ES2222625T3 - Peptido t y peptidos asociados destinados al tratamiento de la inflamacion incluyendo la esclerosis multiple. - Google Patents
Peptido t y peptidos asociados destinados al tratamiento de la inflamacion incluyendo la esclerosis multiple.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE AL PEPTIDO T Y SUS ANALOGOS CICLICOS DE FORMULA GENERAL 1: DONDE A ES ALA, GLY, VA, SER, THR O ESTA AUSENTE; B ES ALA, GLY, VAL, SER, THR O ESTA AUSENTE; C ES SER, THR, O ESTA AUSENTE; D ES SER, THR, ASN, GLU, ARG, ILE, LEU O ESTA AUSENTE; E ES SER, THR, ASP O ESTA AUSENTE; F ES THR, SER, ASN, ARG, GLN, LYS, TRP O ESTA AUSENTE; G ES TYR O ESTA AUSENTE; H ES THR, ARG, GLY, MET, MET(O), CYS, THR, GLY O ESTA AUSENTE; Y I ES CYS O ESTA AUSENTE; II ES CYS, UN GRUPO AMIDA, UN GRUPO AMIDA SUSTITUIDO, UN GRUPO ESTER, O ESTA AUSENTE; AL MENOS UNO DE LOS AMINOACIDOS ESTA SUSTITUIDO OPCIONALMENTE POR UN CARBOHIDRATO MONOMERICO O POLIMERICO O UN DERIVADO DEL MISMO, LLEVANDOSE A CABO DICHA SUSTITUCION A TRAVES DE LOS GRUPOS HIDROXILO Y/O AMINO DE LOS AMINOACIDOS. DICHOS PEPTIDOS COMPRENDEN AL MENOS 4 AMINOACIDOS, Y SE INCLUYEN ASIMISMO SUS SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES. DICHOS PEPTIDOS SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE LA INFLAMACION, ESPECIALMENTE DE LA ESCLEROSIS MULTIPLE, MIELOPATIAS (INCLUYENDO LA MIELOPATIA ASOCIADA A HTLV-1) Y SINTOMAS Y ENFERMEDADES ASOCIADOS CON LA ACTIVACION INMUNITARIA CRONICA, INCLUYENDO EL SINDROME DE FATIGA CRONICA, EL CHOQUE TOXICO, LA ARTRITIS, EL SINDROME DEL COLON INFLAMABLE Y LAS RESPUESTAS DE HUESPED FRENTE A INJERTO E INJERTO FRENTE A HUESPED, EN RECEPTORES DE TRASPLANTES.
Description
Péptido T y péptidos asociados destinados al
tratamiento de la inflamación incluyendo la esclerosis
múltiple.
La presente invención se refiere, en líneas
generales, a la prevención o tratamiento de la esclerosis múltiple
(MS). También se describen composiciones farmacéuticas y ciertos
péptidos activos útiles en tal tratamiento y/o prevención.
La esclerosis múltiple (MS) generalmente es
considerada por muchas autoridades una enfermedad inflamatoria
crónica.
La MS afecta al sistema nervioso central y
periférico y clínicamente puede estar presente como una mielopatía
que afecta tanto a los nervios espinales como a las fibras nerviosas
mielinadas espinales.
La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad
desmielinizante crónica del sistema nervioso central y es la
enfermedad neurológica crónica más común en adultos jóvenes. Durante
décadas no ha cambiado la incidencia de la MS ni su patrón de
distribución. La enfermedad sigue siendo básicamente intratable.
La MS siempre se ha considerado una enfermedad de
las zonas templadas y tiene una prevalencia en el norte de Estados
Unidos, Canadá y Europa de 1:1000. La enfermedad tiene una
predilección de género de 1,5:1 (mujeres:varones).
La MS normalmente afecta a múltiples áreas de
materia blanca en el sistema nervioso central (SNC), más
frecuentemente, la materia blanca periventricular, tronco
encefálico, médula espinal y los nervios ópticos. El proceso
principal destruye las vainas de mielina y finalmente destruye a
los oligodendrocitos creando la placa característica de la
MS.
MS.
Las primeras fases del desarrollo de la placa se
caracterizan por el desarrollo de inflamación perivascular seguido
de la migración de linfocitos, células plasmáticas y macrófagos al
interior de la lesión. A esto le sigue gliosis de astrocitos y los
intentos de remielinización por los oligodendrocitos. Los
linfocitos rodean a la placa.
Aunque todavía se desconoce la etiología de la
MS, el centro de los esfuerzos de investigación que han conducido a
hipótesis convincentes son los de la desregulación inmune,
incluyendo autoinmunidad y predisposición genética, desempeñando
ambos un papel en el desarrollo real de la enfermedad.
En pacientes en la fase aguda de la enfermedad se
encuentran reproduciblemente múltiples anormalidades inmunológicas.
La síntesis de inmunoglobulinas, aunque es normal en el sistema
periférico, está aumentada en el sistema nervioso central y los
anticuerpos producidos tienen un modelo característico de bandas. Se
desconoce la especificidad antigénica de estos anticuerpos y no está
claro si desempeñan un papel en la progresión de la enfermedad.
Los diversos agentes agresores que se sabe que
activan el sistema inmune, tales como infección viral o
intervención quirúrgica, también pueden producir una exacerbación
de la MS. Otros activadores tales como el interferón \gamma
producen efectos similares cuando se administran. Además, por
ejemplo, la terapia antiinflamatoria inmunosupresora con
corticosteroides puede producir una pequeña remisión o al menos un
alivio durante pequeños períodos de tiempo, aunque esta terapia es
controvertida.
Se ha demostrado una reactividad de los
linfocitos contra dos antígenos neuronales, la proteína básica de
mielina y proteolípidos. Aunque no se ha demostrado, esta actividad
podría constituir la base para una respuesta autoinmune contra el
tejido neuronal.
La presente invención se encarga de la
identificación de un grupo de péptidos que alivian la respuesta
inflamatoria en la MS. Los péptidos útiles en la presente invención
no interfieren necesariamente de forma directa con los mecanismos
patogénicos del componente que provoca la enfermedad. Como se
describirá más adelante en los datos experimentales, el mecanismo
por el que estos péptidos pueden aliviar los síntomas de estas
enfermedades depende de su capacidad para modular la producción y el
efecto de citoquinas producidas por células activadas del sistema
inmune. La modulación de las citoquinas puede no limitarse al factor
de necrosis tumoral (TNF), sino que también puede ser válida para
una serie entera de interleuquinas, por ejemplo de la
interleuquina-1 a la
interleuquina-10. Actualmente, los datos presentados
no son evidencias directas, sino más bien un modelo indirecto
poderoso. De esta forma, el modelo usa uno de los compuestos
inflamatorios conocidos más poderosos, LPS, que se une a receptores
presentes sobre los neutrófilos, monocitos y macrófagos; por
consiguiente, estas células se activan y comienzan la producción de
IL-1 y TNF, entre otras citoquinas, comenzando de
esta manera la cascada inflamatoria. Un parámetro usado para medir
este efecto del LPS es la concentración de glucosa en sangre, que
normalmente disminuye tras la exposición a TNF o LPS. Por lo que se
conoce en la bibliografía sobre el mecanismo del Péptido T a un
nivel celular, es muy sorprendente que el Péptido T y sus análogos
puedan reducir significativamente los efectos negativos del LPS.
Normalmente, el LPS se combina con la Proteína de Unión a LPS (LBP)
y ejerce su espectacular efecto a través del receptor CD14. En la
bibliografía publicada hasta la fecha, los péptidos útiles en esta
invención sólo se han relacionado con el receptor CD4, que no se
cree que esté implicado en la respuesta inflamatoria principal
asociada con las citoquinas tales como TNF, o con LPS.
Más específicamente, se ha descubierto que un
grupo particular de péptidos, particularmente los pertenecientes al
grupo que tiene al menos 5 restos aminoacídicos, son agentes muy
eficaces útiles en el tratamiento de la MS.
Los compuestos, como se ha indicado
anteriormente, están relacionados con el Péptido T y sus diversos
derivados. Originalmente se pensó que tales compuestos no tenían
ningún efecto sobre el sistema inmune que no fuera ser muy útiles en
el bloqueo de la unión del virus VIH a las células con receptores
CD4 (Ruff et al, IV International Conference on AIDS,
Stockholm, junio de 1988).
En un principio, muchos de los péptidos útiles en
la invención se describieron como agentes que eran eficaces en la
prevención de la infección y replicación del VIH in vitro;
véanse los documentos EP-A-0249390,
EP-A-0249394 y
WO-A-8809338. Todos los compuestos
descritos en estas memorias descriptivas son útiles para la presente
invención. El péptido original tiene su punto básico de origen en el
octapéptido
Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr.
Se denomina Péptido T porque el 50% de los restos aminoacídicos son
treoninas. Este péptido se ha identificado a partir de una subregión
de la molécula de glicoproteína externa gp120 del virus de la
inmunodeficiencia human (VIH), que es responsable de la unión a
cualquier célula que lleve la molécula CD4 y, en particular,
linfocitos auxiliares, células microgliales en el SNC, monocitos y
células dendríticas. La unión se produce mediante la unión
específica de gp120 a la molécula CD4. Por consiguiente, el
tratamiento de individuos infectados por VIH con este péptido y sus
derivados, que se describen más adelante, tiene el efecto de
inhibir potencialmente la unión de todo el virus o de la molécula
gp120 neurotóxica al receptor celular CD4. De esta forma, la célula
está protegida de la infección y, por lo tanto, el virus, que es
incapaz de replicarse, se destruye por la defensa inmune.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de un péptido lineal o cíclico de
Fórmula General 1:
(Fórmula General
1)I-A-B-C-D-E-F-G-H-II
en la que A es Ala, Gly, Val, Ser,
Thr o está
ausente,
B es Ala, Gly, Val, Ser, Thr o está ausente,
C es Ser, Thr o está ausente,
D es Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, Ile, Leu o está
ausente,
E es Ser, Thr, Asp o está ausente,
F es Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys, Trp o está
ausente,
G es Tyr o está ausente,
H es Thr, Arg, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr,
Gly o está ausente,
I es Cys o está ausente,
II es Cys o está ausente;
y donde el péptido comprende la secuencia de
aminoácidos
-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-
(SEC ID Nº:
3)
estando opcionalmente sustituido
uno o más de los aminoácidos por un carbohidrato monomérico o
polimérico o derivado del mismo, realizándose tal sustitución
mediante grupos hidroxilo y/o amino y/o amino de los
aminoácidos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la
esclerosis múltiple.
Cada uno de los aminoácidos indicados en la
Fórmula General 1 puede estar en la configuración estereoisomérica L
o D, y los candidatos para H pueden esterificarse o amidarse.
Los penta-, hexa-, hepta-, octa- y
nota-péptidos útiles en la invención comprenden la
secuencia de aminoácidos
-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-
(SEC ID Nº: 3) y todos son de los péptidos elegidos a partir de la
secuencia:
I-A-B-C-D-E-F-G-H-II
\newpage
delecionando restos, por ejemplo,
uno cada vez, del extremo carboxilo o amino terminal, o del interior
de la
secuencia.
Se aprecia que los péptidos que tiene la
secuencia central de
Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-
pueden tener en ambos extremos restos aminoacídicos adicionales, de
los que algunos se representan por la Fórmula General 2:
(Fórmula General
2)X-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Y
en la que X es un resto
aminoacídico terminal seleccionado entre Ala y D-Ala
e Y es un resto carboxi terminal seleccionado entre Thr y
Thr-amida.
Los péptidos tienen la secuencia central
mencionada anteriormente de
-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-.
Se descubrió que estos péptidos de la Fórmula General 2 anterior y,
en particular, una variante del Péptido T de la fórmula
-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-,
son muy útiles en la inhibición de la unión del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) a células humanas mediante el bloqueo
de los sitios receptores en las superficies celulares. La expresión
Péptido T se usa a lo largo de la memoria descriptiva para hacer
referencia, a menos que el contexto requiera otra cosa, a péptidos
de Fórmula General 2 que incluyen la secuencia peptídica central.
Por lo tanto, se pretende que el Péptido T englobe todos los
compuestos de Fórmula general 2, entendiéndose que todos estos
compuestos son variantes del octapéptido T entendido normalmente,
también denominado Péptido T prototipo, de la fórmula particular
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-amida.
El péptido generalmente se administrará en una
cantidad eficaz no tóxica o en tal cantidad que encuentre un
equilibrio aceptable entre la eficacia y la toxicidad, teniendo en
cuenta las circunstancias del caso.
Los péptidos útiles en la invención tienen, como
su porción activa, una secuencia de aminoácidos de la fórmula:
-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-
Estos péptidos son útiles en la prevención o
tratamiento de la MS.
Los péptidos más preferidos útiles en la
invención son los siguientes:
1.
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-NH_{2}
(Péptido T prototipo)
2.
Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr
3.
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr
4.
D-Ala-Ala-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Met
5.
Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr
6.
Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr
7.
Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr
8.
D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr
9.
D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH_{2}
10.
D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH_{2}
Con bastante frecuencia puede ser ventajoso tener
el aminoácido amino terminal como un
D-estereoisómero, para proteger a la molécula de la
degradación por aminopeptidasas; como alternativa o adicionalmente,
el aminoácido carboxi terminal puede ser una amida de aminoácido
para proteger a la molécula de la degradación por
carboxipeptidasas. A este respecto, los compuestos 5, 6 y 7
indicados anteriormente incluyen análogos con D-Thr
como resto amino terminal y/o un derivado de amida en el extremo
carboxi terminal.
Además, debe entenderse que uno o más de los
aminoácidos en los péptidos pueden ser aminoácidos sustituidos con
N-alquilo (por ejemplo, alquilo
(C_{1}-C_{4})) en lugar de aminoácidos
primarios; los ejemplos incluyen metilo y etilo. Las cadenas
laterales con grupos hidroxilo de uno o más de los aminoácidos
(Ser, Thr, Tyr) pueden derivatizarse en un grupo éter o éster. Puede
formarse cualquier alquil éster o éter (opcionalmente sustituido),
tal como ésteres, éteres, tioésteres y tioeteres de alquilo
(C_{1}-C_{4}), arilo o arilalquilo
(C_{1}-C_{4}), por ejemplo feniléster,
benciléter o tiofenol etiléster. Los éteres preferidos actualmente
son éteres de metilo, etilo y propilo y son ésteres actualmente
preferidos ésteres de metilo, etilo y propilo.
Las cadenas laterales hidroxilo de los
aminoácidos Ser, Thr y/o Tyr y los grupos amido de los aminoácidos
Asn y/o Gln pueden estar sustituidos con diferentes carbohidratos o
derivados de carbohidratos. Los derivados de carbohidratos pueden
ser como los analizados anteriormente.
Los péptidos lineales útiles en esta invención
pueden prepararse por cualquier proceso adecuado, tal como técnicas
sintéticas de péptidos en fase sólida convencionales; véase "Solid
Phase Peptide Synthetic Techniques", 2ª edición, J.M. Stewart,
J.D. Young, Pierce Chemical Company, 1984, ISBN:
0-935940-030. Un método de fase
sólida que se usa frecuentemente es la técnica de Merrifield. Otra
posibilidad son las técnicas en fase de solución. El péptido
preferido, Péptido T prototipo, se puede obtener fácilmente en
Carlbiotech A/S, Copenhagen, Dinamarca.
Los péptidos cíclicos útiles en la invención
pueden prepararse mediante técnicas conocidas, tales como, por
ejemplo, las descritas en Y. Hamada en Tetrahedron Letters,
26 5155 (1985). Los péptidos cíclicos pueden establecerse en
forma de un puente disulfuro entre dos restos de Cys y/o haciendo
reaccionar el resto aminoacídico carboxi terminal con el resto amino
terminal y/o haciendo reaccionar el resto amino terminal con, por
ejemplo, el grupo \gamma-carboxilo de Glu, cuando
Glu está en la posición D.
Los derivados de carbohidrato pueden prepararse
mediante métodos conocidos en la técnica.
Los péptidos útiles en la invención pueden
administrarse como una composición junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
De esta forma, los péptidos pueden usarse en
composiciones farmacéuticas y en composiciones de materia para
tratar y prevenir la MS.
Los péptidos y formulaciones de péptidos pueden
usarse solos o en combinación con cualquier otro compuesto
farmacéuticamente activo, tal como un agente
anti-infeccioso, por ejemplo un antibiótico y/o
agente antiviral y/o agente antifúngico, u otro compuesto activo
farmacéuticamente aceptable, tal como un agente
anti-neoplásico.
Los péptidos pueden administrarse por vía oral,
bucal, parenteral, tópica, rectal, vaginal, mediante pulverización
por inhalación intranasal, mediante inhalación intrapulmonar o de
otra forma.
En particular, los péptidos pueden formularse
para uso tópico, para inhalación con pulverizador o en polvo, para
inyección (por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular,
intravenosa, intra-articular o intracisternal), para
infusión o para administración oral, y pueden presentarse en forma
de dosis unitaria en ampollas o comprimidos o en viales multidosis u
otros recipientes con un conservante añadido. Las composiciones
pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o
emulsiones, o geles en vehículos oleosos o acuosos, y pueden
contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión,
estabilizantes y/o agentes de dispersión. Como alternativa, el
ingrediente activo puede estar en polvo y/o en forma liofilizada
para administración directa o para reconstitución con un vehículo
adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, solución salina
normal o dextrosa al 5%) antes de uso. Las composiciones
farmacéuticas que contienen el péptido o péptidos también pueden
contener otros ingredientes activos tales como agentes
antimicrobianos o conservantes.
Las composiciones pueden contener de un 0,001 a
un 99% (p/v o, preferiblemente p/p) del material activo. El Péptido
T que puede obtenerse en Carlbiotech A/S normalmente se formula y se
envasa de una forma estéril en una solución de dextrosa al 5% en
viales multidosis. Se apreciará que el péptido puede envasarse en
otros vehículos, tales como solución salina. Preferiblemente, la
concentración del péptido en cada dosis es del orden de 8,5 mg/ml
para inyección subcutánea en dosis de un ml.
Las composiciones se administran en dosis
terapéutica o profilácticamente eficaces, es decir de 0,05 a 10000
mg de péptido al día, en particular 5-1000 mg al
día. Pueden usarse dosis muy grandes ya que el péptido de acuerdo
con la invención no es tóxico. Sin embargo, normalmente esto no se
requiere. La dosis administrada diariamente depende, por supuesto,
del grado de inflamación y de la respuesta inflamatoria.
Para administración por inyección o infusión de
la composición, la dosificación diaria, empleada para el tratamiento
de adultos de aproximadamente 70 kg de peso corporal, normalmente
variará de 0,2 mg a 20 mg de material activo que puede administrarse
en forma de 1 a 4 dosis cada día, dependiendo tales intervalos de
dosificación de la vía de administración y de la afección del
paciente.
Las composiciones, como se han descrito
anteriormente, pueden prepararse mezclando o uniendo de otra forma
los ingredientes.
Para proporcionar una directriz para la
administración y para adquirir una nueva percepción del uso de los
péptidos en el tratamiento de la MS, se ofrece lo siguiente como
guía basada en el amplio trabajo que ya se ha realizado en el uso
del Péptido T para tratar la infección por VIH.
El Péptido T es un homólogo octapeptídico de una
región de gp120, una glicoproteína de la envuelta del VIH, y del
péptido intestinal vasoactivo humano (VIP). En un principio se
desarrolló por Pert et al (documento
EP-A-0249394), para bloquear la
unión de gp120 (una glicoproteína de la envuelta del VIH) y de esta
forma también para bloquear la unión del VIH a CD4, el receptor
viral específico unido a la membrana, bloqueando por lo tanto la
internalización del virus en la célula - un proceso necesario para
la replicación viral. La molécula de CD4 necesaria para la entrada
del VIH en las células se ha localizado en la superficie de
linfocitos, macrófagos, células microgiales, neuronas y otras
muchas células. Se ha demostrado que la unión del VIH al receptor
CD4 permite la entrada viral; y la unión de la glicoproteína gp120
libre (no asociada al virus) ha producido toxicidad neuronal tanto
en estudios in vitro como en estudios in vivo.
Se ha demostrado la eficacia del Péptido T para
invertir signos de demencia inducida por el VIH tanto en el ensayo
clínico de Fase I del Péptido T de la University of Southern
California en Los Angeles como en el ensayo clínico de Fase II en la
Clínica Fenway en Boston. Los dos estudios han demostrado una mejora
en el deterioro neurocognitivo inducido por VIH en pacientes con
SIDA.
Hasta la fecha, la homología del Péptido
T/gp120/VIP se ha usado para explicar al menos dos mecanismos de
acción posibles del Péptido T. En primer lugar, que se une
competitivamente a CD4 (el receptor conocido para VIH) en
superficies de células humanas y que compite tanto con el VIH como
con la glicoproteína gp120 por los sitios de unión.
La unión del Péptido T y sus análogos de Fórmula
General 1, o más particularmente de Fórmula General 2, a CD4 podría
producir un efecto bloqueante para prevenir la unión de cualquier
otra molécula capaz de unirse a ese receptor; como alternativa o
además, la unión del Péptido T a CD4 podría inducir una reacción
similar a la provocada por el ligando endógeno.
CD4 es el antígeno de diferenciación que define
el supgrupo de linfocitos T de células auxiliares/inductoras, pero
también está presente en una amplia diversidad de células que
incluyen neuronas, macrófagos activados y células B. CD4 es el
receptor predominante para VIH y en un principio se creía que era
necesario para la infección celular. Usando el anticuerpo monoclonal
OKT4, Pert et al (Proc. Natl. Sci. Estados Unidos,
83, 9254-9258 (1986); Pert et al
(Clin. Neuropharmacol. 9(4) S19B (1986)) demostraron
la presencia de este antígeno a lo largo del SNC humano y
demostraron que está presente en la concentración más alta en la
circunvolución dentada, el hipocampo, la amígdala y la corteza
profunda. Se descubrió que esta distribución era similar a la
encontrada en otros mamíferos superiores. Se descubrió que el
Péptido T y análogos similares inhibían la unión de gp120
radiomarcada a membranas de hipocampo de rata y lo hacían en
concentraciones 0,1 nM.
Usando el Péptido T y los mismos análogos, Pert
et al. (Proc. Natl. Sci. Estados Unidos, 83,
9254-9258 (1986); Pert et al (Clin.
Neuropharmacol. 9(4) S19B (1986)) pudieron demostrar una
reducción de los niveles detectables de la transcriptasa inversa
del VIH cuando estos péptidos estaban presentes en un ensayo de
infectividad por VIH. A concentraciones 100 nM del Péptido T tuvo
lugar una reducción de nueve veces de la transcriptasa inversa.
Como la glicoproteína gp120 no es idéntica en
todas las cepas aisladas del VIH, se realizó una comparación con
nueve aislados diferentes de VIH, Pert et al (Clin.
Neuropharmacol. 9(4) S19B (1986)). Se descubrió una
homología significativa entre los aislados examinados y el Péptido T
cuando se compararon con el pentapéptido central, (Ruff et
al, FEBS Lett. 211 17-22 (1987);
Brenneman el al, Nature, 335
639-642 (1988); Brenneman et al, Drug
Dev. Res. 15 361-369 (1988); Komisaruk
et al, Annals of the NY Acad. Sci. 527
650-654 (1988); Buzy et al, The Lancet 22 de
julio, 226-227 (1989)). Ahora esta comparación se ha
ampliado a veinte aislados.
La inhibición de la unión de gp120 y VIH a VD4,
así como la demostración de la reducción de la infectividad de VIH
en presencia del Péptido T y sus análogos, proporciona un posible
mecanismo de acción para explicar los efectos clínicos del Péptido
T. A este respecto, el Péptido T en una concentración suficiente
puede evitar una nueva infección celular con VIH. La investigación
inicial en esta área se centró en el SNC por dos razones: se
descubrió una alta concentración de moléculas CD4 en neuronas y uno
de los principales efectos de la infección por VIH es el desarrollo
de disfunción neurocognitiva. Estos hechos son particularmente
importantes dado que el Péptido T se transporta desde la sangre
hasta el cerebro mediante un sistema de transporte saturable activo,
mientras que su salida es sólo por difusión (Barrera el tal,
Brain Res. Bull. 19 629-633
(1987)).
Aunque se acepta que el VIH puede infectar no
sólo a los linfocitos sino también a las neuronas, es difícil
atribuir la disfunción neurológica observada en pacientes con VIH a
una infección activa por VIH en el SCN, ya que sólo están infectadas
activamente un pequeño número de neuronas. Se ha sugerido que los
déficits neurológicos observados en la infección por VIH pueden
producirse no sólo como resultado de una infección, sino también
como resultado de una "toxina" viral, tal como gp120. Brenneman
et al, Nature 335 639-642
(1988)) descubrieron que la gp120 purificada a partir de dos
aislados así como la gp120 recombinante produjeron una muerte
significativa de células neuronales en cultivos de neuronas de
hipocampo fetal de ratón. La neurotoxicidad pudo reducirse mediante
un pretratamiento con anticuerpo contra CD4 y se eliminó
completamente por VIP. Como las neuronas de ratón no pueden
infectarse por VIH, es evidente que la neurotoxicidad es inducida
por gp120 y no se produce como resultado de una entrada o
replicación viral.
VIP (66,67,68,69: TDNYT) y el péptido central
(61-65: TTNYT) comparten la secuencia homóloga que
se une a CD4 y que también se encuentra en aislados de la gp120
mucho más grande. El Péptido T, cuando se usó en el mismo sistema de
cultivo neuronal de hipocampo de ratón, antagonizó completamente la
neurotoxicidad inducida por gp120, Brenneman et al, Grug
Dev. Res. 15 361-369 (1988)). Además, el
CSF de un paciente con demencia inducida por SIDA produjo una
neurotoxicidad sustancial en este sistema (destruyendo el
44-49% a una dilución 1:100.000). Este efecto se
inhibió mediante el Péptido T, Buzy et al, The
Lancet, 22 de julio, páginas 226-227, (1989)).
Normalmente, la gp120 se produce en un gran exceso de las cantidades
requeridas parar la replicación viral; este exceso de gp120 puede
ejercer un efecto neurotóxico que no guarda ninguna proporción con
el número de células microgliales o neuronas infectadas activamente
por el VIH.
El Péptido T puede actuar como agonista además de
o incluso en ausencia de sus efectos neuroprotectores contra la
infección viral y la neurotoxicidad. Se ha demostrado actividad
agonista directa de dos formas. Ruff et al, (FEBS
Lett. 211 17-22 (1987)) demostraron que
el Péptido T y dos análogos eran potentes agonistas de la
quimiotaxis de monocitos humanos. Su grado de potencia como agentes
quimiotácticos correspondía a su capacidad relativa para inhibir
tanto la unión de gp120 como la infectividad de las células T por
VIH.
Como demostración adicional de la actividad
agonista del Péptido T, tanto el Péptido T como VIP ejercen sus
efectos celulares mediante la regulación de la proteína quinasa C:
Zorn et al, The Endoc. Society. Abstract (1989)). De
esta forma, la actividad agonista del Péptido T está implicada
mediante la producción de una señal transmembrana que puede influir
sobre la regulación de la proteína quinasa C. También se ha
demostrado en seis experimientos individuales, como parte de la
presente invención, que el Péptido T puede regular negativamente la
enzima p56^{lck}, una tirosina quinasa asociada a la parte
citoplásmica de la molécula CD4 unida a membrana, implicando de esta
forma que la unión del Péptido T a la molécula CD4 puede producir
una señal transmembrana.
Se proporcionan pruebas adicionales de la
actividad agonista de tipo VIP potencial del Péptido T por los
resultados de ensayos experimentales de la hipótesis de Komisaruk
et al, Annals of the NY Acad. Sci. 527
650-654 (1988)) de que el VIP liberado de terminales
nerviosas pélvicas en la médula espinal puede producir analgesia.
Sabiendo que se ha demostrado la analgesia independiente de
naloxona producida por la administración de VIP a la materia gris
periacueductal en ratas, los investigadores administraron
directamente VIP a la médula espinal de rata y midieron el umbral de
dolor producido por estímulos nocivos distales para ensayar la
hipótesis. La administración en la médula espinal de VIP produjo
analgesia, que se midió mediante la respuesta de latencia del
movimiento rápido de la cola y el ensayo de vocalización inducida
por un shock en la cola por medio de la acción sobre rutas de dolor
moduladas tanto con opiáceos como con agentes no opiáceos,
Komisaruk et al, Annals of the NY Acid. Sci.
527 650-654
(1988)).
(1988)).
En todos los estudios realizados hasta la fecha
se ha sugerido la existencia de efectos clínicos beneficiosos por
la administración del Péptido T a seres humanos: en la enfermedad
producida por VIH, del estudio piloto sueco, los estudios de fase I
de USC y de Fenway/CRI, y el programa Toronto Western Hospital
Compassionate Use Program que implica 51 pacientes; en psoriasis y
otras enfermedades médicas, en informes de casos de Suecia
(Marcusson, Lazega et al, 1989-9, y
Marcusson y Wetterberg, 189-10) y en 8 pacientes con
psoriasis u otras afecciones médicas en Toronto.
La mejora neurocognitiva encontrada en pacientes
positivos al VIH y la mejora de los síntomas constitucionales tanto
en pacientes positivos al VIH como negativos al VIH pueden depender
principalmente de los efectos agonistas y neurotrópicos de tipo VIP
del Péptido T, así como de los efectos antiinflamatorios y
anti-TNF analizados más adelante.
Sin el deseo de limitarse por ninguna teoría
particular con respecto al uso de estos péptidos con el tratamiento
de la MS, y en vista de las directrices y análisis anteriores con
relación al uso de diversos péptidos de Fórmula General 2 y sus
análogos en el tratamiento de la enfermedad producida por VIH, se
plantea la hipótesis de que existen numerosas semejanzas en la
expresión de las dos enfermedades y semejanzas potenciales en la
etiología de las dos enfermedades. El Péptido T parece actuar como
agonista y como bloqueante de la función inmune mediada por CD4 en
lugar de cómo fármaco antiviral. En investigaciones asociadas con la
presente invención, todos los pacientes con enfermedad no
relacionada con VIH tal como esclerosis múltiple se han tratado con
el Péptido T.
Ahora que se ha demostrado la eficacia de los
péptidos de Fórmula General 1, y particularmente los de Fórmula
General 2, a continuación se sugiere una hipótesis de por qué
funcionan los compuestos:
1) La MS es una enfermedad crónica
desmielinizante e inflamatoria del SNC como lo es la enfermedad por
VIH.
2) La MS tiene una posible etiología viral; se ha
sugerido que la MS es una manifestación de la infección por
HTLV-1.
3) La MS comparte varios síntomas comunes con la
mielopatía asociada a HTLV-1, por ejemplo, fatiga,
falta de equilibrio y signos de fenómenos autoinmunes. Un punto en
común entre estas enfermedades puede ser la neuropatía periférica,
que se basa en el proceso de desmielinización.
4) La base parece ser el denominador común tanto
de la desmielinización, ya sea en el sistema nervioso periférico o
en el central, como las manifestaciones autoinmunes comunes en la
MS y en la enfermedad producida por VIH.
5) La desmielinización está asociada con
inflamación de cualquier etiología y parece estar mediada, al menos
en parte, por el TNF.
Sin el deseo de limitarse por ninguna teoría
particular con respecto al uso de péptidos con el tratamiento de
síntomas y enfermedades asociadas con la MS, y en vista de las
directrices y análisis anteriores con relación al uso de diversos
péptidos de Fórmula General 2 y sus análogos en el tratamiento de la
enfermedad producida por VIH, se sugiere la hipótesis de que hay un
efecto inmunomodulador de la unión del Péptido T a CD4. Tal efecto
se demuestra en los ejemplos que se muestran más adelante donde se
ha descubierto que el Péptido T inhibe la proliferación inducida
por mitógenos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
en concentraciones picomolares o inferiores. Se ha descubierto que
el Péptido T permitió que las PBMC proliferaran en respuesta a los
mitógenos, pero a un nivel reducido en comparación con el
crecimiento de PBMC en su ausencia. La preincubación de las PBMC
con el Péptido T durante menos de 30 minutos no tuvo ningún efecto
sobre la estimulación por mitógenos. Sin embargo, la exposición de
PBMC al Péptido T durante 2 horas seguido del lavado de las células
antes de la exposición al mitógeno produjo una inhibición de la
proliferación similar a la observada cuando las células se incuban
en presencia tanto del Péptido T como del mitógeno. También se
descubrió que el Péptido T no afectaba significativamente el
crecimiento de las PBMC cultivadas en ausencia de mitógeno. Por lo
tanto, se cree que el Péptido T puede reprimir la respuesta
proliferativa normal de las PBMC a signos de proliferación no
asociados a CD4.
Ahora que se ha descubierto la eficacia de los
péptidos de Fórmula General 1, y particularmente los de Fórmula
General 2, a la hora de tratar los síntomas y enfermedades
asociadas con la MS, a continuación se sugiere una hipótesis del
mecanismo de acción del Péptido T y, por lo tanto, de por qué son
eficaces los compuestos útiles en la invención.
El Péptido T se une a CD4. En los siguientes
ensayos se ha establecido que el Péptido T inhibe la proliferación
de linfocitos inducida por MLR y por mitógenos. Por lo tanto, se
cree que el Péptido T puede servir como fármaco inmunomodulador que
podría regular negativamente el aumento de la respuesta inmune que
tiene lugar en presencia crónica del antígeno o por otras razones
mencionadas y, por lo tanto, reducir la inflamación crónica.
Subyacente a todas estas utilidades corre el tema
común de la inflamación.
De acuerdo con diversas realizaciones de esta
invención y en vista de las directrices anteriores conseguidas con
el uso de péptidos de Fórmula General 1, y particularmente los de
Fórmula General 2, en el tratamiento de VIH, pueden administrarse
dosis similares del Péptido T y sus análogos a seres humanos o a
otros animales para tratar la MS.
A continuación, la invención se ilustrará
mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Los ejemplos se
refieren a los dibujos adjuntos, donde:
La Figura 1 se menciona en el Ejemplo 6 y muestra
el efecto del Péptido T sobre la expresión del factor tisular
inducido por TNF en células endoteliales de vena umbilical
humana.
Las Figuras 2a, 2b y 2c se refieren al Ejemplo 17
y demuestran que el Péptido T podía inhibir la
linfo-proliferación en respuesta a los mitógenos. Se
cultivaron 10^{5} PBMC en presencia de PWM (2a), Con A (2b) o PHA
(2c) con las diluciones del Péptido T indicadas a continuación: A:
sin Péptido T; B: 10^{-5}M; C: 10^{-7}M, D: 10^{-9}M; E:
10^{-11}M; F: 10^{-13}M; G: 10^{-15}M; H: 10^{-17}M. Los
cultivos se incubaron durante 5 días, se sometieron a pulsos de
^{3}H-timidina y la cantidad de radiactividad
incorporada se convirtió en el índice de proliferación como se
describe en el Ejemplo 17. Un asterisco (*) indica la diferencia de
proliferación; \pm es estadísticamente insignificante
(p>0,05).
La Figura 3 se refiere al Ejemplo 17 y demuestra
que la proliferación de linfocitos inducida por Con A en presencia
del Péptido T paraleliza, pero a una velocidad reducida, el
crecimiento en ausencia de Con A. 10^{5}PBMC se cultivaron en
presencia de Con A durante 8 días. Los cultivos se sometieron a
pulsos y se recogieron diariamente y el grado de linfoproliferación
se expresó como cuentas por minuto (CPM) de
^{3}H-timidina incorporada. El Péptido T (PT,
10^{-9}M) se añadió simultáneamente con A.
La Figura 4 se refiere al Ejemplo 18. En
presencia de estímulos sin mitógenos tales como antígenos de
recordatorio (vacuna del sarampión, paperas, rubéola: MMR),
superantígenos tales como enterotoxinas de estafilococos SEB y
TSST-1, y anticuerpos contra CD3
(anti-CD3), las PBMC proliferarán como se indica
mediante un índice de proliferación superior a 1 (- Péptido T). La
presencia del Péptido T (+ Péptido T) añadido el primer día de este
cultivo de seis días no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de
PBMC en respuesta a estos estímulos.
La Figura 5 también se refiere al Ejemplo 18.
Cuando se cultivan PBMC de una persona (A) se cultivan en presencia
de PBMC de otra persona (B), éstas proliferarán
[(A+B(P-PT)] como resultado del
reconocimiento de antígenos extraños (aloantígenos) en la
superficie celular. En presencia del Péptido T [A+B](+PT)], aún
podrán proliferar las células capaces de presentar una
alorrespuesta.
La Figura 6 también se refiere al Ejemplo 18.
Molt-4 es una línea de células T maligna humana que
crece espontáneamente. En presencia de PBMC, el crecimiento se
inhibe debido a la destrucción de Molt-4 por PBMC
(PBMC/Molt-4-PT). En presencia del
Péptido T añadido el primer día de un cultivo de cuatro días, la
destrucción mediada por PBMC de Molt-4 sigue sin
cambiar (PBMC/Molt-4+PT).
La Figura 7 se refiere al Ejemplo 19, donde se
proporciona la secuencia de etapas implicadas en este ensayo de
citotoxicidad. Los macrófagos activados pueden destruir células
diana K562 en ausencia del Péptido T (no PT). Si el Péptido T se
añade a cultivos de macrófagos junto con los activadores (PT etapa
1), no puede afectar a la citotoxicidad. Si el Péptido T se añade a
cultivos de macrófagos activados junto con las células diana (PT
etapa 2), se inhibe la citotoxicidad. La alteración del ritmo de
adición del Péptido T no altera la inhibición mediada por el
Péptido T de la citotoxicidad mediada por macrófagos.
La Figura 8, que también se refiere al Ejemplo
19, demuestra que el sobrenadante de cultivos de macrófagos
estimulados con LPS contiene sustancias citolíticas capaces de
destruir células K562 diana. Las células diana se marcan con
radiactividad intracelular que se libera tras la muerte celular. Una
mayor liberación de radiomarcador (medida como cuentas por minuto,
cpm) indica una mayor destrucción. En ausencia del Péptido T (A) se
produce más destrucción que en su presencia (B-F).
Como la concentración del Péptido T se redujo por debajo de
1x10^{-15}M, el grado de citotoxicidad por actividad citolítica
volvió a los niveles de control (A). Las concentraciones del
Péptido T fueron las siguientes:
- A:
- sin Péptido T
- B:
- Péptido T, 10^{-5}M
- C:
- Péptido T, 10^{-7}M
- D:
- Péptido T, 10^{-9}M
- E:
- Péptido T, 10^{-11}M
- F:
- Péptido T, 10^{-13}M
- G:
- Péptido T, 10^{-15}M
La Figura 9 se menciona en el Ejemplo 20 y
demuestra que el Péptido T tiene un efecto similar a
anti-TNF en la inhibición de los efectos del
TNF.
La Figura 10 se menciona en el Ejemplo 24 y
demuestra que el Péptido T inhibe la activación de neutrófilos
humanos por el TNF.
La Figura 11 también se menciona en el Ejemplo 24
y demuestra que el análogo 505 del Péptido T inhibe el cebado y
activación de neutrófilos humanos por el TNF.
La Figura 12 se vuelve a mencionar en el Ejemplo
24 y demuestra que el análogo 505 del Péptido T inhibe la
activación de neutrófilos humanos por LPS.
La Figura 18 se menciona en el Ejemplo 26 y
demuestra que el Péptido T reduce la expresión inducida por TNF del
factor tisular en HUVEC.
Los Ejemplos 1 a 4 demuestran los efectos
significativos que los péptidos útiles en la invención tienen
clínicamente sobre la MS. El péptido usando en cada uno de los
Ejemplos 1 a 4 es un Péptido T variante de Fórmula General 2 que
tiene la secuencia
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Amida.
A una mujer de 40 años se le diagnosticó que
tenía MS después de presentar debilidad, pérdida de equilibrio,
visión doble y parestesia en el brazo derecho a los 23 años. Se
trató con prednisona y después con fisioterapia, con poco efecto.
Tras la manifestación, no podía caminar sin un bastón o un andador,
presentaba depresión, nistagmo horizontal y debilidad de los
flexores de la cadera de forma bilateral, debilidad de los flexores
de la rodilla y de los dorsiflexores de los pies. Aumentó el tono
de las dos extremidades inferiores y tenía clonus de tobillo
bilateral. Los reflejos profundos de tendón fueron 2+ en los
brazos, 3+ tanto en las rodillas como en los tobillos y las
respuestas plantares fueron extensoras. Se trató con LIORESAL™
(Baclofeno) mostrando alguna mejora; sin embargo, experimentó un
empeoramiento progresivo hasta que tuvo que depender de una silla
de ruedas y se quejaba de debilidad, espasticidad, clonus,
incontinencia urinaria e infecciones recurrentes del tracto
urinario. Cuando se evaluó su MRI, la exploración cerebral mostró
resultados coherentes con la esclerosis múltiple.
La paciente empezó el tratamiento con el Péptido
T, 8,5 mg diarios por vía subcutánea. Notificó que la mayoría de sus
síntomas, incluyendo la espasticidad, coordinación motora fina,
nocturia y frecuencia urinaria, concentración, memoria y labilidad
emocional, habían mejorado mucho. Fue evaluada después de cinco
semanas de tratamiento y notificó y demostró una mejoría funcional.
Después de seis meses, la paciente mostró una mejoría sostenida en
estos síntomas. Su frecuencia de nocturia se redujo, mejoró su
control motor fino, disminuyó el tartamudeo, sus piernas eran menos
espásticas y podía permanecer de pie con poco apoyo. La paciente
mostró una marcada mejoría sintomática en el funcionamiento
intelectual y motor en unas pocas semanas después de comenzar el
tratamiento con el Péptido T, siendo tal mejoría sostenida durante
un período de 6 meses. El empeoramiento de los síntomas se produjo
cuando la paciente interrumpió el tratamiento con el Péptido T
durante 3 semanas, pero mejoró cuando volvió a tomar el fármaco. La
paciente permaneció estable en lugar de empeorar progresivamente
durante los meses en los que tomó el Péptido T.
A una mujer de 28 años se le diagnosticó neuritis
óptica secundaria a una esclerosis múltiple después de presentar
entumecimiento, trastorno de la función motora y visión borrosa
(20/300 bilateralmente). Su examen neurológico somático estaba
dentro de los límites normales. Durante 6 meses se produjeron
episodios minoritarios de entumecimiento y trastorno del habla, del
equilibrio y de la coordinación, así como dolores de cabeza y
pérdida de visión.
Se inició la terapia con el Péptido T. Seis días
después, una nueva evaluación mostró una agudeza visual
notablemente mejorada (21/30 bilateralmente). Durante la siguiente
semana, la paciente notó una mejora funcional. La recuperación de un
episodio anterior de neuritis óptica llevó seis meses (compatible
con la historia natural de la MS), a diferencia de lo que ocurrió
con este episodio cuya recuperación fue mucho más rápida de lo que
sería de esperar para un episodio de neuritis óptica inducida por
MS.
Una mujer de 34 años tuvo su primer episodio de
esclerosis múltiple que se manifestó por neuritis óptica y ceguera
completa en el ojo derecho durante 2 semanas, entumecimiento de la
pierna derecha y después de las dos piernas. Sus síntomas
empeoraron, se le suministró prednisona y experimentó alguna
mejoría. La paciente tuvo un empeoramiento de sus ataxias con visión
borrosa y oscilopsia y se le suministró 80 mg de prednisona al día.
Una exploración por MRI mostró múltiples signos de alta intensidad
periventricularmente así como en el tronco encefálico, coherente con
la diagnosis de MS. La ataxia y algunos problemas visuales parecían
mejorar con esteroides. Otra exploración por MRI aproximadamente 16
meses después mostró una enfermedad de la materia blanca
periventricular extendida con implicación del cuerpo calloso. Los
hallazgos fueron típicos de una desmielinización coherente con la
MS. En este momento, la paciente mostró nistagmo pulsátil lateral
oscilatorio en reposo y nistagmo lateral con mirada bilateral,
marcha atáxica, un ligero deterioro en el ensayo de
talón-espinilla pero un buen ensayo de
dedo-nariz. El tono aumentó en sus extremidades
inferiores y tuvo clonus de tobillo no sostenido bilateralmente. Su
reflejo de la rodilla aumentó en la pierna derecha en comparación
con la izquierda. Las respuestas plantares aumentaron. En
comparación con las manos, en los pies disminuyó su sensación de
posición, vibración, tacto suave y frío.
Aproximadamente 2 más tarde, la paciente comenzó
el tratamiento con 8,5 mg al día del Péptido T por vía subcutánea.
En un plazo de 1 a 2 semanas, presentó una mejoría subjetiva. La
paciente experimentó una mejoría de las sensaciones en sus dedos,
movimientos finos de sus manos y una mejoría de la función
cognitiva. Cuando interrumpió la terapia con el Péptido T, la
paciente detectó un aumento de la fatiga y de la ataxia. Obtuvo una
mejoría sintomática mínima con 150 mg diarios de prednisona.
Después de empezar de nuevo la terapia con el Péptido T, la
paciente notó una notable mejoría de su fatiga, ataxia y función
motora fina.
Se trató con dilantina e ingresó en el hospital
una mujer de 56 años con una historia de mareos, ataxia, episodios
de vértigo, deterioro de la función motora y debilidad generalizada
de las piernas. El examen posterior mostró nistagmo vertical,
persecución visual suave y sacádica y deterioro de la marcha en
tándem. Se volvió a evaluar aproximadamente 2 años más tarde con
respecto a los episodios de mareos y las quejas de espasmos en las
piernas. Su examen físico mostró una disminución de los campos
visuales con hemianopsia lateral izquierda parcial en el campo
visual lateral y un campo visual derecho restringido. La paciente
mostró un deterioro de la marcha en tándem, una disminución de la
flexión y fuerza de la cadera derecha y una disminución de los
reflejos profundos de tendón en el braquiorradial derecho en
comparación con el izquierdo y en la rodilla derecha en comparación
con la izquierda. La respuesta plantar disminuyó y, como se ha
indicado anteriormente, presentaba nistagmo vertical de mirada
ascendente.
La paciente comenzó el tratamiento con 8,5 mg
diarios del Péptido T por vía subcutánea y en un período de 10 días
presentó un aumento de la energía y de la función intelectual y una
mejora de la visión. Cuando se interrumpió la terapia con el
Péptido T, la paciente regresó sintomáticamente al estado previo a
la administración del fármaco. Su examen físico en ese momento no
mostró cambios con respecto a su examen antes de que se comenzara
la terapia con el Péptido T.
Los Ejemplos 5 a 7 muestran experimentalmente
ciertos efectos significativos mostrados por péptidos útiles en la
invención.
Se administró LPS (250 \mug, E. coli
K-235, Sigma nº cat. L-2018) a
tiempo cero a ratones balb/c normales (hembra, 12 semanas). Después
se trató a un grupo de ratones (50 animales) a intervalos de 30
minutos mediante inyecciones i.p. de albúmina de suero bovino (BSA)
(Sigma nº cat. 6793) disuelta en agua isotónica, estéril, sin
pirógenos (2,5 mg de BSA por animal por inyección, conteniendo cada
inyección 100 \mul).
El segundo grupo de ratones (50 animales) se
trató a intervalos de 30 minutos mediante inyecciones i.p. del
Péptido T (Carlbiotech A/S, lote 109401) disuelto en agua isotónica,
estéril, sin pirógenos (2,5 mg de Péptido T por animal por
inyección, conteniendo cada inyección 100 \mul).
Se determinaron los niveles de glucosa en
muestras de sangre después de 3 horas. En la escala de (-) a (+++)
se indican parámetros subjetivos tales como secreción del ojo,
diarrea y bienestar general.
Como puede observarse en la Tabla I, la
diferencia en los niveles de glucosa entre animales tratados con el
Péptido T y animales tratados con BSA (placebo) es muy
significativa. Los parámetros subjetivos también indican firmemente
un índice general superior de bienestar general para los animales
tratados con el Péptido T.
La estimulación de células endoteliales con TNF
da lugar a la inducción de la actividad procoagulante mediante la
expresión de la actividad del factor tisular y una reducción
concomitante del potencial anticoagulante de las células mediante la
expresión reducida de trombomodulina (Bevilacqua et al,
Nawroth y Stern, J. Exp. Med. 163 740 (1986)). El choque
séptico normalmente va acompañado de coagulación intravascular
diseminada (DIC, Semeraro Acta Clinica Belgica 31 377 (1976))
y hay pruebas considerables de que el factor tisular es un
requisito esencial para que la DIC se induzca por una endotoxina
(LPS). Se ha demostrado que un anticuerpo monoclonal contra el
factor tisular inhibe la DIC inducida por la administración de
endotoxina (Warr et al, Blood, 75, 1481
(1990)).
Se cultivaron células endoteliales de vena
umbilical humana en un medio M199 suplementado con suero de ternero
fetal al 10%, factor de crecimiento de células endoteliales,
penicilina, estreptomicina y L-glutamina en placas
de 96 pocillos usando una modificación del procedimiento de
Bevilaqua et al, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 83, 4533 (1986)). Se realizó un tratamiento con TNF
de los cultivos (100 unidades.ml) durante 4 horas a 37ºC en
presencia de medio de crecimiento, después de lo cual las células se
lavaron y se fijaron. Los cultivos también se trataron con Péptido
T + TNF o Péptido T solo. En estos cultivos, el Péptido T estaba a
una concentración que variaba de 0,5 a 100 \mug/ml. La expresión
del factor tisular por las células endoteliales tratadas con TNF
con o sin el Péptido T se determinó en un ensayo ELISA usando un
anticuerpo monoclonal que neutraliza la actividad del factor
tisular humano (Carlbiochem A/S). El anticuerpo
anti-factor tisular unido se detectó usando Ig de
conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa y el
sustrato ABST. La intensidad del color se determinó mediante la
densidad óptica de cada pocillo a 405 nm.
Los datos obtenidos de cultivos triplicados
demuestran que el Péptido T inhibía la expresión del factor tisular
en células endoteliales estimuladas por 100 unidades/ml de TNF
recombinante humano y se ilustran en la Figura 1.
A ratones portadores de tumores ascíticos Meth A
se les suministraron 100 \mug de LPS por vía subcutánea con
albúmina de suero bovino (BSA) o análogo del Péptido T (504 o 505,
1 mg). Se registró el número de animales con signos de toxicidad de
LPS (diarrea, exudación de los ojos y nivel general de actividad)
en cada grupo a las 19, 24 y 41 horas después de la inyección.
Cuando finalizó el experimento, se registró el número de animales
supervivientes (véase la Tabla II mostrada más adelante) y se
extrajo sangre de los supervivientes para la posterior
determinación de los niveles de TNF, IL-1,
IL-6 y RNI.
La secuencia del análogo más eficaz (505) es:
H-D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH_{2}
y la secuencia del 504
es:
H-D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH_{2}
Se cultivaron PBMC (10^{5}) en 200 \mul de
RPMI que contenía suero bovino fetal inactivado térmicamente al
10%, L-glutamina 2 mM y 100 \mug/ml de gentamicina
con mitógeno y se añadió el Péptido T el primer día del cultivo. El
crecimiento se evaluó por triplicado mediante la captación de
^{3}H timidina después de un período de incubación de 6 días y se
expresó como índice de proliferación (cpm en presencia de mitógeno
\pm Péptido T \div cpm en ausencia de estimulación). Un índice
de proliferación > 1,00 implica un crecimiento superior al
observado en el medio solo. A concentraciones fisiológicamente
obtenibles, el Péptido T inhibe la proliferación de células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) normales (de pacientes
VIH-seronegativos) sin provocar una citotoxicidad
significativa como se muestra en la Tabla III. Este efecto es a
largo plazo, ya que el Péptido T suministrado el primer día de un
cultivo de seis días inhibirá la proliferación inducida por
mitógeno.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
1. \+ SD - desviación típica\cr 2. \+ Concentración del Péptido T
en mol/l\cr 3. \+ Crecimiento en ausencia de mitógenos\cr 4.
\+ \begin{minipage}[t]{145mm} El mitógeno de fitolaca (PWM), la
Concanavalina A (Con A) y la fitohemaglutinina (PHA) se usaron a 25
\mu g/ml \end{minipage} \cr 5. \+ ND - no
determinado\cr}
Se realizó una MLR de dos vías usando 10^{5}
PBMC alogénicas (cpm de A = 142 \pm 86, B = 148 \pm 84)
cocultivadas en 200 \mul de medio como se ha descrito en la Tabla
III.
El Péptido T administrado el primer día de una
MLR inhibirá la proliferación inducida alogénica de PBMC (Tabla
IV).
\hskip3.5cm1. Concentración del Péptido T en mol/l
\hskip3.5cm2. Cuentas por minuto \pm desviación típica
Se prepararon blastos de PBL (leucocitos de
sangre periférica) incubando PBMC a 37ºC con PHA (10 \mug/ml) en
RMPI + FBS al 10% durante 48 horas seguido de la adición de
interleuquina- y de incubación durante las siguientes 96 horas. Las
células se liberaron de la IL-2 por lavado y se
incubaron durante 24 horas, después se liberaron de FBS y se
incubaron durante 24 horas. Los blastos de PBL permanecieron
estimulados o se trataron con OKT4A (anti-CD4) en 10
\mug/ml durante 1 hora seguido de Ig de rata
anti-ratón a 5 \mug/ml durante 5 minutos para
mejorar la actividad lck. Los blastos de PBL se pretrataron con el
Péptido T (10^{-9}M) durante 2 horas, después se lavaron
abundantemente antes de la estimulación anti-CD4.
Después de la imunoprecipitación con conjugados de
anti-lck-Proteína A y de la
incubación (37ºC, 10 minutos) con ^{32}P-ATP, se
determinó la autofosforilación de p56^{lck} por autorradiografía y
se usó como medida de la actividad de p56^{lck}.
El Péptido T inhibirá la activación inducida por
PHA y la mejora dependiente de anti-CD4 de la
actividad de p56^{lck} como se ha determinado (Tabla V) mediante
un ensayo de tirosina quinasa específica de lck. p56^{lck} es una
tirosina quinasa asociada con CD4 implicada en la activación de
células T y en la señalización transmembrana (Janeway C.A. Ann.
Rev. Immunol 10 645-674 (1992)). En
lugar de una señal asociada al receptor de células T, la formación
de enlaces cruzados de CD4 por anticuerpos monoclonales
anti-CD4 inhibe la activación de células T (Bruges
et al, Eur. J. Immunol. 21
1663-1668 (19991)), posiblemente por medio de la
activación de p56^{lck} que incluye la autofosforilación de la
Tyr 505 inhibidora (Abraham et al, Nature 350
62-66 (1991); Abraham et al, Cancer
Invest. 9 455-463 (1991)). El Péptido T
puede inhibir la activación de p56^{lck} (Tabla V) consiguiendo
de esta forma el mismo resultado que anti-CD4
(inhibición de la activación de células T) aunque mediante un
mecanismo diferente.
\hskip2cm1 - P. T. significa Péptido T
\hskip2cm2 - ++++ muy activo
\hskip3cm+ levemente activo
Se sabe que los anticuerpos
anti-CD4 inhibirán la proliferación in vitro
inducida por mitógeno así como la inducida por antígenos de PBMC, la
liberación de linfoquinas, la función auxiliar de células T y MLR
(Bank et al, J. Exp. Med. 162
1294-1303 (1985)). Hay dos posibles mecanismos de
inhibición anti-CD4 de la función de células T.
- 1)
- Los anticuerpos anti-CD4 producen impedimento estérico de la interacción CD4/MHC II que tiene lugar durante la activación de células T. Probablemente, el Péptido T no compartiría este efecto, ya que deriva de una secuencia de gp120 que se sabe que se une a CD4 y el sitio de unión de gp120 en la molécula de CD4 está lejos del sitio de unión del MHC II (Fluery et al (1991)).
- 2)
- La formación de enlaces cruzados de CD4 por anticuerpos anti-CD4 monovalentes, en lugar de la estimulación de TcR/CD3 envía una señal negativa a las células T (Bank et al, J. Exp. Med. 162 1294-1303 (1985)). El Péptido T es monovalente, por lo que no puede formar enlaces cruzados con receptores CD4; por lo tanto, su mecanismo de inhibición de la activación de células T debe ser distinto del anticuerpo anti-CD4. El tratamiento de afecciones inflamatorias con anti-CD4 de ratón ha dado lugar a varios efectos secundarios indeseables incluyendo urticaria, escalofríos, fiebre y temblores que ocasionalmente requieren intervención médica. Además, tras la administración del anticuerpo anti-CD4 se ha notificado una reducción del número de células CD4, una reducción de la proliferación frente a mitógenos y antígenos y una reducción de las reacciones de hipersensibilidad retrasadas, una medida de la función inmune mediada por células (Horneff et al, Cytokine 3 266-267 (1991); Horneff et al, Arth. Rheum. 34 129-140 (1991); Wofsey et al, Semin. Immuno. 2 419-425 (1990)). La administración de anti-CD4 junto con antígeno puede inhibir respuestas inmunes tanto primarias como secundarias (Waldor N.K. Immunol. Ser. 45 573-586 (1990)). Además, el uso de proteínas xenogénicas (no humanas) como agentes terapéuticos está limitado debido a la formación potencial de anticuerpos dirigidos contra la proteína extraña que pueden mediar reacciones de choque y de hipersensibilidad de tipo III tras una administración repetida.
Se incubaron PBMC como se ha descrito en relación
con la Tabla III en el Ejemplo 9 en presencia de la vacuna viva
atenuada del sarampión, las paperas y la rubéola (Merck Sharp y
Dohme, Canadá) hasta una dilución final de 1:20. El Péptido T se
añadió el día 1 de la incubación o en una base diaria. Los
resultados se expresan como índice de proliferación \pm desviación
típica.
Aunque el Péptido T puede inhibir la
proliferación inducida por antígeno de PBMC cuando se administra
in vitro en una base diaria, no se cree que esto vaya a
tener algún efecto significativo sobre la respuesta inmune normal
cuando se administre in vivo (como se demuestra por Goodwin
et al V. International Conf. Aids, Montreal, julio de
1989, Resumen Nº WBP286). Hay dos posibles explicaciones para esto
que no son mutuamente excluyentes.
- 1.
- Los macrófagos pueden ser más sensibles al Péptido T de lo que lo son las células T, ya que las células T reciben muchas señales de activación más potentes que la interacción de CD4/MHC II. De esta forma, los macrófagos pueden regularse negativamente mediante la administración del Péptido T el primer día del cultivo in vitro inhibiendo su capacidad para presentar mitógenos y antígenos a las células T. Las células B pueden actuar como APC en lugar de macrófagos cuando presentan antígenos, pero no cuando presentan mitógenos que son no específicos de antígeno (lo que explica los resultados de la Tabla III). Las células B restantes son resistentes al Péptido T, ya que son CD4 negativas. En presencia de una sola dosis de Péptido T, podrían presentar antígenos a las células T permitiendo la proliferación de PBMC en respuesta al antígeno. Cuando el Péptido T se suministra en una base diaria en células T cultivadas, que pueden ser menos sensibles a los efectos del Péptido T, los macrófagos se pueden inhibir. Esto explicaría los resultados mostrados en la Tabla 4. La administración diaria del Péptido T in vivo puede no funcionar como lo hace en una base diaria in vitro, ya que la vida media del Péptido T in vivo es más corta que in vitro. Los suplementos en suero in vitro se inactivan térmicamente para destruir las enzimas proteolíticas que degradan activamente el Péptido T in vivo. De esta forma, la administración diaria del Péptido T in vivo daría lugar a la inhibición de la actividad de macrófagos, pero no la actividad de células T y permitiría la expresión continuada de respuestas inmunes dirigidas a antígenos. Esto explicaría la eficacia del Péptido T en afecciones inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide (véase más adelante), donde la célula inflamatoria característica es el macrófago. La inflamación aguda se caracteriza por la infiltración de neutrófilos (CD4 negativos) y no se vería afectada por la administración del Péptido T. El requisito de la presentación de antígenos (fagocitosis, degradación y presentación) en una respuesta inmune dirigida por antígenos da lugar a un retraso en la señalización de células T. Por lo tanto, el Péptido T presente el primer día del cultivo in vitro no afectará a la señalización de células T en los días posteriores. La estimulación por mitógenos de la proliferación de PBMC (Tabla III) es un acontecimiento inmediato que no requiere el procesamiento de antígenos y puede inhibirse en una base a largo plazo por medio de la administración concurrente del Péptido T. El Péptido T necesita estar presente conjuntamente con una señal de activación para manifestar sus efectos inmunodepresores. Durante la inflamación crónica o la activación inmune, todas las células de respuesta recibirán todo el tiempo señales de proliferación. La administración diaria del Péptido T in vivo inhibirá la activación inmune crónica. Como la vida media del Péptido T es <1 hora (Ruff et al, Prog. Neuro-Psychopharmacol & Biol. Psychiat Vol. 15, págs. 791-801 (1991)), se inhibirán las señales de proliferación activas durante la primera hora después de la administración del Péptido T. Como todas las células que responden a las señales de activación crónica responden todas a la vez, se regularán negativamente durante este período de 1 hora y permanecerán reguladas negativamente en una base a largo plazo. Debido al ritmo específico de la presentación de antígeno y al hecho de que no se presentan al mismo tiempo todos los epítopos del antígeno (por lo tanto, no todas las células T que pueden responder están activas al mismo tiempo), hay 23 horas antes de la siguiente inyección del Péptido T durante las que se preparan las respuestas inmunes específicas de antígeno. Aunque algunas respuestas inmunes específicas de antígeno pueden inhibirse 60 minutos después de la administración del Péptido T, continuarán la mayoría de ellas, que se producen a tiempos discretos.
De esta forma, el Péptido T puede inhibir la
activación inmune crónica y la inflamación mientras permite la
expresión de respuestas inmunes específicas de antígeno.
La concanavalina A (Con A), el mitógeno de
fitolaca (PWM) y la fitohemaglutinina-P
(PHA-P) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, USA). El Péptido T fue sintetizado por Carlbiotech Ltd
(Copenhaguen, Dinamarca) y suministrado como la sal cloruro a 8,5
mg/ml en alcohol bencílico al 0,9% como conservante y se almacenó a
4ºC. El Péptido T se diluyó para obtener las soluciones de trabajo
en medio de cultivo (RPMI). Se prepararon soluciones nuevas
diluidas del Péptido T a partir de la solución madre de Péptido T
para cada experimento. La ^{3}H-timidina (5
Ci/mmol) se obtuvo en Amersham.
Aislamiento de PBMC: se extrajo sangre
entera de voluntarios adultos sanos en heparina y se aislaron
células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante
centrifugación por gradiente de densidad en HISTOPAQUE™ (Sigma
Chemical Co). Las PBMC se retiraron de la interfaz, se lavaron tres
veces en RPMI que contenía gentamicina (100 \mug/ml) y se
resuspendieron a 1 x 10^{6} PBMC/ml en RPMI que contenía suero
bovino fetal al 10% y gentamicina. Se cultivaron 10^{5} PBMC en
presencia de 100 \mul de suspensión de mitógeno en placas de 96
pocillos. La concentración final de mitógeno fue: PWM 25 \mug/ml;
PHA 12,5 \mug/ml y Con A 6,25 \mug/ml. Se añadieron 10 \mul de
solución de trabajo del Péptido T (o RPMI como control negativo) y
se incubaron cultivos celulares durante un total de 5 días en una
atmósfera húmeda, con un 5% de CO_{2}, a 37ºC. Después, los
cultivos se sometieron a pulsos de ^{3}H-timidina
(en RPMI) 18-24 horas antes de la recolección. La
cantidad de ^{3}H-timidina incorporada se
determinó usando un contador de centelleo líquido BECKMAN™ LS8000 y
la proliferación se expresó como cuentas por minuto (cpm) o como un
índice de proliferación (PI).
PI = \frac{cpm
\ de \ (PBMC + mitógeno)}{cpm \ de \ (PBMC +
medio)}
Un PI de 2 indica que las células han crecido
hasta doblar su número en reposo (sin estimulación).
Todos los experimentos se realizaron por
triplicado. Los resultados presentados son característicos de
experimentos replicados.
Producción del Factor de Necrosis Tumoral
\alpha (TNF\alpha): se incubaron 5 x 10^{6} PBMC/ml en
presencia de Con A (6,25 \mug/ml) durante 48 horas en una
atmósfera húmeda, con un 5% de CO_{2}, a 37ºC. Se añadió Péptido
T (10^{-9} M) a t=0 y a las 24 horas. Al final de la incubación,
se añadió SEPHADEX™ G25 (Pharmacia) (10 mg/ml) y se incubó durante
10 minutos para retirar el mitógeno. PBMC y SEPHADEX se
sedimentaron por centrifugación y el sobrenadante se ensayó para
determinar los niveles de TNF\alpha usando un kit de
radioinmunoensayo de TNF\alpha de Amersham. Las muestras se
analizaron por duplicado.
Análisis Estadísticos: los datos se
analizaron mediante un ensayo ANOVA de dos muestras usando límites
de confianza del 95% de manera que un valor de p \leq 0,05 se
consideraba una diferencia significativa.
Cuando se añadió en el primer día de cultivo, el
Péptido T pudo inhibir la linfoproliferación como respuesta a PWM
(Figura 2a), Con A (Figura 2b) y PHA (Figura 2c). El Péptido T pudo
inhibir los cultivos de PBMC estimulados con PHA a una
concentración de 1 x 10^{-13} M. Los cultivos estimulados con Con
A o PWM se inhibieron con una cantidad tan pequeña como 1 x
10^{-15} M de Péptido T. El Péptido T alcanza un pico de
concentración en plasma de 5,5 x 10^{-8} M después de la
administración in vivo; por lo tanto, la inmunomodulación
mediada por el Péptido T sería activa a concentraciones del fármaco
que pueden obtenerse fácilmente en plasma y CSF. El medio de
cultivo, en el que se diluyó el Péptido T, no tuvo ningún efecto
sobre la linfoproliferación. A la concentración de Péptido T más
eficaz usada, la linfoproliferación como respuesta a PHA se inhibió
en un 26%, a PWM en un 38% y a Con A en un 36%.
La inhibición de la linfoproliferación podría ser
un resultado de la citotoxicidad, un retraso en el inicio de la
proliferación, una reducción en la velocidad de crecimiento o
cualquier combinación de los anteriores.
Cuando se midió diariamente la proliferación de
PBMC inducida por Con A, durante el periodo de crecimiento (días
2-4) la proliferación de linfocitos en presencia de
Péptido T se igualó, pero a una velocidad reducida, al crecimiento
en ausencia del fármaco (Figura 3). En ausencia de mitógeno, el
Péptido T tuvo efectos insignificantes sobre PBMC. Por lo tanto, el
Péptido T no fue citotóxico para los linfocitos respondedores ni
retrasó el comienzo de la proliferación. El Péptido T permitió
crecer a las células, aunque a una velocidad reducida.
El Péptido T pudo inhibir la linfoproliferación
inducida por mitógenos cuando se añadió a PBMC después de haber
expuesto las células a mitógenos (Tabla VII). Este efecto estaba
presente incluso cuando el Péptido T se añadió tres días después de
la exposición de PBMC a mitógenos. La inhibición de la
linfoproliferación mediada por el Péptido T fue más pronunciada
cuando se añadió a cultivos que se habían estimulado con Con A.
Además de inhibir la linfoproliferación, la
presencia del Péptido T redujo la cantidad de TNF\alpha secretado
en el sobrenadante (SN) de un cultivo de PBMC de 48 horas
estimulado con Con A (Tabla VIII). Ni el Péptido T ni RPMI
mostraron reactividad en el RIA para TNF\alpha. En ausencia de Con
A, no se detectó TNF\alpha en el sobrenadante del cultivo.
A diferencia de los mitógenos que inducen las
señales de proliferación de linfocitos ligando MO/MAC y células T
mediante restos carbohidrato en diversos receptores de la
superficie celular, la linfoproliferación no estimulada por
mitógenos mediada por antígenos de recordatorio, superantígenos,
anticuerpos contra CD3 (anti-CD3) y moléculas de
MHC alogénicas interactúan únicamente con el complejo receptor del
antígeno de célula T/CD3 (TcR/CD3). En este sentido, los estímulos
no mitogénicos son más específicos que los mitogénicos.
Sólo los linfocitos con TcR complementario a
epítopos antigénicos procesados responderán a los antígenos de
recordatorio. Típicamente, esto representa una pequeña fracción del
grupo total de linfocitos. Las reacciones con MHC alogénicas,
caracterizadas por la reacción de linfocitos mixtos (MLR) está
mediada por el reconocimiento de moléculas del MHC de Clase II
extrañas mediante el TCR de las células respondedoras (Adv.
Immunol. 31 271 (1981)). Aproximadamente el 10% de las
células T son alorreactivas (Lancet 339 824 (1992)). Los
superantígenos tales como las enterotoxinas de estafilococos A y B
(SEA y SEB) y la toxina-1 del síndrome de choque
tóxico (TSST-1) estimulan el crecimiento de
aproximadamente el 20% del grupo de células T (Sci. Am. 266
92 (1992)) por interacción con segmentos V_{\beta} definidos de
TcR (Science 244 811 (1989)). Anti-CD3
puede estimular el crecimiento del 100% de las células T
independientemente de la función de células accesorias ligando
directamente complejos TcR/CD3.
Como los mitógenos representan una forma
artificial, no específica de activación de linfocitos, se evaluó el
efecto del Péptido T sobre la linfoproliferación como respuesta a
los antígenos de recordatorio, anti-CD3,
superantígenos y MLR. Además, se examinaron las funciones efectoras
de células T y el crecimiento de líneas celulares malignas que
proliferan espontáneamente, en presencia del Péptido T.
A menos que se indique otra cosa, las condiciones
experimentales fueron generalmente como las descritas en el Ejemplo
17.
Cuando se añadió en el primer día de un cultivo
de seis días, el Péptido T pudo inhibir la linfoproliferación
inducida por Con A, aunque tuvo efectos insignificantes sobre los
linfocitos que respondían al antígeno de recordatorio (vacuna de
sarampión, paperas, rubéola, MMR), anticuerpos contra CD3 o los
superantígenos SEB y TSST-1 (Figura 4). De manera
similar, el Péptido T no afectó al crecimiento de los linfocitos en
una reacción de linfocitos mixtos (Figura 5).
Molt-4 es una línea celular de
linfoma T humana, p56^{lck} negativa, y Jurkat es una línea de
células T humana, p56^{lck} positiva, que crecerá espontáneamente
en ausencia de estímulos exógenos. Como demuestran los resultados
de la Tabla IX, el Péptido T no afectaba significativamente al
crecimiento de las líneas celulares Molt-4 o
Jurkat.
Cuando las PBMC se mezclan con células
Molt-4 alogénicas, se inhibe el crecimiento de
Molt-4 (Figura 6). Las PBMC alorreactivas reconocen
Molt-4 como extrañas y generan células efectoras
citotóxicas que destruyen Molt-4.
Molt-4 no es una línea celular citotóxica y no
puede generar células efectoras alorreactivas. Cuando se añade el
Péptido T a esta reacción, la inhibición de la proliferación de
Molt-4 mediada por PBMC no se ve afectada (Figura
6), lo que sugiere que el Péptido T no afecta a la generación de
funciones efectoras citotóxicas. No es posible distinguir el
crecimiento de células T alorreactivas del crecimiento de las
Molt-4 supervivientes, ya que ni el crecimiento de
las células T alorreactivas (Figura 5) ni el crecimiento de las
Molt-4 (Tabla IX) se vería afectado por el
Péptido
T.
T.
Las células de las líneas monocito/macrófago
(MO/MAC) son células no proliferativas con vida larga que
caracterizan las reacciones inflamatorias crónicas. Las células
MO/MAC funcionan como fagocitos no específicos, células que
presentan antígenos (iniciando respuestas inmunes específicas de
antígeno), como células inmunorreguladoras y células efectoras
citotóxicas. Las MO/MAC generan diversas moléculas efectoras
citotóxicas intracelulares y extracelulares incluyendo intermedios
reactivos de oxígeno, enzimas lisosomales y factor de necrosis
tumoral alfa
(TNF).
(TNF).
Las MO/MAC se han implicado en la patogénesis de
la enfermedad producida por VIH. Todas las células MO/MAC expresan
CD4 (J. Immunol. Meth. 135 59 (1990)) y, por lo
tanto, pueden infectarse con VIH. Incluso se ha sugerido que las
células MO/MAC pueden ser las primeras en infectarse por el VIH
durante el proceso de infección (Annal. N.Y. Acad. Sci.
616 1 (1990)). Las células MO/MAC no son tan susceptibles a
los efectos citopáticos del VIH como las células T CD4 positivas
(TIPS 12 28 (1991)) y pueden ser responsables del
establecimiento de una infección por VIH persistente o latente. Las
células MO/MAC pueden ser responsables de la transmisión del VIH al
SNC, que comprende el tipo de células primarias infectadas por VIH
(Compr. Ther. 17 57 (1991)). En el SNC, las células
MO/MAC pueden mediar las lesiones neurológicas liberando la
glicoproteína gp120 neurotóxica (Science 248 364 (1990)),
tat (J. Virol. 65 961 (1991)) o neurotoxinas
derivadas de MO/MAC (Science 250 1593 (1990)). Es
interesante indicar que las células MO/MAC activadas también se han
visto implicadas en la patogénesis de otros trastornos neurológicos
tales como esclerosis múltiple (Acta. Neuropathol. 80
208 (1990); Pathol. Immunopathol. Res. 6 241 (1987);
Ann. Rev. Immunol. 10 153 (1992)) y la enfermedad de
Alzheimer (Eur. Neurol. 28 30 (1988)).
Las células MO/MAC infectadas por VIH presentan
disfunción de células auxiliares (Clin. Immunol.
Immunopathol. 59 436 (1991); J. Immunol.
146 2297 (1991)). Además, el VIH induce la activación de
MO/MAC como indica el aumento de nivel de neopterina, un marcador
de la activación de MO/MAC dependiente de células T, y el aumento
de los niveles de monoquinas (TNF, IL-1 e
IL-6).
In vitro, las células MO/MAC pueden
activarse por IFN-\gamma y lipopolisacárido
(LPS), que inicia al menos cuatro señales intracelulares distintas
incluyendo un flujo de calcio (Immunol. Today 10 33
(1989)). La producción de TNF puede iniciarse por la activación de
IFN o de MO/MAC aunque necesita LPS para desencadenar su liberación
(J. Exp. Med. 175 405 (1992)).
Se ha sugerido un papel para TNF en la enfermedad
por VIH basándose en las observaciones de que los macrófagos de
pacientes con SIDA liberan mayores cantidades de TNF que los de los
controles normales (Am. Rev. Respir. Dis. 144 195
(1991)) y los niveles mayores de TNF se han asociado con la
progresión de la infección de VIH latente al SIDA (Am. J.
Med. 85 289 (1988)). Los efectos potenciales del TNF que
contribuyen a la patogénesis del VIH incluyen caquexia mediada por
TNF (New Eng. J. Med. 327 329 (1992); J. Nutr.
122 749 (1992)), potenciación autocrina/paracrina de la
replicación del VIH (Immunol. Today 11 176 (1990)),
hiperactivación del sistema inmune (Biotherapy 3 127
(1991)), inhibición de zidovudina (AZT), ddI y ddC (VIII Int'l
Conf. AIDS Abs. #PoA 2326 (1992); J. Intern. Med. 228
549 (1990)), expansión de CTL específicos de CD4 autorreactivos
(VIII Int'l Conf. AIDS Abs. #PoA 2326 (1992)), daños en la
mielina y oligodendrocitos (AIDS 5 1405 (1991)), citopenia
(Am. Rev. Respir. Dis. 144 195 (1991)) y apoptosis
(Immunol. Ser. 56 315 (1992)).
El TNF también se ha visto implicado en la
patogénesis de la esclerosis múltiple. El TNF es citotóxico para
los oligodendrocitos que producen la mielina (Ann. Rev.
Immunol. 10 153 (1992)) y puede provocar daños en la
mielina directamente induciendo la formación de ampollas y el
hinchamiento de la vaina de mielina (Annal. Neurol.
23 339 (1988)).
El ensayo de citotoxicidad de MO/MAC es un ensayo
en dos etapas. Después de aislar las células adherentes
(principalmente MO/MAC) de las PBMC, las células MO/MAC se activan
por linfoquinas (incluyendo IFN gamma y LPS). Después del lavado
que retira los activadores, se añaden células diana K562 marcadas
con ^{3}H-timidina a las MO/MAC activadas y se
incuban durante 3 días. En el siguiente esquema se muestra el grado
de citotoxicidad que fue proporcional a la cantidad de marcador
radiactivo liberado en el sobrenadante del cultivo:
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\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió el sobrenadante (SN) de MO/MAC
activadas de monocapas de células adherentes derivadas de PBMC que
se habían expuesto a LPS durante 23 horas. Se ensayó la actividad
citolítica de este SN contra células K562 marcadas con
^{3}H-timidina en un ensayo de citotoxicidad de 48
horas, a 37ºC. El SN se almacenó a 4ºC durante una noche o se
almacenó congelado a -20ºC durante periodos más largos antes de su
utilización.
La presencia del Péptido T en diferentes etapas
del ensayo de citotoxicidad demostró que aunque el Péptido T no
afectaba a la capacidad de activación de las células MO/MAC en
reposo, podía inhibir la citotoxicidad de las células MO/MAC
activadas (Figura 7). No afectó a la actividad del fármaco que el
Péptido T se añadiera conjuntamente con las células diana o cada día
del cultivo.
El tratamiento con Péptido T reduce los
niveles de neopterina aunque la disminución de neopterina del suero
dependiente de Péptido T no estaba relacionada con la disminución
de IL-1 en suero.
Cuando se ensayó IL-1 en el suero
de pacientes con disminuciones dependientes de Péptido T de niveles
elevados de neopterina, no se pudo demostrar ninguna correlación
(Tabla X). Sin embargo, los niveles de neopterina eran elevados
antes de la administración del Péptido T mientras que los niveles
de IL-1 en suero eran normales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la capacidad de los SN del cultivo
de MO/MAC para lisar células K562 diana en presencia de Péptido T.
Se usaron SN del cultivo de MO/MAC a una dilución final de 1:6 en
el pocillo de cultivo. Como se muestra en la Figura 8, el Péptido T
pudo bloquear la lisis de K562 mediada por SN de MO/MAC incluso
añadido a 1 x 10^{-13}
M.
M.
Se cultivaron 10^{5} PBMC en presencia de PWM,
Con A o PHA (véase el Ejemplo 17). Se añadió Péptido T (10^{-9}
M), MoAb anti-TNF Nº47 a una dilución 1:200
(antiTNF) o una combinación de ambos a los cultivos,
simultáneamente con mitógenos. Después de una incubación de cinco
días, los cultivos se sometieron a pulsos de
^{3}H-timidina 18-24 horas antes
de recogerlos. La ^{3}H-timidina incorporada se
convirtió en un índice de proliferación (véase el Ejemplo 17). Los
datos se analizaron mediante ANOVA con dos muestras usando límites
de confianza del 95%.
Neutrófilos. Los neutrófilos se aislaron
de sangre entera de donantes de sangre sanos. La separación se
consiguió por el método rápido en una sola etapa de centrifugación
de sangre entera en FICOLL-HYPAQUE™. Tenían una
viabilidad de >99% y normalmente una pureza de >98%.
Péptidos y TNF. El TNF era un producto
recombinante producido en E. coli. El Péptido T y el análogo
505
(D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr)
se resuspendieron en Solución Salina Equilibrada de Hank
(HBSS).
A 100 \mul de 500-1000 U/ml de
TNF se les añadieron 10 \mul de péptido y después de 5 minutos se
añadieron 100 \mul de 1 x 10^{7} neutrófilos/ml. Las células se
incubaron adicionalmente a 37ºC/20 minutos y después se ensayó su
actividad quimioluminiscente. En algunos casos se añadió un agonista
tal como fMLP (10^{-7} M). La quimioluminiscencia se midió en un
luminómetro (LKB). Los resultados para el Péptido T se presentan en
la figura 12 como un pico de velocidad de liberación de CL. Se
midió la quimioluminiscencia dependiente de lucigenina: esto
representa una medida de superóxido. En otro conjunto de
experimentos se examinaron los efectos del análogo 505 sobre la
quimioluminiscencia de neutrófilos inducida por LPS. En este caso,
el TNF se sustituyó esencialmente por LPS. La concentración de LPS
fue de 0,005 \mug/ml. Los resultados se presentan en las figuras
13 y 14, que demuestran, respectivamente, que el análogo 505 (a)
inhibe el cebado de TNF y la activación de neutrófilos humanos y (b)
inhibe la activación de neutrófilos humanos por LPS.
En la inflamación sistémica aguda, por ejemplo,
en un paciente con choque séptico, puede observarse coagulación
intravascular diseminada. Durante el transcurso de la reacción de
coagulación, las células endoteliales se ven implicadas como
mediadores de la adhesión celular. Un factor que se produce y que
se ve implicado en la cascada de la coagulación es el factor
tisular, conocido también como actividad procoagulante de células
endoteliales; lo induce el TNF. En este ejemplo, se demuestra que
el Péptido T inhibe la expresión del factor tisular por las células
endoteliales, demostrando de esta manera que el Péptido T inhibe
algo de la patología asociada con las reacciones inflamatorias
agudas.
Metodología. Se cultivaron células
endoteliales de la vena umbilical humana básicamente por el método
de Bevilacqua et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
4533-4537 (1986). Los cultivos celulares se trataron
con TNF\alpha a 3 \mug/ml durante 4 horas a 37ºC en presencia o
ausencia del péptido T. La expresión del factor tisular se midió
por un ELISA, siguiendo la absorbancia a 450 nm. Los resultados se
muestran en la Figura 15, y de ellos puede observarse que al
aumentar progresivamente las concentraciones de Péptido T se reduce
la expresión del factor tisular.
Para evaluar el impacto del cambio relacionado
con fármaco sobre la salud general y la carga de síntomas, se
sometieron pacientes con MS a un seguimiento rutinario con
instrumentos de calidad de vida relacionada con la salud tanto
reconocidos como desarrollados recientemente: una versión modificada
de MS del Estudio de Resultados Médicos - Encuesta de VIH
(MOS-VIH) con 30 elementos desarrollado
originalmente por el Dr. Albert Wu, el Programa de Bienestar
General Psicológico (PGWB) desarrollado por el Dr. Harold Dupuy, y
la Lista de Comprobación de Síntomas de MS desarrollada para este
estudio. Estos instrumentos, de los cuales los dos primeros se han
validado anteriormente y se ha demostrado que responden a los
cambios en otras patologías, permiten cuantificar la variación de
síntomas auto-notificados (véase Brook et al.,
Medical Care 17 (7 Suppl.) 1-54 (1979),
Fazio "A Concurrent Validation Survey of the NCHS General
Well-Being Schedule", Departamento de Salud,
Educación y Bienestar de Estados Unidos, Centro Nacional de
Estadísticas de Salud, Hyattsville, Maryland, USA 1977, McDowell y
Newell "Measuring Health: A Guide to Rating Scales and
Questionnaires", Oxford University Press 1987, Stewart et al.,
Medical Care 26 724-35 (1988),
JAMA 262 907-13 (1989), y
"Measuring Functioning and Well-Being of Patients
with Chronic Conditions: The Medical Outcomes Study Approach",
Duke University Press 1992, Wachtel et al., Ann. Int. Med.
116 129-137 (1992), Ware K., et al.,
"Conceptualization and Measurement of Health for Adults in the
Health Insurance Survey, Vol III: Mental Health", Rand
Corporation 1979, y Wu et al., Medical Care 29 (8)
786-98 (1991)).
Dado el pequeño número de pacientes implicados en
este informe, algunos de los cuales recibieron el péptido T en un
diseño de
activación-desactivación-activación,
no es de esperar que pueda obtenerse un significado estadístico.
Para facilitar el establecimiento de cualquier tendencia, en el
siguiente análisis aparecen dos veces tres pacientes que dejaron de
tomar Péptido T y después volvieron a tomar el fármaco algunas
semanas más tarde después de un nuevo periodo basal. De esta manera,
se definieron 8 medidas basales y repetidas (en las semanas 0, 4, 8
y 12) y se analizaron usando ensayos-t por parejas
con dos colas: véase la Tabla XIV.
\newpage
Nota: Los inicios y reinicios después de la
eliminación se consideran ejemplos diferentes. En todas las
escalas, una mayor puntuación indica mejora.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el MOS-VIH modificado con MS,
se observó una tendencia o mejoría estadísticamente significativa
en las semanas 4, 8 y 12 incluso en esta pequeña muestra en
dimensiones de salud tales como incomodidad física, salud mental y
malestar. La mejora fue estadísticamente significativa en los tres
puntos de medida de energía, calidad de vida general, bienestar y
la puntuación del resumen sin ponderar. La mejoría global general
se corroboró mediante la puntuación del resumen de PGWB.
Se corroboró una mejora notable en energía
mediante la subescala de vitalidad de PGWB y mediante los índices
de impacto de la fatiga en las actividades diarias.
La mejora en el malestar fue estadísticamente
significativa a las 4 y 8 semanas. Con respecto a las
manifestaciones neurocognitivas de la MS, hubo una tendencia hacia
una mejora en los olvidos y en la lentitud de pensamiento.
En la evaluación de la calidad de vida
relacionada con la salud, un cambio estadísticamente significativo
mayor de 0,5 desviaciones típicas normalmente se toma como
indicación de un cambio moderado clínicamente significativo (véase
Testa, J. Hipertensión 5 S9-S13
(1987)). Todas las mejorías observadas superaban fácilmente este
ensayo, siendo muchas de las mejorías mayores de 1 desviación
típica. Las mejorías medias en las medidas de energía en la semana
12 en los tres instrumentos superaron 2 desviaciones típicas, una
indicación de un gran cambio clínico en un síntoma común y
debilitante de la MS.
Estas evaluaciones cuantificables con el tiempo
respaldan las observaciones clínicas de mejora significativa.
Claims (16)
1. Uso de un péptido lineal o cíclico de Fórmula
General 1:
(Fórmula General 1, SEC ID
Nº:
1)I-A-B-C-D-E-F-G-H-II
en la
que
A es Ala, Gly, Val, Ser, Thr o está ausente,
B es Ala, Gly, Val, Ser, Thr o está ausente,
C es Ser, Thr o está ausente,
D es Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, Ile, Leu o está
ausente,
E es Ser, Thr, Asp o está ausente,
F es Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys, Trp o está
ausente,
G es Tyr o está ausente,
H es Thr, Arg, Gly, Met (O), Cys, Thr, Gly o está
ausente,
y
I es Cys o está ausente,
II es Cys, un grupo amida, un grupo amida
sustituido, un grupo éster o está ausente;
y donde el péptido comprende la secuencia de
aminoácidos
Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-
(SEC ID Nº:
3),
estando opcionalmente sustituido
uno o más de los aminoácidos por un carbohidrato monomérico o
polimérico o derivado del mismo, realizándose tal sustitución
mediante grupos hidroxilo y/o amino y/o amido de los
aminoácidos,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención
de la esclerosis múltiple.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 de
un penta-, hexa-, hepta-, octa- o nonapéptido, donde uno o más
aminoácido(s) se han deleccionado del extremo carboxi o
amino, donde el aminoácido carboxi terminal puede estar en forma de
una amida, una amida sustituida o un éster, y donde el péptido
comprende la secuencia de aminoácidos
Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-
(SEC ID Nº: 3),
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,
en el que al menos uno de los grupos hidroxilo de un resto Ser, Thr
o Tyr se derivatiza en un compuesto éster o éter.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o
3, en el que al menos uno de los aminoácidos es un aminoácido
N-alquil sustituido.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos uno de los aminoácidos
está sustituido con un carbohidrato monomérico o polimérico, o un
derivado del mismo, realizándose tal sustitución o sustituciones a
través de grupos hidroxilo y/o amino y/o amido de los
aminoácidos.
6. Uso de un péptido lineal o cíclico que es
- 1.
- D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-NH_{2};
- 2.
- Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEC ID Nº: 5);
- 3.
- D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr;
- 4.
- D-Ala-Ala-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Met;
- 5.
- Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr (SEC ID Nº: 6);
- 6.
- Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr (SEC ID Nº: 7);
- 7.
- Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEC ID Nº: 8);
- 8.
- D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr;
- 9.
- D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH_{2};
- 10.
- D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH_{2};
o un derivado o sal del mismo, en la fabricación
de un medicamento para tratar o prevenir la esclerosis
múltiple.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el péptido es
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-NH_{2};
o un derivado o sal del mismo.
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