 0,25 M. La
proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón
de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al
4%, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) y
se guardó a -80ºC.
Las construcciones de proteínas de
inmunoadhesina se purificaron del medio condicionado de la manera
siguiente. El medio condicionado se bombeó en una columna de
Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón
fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lavó
extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido
cítrico, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente
mediante cosecha de fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275
ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se
desaló a continuación en tampón de almacenamiento tal como se
describió más arriba para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad de las proteínas se
verificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)-SDS y secuenciación aminoacídica
N-terminal mediante degradación de Edman.
La proteína PRO se puede expresar en células de
insecto infectadas con Baculovirus mediante el procedimiento
anterior.
Alternativamente, se puede utilizar un
procedimiento de baculovirus modificado que incorpora células altas
5. En este procedimiento, el ADN que codifica la secuencia deseada
se amplifica con sistemas adecuados, como la Pfu (Stratagene), o se
fusiona cadena arriba (5'-de) de una etiqueta
epitópica con un vector de expresión de baculovirus. Dichas
etiquetas epitópicas incluyen etiquetas poli-His y
etiquetas de inmunoglobulinas (como las regiones Fc o IgG). Es
posible utilizar diversos plásmidos, incluyendo plásmidos derivados
de plásmidos comerciales como el pIE1-1 (Novagen).
Los vectores pIE1-1 y pIE1-2 se
diseñaron para expresión constitutiva de proteínas recombinantes
del promotor ie1 de baculovirus en células de insecto transformadas
de forma estable. Los plásmidos difieren únicamente en la
orientación de las dianas de clonación múltiples y contiene todas
las secuencias promotoras conocidas por ser importantes para la
expresión de genes mediados por ie-1 en células de
insecto no infectadas así como el elemento intensificador hr5. Los
vectores pIE1-1 y pIE1-2 incluyen el
sitio de inicio de traducción y pueden utilizarse para producir
proteínas de fusión. En resumen, la secuencia deseada o la porción
deseada de la secuencia (como la secuencia codificante del dominio
extracelular de una proteína transmembrana) se amplificó mediante
PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El
cebador 5' puede incorporar dianas de restricción flanqueantes
(seleccionadas). El producto se digiere a continuación con las
enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de
expresión. Por ejemplo, los derivados de pIE1-1
pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG) o una
etiqueta de 8 histidinas cadena abajo (3'-de) la
secuencia deseada. Preferentemente, la construcción del vector se
secuencia para su confirmación.
Las células altas 5 se crecen a una confluencia
del 50% en las siguientes condiciones: 27ºC, sin CO_{2}, sin
pen/strep. Para cada placa de 150 mm, se mezclan 30 \mug del
vector basado en pIE que contenía la secuencia con 1 ml de medio
Ex-Cell (Medio: Ex-Cell 401 + 1/100
L-Glu JRH Biosciences #14401-78P
(nota: este medio es sensible a la luz), y en un tubo separado, se
mezclan 100 \mul de CellFectin (CellFECTIN
(GIbcoBRL#10362-010) (se agita con el vórtex para
mezclar) y se añade 1 ml de medio Ex-Cell y se
mezcla. Las dos soluciones se combinan y se permite la incubación a
temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añaden 8 ml de medio
Ex-Cell a los 2 ml de ADN/CellFECTIN y todo ello se
dispone sobre las células altas 5 que habían sido lavadas una vez
con medio Ex-Cell. La placa se incuba a continuación
en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de
ADN/CellFECTIN se aspira y las células se lavan de nuevo con
Ex-Cell para eliminar el exceso de CellFECTIN, se
añaden 30 ml de medio Ex-CEll fresco y las células
se incuban durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosecha y se
determina la expresión de la secuencia en el vector de expresión de
baculovirus mediante unión del lote de 1 ml de sobrenadante a 25 ml
de bolas de NTA-Ni2+ (Qiagen) para las proteínas
etiquetadas con histidina o bolas de Protein-A
Sepharose CL-4 (Pharmacia) para proteínas
etiquetadas con IgG seguido por análisis de
PAGE-SDS comparando con una concentración conocida
de proteínas estándares por tinción de azul de Coomassie.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 L) se recogió mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró a través de un filtro de 0,22
\mum. Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, la proteína que comprende la secuencia se
purificó con una columna NTA-Ni2+ (Qiagen). Antes
de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una
columna de NTA-Ni2+ de 6 ml equilibrada con Hepes 20
mM, pH 7,4, y tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una
velocidad de flujo de 4-5 min a 48ºC. Después de la
carga, la columna se lavó con tampón de equilibrio y la proteína se
eluyó con tampón de equilibrio que contenía imidazol. La proteína
altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de
almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al
14%, pH 6,8 con una columna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y se
guardó a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de las proteínas se purificaron del medio condicionado
de la manera siguiente. El medio condicionado se bombeó n una
columna de 5 ml de Protein A (Pharmacia) que había sido equilibrada
con tampón fosfato N 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna
se lavó extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución
con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían
ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían
275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada
se desaló en el tampón de almacenamiento tal como se describió
anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad de la secuencia se
confirmó mediante geles de poliacrilamida-SDS y
secuenciación aminoacídica N-terminal por
degradación de Edman y otros procedimientos analíticos según sea
necesario o a requerimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
PRO7133.
Las técnicas para la producción de los
anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia y se describen,
por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunogenes que pueden
utilizarse incluyen las proteínas de fusión PRO7133 purificadas que
contienen PRO7133 y las células que expresan el PRO7133 recombinante
en la superficie celular. La selección del inmunogen puede
realizarse por el experto en la materia sin demasiada
experimentación.
Se inmunizaron ratones, como los Balb/c, con el
inmunógeno PRO7133 emulsionado en adyuvante completo de Freund y se
inyectaron subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
se emulsionó en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectaron en los
cojinetes de las patas traseras. Los ratones inmunizados se
volvieron a inyectar 10 a 12 días después con inmunógeno adicional
emulsionado en el adyuvante seleccionado. Los ratones también pueden
volverse a inyectar con inyecciones de inmunización adicionales
durante varias semanas. De este modo, es posible obtener muestras
de suero periódicamente del ratón mediante sangrado
retro-orbital para los ensayos ELISA con el fin de
detectar anti-PRO7133.
Después de detectar un título de anticuerpos
adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden
volverse a inyectar con una inyección intravenosa final de PRO7133.
De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se
obtienen las células del bazo. Éstas se fusionan (por medio de
polietilén glicol al 35%) con una línea celular de mieloma murino
como P3X63AgU.1, disponible de ATCC No.CRL 1597. Las fusiones
generan células de hibridoma que pueden sembrarse en placas de 96
pocillos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para
inhibir la proliferación de células no-fusionadas,
híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.
Las células de hibridoma se analizarán en un
ensayo ELISA para su reactividad contra PRO7133. La determinación
de células de hibridoma "positivas" que secreten los
anticuerpos monoclonales contra PRO7133 deseados se halla dentro
del ámbito de la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c para producir
ascitas que contengan anticuerpos monoclonales
anti-PRO7133. La purificación de anticuerpos
monoclonales en las ascitas puede lograrse mediante la utilización
la precipitación con persulfato amónico, seguido de cromatografía
de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la
cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la
proteína A o proteína G.
Los materiales siguientes se han depositado en
el American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.
Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Material | ATCC Depósito No: | Fecha del depósito |
DNA128451-2739 | PTA-618 | 31 de Agosto de 1999 |
Estos depósitos se realizaron según las
consideraciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de
Procedimiento de Patentes y sus Regulaciones (Tratado de Budapest).
Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito de
30 años desde la fecha del depósito. El depósito estará disponible
por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a
un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegure la
disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del
cultivo depositado para el público según la expedición de la patente
americana pertinente o tras haber permanecido abierta al público de
cualquier solicitud americana o extranjera, quien quiera que sea el
primero y asegure una disponibilidad de la progenie al determinado
por el Comisionado U.S. de Patentes y Marcas según el acuerdo 35
USC \NAK 122 y las normas del Comisionado según lo acordado
(incluyendo la 37\NAKCFR1.14 con la referencia especial a 886 OG
638).
El cesionario de la presente solicitud está de
acuerdo en que si un cultivo de los materiales en depósito
pereciera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las
condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán prontamente
tras notificación con otro cultivo del mismo. La disponibilidad del
material depositado no debe considerarse como una licencia para la
práctica de la invención en contravención con los derechos
garantizados bajo la autoría de cualquier gobierno de acuerdo con
sus leyes de patentes.
La memoria escrita precedente se considera
suficiente para permitir a un experto en la materia la práctica de
la invención. La presente invención no está limitada en su ámbito
por la construcción depositada, ya que la realización depositada
pretende ser una única ilustración de ciertos aspectos de la
invención y cualquier construcción que sea equivalente
funcionalmente se hallará dentro del ámbito de esta invención. El
depósito del material no constituye una admisión de que la
descripción escrita contenida aquí sea inadecuada para permitir la
práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor
modo de la misma, ni debe considerarse como limitante el ámbito de
las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que se
presentan. De hecho, serán evidentes para los expertos en la
materia a partir de la anterior descripción diversas modificaciones
de la presente invención además de las mostradas y descritas en la
presente invención y se encontrarán dentro del ámbito de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
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\bullet US 4816567 A [0104] [0105] [0237]
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 05018358.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-02-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US00/03565
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-02-11
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<150> PCT/US99/05028
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<151>
1999-03-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/123.972
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-03-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/133.459
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-11
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> PCT/US99/12252
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-06-02
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> US 60/140.650
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<151>
1999-06-22
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<151>
1999-06-22
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<150> US 60/144.758
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<151>
1999-07-20
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<150> US 60/145.698
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<151>
1999-07-26
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<151>
1999-07-28
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> US 60/149.395
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<151>
1999-08-17
\vskip1.000000\baselineskip
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<151>
1999-08-31
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<150> PCT/US99/20111
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<151>
1999-09-01
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<150> PCT/US99/21090
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1999-09-15
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1999-11-30
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1999-12-01
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1999-12-01
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<151>
2000-01-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda sintética de
oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccggatcca caatggctac cgagagtact cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda sintética de
oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda síntetica de
oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda síntetica de
oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttagggaatt tggtgctcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda sintética de
oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgctctccc ttgctcttcc cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda sintética de
oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgcagta ggtattttca gttt
\hfill24
Claims (28)
1. Ácido nucleico aislado que tiene:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de aminoácidos
con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2
(SEC ID No: 2); o
que tiene al menos un 80% de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos con respecto a una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en
(b) la secuencia de nucleótidos mostrada en la
figura 1 (SEC ID No: 1);
(c) la secuencia codificante de longitud
completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEC
ID No: 1); y
(d) la secuencia codificante de longitud
completa de DNA128451-2739, depositada bajo el
número de acceso de ATCC PTA-618;
en el que la identidad de secuencia de ácidos
nucleicos se establece utilizando el programa
ALIGN-2 y en el que dicho ácido nucleico se
amplifica en el tumor de pulmón y/o colon.
2. Vector que comprende el ácido nucleico según
la reivindicación 1.
3. Vector según la reivindicación 2, unido
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
huésped transformada con el vector.
4. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 3.
5. Célula huésped según la reivindicación 4, en
la que dicha célula es una célula CHO, una E. coli, una
célula de levadura o una célula de insecto infectada con
Baculovirus.
6. Proceso para producir un polipéptido PRO7133
codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1, que
comprende el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 5,
en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y
la recuperación de dicho polipéptido del cultivo celular.
7. Polipéptido aislado codificado por un ácido
nucleico según la reivindicación 1, que tiene al menos un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la
figura 2 (SEC ID No: 2); y
(b) la secuencia de aminoácidos codificada por
la secuencia codificante de longitud completa de
DNA128451-2739, depositada bajo el número de acceso
de ATCC PTA-618;
en el que la identidad de la secuencia de
aminoácidos se establece utilizando el programa
ALIGN-2.
8. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido según la reivindicación 7.
9. Molécula quimérica según la reivindicación 8,
en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
secuencia de etiqueta epitópica, o una región Fc de una
inmunoglobulina.
10. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido según la reivindicación 7.
11. Anticuerpo según la reivindicación 10, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo
humanizado o un anticuerpo de cadena única.
12. Anticuerpo según la reivindicación 10, que
es un anticuerpo monoclonal que comprende una región determinante
de complementariedad (CDR) no humana o una región estructural (FR)
humana.
13. Anticuerpo según la reivindicación 10, que
está marcado.
14. Anticuerpo según la reivindicación 10, que
es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena única.
15. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica el anticuerpo según la reivindicación 10.
16. Vector que comprende la molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 15.
17. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 16.
18. Procedimiento para producir un anticuerpo
que se une a un polipéptido PRO7133 tal y como se ha definido en la
reivindicación 7, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de la
célula huésped según la reivindicación 17 en condiciones
suficientes para permitir la expresión de dicho anticuerpo y la
recuperación de dicho anticuerpo del cultivo celular.
19. Procedimiento para determinar la presencia
de un polipéptido PRO7133 tal y como se ha definido en la
reivindicación 7, en una muestra de prueba sospechosa de contener
dicho polipéptido, comprendiendo dicho procedimiento la exposición
de la muestra a un anticuerpo anti-PRO7133 según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, y la determinación de
la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido en dicha
muestra.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicha muestra comprende una célula sospechosa de contener un
polipéptido PRO7133 tal y como se ha definido en la reivindicación
7.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha célula es una célula cancerosa.
22. Procedimiento de diagnóstico de un tumor en
un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la detección del
nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido PRO7133 tal
y como se ha definido en la reivindicación 7 (a) en una muestra de
prueba de células del tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una
muestra de control de células del tejido normales conocidas del
mismo tipo de célula, en el que un nivel de expresión más elevado
en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control,
es indicativo de la presencia de tumor en el mamífero del que se
obtuvieron las células del tejido de prueba.
23. Procedimiento de diagnóstico de un tumor en
un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento (a) el contacto de
un anticuerpo anti-PRO7133 según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14 con una muestra de prueba de células del
tejido obtenidas del mamífero, y (b) la detección de la formación de
un complejo entre dicho anticuerpo y un polipéptido PRO7133 tal y
como se ha definido en la reivindicación 7 en la muestra de prueba,
en el que la formación de un complejo es indicativo de la presencia
de un tumor en dicho mamífero.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que dicho anticuerpo está marcado de manera detectable.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en el que dicha muestra de prueba de
células del tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener
crecimiento o proliferación de células neoplásicas.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 25, en el que dicha muestra de prueba
comprende células de pulmón o colon.
27. Kit de diagnóstico del cáncer que comprende
un anticuerpo anti-PRO7133 según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14 y un portador en un envase adecuado.
28. Kit según la reivindicación 27, que
comprende además instrucciones para utilizar dicho anticuerpo para
detectar la presencia de un polipéptido PRO7133 tal y como se ha
definido en la reivindicación 7 en una muestra sospechosa de
contener el mismo.
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