PT585681E

PT585681E - Utilizacao do receptor de il-4 para terapia, profilaxia e diagnostico de doencas infecciosas

Info

Publication number: PT585681E
Application number: PT93112929T
Authority: PT
Inventors: Karlheinz Enssle; Roland Kurrle; Leander Lauffer; Friedrich-Robert Seiler
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1992-08-31
Filing date: 1993-08-12
Publication date: 2001-11-30
Also published as: DK0585681T3; CA2105101A1; EP0585681A3; US6328954B1; GR3036655T3; JP3703103B2; AU668974B2; JPH06157335A; NO933077D0; EP0585681B1; MX9305269A; AU4495093A; NO933077L; EP0585681A2; CA2105101C; ATE202285T1; IL106842A0; DE59310177D1; ES2158852T3; US6210661B1

Description

f Ρ7έΓ r DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DO RECEPTOR DE IL-4 PARA TERAPIA, PROFILAXIA E DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS" A terapia e a profilaxia de muitas doenças virais, parasitárias e bacterianas representa como sempre um grande problema. A presente invenção refere-se à utilização do receptor de IL-4 ou de derivados deste para a preparação de um medicamento para a terapia, a profilaxia e o diagnóstico destas doenças.

Numa doença virai, parasitária ou bacteriana é sabido que no respectivo decurso ocorrem alterações nas subpopulações dos linfócitos e dos monócitos. Estas alterações consistem por exemplo na ocorrência de proliferação das chamadas células auxiliares T do tipo 2 (no que se segue designadas por células TH2) . As células T podem em geral ser divididas em subpopulações com base nos marcadores de superfície e com base na respectiva função. Deste modo os linfócitos auxiliares T possuem por exemplo moléculas superficiais CD4 e segregam citoquinas após a sua activação.

Após estimulação em ratos, por exemplo com o antigénio bacteriano de Brucella abortus ou com Mycobacterium tuberculosis, encontram-se após clonagem de células auxiliares T principalmente clones que segregam linfotoxinas, interferão gama e interleuquina-2 mas poucos ou nenhuns que segregam interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6 e interleuquina-10 (células auxiliares T do tipo conhecido como TH1) .

Após infecção de, por exemplo, ratos susceptíveis com agentes parasitários como Leishmania major, ocorrem na clonagem de células auxiliares T principalmente clones que produzem 1 \l ' interleuquina-4, interleuquina-5 e interleuquina-10 após proliferação, mas quantidades reduzidas ou não detectáveis de interleuquina-2 e interferão gama (células auxiliares T do tipo TH2) (Mosmann et al., Immunological Reviews 1991, n.° 123, 209--229; S. Romagnani, Immunology Today, 256-257, vol. 12, n.° 8 1991).

Esta ocorrência de proliferação de linfócitos TH2 foi já detectada em algumas doenças infecciosas em animais e em doentes humanos (Else e Grencis, Parasitology Today, vol. 7. n.° 11, 1991, pp. 313-316; Parasitology Today, vol. 7. n.° 10, 1991, p. 261) e reflecte-se também em parâmetros secundários. Deste modo, ratos infectados com Leishmania major mostram em geral uma produção reduzida de interferão gama, uma IgE no soro aumentada e eosinofilia.

Nos seres humanos afectados por exemplo por lepra lepromatósica, leishmaniose e esquistossomíase e infecções com Mycobacterium tuberculosis encontram-se em geral concentrações muito elevadas de IgE no soro destes doentes em comparação com o soro de pessoas normais. Nas infecções parasitárias observa--se frequentemente uma eosinofilia no decurso da doença.

Verificou-se agora que infecções que se caracterizam por meio da ocorrência de proliferação de células auxiliares T do tipo TH2 podem ser diagnosticadas e tratadas terapeuticamente e/ou profilacticamente com o auxilio do IL-4R ou de derivados deste. O objecto da presente invenção é por conseguinte a utilização do receptor de IL-4 ou de derivados deste para a preparação de um medicamento para a terapia e/ou profilaxia ou para a preparação de um meio de diagnóstico para detectar infecções nas quais ocorre uma proliferação de células auxiliares T do tipo TH2.

Por "derivados" do IL-4R no sentido da presente invenção 2 entendem-se fracções, mutantes ou variantes equivalentes funcionais do IL 4R, em especial as fracções extrac.el ulares do IL-4R, principalmente do ácido aminado 1 até aproximadamente ao 209 da proteína madura do receptor humano de IL-4 mas também os respectivos mutantes de glicosilação. Para a utilização de acordo com a presente invenção do receptor podem também ser empregues proteínas de fusão que contêm o IL-4R ou os seus derivados bem como outras proteínas ou fracções de proteínas, de preferência a fracção Fc de anticorpos (proteínas de fusão IL-4R/Fc). Para além disso, podem ser empregues o IL-4R ou derivados ou proteínas de fusão do mesmo em preparados de combinação para o diagnóstico, a terapia e/ou o tratamento profilático das doenças referidas, de preferência em combinação com interferão gama.

Também é vantajosa uma terapia em combinação com alérgenos purificados ou fracções destes.

Além disso é vantajosa uma terapia em combinação com interferão gama e/ou substâncias que bloqueiam a interacção da molécula de superfície das células CD40 com o seu ligando, o ligando da molécula de superfície das células CD40, de preferência uma variante solúvel da própria molécula de superfície CD40, como p. ex. uma proteína de fusão CD40-Ig correspondente à descrição que se segue ou os seus derivados.

Por "derivados" de uma variante solúvel da molécula de superfície CD40 no sentido da presente invenção compreende-se uma fracção ou variante funcional equivalente que bloqueia a interacção de CD40 celular com o ligando da molécula de superfície celular CD40.

Entre as doenças contam-se infecções, em especial infecções virais, bacterianas e parasitárias bem como infecções por fungos; de preferência infecções com o vírus da imuno-deficiência humana (HIV), por micobactérias, principalmente por Mycobacterium leprae, com Listeria, com protozoários, 3 - u principalmente dos géneros Leishmania e Plasmodium, com helmintos, principalmente dos géneros esquistossoma, Nippostrongylus e Heligmosomoides com Trichurida, Trichinella, Taenis (Cysticercus), Candida e Aspergillus.

As formas de aplicação são em geral diferentes nas diversas doenças. Deste modo, por exemplo, a aplicação tópica pode ser vantajosa em algumas doenças. Por exemplo, na conjuntivite é conveniente a aplicação de gotas oftálmicas, uma vez que as células TH2 patológicas podem principalmente ser detectadas topicamente.

Foi anteriormente descrito que o receptor humano de IL-4 é constituído no seu conjunto por 825 ácidos aminados (Idzerda, R.J. et al. (1990) J. Exp. Med. 171, 861-873). De acordo com Idzerda et al., retirados os 25 ácidos aminados N-terminais como peptídeo de sinal, o receptor de IL-4 humano maduro é constituído por 800 ácidos aminados e apresenta uma estrutura em três domínios que são 1) o domínio extracelular (207 ácidos aminados), 2) a região transmembrana (cerca de 24 ácidos aminados) e 3) o domínio citoplasmático (569 ácidos aminados) . É especialmente vantajosa uma preparação do receptor de IL-4 por manipulação genética, uma vez que é possível deste modo obter sem mais as quantidades de substância necessárias para a terapia. A preparação do IL-4R pode por exemplo ser efectuada de acordo com o pedido de Patente Internacional W090/05183. Segundo este, prepara-se um banco genético de ADNc por exemplo da linha de células T designada por T22 e submete-se a busca com uma sonda de ADNs específica para IL-4R. Como sonda pode utilizar-se o ADNc de uma linha de células de rato híbrido subtraído descrito em W090/05183. É possível no entanto utilizar também uma sonda de hibridação específica para IL-4R, por exemplo uma ou várias sondas de cerca de 20 nucleótidos de comprimento das posições 193 a 210, por exemplo, para busca do banco de ADNc. Após a verificação dos clones positivos de ADNc 4

específicos em relação a IL-4R, p. ex. por sequenciaçâo, o ADN de IL-4R encontrado pode ser clonado em vectores de expressão adequados, p. ex. pCAV/NOT (W090/05183) e pode ser expresso integral ou parcialmente em células hospedeiras apropriadas, p. ex. células COS-7; BHK-21 ou CHO. Se se utiliza para a expressão apenas a fracção do ADNc que codifica para a região extracelular do receptor de 1L-4, a região extracelular do receptor de interleuquina 4 em geral de células transfectadas é segregada para o meio de cultura. Para este fim, o ADNc é modificado por métodos de manipulação genética correspondentes ao estado da técnica de tal modo que após a sequência de φ codificação para a região extracelular de um receptor, ou a fracção pretendida deste, se introduz um codão de paragem e o ADNc modificado deste modo é clonado num vector de expressão apropriado (Maliszewski et al. (1990), J. Immunol. 144, 3028--3033; Dower et al. (1989), J. Immunol. 142, 4314). Em muitos casos, como p. ex. no caso do receptor de IL-4 murino, isolam--se ADNcs que codificam para uma forma segregada de ocorrência natural do receptor (Mosley et al. (1989), Cell 59, 335). Estes ADNcs podem então ser utilizados directamente para a preparação de vectores de expressão. A proteína segregada pode ser purificada a partir do meio de cultura por exemplo por meio de cromatografia de afinidade com ligandos ou cromatografia de afinidade imunológica utilizando anticorpos monoclonais ^ (Maliszewski et al. (1990), J. Immunol. 144, 3028-3033).

Conforme se encontra descrito no pedido de Patente Europeia EP--Al-0 464 533, podem-se preparar ainda por via de tecnologia genética proteínas de fusão entre o IL-4R ou derivados deste e outras proteínas, por exemplo com fracções de imunoglobulinas, p. ex. a fracção Fc de moléculas de anticorpos, e aquelas (doravante designadas por IL-4R/Fc) podem ser levadas a expressão. A vantagem das proteínas de fusão deste tipo reside em prolongamento do tempo de semi-vída e numa concentração e purificação mais fácil por meio de cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose.

Em virtude da purificação sem problemas por cromatografia 5 \ \

de afinidade e das propriedades farmacocinéticas eventualmente melhoradas, a síntese de formas solúveis do rec.eptor de IL-4 sob a forma de proteínas de fusão com imunoglobulinas é particularmente vantajosa. A proteína CD40 é uma proteína de membrana do tipo I, isto é, é constituída por uma região extracelular (aminoterminal), uma região transmembrana e uma região citoplasmática (carboxi-terminal) . 0 ADNc que codifica para CD40 pode ser isolado por exemplo a partir de um banco de ADNc de células Raji por meio do método de "Panning" (Stamenkovic, I. et al. (1989) EMBO J., vol. 8, pp. 1403-1410) . A fim de provocar a expressão da proteína de membrana de um modo normal sob a forma solúvel, existem diversas possibilidades bem conhecidas dos especialistas. Por exemplo, é possível introduzir um codão de paragem por meio de uma reacção de cadeia de polimerase utilizando um iniciador de mutagénese na extremidade da sequência de ADNc que codifica para a região extracelular. O ADNc modificado deste modo codifica então para uma proteína CD40 que é segregada para fora das células como outras proteínas de secreção em virtude da falta de ancoragem à membrana (Fanslow, W.C. et al. (1992) J. Immunol., pp. 655--660). Pode também ser vantajosa a utilização de proteínas de fusão solúveis recombinantes com imunoglobulinas, cuja preparação é por exemplo descrita em EP-A-0 464 533. São em especial conhecidas da literatura proteínas de fusão CD40/Ig (Fanslow et al. (1992) J. Immunol., vol. 149, pp. 655-660 e Noelle et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 89, pp. 6550-6554). Em ambas as publicações são descritas proteínas de fusão CD40/Ig constituídas pela região extracelular de CD40 fundida aos domínios de charneira, CH2 e CH3 da cadeia pesada de uma molécula G1 de imunoglobulina humana. Para a preparação da construção de ADN correspondente, introduzem-se no ADNc de CD40 locais de corte por restrição por meio de reacções em cadeia de polimerase utilizando iniciadores mutagénicos (Fanslow et al., (1992) J. Immunol., vol. 149, pp. 655-660) ou utilizam-se locais de corte por restrição de ocorrência natural 6 no ADNc de CD40 (Noelle et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 89, pp. 6550-6554).

As formas solúveis de CD40 podem ser expressas como proteínas recombinantes em sistemas procarióticos ou eucarióticos conhecidos, de preferência porém em culturas de células de mamífero, e podem ser purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura ou dos restos celulares por meio de métodos convencionais. Abstraindo de uma possível utilização terapêutica directa das moléculas solúveis de CD40, estas podem a partir de agora ser também empregues para a identificação de outras substâncias que bloqueiam a interaeção de CD40 de membrana e de ligandos de CD40 e deste modo apresentam igualmente um potencial terapêutico. Isto pode ocorrer por exemplo em ensaios de ligação de receptores isentos de células (EP-A-0 488 170) , em que as moléculas solúveis de CD40 são integradas numa fase sólida e a ligação de ligandos solúveis de CD40 é efectuada por meio de marcação ou de anticorpos adequados. Estes ensaios oferecem em virtude da sua possibilidade de automatização a possibilidade de investigar uma grande quantidade de substâncias no que se refere à sua interaeção com CD40/ligandos de CD40 ("escrutínio de receptores").

Para os exemplos que se apresentam em seguida utilizaram--se as regiões extracelulares definidas em Idzerda et al. (1990, J. Exp. Med. 171, 861-873) ou Maliszewski et al. (1990, J. Immunol. 144, 3028-3033) ou as formas solúveis de ocorrência natural do receptor de IL-4 humano ou murino (daqui em diante designado por huIL-4R ou muIL-4R, respectivamente), que após dupla selecção com metotrexato e G418 (EP-A 0330 977) são segregadas sob a forma de proteínas solúveis para o meio de cultura pelas células BHK que expressam de forma estável e são purificadas por meio de cromatografia de imuno-afinidade. Para este fim utilizam-se proteínas de fusão receptor/imunoglobulina (EP-A1-0 464 533) que são constituídas pela região extracelular do receptor humano ou murino de IL-4 com dominios de charneira, CH2 e CH3 de uma molécula de IgG2b humana ou murina, respectivamente (ZettlmeiRl et al. (1990) ADN and Cell Biol. 9, 347-353) (daqui em diante designadas por huIL-4R/Fc e muIL--4R/Fc, respectivamente) e igualmente após expressão em células BHK são purificadas por meio de cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose. A interleuquina-4 de cada espécie homóloga é neutralizada numa análise biológica por IL-4R e IL-4R/FC com igual eficácia.- (Exemplo 1). Foi possível para além disso detectar a inibição de clones de células T humanas do tipo TH2 por meio de huIL-4R/Fc também in vitro. A IL-4 formada in vitro por meio deste clone foi neutralizada por huIL-4R/Fc. Daqui resulta como consequência uma redução da proliferação. Clones de controlo do tipo TH1 não foram influenciados no seu crescimento por huIL--4R/Fc (Exemplo 3).

Para além disso, verificou-se que a proteína huIL-4R/Fc pode reprimir in vitro a síntese induzida por IL-4 e também surpreendentemente a síntese específica em relação ao antigénio de IgE por meio das células mononucleares humanas do sangue periférico (Exemplo 2).

Surpreendentemente foi possível detectar para o receptor murino solúvel da interleuquina-4 um efeito terapêutico e profilático em infecções como por exemplo num modelo animal da listeriose murina e num modelo animal (rato) da infecção por Cysticercus crassiceps.

Exemplo 1

Actívidade biológica das variantes humana e murina de IL-4R e IL-4R/FC. A actívidade biológica foi medida por meio de uma análise biológica. A IL-4 liga-se fortemente de modo específico ao receptor de IL-4. A partir desta base, utilizou-se uma linha de 8 [ ^ —Ê· \l ' células de origem murina e que apresenta nas membranas o receptor murino de IL-4. Esta linha de células foi transfectada com o gene completo para o receptor da interleuquina-4 humana. Os receptores de membrana murino e humano eram expressos de modo simultâneo funcionalmente por esta linha de células e a linha de células proliferou tanto na dependência da IL-4 murina como também da humana (Mosley et al., Cell, vol. 59, 335-340, 20 de Outubro de 1989).

Para a detecção de muIL-4R e de muIL-4R/Fc utilizou-se IL-4 murina (Quadro 1) . A linha de células proliferou na dependência da IL-4 murina (Quadro 1) . Quando se empregou interleuquina-4 de modo constante e se adicionou simultaneamente muIL-4R ou muIL-4R/Fc, resultou uma neutralização dependente da concentração da interleuquina-4. Uma vez que há pouca interleuquina-4 disponível para a linha de células, a proliferação retrocede. Uma proteina de controlo com a mesma fracção de Fc não apresenta este efeito. As diferenças nas inibições dependentes da concentração entre muIL-4R e muIL--4R/Fc no Quadro 1 são de atribuir aos diferentes pesos moleculares.

No Quadro 2 apresenta-se a bioactividade da interleuquina-4 humana e, de modo correspondente ao Quadro 1, o efeito de neutralização especifica de huIL-4R ou huIL-4R/Fc.

As diferenças nas inibições dependentes da concentração entre huIL-4R e huIL-4R/Fc são de atribuir aos diferentes pesos moleculares.

Exemplo 2

Isolaram-se células mononucleares humanas do sangue periférico. Cultivaram-se 5000 células por alvéolo numa placa de cultura de 96 alvéolos com 200 μΐ de meio de cultura de Iscove com 10 % de BSA durante 14 dias. No inicio não se utilizou qualquer aditivo para a cultura ou adicionaram-se 9 apenas 100 unidades SQ (segundo as instruções do fornecedor) de antigénio de ácaro (Derm. Pt., Art.° n.° Sq 503, Soc. Scherax, Hamburgo) ou antigénio de ácaro e 3 μg/ml de huIL-4R/Fc. Para controlo de Fc utilizou-se uma amostra com antigénio de ácaro e 3 μg/ml de TW1. TW1 é um anticorpo monoclonal humano com especificidade para o antigénio da raiva que apresenta o mesmo isõtipo de hUIL-4R/FC. A preparação de TW1 foi levada a efeito de acordo com EP-0 445 625 AI. Em seguida separou-se o sobrenadante e ensaiou-se por ELISA em IgE humana. Verificou-se que a produção de IgE induzida por antigénio por meio de huIL--4R/Fc foi reprimida de modo especifico (Quadro 3).

Exemplo 3

Inibição da proliferação induzida por antigénio de clones de células T do subtipo TH2.

Isolaram-se clones de células T da pele de um doente com dermatite atópica. Uma fracção mais elevada dos clones segregaram após estimulação in vitro citoquinas do tipo TH2 e apenas foi encontrada uma fracção reduzida de clones do tipo TH1. Os ensaios de proliferação foram efectuados em placas de microtitulação de 96 alvéolos com lxlO4 de células T clonadas e lxl0S de PBL autólogos irradiados como células estimuladoras em meio de cultura de Iscove com 4 % de soro AB humano. A cultura foi levada a efeito durante 18 h com 0,5 μΟϊ/concavidade de cultura de 3H-timidina em estufas de criação em atmosfera de CO2 a 37 °C. Após 18 h determinou-se a proliferação das células por meio da timidina incorporada. Para a produção de citoquinas no sobrenadante, estimularam-se lxl06/ml de células T clonadas com meio de Iscove, 10 % de FCS e 10 μρΜΙ de concanavalina A em placas de cultura de 24 alvéolos. Os sobrenadantes foram retirados após 24 h de duração da cultura em estufas de criação em atmosfera de CO2 (37 °C) . Ensaiaram-se os sobrenadantes das culturas em análises biológicas no que se refere ao teor de interleuquina-2 humana e de interleuquina-4 humana. As análises biológicas foram baseadas em linhas de células que proliferam em dependência de interleuquina-2 humana ou de interleuquina-4 humana (Mosley et al. Cell, vol. 59, 335-348, 10 de Outubro de 1989) . Nos sobrenadantes de um clone de TH2 não foi possível detectar qualquer IL-2, mas sim uma grande quantidade de IL-4. Por adição de 3 pg/ml de huIL-4R/Fc foi possível detectar em vez de 49 ng/ml de IL-4 apenas ainda 10 ng/ml de IL-4. Os sobrenadantes de um clone de TH1 continham em comparação muita IL-2, mas apenas pouca IL-4. A concentração de interleuquina-2 nos sobrenadantes do clone de THl não foi influenciada de modo significativo pela adição de huIL-4R/Fc durante a cultura. Em experiências de proliferação foi possível demonstrar que a proliferação do clone de TH2 é reprimida, ao contrário do que se passa com o clone de THl, pela adição de 3 μg/ml de huIL--4R/Fc (Quadro 4). Além disso foi possível demonstrar que por adição de huIL-4R/Fc a proliferação específica em relação a um antigénio específica para ácaros do clone de TH2 é reprimida, mas não a do clone de THl. Numa outra experiência foi possível demonstrar que a síntese de IgE induzida por antigénio de ácaro de uma mistura de um clone de TH2 com linfócitos B autólogos do mesmo doador pode ser reprimida por adição de huIL-4R/Fc.

Exemplo 4

Tratamento de uma infecção com Cysticercus (Taenia) crassiceps no rato com receptor de interleuquina-4 murina.

Para a experiência infectaram-se no dia 0 ratos NMRI com 15 a 25 g de peso corporal com 5 metacestóides simples por rato em 1 ml de PBS i.p. da estirpe de Cysticercus (Taenia) crassiceps MR-1. Utilizaram-se 10 animais por grupo da experiência. Um grupo não foi infectado para controlo (injecção de PBS sem metacestóides) . Um grupo foi infectado, mas não foi tratado. Um grupo foi infectado e foi tratado nos dias -1, 0, 1, 7, 14, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55 e 63 com 100 μg em cada animal i.p. de muIL-4R. Um outro grupo foi infectado e foi tratado com huIL-4R como proteína de controlo de modo análogo ao do tratamento com muIL-4R. No dia 76 pesaram-se os animais e

V

U efectuou-se uma secção. Determinou-se em quais dos animais podiam ser encontrados na cavidade abdominal metacestóides. Nos animais positivos determinou-se o peso em húmido dos metacestóides encontrados por animal. No grupo que tinha sido tratado com o receptor da interleuiquina-4 murina foi possível verificar uma redução nítida do peso total dos metacestóides {Quadro 5).

Exemplo 5

Influência da muIL-4R sobre a infecção com Candida albicans murina

Infectaram-se ratos híbridos fêmeas (BALB/cCrxDBA/2Cr)F1 (CD2F1) com a estirpe altamente patogénica de Candida albicans CA-6 (5 x 104 células por via intravenosa) (dia 0 da experiência). Com inicio 24 horas antes da infecção cada animal recebeu 100 μg de muIL-4R em 250 μΐ de PBS por via intraperitoneal uma vez no dia -1, duas vezes em cada um dos dias 0 e 1 e uma vez em cada um dos dias 2 e 3. Os animais de controlo receberam em alternativa com o mesmo esquema albumina de soro de rato (MSA) , huIL-4R ou PBS. Todos os animais que foram tratados com albumina de soro de rato (16 animais), huIL--4R (16 animais) e PBS (24 animais) desenvolveram uma infecção progressiva com Candida com um período de sobrevivência médio de 14 a 17 dias após infecção. Dos animais que foram tratados com muIL-4R (24 animais) sobreviveram 91,6 %. Estes animais sobreviventes foram infectados de novo 8 semanas após infecção com Candida albicans (106 células). Todos os animais sobreviveram a esta nova infecção. Esta dose de infecção provocou em ratos normais não tratados uma infecção letal com períodos de sobrevivência de 2 a 3 dias após infecção. 12 Γ y

Quadro 1

Bioactividade de receptores de IL-4 murina

Curva padrão de IL-4 murina ng/ml CPM Desv. padr. 100 46609 7,4 20 47809 8,1 0,4 43550 11,1 0, 8 25534 7,9 0, 16 8456. 13,7 0, 032 1987 10,7 0, 064 901 12,4 1 ng/ml de IL-4 murina constante

Mu IL-4R Mu IL- -4R/Fc Fc - controlo μg/ml CPM desv. padr. CPM desv. padr. CPM desv. padr. 10 635 7,7 3844 35,7 34696 15,1 1 1285 17,1 3482 11, 6 38452 6,0 0,1 7417 10, 9 14408 6,2 39532 8,9 0, 01 27038 2,3 32310 14, 9 35308 3,1 0,001 33187 7,7 34658 7,5 39290 5,4 0,0001 31881 4,5 36931 14,1 38388 4,1 0,00001 36059 5,2 36719 5, 3 40911 6,4 o o 34112 5, 5 37417 4,1 37663 14, 5 (desvio padrão em %) 13

Quadro 2

Bioactividade de receptoree de IL-4 humana Curva padrão de IL-4 humana ng/ml CPM desv. padr. 100 134112 4,0 20 125877 3,0 4 127607 8, 6 0, 8 91743 4,7 0,16 45908 9,2 0, 032 20898 3,9 0,064 12385 7,1 1 ng/ml de IL-4 humana constante

Hu IL-4R Hu IL -4R/FC Fc - Controlo □g/ml CPM desv. CPM desv. CPM desv. padr. padr. padr. 10 2770 32,9 3860 11, 6 98001 3,3 1 7421 11,6 11480 6,0 96002 1,9 0,1 26508 2, 3 37794 2, 3 100637 4,8 0, 01 62536 5, 3 75391 2,2 95146 0,8 0,001 77769 7,1 90660 9,3 98835 0,2 0,0001 85739 3,7 95597 10,6 81495 20, 7 0,00001 90227 5,3 96132 6,2 94356 2, 0 0, 0 92748 6, 5 95139 4,9 95203 6, 5 (desvio padrão em %)

Quadro 3

Inibição da síntese de IgE específica de alérgeno

Meio. 100 SQ U/ml de derm. pt. de alérgeno de ácaro 3 μρ/ιηΐ de 3 μg/rαl de Controlo sem hu TT,-4R/Fc hu IL-4R/Fc Fc - controlo <0, 09 1,23 (4,1) <0, 09 1,17 (5,6)

Os dados são de IgE humana em ng/ml.

Entre parêntesis: desvio padrão em percentagem

Quadro 4 Γ

Clone de células T especificas em relação a ácaros da pele de um doente com dermatite atópica IL-2 autócrina (U/ml, análise biológica) IL-4 autócrina (ng/ml, análise biológica) IL-4 autócrina (ng/ml, 3 μg/Inl hu IL-4R/Fc por análise bioiõgica Proliferação rH2-clone 1141 10 μg/Ial ConcA - < 25 49 (9) < 1 Inibição 10 μg/Ittl ConcA +3μg/lILl hu XL-4R/F c ΓΗΙ-Klcn 1150 < 25 10 (8) < 1 10 μg/Inl ConcA 97 (2) 18 (29) 8,8 (11) sem 10 μ9/ιη1 ConcA ^-3μg/ml hu IL-4R/Fc 86 (20) 10 (5) 6,3 (1 ~) inibição (desvio padrão em %)

Quadro 5 Tratamento de urna infecção com CysticercuG (Tacnia) crassiceps no rato com receptor de interleuquina-4 murina Tratamento Peso corporal Carga de Carga de parasitas parasitas com (gramas) (gramas de peso (gramas de peso húmido por cada húmido por cada animal animal muIL-4R 35,7 neg. neg. 0,1 neg. 6, 0 7,5 13,7 neg. 0,1 neg. neg. huIl-4R 35, 9 < 0,1 neg. < 0,1 neg. 8,4 6, 3 34,9 8,2 5,7 1,3 5, 0 Controlo de 35, 8 1/0 5, 8 infecção neg. 3,7 2,7 2,1 31,6 7,2 6,2 1,0 1,9 Controlo 0 34, 5 - -

Lisboa, 10 de Setembro de 2001 3ENTE oficial da propriedade industrial

17 *7

Claims

Γli t REIVINDICAÇÕES 1. Utilização do receptor de IL-4 (IL-4R) ou de um seu derivado para a preparação de um medicamento para terapia e profilaxia de infecções que se caracterizam pela ocorrência de proliferação de células auxiliares T do tipo TH2.
2. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado para a preparação de um agente de diagnóstico para a detecção de infecções que se caracterizam pela ocorrência de proliferação de células auxiliares T do tipo TH2.
3. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os derivados serem fracções, mutantes ou variantes do IL-4R.
4. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por um derivado ser a região extracelular do IL-4R.
5. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o receptor de IL-4 ou um seu derivado ser componente de uma proteína de fusão.
6. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a proteína de fusão conter o receptor de IL-4 ou um seu derivado e a fracção Fc de um anticorpo.
7. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a infecção ser uma infecção virai, bacteriana ou parasitária ou uma infecção por fungos.
8. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com toma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a 1 p- L· ^^ infecção ser uma infecção com retrovírus, plectomicetes, sacaromiceteo, micobactérias, Listeria, protozoários, cestóides ou helmintos.
9. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a infecção ser uma infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), Mycobacterium leprae, Leishmania, Plasmodium, esquistossoma, Nippostrongylus, Trichurida, Trichinella, Taenia (Cysticercus) , Candida, Aspergillus, Cyclophilida ou Heligmosomoides.
10. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o IL- -4R ou um seu derivado ser utilizado num preparado de combinação.
11. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o preparado de combinação conter interferão gama.
12. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o preparado de combinação conter alérgenos ou fracções de alérgenos.
13. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o preparado de combinação conter uma ou várias substâncias que inibem a interacção do ligando da proteína de superfície das células CD40 com a proteína de superfície das células CD40.
14. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por pelo menos uma das substâncias constituir um determinante solúvel da molécula de superfície CD40 ou um seu derivado.
15. utilização do IL-4R ou de um seu derivado para a preparação 2 ► * de um medicamento de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6 para aplicação tópica.
16. Utilização do IL-4R ou de um seu derivado para a preparação de um medicamento de acordo com a reivindicação 15 para aplicação intradérmica, subcutânea, dérmica, nasal ou pulmonar. Lisboa, 10 de Setembro de 2001

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