ES2251719T3 - Metodos para la proliferacion y diferenciacion de celulas b y su empleo. - Google Patents
Metodos para la proliferacion y diferenciacion de celulas b y su empleo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA METODOS DE PROLIFERACION DE CELULAS B COMO UN MEDIO DE OBTENCION DE UN GRAN NUMERO DE CELULAS B. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA ADEMAS METODOS DE DIFERENCIACION DE UNA POBLACION DE CELULA B PROLIFERANTE DE CELULAS QUE PRODUCEN ANTICUERPOS.
Description
Métodos para la proliferación y diferenciación de
células B y su empleo.
La presente invención está dirigida al campo de
la inmunología. Concretamente, la presente invención proporciona
métodos para proliferar y diferenciar células B.
Durante la respuesta inmune, la activación y
diferenciación de las células B lleva a la secreción de anticuerpos
de antígeno-específicos de gran afinidad. Cuando la
respuesta del anticuerpo está dirigida contra antígenos de
proteína, la producción de anticuerpos también depende de la
activación de las células T ayudantes (Th) específicas y sus
interacciones con las células B. Durante los procesos de activación
y diferenciación, las células B siguen uno o más caminos diferentes
e irreversibles para adquirir una o más funcionalidades
identificables. Por ejemplo, las células B inicialmente activadas
sufren altos niveles de proliferación, y durante este periodo de
división celular pueden ocurrir varios casos: puede ocurrir un
cambio de monotipos para dar una combinación de los genes de la
región variable (V) de la cadena pesada proximales a las diferentes
regiones constantes (subclases \gamma, \alpha o \epsilon) y
la secreción de diferentes clases de anticuerpos; puede ocurrir una
mutación somática en los segmentos de genes de las regiones V de las
cadenas pesadas y ligeras para generar sitios de combinación de
anticuerpos con gran afinidad; y las células B pueden diferenciar
para convertirse en células memoria o células plasmáticas
eficientes secretoras de anticuerpos.
Lo que determina el camino concreto que sigue la
célula B es probablemente el tipo de estímulo que recibe; y eso se
cree que está determinado por su entorno global. Por ejemplo, la
presencia de otros tipos celulares (diferentes tipos de células Th
y/o células dendríticas foliculares), así como la presencia o
ausencia de antígenos específicos pueden proporcionar diferentes
señales a las células B. Algunos casos, como las señales que
generan células B de memoria y los mecanismos moleculares que
dirigen la mutación somática y la selección de células productoras
de anticuerpos de alta afinidad, son todavía poco comprendidos.
Otros procesos, como las señales de activación iniciales que
conducen a las células nave a proliferar y cuáles son proporcionadas
por el contacto con células Th específicas cebadas y activadas han
sido ahora bien caracterizadas. (Parker, D., Annu. Rev.
Inmunología. 11:331-360 (1993). Además, también
se han descrito los efectos de las linfocitos derivadas de las
células Th sobre células B activadas (Parker, D., Annu. Rev.
Immunol. 11:331-360 (1993); Hodkin et al., J.
Immunol. 145:2025-2034 (1990); Noelle et al.,
J. Immunol. 146:1118-1124 (1991)).
Puesto que la generación de células Th cebadas y
activadas es obligatoria para la activación de las células B, ha
sido difícil definir los requisitos que tienen que cumplir las
células B utilizando los sistemas in vitro clásicos para
estudiar la respuesta de las células B. En estos sistemas, muchos de
los cuales utilizan las células B purificadas, clones de células Th
específicas para un antígeno, o un antígeno, los requisitos para la
activación de las células Th también eran esenciales para generar
una respuesta de las células B.
Los pasos involucrados en la activación de
células B por parte de las células Th pueden dividirse en, primero,
la activación restringida del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) y el cebo de las células Th específicas, y segundo, la
interacción de células Th activadas secundariamente con células B
para inducir la activación de las células B, su proliferación y
diferenciación (Parker, D., Annu. Rev. Immunol.
11:331-360 (1993)). Las células naive Th son
cebadas por interacciones con antígenos que han sido cortados en
péptidos (procesados) que tienen uniones con moléculas del MHC de
clase II en la superficie de las células presentadoras de antígeno.
En el estadio de cebar las células Th, el resto de células B no es
capaz de servir como células presentadoras de antígeno, puesto que
no parecen ser capaces de proporcionar las señales coestimulatorias
necesarias para las células Th. Las células presentadoras de
antígeno que pueden proporcionar las señales coestimulatorias
apropiadas para las células Th son células dendríticas
interdigitales que se encuentran en las zonas ricas de células Th
del bazo y posiblemente células B activadas. Una vez las células Th
específicas son cebadas, sus requisitos de activación parecen ser
menos astringentes. Las células Th cebadas pueden activarse
eficientemente mediante los linfocitos B restantes que han
capturado antígenos con receptores de antígeno específicos y los
han procesado en péptidos (Parker, D., Annu. Rev. Immunol.
11:331-360 (1996)). Una vez activadas, las
células Th cebadas expresan genes que les permiten enviar
recíprocamente las señales de activación dependientes de linfocina
y de contacto apropiadas para las células B restantes (Kehry, M. R.,
and Hodkin, P. D., Sem. Immunol. 5:393-400
(1993)).
Varios estudios en la década de los ochenta
describían características críticas de señales específicas enviadas
por células Th cebadas y activadas a células B (Coffman et al.,
Immunol. Rev. 102:5-28 (1998); DeFranco et
al., J. Exp. Med. 159:861-880 (1984)). Se
necesitaba contacto entre las células Th y las B; las señales
derivadas de las células Th que conducen a la activación de las
células B restantes no podían ser únicamente sustituidas por
linfocinas solubles (Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:1612-1616 (1980); Julius et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79:1989-1993 (1982);
Owens, T., Eur. J. Immunol. 18:395-401
(1988); Whalen et al., J. Immunol.
141:2230-2239 (1988); Hirohata et al., J.
Immunol. 140:3726-3744 (1998); Noelle et al.,
J. Immunol. 140:1807-1814 (1989); Julius et
al., Eur. J. Immunol. 18:381-386 (1988)). Un
descubrimiento importante en la caracterización de las moléculas
relacionadas con el envío de señales de contacto a las células B
restantes fue que las células Th preactivadas podían utilizarse
para enviar señales de activación. Esto implicaba que las señales
de contacto que recibían las células B naive no necesitaban ser
análogas; eran independientes de antígeno y no estaban restringidas
por el MHC. Las señales de activación de las células B parecían ser
diferentes de las señales necesarias para la activación de las
células Th, y por eso eran capaces de generar respuestas de las
células B circunstantes significativas (Whalen et al., J.
Immunol. 141:2230-2239 (1988)). Esto sugería
que los receptores de las células B para las señales de contacto
dependientes de las células Th se expresaban constitutivamente y no
eran polimórficas ni estaban relacionadas con el receptor del
antígeno de las células B. Además, las moléculas de células Th que
envían señales de contacto estaban con facilidad funcionalmente
ausentes en las células Th restantes. Esto tiene un papel para el
complejo receptor de las células T que estaba inicialmente
implicado en las señales de activación de las células Th
antígeno-específicas.
Estos estudios también delinearon un papel para
las linfocinas derivadas de las células Th en la determinación de
la cantidad y el isotipo del anticuerpo secretado (Coffman et
al., Immunol. Rev. 102:5-28 (1988). Se ha visto
que, en el ratón, la capacidad de un clon de célula Th para inducir
la diferenciación de la célula B, depende del repertorio de
linfocinas secretadas tras su activación. Los clones de células Th
tipo Th2, que secretan IL-4 y IL-5,
son efectivos induciendo la producción de IgM y cambiando a IgG1,
IgA, y IgE (Coffman, et al., Immunol. Rev.
102:145-173 (1989)). A pesar de algunas adversidades
iniciales existentes sobre la capacidad de los clones de células Th
de tipo Th1, que producen IL-2 y
IFN-\gamma, para estimular la diferenciación de
células B, parece que la mayoría de clones de células Th1 son
capaces de proporcionar el contacto apropiado y señales solubles
para activar las células B restantes para secretar el anticuerpo
cuando se proporcionan las linfocinas de Th2. (Abbas et.al.,
J.Immunol. 144:2031-2037 (1989)).
Aunque el papel de las linfocinas parecía ser el
de inducir la diferenciación de células B y no el de iniciar los
sucesos de activación, se necesitó un sistema que separadamente
llevaba a cabo el contacto de las señales solubles. Un estudio
reciente demostró que los componentes de membrana de las células T
podían ser transferidos a otros tipos celulares por una fusión
mediada por el virus Sendai.(Lindqvist et.al., Scand. J
immunol. 23:119-125 (1986)). Estas células
contenían proteínas de membrana específicas de células T funcionales
que podían transducir señales para la activación de genes
específicos para células T, pero las células no se examinaron por la
capacidad de activar células B. Un estudio adicional demostró que
las membranas plasmáticas de células tumorales eran suficientes
para generar linfocitos T citotóxicos alogénicos (Stallcup et
al., cell. Immunol. 89:144-150 (1984)). Esto
sugiere que el contacto célula-célula proporciona
señales críticas que regulaban la activación de linfocitos. Sin
embargo, dosis altas de membranas plasmáticas no eran
específicamente inhibitorias para ambas respuestas de linfocitos T
y B (Stallcup et al., Cell. Immunol.
89:144-150 (1984)). Algunos años más tarde, Sekita
et al. Preparó membranas plasmáticas de una variedad de
células T y líneas celulares linfoides y se demostró su capacidad
para estimular y coestimular la proliferación de células B (Sekita
et al., Eur. J immunol. 18:1405-1410
(1988)). Sin embargo, estos investigadores encontraron que las
membranas preparadas a partir de la mayoría de tipos celulares
podrían activar células B (Sekita et al., Eur. J. Immunol.
18:1405-1410 (1988)). Puesto que no se observó
especificidad para células Th o para células T restantes activadas,
el componente activo en aquellas membranas parecía ser diferente
del que se inducía por activación de células Th normales
cebadas.
Estudios que demostraron la mayoría de promesas
para desarrollar un sistema libre de células Th para enviar señales
de contacto a células B usaron una fracción enriquecida de membrana
plasmática de vesículas preparadas a partir de un clon activado de
células Th2 de ratón, D10.G4.1 (D10), para enviar señales de
contacto en ausencia de otros tipos celulares (Brian, A.A.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:564-568 (1988)). En este
trabajo, se demostró la especificidad en que las membranas
preparadas a partir de las células Th2 restantes no fueron
estimulatorias para para la proliferación de células B. Sin
embargo, la población de células B no habían sido purificadas para
eliminar células B preactivadas, las cuales tenían requisitos de
activación diferentes que las células B restantes. Las células B
preactivadas únicamente responden a linfocinas Th2 (en particular,
IL-5) por crecimiento y secreción de IgM e ausencia
de señales de contacto dependientes de células Th (Takatsu et
al., Immunol. Rev. 102:107-135 (1988)). Ya que
no es posible separar las vesículas de retículo endoplasmático
contaminadas que contendrían linfocinas de vesículas de membrana
plasmática no estaba claro al principio del estudio (Brian, A.A.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:564-568 (1988)) si un
estímulo dependiente del contacto actual podría ser distribuido a
las células b restantes por una fracción de membrana plasmática a
partir de un clon de célula Th.
La presente invención está basada en la
observación de que el ligando de unión CD40 de alta afinidad de la
membrana (aquí después, ligando hdmb CD40), puede indcir la
proliferación a largo plazo de células B en cultivo. Además, se ha
descubierto que variando los tipos y concentración de linfocinas y/o
células de contacto que están presentes durante la proliferación,
las células B proliferando pueden ser pueden ser inducidas para
diferenciarse (madurar) en células productoras de anticuerpos. Por
último se ha observado que la proliferación y diferenciación en
presencia de un antígeno preferentemente prolifera o selecciona las
poblaciones en diferenciación de células B para incrementar el
porcentaje de células que producen anticuerpos específicos al
antígeno suministrado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Basada en observaciones anteriores, una
realización de la presente invención proporciona métodos para la
proliferación de células B que comprometen el paso de cultivar una
o más células B en presencia del ligando hdmb CD40. Los
procedimientos de la presente invención puede ser aplicado a células
B aisladas de cualquier mamífero, siendo las más preferidas las
células B humanas.
Los métodos que se reivindican aquí mejoran los
ensayos previos para que las células B proliferen en el uso del
ligando hdmb CD40. Los ensayos previos a la proliferación de
poblaciones de células B en presencia del ligando de unión a la
membrana CD40 aislado de forma natural, el ligando CD40 unido a la
membrana producido a partir de células animales transfectadas,
producían de manera recombinante formas solubles del ligando CD40,
y los anticuerpos del receptor anti-CD40 han
producido resultados pobres.(por ejemplo, como se describe en
Amuitage et al., J.Immunology 15:36.71-3680
(1993)). La proliferación tiende a ser moderada, acabando después
de 1-4 rondas de replicación, y con frecuencia hay
un requerimiento de la presencia de una linfocina o citoquina (por
ejemplo linfocinas Th) para estimular la proliferación. Utilizando
los métodos presentes, se han obtenido las respuestas de
proliferación equivalentes a 250 veces más.
El método presente puede ser usado en un
procedimiento con un único paso de proliferación, o en un
procedimiento de pasos múltiples. Específicamente, el ligando hdmb
CD40 se incluyen en el cultivo durante las fases iniciales del
cultivo. La presencia del ligando hdmb CD40 se mantiene hasta que la
tasa de proliferación disminuye. Luego las células se dejan reposar
en el cultivo bajo condiciones que no contienen el ligando hdmb
CD40. Después de dejar reposar las células, las células pueden ser
reestimuladas para continuar la proliferación y diferenciación por
adición del ligando CD40 unido a hdmb y las citoquinas se
devolvieron en el medio de cultivo.
Una realización más de la presente invención se
basa en la observación que las citoquinas, extractos de células,
y/o células productoras seleccionadas cuando se añaden a células B
que están proliferando o han sido proliferadas usando los métodos
que antes se han descrito, estimulan las células B para
diferenciarse en células productoras de anticuerpos. Basado en esta
observación, la presente invención proporciona métodos para
diferenciar la proliferación de células B que comprenden el paso
del cultivo de células B en presencia del ligando CD40 hdmb y una o
más linfocinas, células productoras, o extractos del mismo. Ejemplos
de citoquinas y células productoras que pueden ser empleadas
incluyen, pero no se limitan a linfocinas Th2 y células dendríticas
foliculares.
Una tercera realización de la presente invención
se basa en la observación que la diferenciación de células B puede
ser parcialmente controlada incluyendo un antígeno en el medio de
cultivo. Específicamente, el porcentaje de células B que producen
anticuerpos selectivos para un antígeno específico puede aumentar si
se añade un antígeno al medio de cultivo durante el estadio de
proliferación, el estadio de reposo, el estadio de diferenciación,
o la reproliferación de los métodos hasta aquí descritos.
Además del uso in vitro, otras formas del
ligando CD40 han sido descritas en la bibliografía como maneras de
proliferar y activar las células B con un huésped mamífero. En
general, las condiciones patológicas que resultan en la supresión
de la proliferación y activación de células B pueden ser tratadas
usando el ligando CD40 hdmb de la presente invención en lugar de
las formas generadas previamente del ligando CD40. Supliendo un
mamífero con el ligando CD40 hdmb, las poblaciones de células B
pueden ser proliferadas en el huésped a hasta un nivel y a una tasa
que es mucho mejor que la que se encontró con las formas del ligando
CD40 previamente aisladas.
Figura
1
Las secuencias de nucleótidos del ligando CD40
humano y ratón. CD 40 es un miembro de la familia del receptor de
TNF (Mallett & barclay, Immunol. Today
12:220-223 (1991) que contienen cuatro dominios
extracelulares ricos en Cys repetidos. El ligando CD40 del ratón es
un glicoproteína de membrana de tipo 2 de PM
33.000-35.000 prevista para ser de 260 amioácidos
de longitud y que se expresa en células T activadas. Se relaciona
con el TNF (Farrah & Smith, Nature 358:26 (1992)) y ligandos
para otros miembros de la familia del receptor de TNF (Goodwin
et al., Cell 73:4473456 (1993); Smith et al., Cell
73:1349-1360 (1993); Smith et al., Cell
76:959-962 (1994); Aruffo et al., EMBO J.
(1992); Hollenbaugh et al., EMBO J.
11:4313-4321 (1992)).
Figura
2
A. Las células SF9 se infectaron con un
baculovirus recombinante que contiene el ligando CD40 de ratón
durante varias veces. Se preparó una fracción de membrana
enriquecida con plasma y cada preparación de membrana titulada en
un ensayo de proliferación de células B (2 x 10^{4} células
B/pocillo durante 72 h). Círculos completos, infección 18 horas;
cuadrados abiertos, infección 42 h; círculos abiertos, infección 66
h; cuadrados completos, infección 90 h.
B. el ligando hdmb CD40 producido antes en A se
usó para estimular las células B en presencia de D10 sn (1/100;
linfocina- que contienen el sobrenadante de D10G4.1 estimulado 9 h.
El clon de la célula T Th2, Hodkin et al., J.Immunology
145:2025-2034 (1990)). Símbolos como en la Figura
1A.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Figura
3
Las células B (2 x 10^{4}/pocillo) fueron
estimuladas con una cantidad constante del ligando CD40 hdmb
(1/200). Círculos completos, CD40-IgG incluida (35
\mug/ml a la concentración más alta); cuadrados abiertos, no
CD40-IgG.
Figura
4
Las células B se colocaron en placas de 96
pocillos (1 x 10^{4/} pocillo) con el ligando Cd40 hdmb (1/80) y
D10 sn (1/100). Las células se contaron y el medio se reemplazó cada
48 h. Los días 5 y 8 las células se resuspendieron y se
fraccionaron en 1/8. Triángulos completos, células no fraccionadas;
círculos completos, fracción 1/8 el día 5; cuadrados completos,
fracción 1/8 el día 8; círculos abiertos, fracción 1/8 multiplicado
por 8; cuadrados abiertos, el segunda fracción 1/8 multiplicado por
64.
Figura
5
Las células B se colocaron en placas de 96
pocillos en fondo plano y de fondo en "V" (1 x
10^{3}/pocillo). Las células se incubaron con el ligando CD40
hdmb y D10 sn (+ +) o solo las membranas del ligando CD40 hdmb. Las
células se contaron y el medió se retiraba y se reemplazaba cada
cada 48 h. Cuadrados completos, ligando CD40 hdmb y D10 sn en placa
de fondo plano; círculos abiertos, ligando CD40 hdmb y D10 sn en
placa de fondo en "V"; cuadrados abiertos, ligando CD40 hdmb
en placa de fondo plano; círculos completos, ligando CD40 en placa
de fondo en "V".
Figura
6
A. Se colocaron células B en placas de fondo en
"V" de 96 pocillos (1 x 10^{3} células/pocillo) con el
ligando CD40 hdmb (1/300) y D10 sn (1/100). Cada 48 h las células
se sacaban y se contaban. Cuadrados abiertos, número total de
células viables; círculos completos, fracción de células que fueron
viables.
B. El medio de los pocillos de replicación se
sacó para medir la concentración de anticuerpo por ELISA
cuantitativa. Círculos completos, IgM; cuadrados completos, IgG1;
triángulos completos, IgE. Las concentraciones de anticuerpo
acumuladas se proporcionan en ng/ml.
Figura
7
A. Se colocaron las células B en placas de fondo
en "V" de 96 pocillos (1 x 10^{3} células/pocillo) con el
ligando CD40 hdmb (1/300) y D10 sn (1/100). Cada 48 h las células se
sacan y se cuentan; el medio viejo se sacó y se reemplaza con medio
fresco. Cuadrados abiertos, número total de células viables;
círculos completos, fracción de células que fueron viables.
B. El medio de los pocillos de replicación se
sacaron para medir la concentración de anticuerpo por ELISA
cuantitativo. Círculos completos, IgM; cuadrados completos, IgG1;
triángulos completos, IgE. Las concentraciones de anticuerpo
acumuladas se proporcionan en ng/ml.
Figura
8
A. Las células B se colocaron en placas de fondo
en "V" de 96 pocillos (1 x 10^{3} células/pocillo) con el
ligando CD40 (1/300) y D10 sn (1/100). Cada 48 h las células se
sacaron y se contaron; el medio viejo se sacó y se reemplazó con un
medio fresco; +-, medio que contiene el ligando CD40 hdmb; - -
medio que no contiene adiciones; ++, medio que contiene el ligando
CD40 hdmb y D10 sn. Cuadrados abiertos, número total de células
viables; círculos completos, fracción de células que fueron
viables.
B. Medio para los pocillos de replicación se
sacaron para medir la concentración de anticuerpo por ELISA
cuantitativa. Círculos completos, IgM; cuadrados completos, IgG1;
triángulos completos, IgE. Las concentraciones de anticuerpo
acumuladas se proporcionaron en ng/ml.
Figura
9
Las células B se colocaron en placas a 1, 3, 10 y
30 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo en "V"
con el ligando CD40 hdmb (1/300) o el ligando CD40 hdmb (1/300) y
D10 sn (1/100). Después de 6 días, las células se resuspendieron,
se transferieron a placas de fondo plano, y se evaluaron por la
presencia de células viables (\geq células/pocillo).
Figura
10
Las células B humanas se incubaron en pocillos de
fondo en V como se describe en la Figura 7 con o sin adición de
IL-4, IL-6, o IL-10
recombinantes humanas como se indica.
Figura
11
Las células B de la sangre periférica humana
purificada (7.000/pocillo) se incubaron en BCM (100 \mul) con
varias concentraciones del ligando CD40 hdmb humano en la forma de
membranas plasmáticas purificadas a partir de células SF9
infectadas con un ligando CD40 humano que contiene baculovirus
recombinante ( de aquí en adelante ligando CD40 hdmb humano).
(cuadrados), las células B en ausencia de membranas; (triángulos),
ligando CD40 humano hdmb y una mezcla de linfocinas recombinantes
humanas (IL-\alpha, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-10, y
IL-11). ^{3}H-Timidina (1
\muCi/pocillo) se añadió durante las últimas 6 h del periodo de
cultivo de 96 h. Cada punto es la media de los pocillos
duplicados.
Figura
12
Las células B de la sangre periférica humana
purificada a 1,3,10 y 30 células/pocillo en placas de fondo en
"V" de 96 pocillos en presencia del ligando CD40 hdmb humano (1
\mug/ml) y una mezcla de IL-\alpha,
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-10, y IL-11 (150 \mul total).
Los días 4,8, y 11, el medio viejo se sacó y se reemplazó con medio
fresco que contiene el ligando CD40 hdmb humano y linfocinas. (A)
Los pocillos que contienen células viables (\geq 4
células/pocillo) se evaluaron el día 14 después de resuspender las
células y transferirlas en placas de fondo plano de 96 pocillos.
Las líneas discontinuas indican el número de células B/pocillo donde
el 37% de los cultivos fueron negativos para el crecimiento. De
acuerdo con la distribución de Poisson, a este número de células
cada pocillo contendría una célula de crecimiento. (B) El medio
cultivado de las placas el día 11 se ensayaron para la presencia de
IgM humana y IgG humana por ensayos separados ELISA. El número de
pocillos positivos para IgG y IgM se combinaron para evaluar. La
línea discontinua indica que el número de células B/pocillo donde
el 37% de los cultivos fueron negativos para la producción de
anticuerpos.
Figura
13
Se incubaron células B de la sangre periférica
humana (500/pocillo) en placas de fondo en "V" de 96 pocillos
con el ligando CD40 hdmb humano (1 \mug/ml) en presencia de las
linfocinas indicadas en 150 \mul de BCM durante 14 días. Los
sobrenadantes del cultivo se recogieron y los niveles de IgM y IgG
se determinaron por ELISA. Cada punto es la media \pm S.E. de 4
pocillos replicados. Las concentraciones de linfocina se suplieron
como se describe en el ejemplo 3, Materiales y Métodos. PHA/PMA sn,
sobrenadante del cultivo de células T de la sangre periférica
activada con PHA y PMA; \alphaCD3 sn, sobrenadante del cultivo de
células T de la sangre periférica activada con
anti-CD3. Concentraciones finales de sobrenadantes
de células T humanas como se indican.
Figura
14
Células B de la sangre periférica humana
(500/pocillo) se incubaron en placas de fondo en V de 96 pocillos
con el ligando CD40 hdmb humano (1 \mug/ml) en presencia de varias
diluciones de sobrenadante a partir de células T de la sangre
periférica activada con anti-CD3 en 150 \mul de
BCM. El día 23, se sacó el medio y se determinaron los niveles de
IgM (barras punteadas) y IgG (barras de líneas cruzadas) por ELISA.
Cada punto es la media \pm S.E. de los cuatro pocillos
replicados.
\newpage
Figura
15
Se colocaron células B esplénicas densas de ratón
en placas a 1000, 3000, 10000, y 30000 células/pocillo en placas de
fondo en V de 96 pocillos en presencia del ligando CD40 humano hdmb
de ratón (0,1 \mug/ml) y sobrenadante D10 (1/100) en 150 \mul
de BCM. En los días 5, 8 y 12, se sacó el medio viejo y se reemplazó
con medio fresco que contenía Sf9^{CD40L} y linfocinas. En el día
14 los pocillos se ensayaron por la presencia de células secretoras
del anticuerpo específico para LKH por ELIPSOT como se ha descrito
en el Ejemplo 3, Materiales y Métodos. Cada pocillo en las placas
originales se dividieron en dos placas ELIPSOT idénticas; uno de los
duplicados de placas se desarrollaron para IgM y el otro se
desarrolló para IgG. Las placas fueron evaluadas positivamente para
las células secretoras de IgM (\geq3 puntos/pocillo) o células
específicas secretoras de IgG (\geq4 puntos/pocillo) bajo un
microscopio de disección. Las líneas de trazado indican el número de
células B/pocillo donde el 37% de los cultivos fueron negativos
para la producción de anticuerpo específico de antígeno.
La presente invención está basada en la
observación de que el enlace de membrana de alta densidad al ligando
CD40 (de aquí en adelante ligando CD40 hdmb), puede inducir gran
nivel de proliferación de células B en cultivo. Además, se ha
encontrado que variando los tipos y concentración de citoquinas y/o
células de contacto que están presentes durante la proliferación,
células B de proliferación pueden ser inducidas para diferenciarlas
en células productoras de anticuerpos. Por último, se ha observado
que la proliferación y diferenciación en la presencia de un
antígeno preferentemente prolifera o selecciona células B
diferenciadas para producir anticuerpos específicos para el
antígeno proporcionado.
Basada en las observaciones anteriores, una
realización de la presente invención proporciona métodos para la
proliferación de células B que comprenden el paso de cultivar una o
más células B en la presencia del ligando CD40 de hdmb, en donde la
membrana contiene el ligando CD40 al menos a una densidad 10 veces
mejor que la encontrada en las células que naturalmente expresan el
ligando CD40 y las células B son proliferadas al menos 100 veces
más.
Como se usa aquí, la proliferación se define como
el proceso de expandir (incrementar) el número de células B a
partir de un inicio de una o más células a un número mayor de
células. En los ejemplos siguientes, se presenta la evidencia para
la proliferación de 250 veces más (ocho rondas de división en seis
días). El grado y cantidad de proliferación obtenida usando los
métodos presentes, variará dependiendo del tipo y naturaleza de las
células B iniciales usadas así como las condiciones de cultivo
empleadas. Sin embargo, siempre que el número de células B vivas
presentes en el cultivo incremente como resultado de la división o
supervivencia incrementada de la población dividida, las células B
proliferan (ver figuras 2,6,7,8 y 10).
Como se usa aquí, las células B, o una población
de células B, se refiere a una o más células que derivan de un
explante primario que contiene células B o un cultivo derivado de
ahí (para una definición de células B y poblaciones de células B,
ver Parker, Annu. Rev. Immunol. 11:331-360 (1993)).
Las células B preferidas para el uso en la presente invención se
clasifican como "células B de baja densidad". Como se describe
en los ejemplos que siguen, las células B de baja densidad pueden
ser purificadas a partir de los bazos, sangre periférica, médula
osea o células aisladas de órganos linfoides de un mamífero usando
técnicas conocidas en el campo, por ejemplo, ver Hodgkin et
al., J.Immunology 145:2025-2034 (1990), Clark
et al. J. Immunology 148:3327-3335 (1992),
Thomas et al. J. Immunology 150:821-834
(1993), Freudenthal et al. PNAS USA 87:7698 (1990).
La población inicial de células B pueden
consistir en un explante primario de células B de baja densidad
aisladas (aproximadamente 1000 células), ser un explante primario
de células B aisladas individualmente, obtener a partir de cultivos
de células B existentes producidos por los métodos que se describen
aquí o aislar células de sangre periférica, células de la médula
ósea y células derivadas de órganos linfoides. Un experto del campo
conocerá como variar la condición del cultivo dependiendo de la
fuente y el tamaño de la población inicial usando parámetros
conocidos (ver Figura 4 y 11).
Los procedimientos de la presente invención
pueden ser aplicados a células B aisladas de cualquier mamífero.
Los ejemplos siguientes dan evidencia de la capacidad del ligando
CD40 hdmb para proliferar ambas células B de ratón y humanas
(Figuras 2,7 y 9-12).
Como se usa aquí, "cultivar" se refiere al
conjunto de procedimientos usados in vitro donde una
población de células (o una célula simple) se incuba bajo
condiciones que han sido mostradas para soportar el crecimiento o
viabilidad de la células in vitro. El campo reconoce un
amplio número de formatos, medios, rangos de temperatura,
concentraciones de gas etc. Que necesitan ser definidas en el
sistema de cultivo. Los parámetros variarán basados en el formato
seleccionado y las necesidades específicas del individuo que
practica los métodos aquí descritos. Sin embargo, se reconoce que
la determinación de los parámetros del cultivo es rutinario.
Cualquiera de la amplia variedad de formatos,
incluyendo, pero no limitado a, tecnología de fibra al vacío e
inmovilización en soporte sólido o frascos de cultivo, pueden ser
adaptados para el uso en los métodos actualmente descritos desde
que estos formatos de han empleado con éxito en el cultivo de otros
tipos celulares de mamíferos. En los ejemplos que siguen, las
células B se incubaron en placas micotituladas de 96 pocillos de
fondo en V o de fondo plano con tapas estériles (Figura 5, 10 y
11). Durante el cultivo, las placas se incubaron en CO_{2} 5,5% a
37ºC. Estos procedimientos se usaron para cultivar masas de células
B de baja densidad (de aproximadamente 1000 células) así como 1, 3
y 10 células por pocillo para hacer crecer clones de células B
seleccionadas. Estos procedimientos fueron seleccionados solamente
como un ejemplo de la amplia variedad de formatos y condiciones que
pueden ser
empleados.
empleados.
Además de la amplia variedad de formatos, puede
emplearse cualquiera de los medios de cultivo de células de
mamíferos actualmente conocido en los métodos reivindicados que se
presentan. Un experto puede determinar la idoneidad de un medio
particular y la combinación de medio/formato para el uso en los
presentes métodos reivindicados usando procedimientos conocidos. En
los ejemplos que siguen, el medio de células B (BCM) que consiste
en un 10% de suero fetal bovino (caracterizado como HyClone), hepes
10 mM pH 7,3, L-glutamina,
penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato
sódico. 5 x 10^{-5} M de mercaptoetanol en medio RPMI 1640 y se
usó 100x de suplementos de Gibco. Revisiones detalladas de otros
formatos conocidos y condiciones de cultivo usadas en cultivos de
células de mamífero son conocidos en el campo.
Los métodos reivindicados aquí se basan
mayormente en el uso del ligando CD40 hdmb. Como se usa aquí, el
"ligando CD40" se refiere a cualquier proteína que posee
similitud sustancial a una de las secuencias de aminoácidos
conocida del ligando CD40 y posee actividad de ligando CD40 (para
una revisión de la secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ácidos nucleicos que codifica los ligando CD40 ver Armitage et
al. Nature 357:80-82 (1992); Hollenbaugh et
al., EMBO J. 11:4313-4321 (1992)). Como se usa
aquí, dos proteínas que tengan una similitud sustancial en la
secuencia de aminoácidos cunado un dominio activo o una región
involucrada en la unión al receptro contiene un 80% o una homología
mejor de la secuencia de aminoácidos. Los ligandos CD40 preferidos
de la presente invención son ligandos CD40 humanos y ligandos CD40
de ratón.
El ligando CD40 de la presente invención puede
ser aislado a partir de células que expresan de forma natural el
ligando CD40, o puede ser purificado a partir de células que han
sido alteradas para expresas el ligando CD40. Para una revisión
detallada de la aplicación de procedimientos recombinantes para la
producción de ligandos CC40, ver, Armitage, Nature
357:80-82 (1992) y Hollenbaugh et al., EMBO
J. 11:4313-4321 (1992), así como los ejemplos que
siguen.
El ligando CD40 que se usa en el método presente
es una forma de enlace de membrana del ligando CD40. Como se usa
aquí, " ligando CD40 del enlace de membrana" se refiere al
ligando CD40 que se une a un lípido o membrana plasmática. La unión
del ligando CD40 a la membrana se puede realizar de varias maneras.
Por ejemplo, el ligando CD40 se puede unir a una membrana usando el
dominio natural transmembrana del ligando CD40 puesto que el ligando
CD40 es una proteína transmembrana de aparición natural de células
que se crean de forma natural o que han sido alteradas para
expresar el ligando CD40, el ligando CD40 que se obtiene es la forma
de enlace de membrana. El ligando CD40 enriquecido o purificado se
obtiene a partir de células como una fracción de membrana o puede
ser aislado como una molécula solubilizada y reconstituida con
lípidos para formar una membrana artificial.
Alternativamente, el ligando CD40 o derivados
solubles del ligando CD40, se puede unir a la membrana plasmática a
través del uso de un conector de proteínas de la membrana apropiado
y un agente reticulante proteico o un vínculo GPI. En general, el
concepto y los procedimientos para anclar una proteína en la
membrana son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, un agente
reticulante proteico conocido puede ser usado para anclar el
ligando CD40 a una membrana lipídica que contiene proteínas de
membrana integrales con residuos expuestos activables. Un experto
puede adaptar inmediatmanete cualquiera de la variedad de las
técnicas de anclaje a la membrana conocidas con el fin de obtener
el ligando CD40 de enlace a la membrana.
Como se usa aquí, "alta densidad" se refiere
a membranas que contiene el ligando CD40 al menos a una densidad de
10 veces mayor que la encontrada en las células que expresan de
forma natural el ligando Cd40, y más preferiblemente 100 veces
mayor. Se ha observado que los intentos previos en expresar el
ligando CD40 en un huésped recombinante han resultado en la
producción del ligando Cd40 a densidades similares a aquellos
encontrados en células que expresan naturalmente ligandos CD40 por
ejemplo como se describe en Armitage et al., J.Immunology
15:3671-3680 (1993)).
Una variedad de procedimientos pueden ser usadas
o para determinar la "densidad" del ligando CD40. Esto incluye
pero no se limita a microscopia de fluorescencia, análisis de
células activadas fluorescentemente, ensayo de unión
ligando/receptor, e inmunoreactividad. (Por ejemplo, ver Castle
et al., J. immunol. 151:1777-1788
(1993)).
Como se ha discutido arriba, una variedad de
procedimientos pueden ser usados para obtener el enlace del ligando
CD40 a la membrana de alta densidad. El método preferido de la
presente invención es expresar el ligando CD40 en células de
insecto cultivadas infectadas con un vector baculoviral modificado.
Se ha encontrado que el ligando CD40 puede ser expresado de
inmediato en cultivos de células de insecto como una alta densidad,
forma de enlace de membrana. Un experto puede adaptar de inmediato
los sistemas de expresión de baculovirus conocidos para producir el
ligando CD40 en una forma de enlace de membrana de alta densidad.
Los ejemplos de abajo demuestran el uso de células SF9 cultivadas
para producir el ligando CD40 para el uso en los métodos
reivindicados aquí. (ver Figura 2).
Los intentos previos de proliferación de células
B en presencia del ligando CD40 unido a la membrana aislada
naturalmente, ligando CD40 unido a la membrana producido a partir de
células de animales transfectadas, o derivados solubles expresados
recombinantemente del ligando CD40 ha producido resultados pobres.
La proliferación tiende a ser moderada, acabando después de
1-4 rondas de replicación. La presente invención
proporciona mejoras sobre el uso de formas previas del ligando CD40
en que las respuestas de proliferación que se ha demostrado que son
250 veces superiores. La presencia de linfocinas cuando se usa el
ligando CD40 hdmb resulta en la diferenciación de la proliferación
de células B en células productoras de anticuerpos.
El método presente puede ser usado en un
procedimiento de proliferación de un único paso o un procedimiento
de pasos múltiples. En un procedimiento de pasos múltiples, el
ligando Cd40 hdmb se incluye en el medio de cultivo durante las
fases iniciales del cultivo. La presencia del ligando CD40 hdmb se
mantiene hasta que la tasa de proliferación disminuye. Las células
se dejan reposar cultivándolas bajo condiciones donde el ligando
Cd40 hdmb no está presente. Depués de dejar reposar las células, las
células pueden ser reestimuladas para continuar la proliferación
por adición del ligando CD40 y retorno de las citoquinas al cultivo
(ver Figura 8). El mecanismo fundamental para el estadio de reposo
seguido de un estadio de proliferación usando el ligando CD40 hdmb
es desconocido. Sin embargo, se ha encontrado que algunas de las
poblaciones de células B activadas requiere tal fase de reposo
después de que el índice de proliferación inicial haya disminuido.
Un experto puede monitorizar de inmediato la proliferación de
células B y eliminar el ligando CD40 hdmb del medio de cultivo
cuando el índice de proliferación de células B decline.
Una variedad de procedimientos pueden ser usados
para monitorizar la proliferación de células B. Éstos incluyen,
pero no se limitan a, medir la incorporación de un compuesto
marcado, tal como timidina tritiatada, o por técnicas de contaje
celular directo. Ambos procedimientos se describen con más detalle
en los ejemplos que siguen.
Puntos temporales específicos para un
procedimiento de proliferación de pasos múltiples puede ser
determinado de inmediato por un experto en el campo usando los
procedimientos que se describen arriba. En los siguientes ejemplos,
el procedimiento usado fue para cultivar células B (una población
aislada de baja densidad) en presencia del ligando Cd40 hdmb
durante seis días (estadio de proliferación). Después de seis días
de cultivo, el ligando CD40 hdmb se eliminó del medio de cultivo y
las células se alimentaron durante seis días más (estadio de
reposo). Después del sexto día de la fase de reposo en la que el
ligando Cd40 hdmb no estaba presente, las células se recultivaron
en presencia del ligando CD40 hdmb y citoquinas apropiadas (estadio
de reproliferación).
Una realización más de la presente invención se
basa en la observación de que las citoquinas, extractos de células
seleccionadas, agentes que interconectan los receptores de la
superficie y moléculas Ig, y/o poblaciones de células productoras
seleccionadas, cuando se añade a células B que están proliferando o
han sido proliferadas usando los métodos descritos anteriormente,
estimula las células B para diferenciarlas en células productoras
de anticuerpos. Basado en esta observación, la presente invención
proporciona métodos para diferenciar las células B que proliferan
que comprende el paso de cultivar células B en presencia del ligando
Cd40 hdmb y una citoquina, células productoras o extractos de las
mismas.
Como se usa aquí, las citoquinas se refieren a la
clase de moléculas que se ha demostrado que tienen actividad de
diferenciación celular y/o actividad de promocionar el crecimiento.
Las citoquinas pueden ser identificadas y añadidas al medio de
cultivo de forma altamente purificadas, por ejemplo como
interleucina-1, IL-2,
IL-4, INF-\alpha, etc
purificadas, o pueden ser suplidas como sobrenadantes o extractos
obtenidos a partir de células estimuladas que producen las
citoquinas. En la presente invención, las linfocinas Th2 se usaron
para diferenciar las células B del bazo de ratón mientras que las
linfocinas secretadas o las células T activadas con
anti-CD3 o una combinación de IL-2,
IL-4, IL-6, y IL-10
recombinantes soportaban la diferenciación de células B de la
sangre periférica humana estimuladas con el ligando CD40 hdmb.
Específicamente, para células B de ratón, el clon de Th2 D10.G4.1
se estimuló durante nueve horas con concavalina A y los
sobrenadantes del cultivo fueron absorbidos con manosa/agarosa,
ultracentrifugados a 100.000 g durante 30 minutos, filtrado de forma
estéril, y almacenados a -80ºC antes de usarse (SN de Th2 o
sobrenadante de Th2)(ver Hodgkin et al. Immunology
145:2025-2034 (1990)). El sobrenadante aislado de
Th2 luego se usó para estimular la diferenciación de las células B
de ratón que proliferan.
Para diferenciar células B de sangre periférica,
se preparó una linfocina que contiene el sobrenadante como sigue.
Células mononucleares de sangre periférica obtenidas después de la
centrifugación sobre Ficoll-Hypaque fueron cribadas
secuencialmente en placas cubiertas toda la noche con
anti-CD14 (5 \mug/ml), anti-CD14 y
anti-CD19 (2,5 \mug/ml cada uno), y
anti-CD8 (5 \mug/ml). El cribado fue en solución
salina equilibrada de hank, 5% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,3 a 4ºC
durante 1 hora. Las células no adherentes se lavaron y se
resuspendieron a 4x10^{6} células/ml en BCM caliente [RPMI 1640
suplementado con 10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,3), 2 mM de
L-glutamina (GIBCO, Grand Island, NY), 0,1 mM de
aminoácidos no esenciales (GIBCO), 1 mM de piruvato sódico, 5 x
10^{-5} M de 2-mercaptoetanol, y 100 U/ml cada
penicilina y estreptomicina (GIBCO)]. Para la estimulación
anti-CD3, las células se colocaron en placas de
cultivos de tejidos cubiertos con 4 \mug/ml de
anti-CD3 durante 48 horas a 37ºC. Para la
estimulación con PHA/PMA, las células se incubaron con 2,5 \mug/ml
de PHA y 10 ng/ml de PMA durante 2 h a 37ºC, se lavaron y e
incubaron en BCM caliente fresco durante 46 h a 37ºC. Después de
eliminar las células por centrifugación a baja velocidad, los
sobrenadantes se centrifugaron a 100.000x g, se filtraron a través
de una membrana de 0,2 \muM; y se almacenaron en alícuotas a
-80ºC.
Adicionalmente, las citoquinas producidas por
otros tipos celulares, incluyendo células dendríticas, células
dendríticas foliculares, y otras células presentadoras de antígeno,
en la presencia o ausencia de antígeno específico, pueden ser
incluidas en los cultivos como estímulo. Además de las Th2 y el
sobrenadante activado con anti-CD3 que se usó en
los ejemplos, un experto en el campo puede de inmediato utilizar
cualquier citoquina conocida en los presentes procedimientos de
diferenciación.
Además de las citoquinas específicas o
sobrenadantes que contienen citoquinas, capas productoras, extractos
celulares obtenidos de otras células involucradas en la
diferenciación de células B, y/o agentes que interconectan las
moléculas de la superficie pueden ser añadidas para proliferar las
células B para estimular la proliferación. Por ejemplo, las células
B son conocidas por interactuar con células dendríticas foliculares
durante la maduración. Los extractos de membrana, sobrenadantes de
cultivo o moléculas purificadas derivadas de células dendríticas
foliculares (obtenidas de la misma manera como se ha descrito para
los sobrendantes de Th2), o se puede usar una capa productora de
células dendríticas foliculares para estimular la diferenciación de
células B proliferando o aumentar la diferenciación que se estimula
a través del uso de otras citoquinas como se ha descrito antes.
Además, agentes tales como anticuerpos, que interactúan con los
receptores de la superficie señalan la diferenciación de células B
proliferadas y las que están proliferando (en algunos casos, estos
agentes inducirán la hipermutación somática en los CDRs de las
regiones variables del anticuerpo que codifica DNA en la células B).
Anticuerpos anti-IgD o anti-IgM que
interactúan con las moléculas Ig enlazadas a la membrana en la
célula B se han mostrado para estimular la permutación para los
anticuerpos secretados (por ejemplo, conduciendo a la producción de
altos niveles de anticuerpos IgA).
Las citoquinas, extractos de
células/sobrenadantes, o células productoras usadas para estimular
la diferenciación pueden ser añadidas a las células B a cualquiera
de uno de la variedad de puntos temporales durante el cultivo. Por
ejemplo, las citoquinas pueden ser usadas al principio del cultivo.
Usando este procedimiento, la producción de anticuerpos normalmente
empieza alrededor del día 8 a 10 (Figuras 6,7,10 y 13).
Alternativamente, las citoquinas se pueden añadir durante el reposo
o la fase de reproliferación si se usa un proceso de pasos
múltiples. La ventaja de una aproximación de pasos múltiples es que
permite que una pequeña población inicial de células B proliferen
y/o se seleccionen antes de la diferenciación.
Una variedad de procedimientos se pueden usar
para monitorizar la diferenciación de células B. Estos
procedimientos incluyen, pero no se limitan a, examinar las
características morfológicas de las células que proliferan, ensayos
que determinan la presencia de la proteína anticuerpo, ensayos para
marcadores de superficie celular, y métodos que ensayan la
presencia de secuencias de ácidos nucleicos que codifican
anticuerpos (Figuras 6, 7 10, 13, y 14). Un experto puede adaptar
de inmediato cualquiera de estos procedimientos para monitorizar la
diferenciación de células B proliferando que se obtienen usando los
métodos hasta aquí descritos.
Durante la diferenciación, puede ser preferible
para clonar fuera de los individuos seleccionados o subpoblaciones
de las células B proliferando con el fin de obtener líneas de
células clonales. Estos procedimientos se realizan de forma más
inmediata usando técnicas de revestimiento conocidas en el campo
(ver Figuras 9,12 y 15). Un experto puede aplicar inmediatamente
estos procedimientos de clonaje para células que proliferan y que se
diferencian producidas por los métodos descritos hasta aquí.
Una tercera realización de la presente invención
se basa en la observación de que la diferenciación de células b
proliferando puede ser parcialmente controlada incluyendo un agente
en el medio de cultivo. Específicamente, el porcentaje de células B
que producen un anticuerpo selectivo para un antígeno específico que
puede ser incrementado añadiendo un antígeno al medio de cultivo
durante la fase de proliferación, la fase de diferenciación, o la
fase de reproliferación de los métodos descritos hasta aquí.
Como se usa aquí, un antígeno es un compuesto que
se ha mostrado, o se puede mostrar, que estimula una respuesta de
anticuerpo cuando se administra a un huésped mamífero. Los antígenos
vienen en una variedad de formas e incluyen, pero no se limitan a,
proteínas, carbohidratos, compuestos sintéticos, y derivados
vitamínicos. Un experto puede aplicar de inmediato procedimientos
conocidos para determinar la antigenicidad de un compuesto
particular.
En una aplicación del método anterior, un
antígeno se añade al medio de cultivo cuando la citoquina (u otro
agente de diferenciación) está presente. Por ejemplo, en
procedimientos donde la citoquina se añade durante la proliferación
inicial, el antígeno se proporciona en el estado de incubación. En
procedimientos donde la citoquina se añade después del estadio de
proliferación inicial, el antígeno se añade en este estado. Además,
un experto puede usar de forma inmediata procedimientos conocidos
para incrementar la antigenicidad de un antígeno así como para
asegurar que el antígeno viene en contacto con las células B
proliferando o diferenciándose. Tales procedimientos pueden incluir
el acoplamiento del antígeno al vehículo proteína o carbohidrato
para incrementar las propiedades tales como la solubilidad y
anitgenicidad, o para acoplar el antígeno a la superficie de una
membrana o pocillo de cultivo de plástico para adherir
selectivamente (cribar) células B diferenciándose que expresan
anticuerpos de superficie al antígeno acoplado.
En un ejemplo del uso de antígeno, el antígeno se
acopla a la membrana que contiene el ligando CD40 hdmb. El
acoplamiento de un antígeno al ligando CD40 hdmb actúa
preferentemente apuntando al ligando CD40 hdmb a células B que
reconocen el antígeno particular. En otro ejemplo, el antígeno o
antígeno/ligando CD40 hdmb se proporciona como un copolímero de
dextrano. La copolimerización con dextrano se conoce por incrementar
la densidad epitópica de un antígeno, así incrementando el número y
grado de contactos adecuados de las células B.
Aunque la estimulación del antígeno se ha visto
que incrementa el porcentaje de células B que se diferencian para
producir anticuerpos dirigidos al antígeno, tal preferencia no es
completa en toda la población entera de células B proliferantes.
Como consecuencia, un experto necesitará emplear procedimientos
conocidos de clonaje o cribado con el fin de aislar líneas clonales
específicas de células B diferenciadas que producen anticuerpos
dirigidos al antígeno suministrado.
Los procedimientos anteriores para la
proliferación y diferenciación se pueden usar por una variedad de
propósitos y usos. Un experto puede reconocer inmediatamente el
valor de ser capaz de proliferar y obtener grandes números de
células B, y en particular, células B humanas. Específicamente,
tales procedimientos eliminan la necesidad de inmortalización de
líneas celulares B para obtener cantidades usables/factibles de
materiales derivados de células B. Los materiales derivados de
células B se reconocen por ser útiles en el desarrollo de compuestos
farmacéuticos basados en anticuerpos. Previo a la invención del
Solicitante, la investigación dirigida a las células B fue limitada
a causa de la disponibilidad del material de partida. La presente
invención ahora proporciona el suministro de células B expandidas
para tales propósitos.
Las células B proliferadas, diferenciadas o no,
pueden servir como fuente de mRNA que codifica toda o parte de una
molécula de anticuerpo. A causa de la cantidad limitada de mRNA que
codifica un anticuerpo que se produce por una célula B, y la
naturaleza policlonal y el número clonal limitado de células B
encontrado en un huésped mamífero, es difícil obtener cantidades
suficientes de un mRNA que codifica un anticuerpo deseado a partir
de células B simples para el uso en técnicas de producción de
anticuerpos seleccionados. Proporcionando un método para la
proliferación y diferenciación de células B, la presente invención
proporciona una fuente de material de partida que un experto puede
usar para obtener mRNA que codifica un anticuerpo.
Además, un experto puede identificar células B
que reaccionan con antígenos específicos para más usos. Antes de
ocuparse del diseño del anticuerpo, es preferible determinar la
especificidad (que antígeno se reconoce) del anticuerpo producido
por una célula B o un clon de célula B. Aunque los procedimientos de
PCR permiten aislar la secuencia de nucleótidos que codifica un
anticuerpo a partir de tan poco como una célula simple, se
requieren masas celulares de al menos 100 células para aislar y
caracterizar la naturaleza de un anticuerpo secretado. La presente
invención proporciona métodos para obtener dicho material.
Además del uso in vitro, el ligando Cd40
se ha descrito en la bibliografía puesto que proporciona una manera
de proliferar y activar células B en un huésped mamífero. En
general, condiciones patológicas que resultan en una supresión de
la proliferación y la activación de células B pueden ser tratadas
usando el ligando CD40 hdmb como se ha descrito hasta aquí.
Proporcionando a un mamífero con el ligando Cd40 hdmb, las
poblaciones de células pueden proliferar en un huésped a un nivel
mucho mayor que el encontrado con formas del ligando CD40 hdmb
previamente producidas. Además, el ligando CD40 hdmb se puede usar
para proliferar y/o diferenciar células B in vitro que luego
pueden ser devueltas volviendo al huésped que ellos eliminaron a
partir de u otro huésped compatible. Tal procedimiento permite la
proliferación de células B fuera del huésped, reduciendo el riesgo
de efectos negativos de terapéuticos in vivo.
Al proporcionar el ligando CCD40 hdmb a un
paciente, la dosis del agente administrado variará dependiendo de
variaos factores como la edad del paciente, peso, altura, sexo,
condición médica general, historial médico previo, etc. En general,
se desea proporcionar al receptor con una dosis del agente que está
en el rango de alrededor de 1 pg/kg a 10 mg/kg (peso corporal del
paciente), aunque se puede administrar una dosis inferior o
superior.
La dosis terapéuticamente efectiva puede ser
disminuida usando la composición como se describe en combinación
con otro agente que tiene actividad
inmuno-estimulatoria (tal como, por ejemplo,
IL-4, IL-14, un antígeno
específico, o un anticuerpo anti-inmunoglobulina).
Como se usa aquí, dos o más compuestos se dice que se administran
"en combinación" con el otro cuando (1) efectos fisiológicos de
cada componente, o (2) las concentraciones de suero de cada
componente puede ser medida al mismo tiempo.
Los agentes como se describen aquí intentan
proporcionar a los sujetos receptores en cantidad suficiente para
incrementar los números de células B en el huésped. La
administración de los agente(s) como se describe hasta aquí
puede ser tanto para un propósito "profiláctico" o
"terapéutico". Cuando se proporcionan profilácticamente, los
agente(s) se proporcionan en avance a cualquier disminución
en el número de células B o niveles de anticuerpos en suero
presentes en el huésped. La administración profiláctica de los
agente(s) sirve para prevenir o atenuar cualquier
subsiguiente reducción en el número de células B. Cuando se
proporciona terapéuticamente, los agente(s) se proporcionan
a (o un poco después) el comienzo de una reducción en el número de
células B o anticuerpos presentes en una muestra de sangre. La
administración terapéutica de los compuesto(s) sirve para
atenuar cualquier reducción existente en el número de células B o
niveles de anticuerpo.
Los agentes como se describe hasta aquí se
administran al mamífero en una forma faramacéuticamente aceptable y
en una concentración terapéuticamente efectiva. Se dice que una
composición es "farmacológicamente aceptable" si su
administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Se dice
que este agente es administrado en una "cantidad terapéuticamente
efectiva" si la cantidad administrada es fisiológicamente
significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su
presencia resulta en un cambio detectable en la fisiología de un
paciente receptor.
Los agentes como se describen hasta aquí pueden
ser formulados de acuerdo con los métodos conocidos para preparar
composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que estos materiales,
o sus derivados funcionales, se combinan en la mezcla con un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados y su
formulación, incluyendo otras proteínas humanas, p.ej., albúmina
sérica humana, como se describe, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences (16eh ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA
(1980)). Con el fin de formar una composición farmacéuticamente
aceptable adecuada para una administración efectiva, tales
composiciones contendrán una cantidad efectiva de uno o más de los
agentes de la presente invención, junto con una cantidad adecuada de
vehículo.
Métodos farmacéuticos adicionales pueden ser
empleados para controlar la duración de la acción. Las preparaciones
de liberación controlada se pueden conseguir a través del uso de
polímeros para acomplejar o absorber uno o más de los agentes como
se ha descrito hasta aquí. La liberación controlada puede ejercerse
seleccionando macromoléculas apropiadas (por ejemplo poliésteres,
poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etilenviniloacetato,
metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o protamina, sulfato) y la
concentración de macromoléculas así como métodos de incorporación
con el fin de controlar la liberación. Otro posible método para
controlar la duración de la acción por preparaciones de liberación
controlada es incorporar agentes como los descritos hasta aquí en
partículas de un material polimérico como poliésteres,
poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de
etilenvinilacetato. Alternativamente, en lugar de incorporar estos
agentes en partículas poliméricas, es posible coger estos
materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de
coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas
de poli(metilmetacilato), respectivamente, o en sistemas de
liberación de fármacos coloidales, por ejemplo, liposomas,
albúmina, microesferas, microemulsiones, nanopartículas, y
nanocápsulas o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A., Ed., Mack,
Easton PA (1980).
Teniendo ahora la invención generalmente
descrita, lo mismo se entenderá más rápido a través de la referencia
a los siguientes ejemplos que se proporcionan mediante
ilustraciones, y no pretenden limitar la presente invención, a
menos que se especifique.
Aunque el papel de las linfocinas parece ser
inducir la diferenciación de células B y no en iniciar los eventos
de activación, ambos contacto celular y linfocinas parecen ser
esenciales para generar una respuesta de anticuerpos. Ya que el
contacto celular y las señales de linfocina ejercían efectos
distintos en las células B en reposo deben ser claramente
evaluadas. Adicionalmente, la identidad de las linfocinas que
soportaban la activación de células B, la diferenciación, y cambio
de isotipo no fueron claros. Porque el clon D10 de las células Th2
podrían proporcionar todo el contacto y linfocinas dependientes de
señales necesarias para las células B en reposo este clon
específico de antígeno se eligió para estudios iniciales y la
preparación de membranas plasmáticas. La activación independiente
de antígeno de células D10 se consiguió incubando células con tanto
la concanavalina A mitógena (Con A) como los anticuerpos
anti-CD3 adsorbidos en las placas de plástico.
Después de recoger, las células se usaron para preparar vesículas
de membrana enriquecidas para membranas plasmáticas como se
describe en Brian, A. A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:564-568 (1988)), y el sobrenadante del cultivo se
usó como fuente de linfocinas Th2 por ultracentrifugación para
eliminar cualquier componente de membrana y absorber cualquier Con
A restante. Otros estudios han utilizado métodos similares para la
preparación de fracciones ricas en membrana plasmática. (Noelle
et al., J. Immunol. 146:1118-1124 (1991);
Sekita et al. Eur. J Immunol.18:1405-1410
(1998)).
Las membranas preparadas a partir de las células
Th D10 activadas inducían una fuerte proliferación de células B en
reposo pequeñas. La actividad estimulatoria se detectó al cabo de 3
horas de la activación de células Th con Con A y se obtuvo el pico
máximo de 6 horas antes de la declinación a bajos niveles. Estas
cinéticas seguida de cerca de la producción de linfocinas por las
mismas células, sugieren una vía regulatoria común para ambas
superficie celular y componentes estimulatorios de la célula B
secretados. (Hodgkin et al., J. Immunol.
145:2025-2034 (1990)) Además de la evidencia para un
vía de señalización común fue que la unión de inmunofilina a
fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, (Bram et al.,
Molec. Cell. Biol.13:4760-4769 (1993)) inhibían
tanto la secreción de linfocinas como la inducción de la actividad
estimulatoria de las células B (Hodgkin, P.D., and Kehry, M. R.,
Advances in Molec. Cell. Immunol. 1ª:127-160
Greenwich, CT:JAI Press, Inc. (1993)). Parecido a los resultados
anticipados de Stallcup et al. En las propiedades
inhibitorias no específicas de membranas plasmáticas, (Stallcup
et al., Cell.Immunol. 89:144-150 (1984)),
altas dosis de membranas de células Th activadas producían un
efecto inhibitorio no específico en la proliferación de células B
(Hodgkin et al., J. Immunol. 145:52025-2034
(1990)).
Una característica espectacular de la activación
de células B por membranas de Th fue que eran independientes del
antígeno y no restringidas al MHC. Siguiendo estas observaciones la
estimulación de la membrana de Th fue policlonal, induciendo más
del 70% de las células B de reposo al entrar en la fase S del ciclo
celular al cabo de 48 horas de la estimulación (Hodgkin et
al., J. Immunol. 145:2025-2034 (1990)). Además,
la actividad inducida pareció ser una molécula no descrita puesto
que no fue bloqueada por anticuerpos para moléculas candidatas
tales como el MHC de clase II, receptor de células T, CD4,
LFA-1, Thy-1, o CD28. Así, la señal
de contacto en ausencia de linfocinas apareció para liberar todas
las señales necesarias para la inducción de la síntesis de DNA de
células B policlonales.
Las células B estimuladas por las membranas de
las células Th no secretaban inmunoglobulinas a menos que el
sobrenadante que contenía linfocinas de células D10 se incluyera en
el cultivo. Notablemente, las cantidades de los isótopos mayores de
inmunoglobulinas producidas (IgM, IgG1, y IgE) parecidos a aquellos
generados por las células B estimuladas directamente por células
D10 intactas. Así, la activación independiente del antígeno de
células B por membranas de Th y linfocinas surgieron para
proporcionar todas las señales necesarias para inducir la
proliferación de las células B, cambio de clase de inmunoglobulinas,
y diferenciación a secreción de inmunoglobulinas (Hodgkin et
al., J. Immunol. 145:2025-20034 (1990); Noelle
et al., J. Immunol. 146:1118-1124
(1991)).
Los clones de las células Th pueden ser
categorizados por su perfil de secreción de linfocinas seguido de
la activación (Mosmann & Coffman, Annu. Rev. Immunol.
7:145-173 (1989)). Las células T Th1 únicamente
secretan IL-2 y IFN-\gamma y
generalmente son estimuladores pobres de la secreción in
vitro de inmunoglobulinas de las células B. Las células Th2
secretan IL-4 y IL-5 e inducen la
fuerte secreción de inmunoglobulinas a partir de células B. Las
diferentes capacidades para inducir la secreción de inmunoglobulinas
podría ser debida tanto a diferencias en las linfocinas secretadas
o a un deterioro de las células Th1 para generar ligandos apropiados
estimulatorios de la superficie celular. Para probar estas
posibilidades se prepararon las membranas a partir de seis clones
de células Th1 activadas diferentes. Cada fuerte proliferación
estimulada de las células B, y como con las membranas de Th2, las
membranas de Th1 solas no inducían la secreción de inmunoglobulinas
(Hodgkin et al., J. Immunol. 147:3696-3702
(1991)). Cuando los sobrenadantes de las células Th2 activadas se
añadieron a las membranas de Th1 los isotipos de inmunoglobulina
secretados por células B fueron idénticos a aquellos secretados
siguiendo la activación con membranas de Th2 y linfocinas de Th2.
Además, los sobrenadantes que contienen linfocinas de cada uno de
los clones de células Th1 fueron incapaces de inducir la secreción
de inmunogloblinas a partir de células B estimuladas con membranas
preparadas tanto de células Th1 como de Th2 (Hodgkin et al.,
J. Immunol. 147:3696-3072 (1991)). Por lo tanto
parece ser que el repertorio de linfocinas de las células Th1 y no
la incapacidad para proporcionar las señales dependientes del
contacto, hace que las células Th sean pobres estimuladores de
células B in vitro.
Ambas linfocinas de th2 Il-4 y
IL-5 jugaban un papel en efectuar la diferenciación
de la membrana de las células B activadas para secretar
inmunoglobulinas. La combinación de IL-4 y
IL-5 recombinantes reprodujeron la capacidad de los
sobrenadantes de Th2 para inducir la síntesis de IgM, IgG1, y IgE, y
los anticuerpos anti-IL-4
previnieron completamente la secreción de inmunoglobulinas (Hodgkin
et al., J. Immunol. 145:2025-2034 (1990);
Noelle et al., J. Immunol. 146:1118-1124
(1991)) (observaciones no publicadas). Las citoquinas que se
utilizan para la proliferación de células B humanas pueden ser
diferentes de aquellas usadas para la diferenciación de células de
ratón. Un estudio más detallado de la combinación de
IL-4 y IL-5 reveló que el efecto de
cada una de estas linfocinas era algo complejo.
IL-4 sola promovió la proliferación de células B
inducidas por las membranas de células Th (Hodgkin et al.,
J. Immunol. 145:2025-2034 (1990)).
IL-4 no fue esencial para las células B para entrar
a la fase S del ciclo celular, pero incrementó alrededor de 10 veces
la sensibilidad de las células B al estímulo de la membrana de Th.
Por lo contrario, otras linfocinas, incluyendo IL-5,
no tenían efecto en la proliferación inducida de la membrana de Th.
IL-4 sola también podría inducir las células B
estimuladas de la membrana para secretar inmunoglobulina (Hodgkin
et al., J. Immunol. 145:2025-2034 (1990)).
Sin embargo, hubo una disparidad en la marcada
dosis-respuesta; el incremento de la proliferación
de células B requirió 100 veces menos IL-4 que la
inducción de la secreción de inmunoglobulina. El efecto de
IL-5 pareció ser el de promover la capacidad de
IL-4 para inducir la diferenciación de células B
para la secreción de inmunoglobulinas, ejerciendo su mejor efecto a
bajas concentraciones de IL-4. También está clara la
incapacidad de IL-4 sola para inducir las células B
estimuladas con la membrana de Th1 para secretar de inmunoglobulinas
(Noelle et al., J. Immunol. 146:1118-1124
(1991); Hodgkin et al., J. Immunol.
147:3696-3702 (1991)) puede ser explicada por su
disparidad dosis-respuesta y por la presencia de
IFN-\gamma residual en las vesículas de la
membrana de Th1, puesto que las células B estimuladas por las
membranas de Th1 y IL-4 en presencia de
anti-IFN-\gamma sintetizan
grandes cantidades de inmunoglobulina (observaciones no
publicadas).
La capacidad del sistema de la membrana de Th1
para separar los distintos eventos en la activación de las células
B nos permitieron determinar cuando se requerían linfocinas para
inducir la secreción de inmunglobulinas. Depués de iniciar los
cultivos con las membranas de Th y añadir o eliminar el sobrenadante
de D10 varias veces encontramos que las linfocinas eran
críticamente requeridas durante un periodo de tiempo que
correspondía casi al periodo de proliferación de células B (Hodgkin
et al., Eur. J. Immunol. 24:239-246 (1994)).
Estos experimentos indicaron que la misión dependiente de
linfocinas para diferenciarse en una célula secretora de
inmunoglobulinas tenía lugar antes de la primera ronda de la
división celular. Además, el tiempo que las células fueron
expuestas a linfocinas durante la proliferación probablemente fue
para diferenciar la secreción de IgE. Los experimentos en curso
demostraron que primero aparecían las células secretoras de IgM en
cultivos el día 3 y precedían las células secretoras de IgG1 al
cabo de casi 24 horas. Las células secretoras de IgE aparecieron el
día 5 e incrementaron en número puesto que el número de células
secretoras de IgM fue disminuyendo.
Algunas características del mecanismo por el que
las moléculas activan las células B fueron descritas en estudios
originalmente diseñados para aislar bioquímicamente y reconstituir
las moléculas de la superficie celular de Th en las vesículas de la
membrana. La solubilización con detergente de las membranas de Th se
demostró originalmente que eliminaba la capacidad de estas
membranas para activar las células B en reposo. Sin embargo, un
fracción soluble podría ser usada para competir con la capacidad de
las membranas de Th intactas para estimular la proliferación de
células B (M.R.K. observaciones no publicadas). Como lavar las
membranas de Th con soluciones salinas 3M no tenía efecto en la
actividad (M.R.K. observaciones no publicadas) las moléculas que
activan las células B parecieron ser proteínas integrales de
membrana.
El carácter físico de las vesículas activas de la
membrana de Th se examinó ensayando la actividad de membrana en
varias ocasiones durante la preparación y después de la breve
sonicación. En paralelo con los ensayos biológicos, la microscopía
de transmisión de electrones se realizó en cada preparación de
membrana (Kehry et al., "Mechanisms of Lymphocyte
Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications,
Plenum Press New York (1992), pp.139-148). Se
encontró que las vesículas de membrana frescamente preparadas y
centrifugadas en sacarosa tenían baja actividad y eran mayormente
individuales y desagregadas. Después de la ultracentrifugación en
un pellet y resuspensión, estas vesículas tenían máxima actividad en
estimular la proliferación de células B y consistía en varios
agregados extremadamente grandes. De forma similar, la sonicación de
las vesículas de membrana activas reducía su actividad y producía
vesículas pequeñas desagregadas. La ultracentrifugación de
vesículas sonicadas restauró la actividad completa y produjo grandes
agregados (Khery et al., "Mechanisms of Lymphocite
Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications,
Plenum Press, New York (1992), pp. 139-148). Estos
resultados sugirieron que las vesículas de membrana de Th como la
actividad máxima de estimulación de células B de hecho eran
agregados de vesículas que serían capaces de interactuar en gran
medida con la superficie de las células B.
La unión y destino de las vesículas de membrana
de Th en cultivos con células B en reposo también se examinó. Las
células B podrían ser visualizadas por tinción con el anticuerpo
anti-B220 y, puesto que anti-CD4 no
bloqueaba la capacidad de las membranas de Th para activar las
células B, (Hodgkin et al., J. Immjnol.
145:2025-2034 (1990))
anti-CD-4 podría ser usado para
visualizar las vesículas de membrana de Th unidas a las células B.
Las membranas de Th agregadads en gran medida se unieron a las
células B durante 24 horas de cultivo, y la agregación de las
células B se indujo máximamente durante 72 horas. Aunque sobre el
curso de los 4 días (tiempo durante el cual tuvo lugar la
proliferación máxima de células B) las vesículas de la membrana de
Th se desagregaron, el contacto entre las membranas de Th y las
células B se mantuvo y no se observó internalización o cubierta de
las vesículas de membrana (Kehry et al., "Mechanisms of
Lymphocyte Activation and Immune regulation IV": Celluar
Communications, Plenum Press, New York (1992),
pp.139-148).
También se encontró que lavando las células B
estimuladas por las membranas de Th con un tampón helado que
contenía agentes quelantes de iones metálicos podrían inhibir la
estimulación funcional de las células B. Esto se usó para examinar
el tiempo de contacto membrana de Th-célula B
requerido para la inducción de la proliferación de células B. Las
membranas de Th se lavaron después de cultivarlas varias veces, y se
encontró que aunque el contacto se produjera pronto, se requería un
tiempo de contacto largo (24-36 horas) entre las
células B y las membranas de Th para inducir el crecimiento máximo
de las células B. Esto implicaba que las células B en reposo
requieren señalización continua en este periodo para conseguir la
inducción de la síntesis de DNA (Kehry et al., "Mechanisms
of Lymphocyte Activation and Immune Regulation IV": Cellular
Communications, Plenum Press, New York (1992),
pp.139-148). Así, las moléculas activadoras de
células B necesitaban en gran medida interactuar con la superficie
de las células B y proporcionar señales funcionales durante al menos
24 horas con el fin de llevar a las células B en reposo a
proliferar.
proliferar.
La caracterización inicial de las moléculas
activadoras de células B implicadas en la liberación de la señal de
contacto a las células B en reposo vino de estudios bioquímicos en
membranas activas de células Th (Hodgkin et al., J. Immunol.
145:2025-2034 (1990)). Empleando numerosos lavados,
proteolisis, y técnicas de solubilización con detergentes, se
encontró que las moléculas activadoras de células B se encontró que
eran proteínas de membrana integrales que requerían nuevo mRNA y
síntesis proteica para su expresión. En todos los respectos las
moléculas activadoras de células B eran linfocinas como los
componentes de la membrana de las células Th activadas: (Hodgkin
et al., J. Immunol. 145:2025-2034 (1990))
fueron sintetizadas de nuevo después de la activación de células
Th; su síntesis por células Th activadas fue rápida y transitoria; y
produjeron sus efectos sobre los tipos celulares de manera no
cognada. En el primer paso para identificar las moléculas
activadoras de las células B, Lederman et al. aisló un
anticuerpo a una molécula específica de las células Th que mostraba
todas las características citadas anteriormente (Lederman et
al., J Exp. Med. 175:1091-1101 (1992)). Una
aproximación simultánea consideró posibles candidatos para un
receptor expresado constitutivamente por moléculas activadoras de
células B sobre la superficie de células B en reposo. Varias líneas
de evidencia sugirieron que un receptor probable de células B para
la activación de células B era la molécula CD40. La estimulación de
células B humanas por anticuerpos para CD40 en presencia de
linfocinas parecieron reproducir varias de las características de
la activación de células B dependiente de Th, proliferación, y
diferenciación (Jabara et al., J. Exp. Med.
172:70-72 (1991)). CD40 pertenece a la familia del
receptor TNF cuyos miembros se caracterizan por dominios
extracelulares ricos en repeticiones de Cys. Por homología funcional
con el receptor TNF una investigación para un ligando soluble para
CD40 había estado en vías de ejecución (Clark, E.A., Tiss. Antigens
35:33-36 (1990)). Sin embargo, la actividad de los
anticuerpos anti-CD40 y la capacidad de estos
anticuerpos inmovilizados en el receptor Fc que expresan células L
para inducir el crecimiento a largo plazo de células B humanas
(Banchereau et al., Science 251:70-72
(1991)) hicieron posible la unión a la membrana del ligando para
CD40.
Varios laboratorios produjeron una forma soluble
de CD40 que unía el dominio extracelular de CD40 humano a la
porción Fc de la IgG1 humana (Franslow et al., J. Immunol.
149:655-660 (1992); Castle et al., J.
Immunol. 151:1777-1788 (1993)). Esta proteína de
fusión fue capaz de bloquear la activación de células B dependiente
de células Th (Castle et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA
89:6550-6554 (1992)) y se usó para identificar y
clonar un ligando para CD40 (Armitage et al., Nature
357:80-82 (1992)). El ligando CD40 se identificó
como una glicoproteína de PM 33.000-35.000 que no
se asociaba covalentemente con otras proteínas y se expresaba en
células T activadas. Cuando el ligando recombinante CD40 se expresó
en la superficie de los fibroblastos, fue capaz de estimular la
proliferación de células B, a pesar de que los niveles eran
relativamente bajos (Armitage et al., Nature
357:80-82 (1992)). Concurrentemente, los anticuerpos
se produjeron de tal manera que reconocían ambas moléculas
activadoras de células B humanas (Lederman et al., J. Exp.
Med. 175:1091-1101 (1992)) y de ratón (Noelle et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6550-6554
(1992)). Estos anticuerpos tenían la propiedad de bloquear los
eventos de la activación de las células B dependientes de células Th
y se demostró que reconocen el ligando para CD40.
El ligando CD40 tiene todas las propiedades de
las moléculas activadoras de células B y de una linfocina asociada
a la membrana (Farrah & Smith, Nature 358:26 (1992)). La mayoría
de características estructurales halladas del ligando CD40 son su
homología con TNF-\alpha y
TNF-\beta (Farrah & Smith, Nature 358:26
(1992); Smith, Cell 76:959-962 (1994)) y su
orientación probable como una glicoproteína de membrana de tipo 2.
La regulación de la expresión del gen del ligando CD40 en los
clones de células Th se encontró que era similar a la regulación del
gen de IL-2, (Castle et al., J. Immunol.
151:1777-1788 (1993) otra vez sugiriendo que el
ligando CD40 es un miembro de una nueva clase de linfocinas
asociadas a la membrana. Esto está apoyado por el clonaje reciente
de los ligandos de la superficie celular relacionados con los otros
miembros de la familia del receptor TNF., CD27 (Goodwin et
al., Cell 73:447-456 (1993)) y Cd30 (Smith et
al., Cell 73:1349-1360 (1993)). El papel crítico
del ligando CD40 en la activación de células B dependiente de
células Th se ha demostrado por correlación con una enfermedad
inmunodeficiente, el síndrome hiper-IgM ligado al X,
a una falta de expresión del ligando CD40 funcional en células Th.
Los resultados defectuosos de una variedad de mutaciones en el gen
del ligando CD40 (Allen et al., Science
259:990-993 (1993); Aruffo et al., Cell
72:291-300 (1993); Korthauer et al., Nature
361:539-541 (1993); DiSanto et al., Nature
361:541-543 (1993)). Este síndrome se caracteriza
por la ausencia de células B secretoras de IgG, IgA e IgE
permutadas y una falta del anticuerpo correspondiente.
Estudios recientes de varias formas de ligando
CD40 recombinante humano y de ratón han incrementado nuestra
comprensión de los requerimientos de las células B en reposo para la
inducción de los eventos de la activación y proliferación. Como una
proteína de fusión con el dominio extracelular de CD8\alpha, se ha
encontrado que el ligando CD40 soluble tiene una actividad de nivel
bajo para estimular la proliferación de células B (Lane et
al., J. Exp. Med. 177:1209-1213 (1993);
Hollenbaugh et al., EMBO J. 11:4313-4321
(1992)). En ausencia de la interacción externa el ligando CD40
soluble actuó primariamente como un coestimulador de la
proliferación de células B en conjunción con ésteres de forbol,
anti-CD20, o anti-\mu (Lane et
al., J Exp. Med. 177:1209-1213 (1993);
Hollenbaugh et al., EMBO J. 11:4313-4321
(1992)). Hemos observado que la proteína de fusión ligando CD40 –
CD8 es capaz de conducir la proliferación de células B en reposo
solamente después de la interacción con anti-CD8 o
cuando se usa como coestimulador con linfocinas Th2 (B. Castle and
M.R.K., Sem. Immunol. 6:287-294 (1994)) o
interacción en la superficie de IgM o IgD (Snapper, C.M. et
al., J. Immunol. 154:1177-1187 (1995)). Como
CD40 soluble no es monomérico (B. Castle and M.R.K., observaciones
no publicadas), ésto implica que las células B en reposo requieren
un grado alto de interacción CD40 para la inducción de la
proliferación. Adicionalmente, IL-4 parece ser que
incrementa la sensibilidad de las células B en reposo a bajos
niveles de interacción CD40, como se ha encontrado usando
anticuerpos anti-CD40 (Clark, E.A., Tiss. Antigens
35:33-36 (1990); Rousset et al., J. Exp.
Med. 173:705-710 (1991); Gordon et al., Eur.
J Immunol. 17:1535-1538 (1987)). Se han encontrado
respuestas similares usando IL-4 y anticuerpos
anti-\mu (Hodgkin et al., Cell. Immunol.
134:14-30 (1991)). Así, bajo condiciones que
inducen la interacción extensiva, el ligando CD40 parece ser
suficiente para activar las células B en reposo. Bajo condiciones
de interacción subóptima, el ligando CD40 actúa como un
coestimulador con linfocinas u otras moléculas de la superficie de
las células B. Tales condiciones de activación B son similares a
aquéllas inducidas por células Th normales que quedan para
ser
determinadas.
determinadas.
La capacidad de las linfocinas para coestimular
la proliferación de las células B con el ligando CD40 soluble
proporciona una explicación de una discrepancia en los efectos de
IL-4 sobre la proliferación de células B inducidas
por las membranas Th (Hodgkin et al., J. Immunol.
145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J.
Immunol. 146:1118-1124 (1991)). En un estudio, se
encontró que las membranas de Th eran capaces de estimular el
incremento en la síntesis de RNA de células B, pero requerían la
adición de IL-4 para efectuar la síntesis de DNA
(Noelle et al., J. Immunol. 146:1118-1124
(1991)). En un estudio diferente, se encontró que las membranas Th
eran capaces de estimular la proliferación de células B en ausencia
de linfocinas añadidas, aunque IL-4 promovía
significativamente la proliferación de células B (Hodgkin et
al., Immunol. 145:2025-2034 (1990)). Ahora se
sabe que la forma recombinante de la membrana del ligando CD40 sola
es capaz de estimular la proliferación de células B (Armitage et
al., Nature 357:80-82 (1992)) (ver más abajo).
Parece ser que los métodos usados para preparar las membranas de Th
en los dos estudios pueden haber diferido de tal manera que en un
caso, donde un protocolo de homogenización diferente se realizó en
células Th activadas, (Noelle et al., J. Immunol.
146:1118-1124 (1991)) pueden haber resultado menos
vesículas más pequeñas. (Éstas serían análogas a las vesículas
sonicadas de la membrana de Th descritas más arriba (kehry et
al., "Mechanisms of Lymohocyte Activation and Immune
Regulation IV": Cellular Communications, Pleum Press, New York
(1992), pp.139-148) o el ligando CD40 soluble y
requerían la coestimulación para inducir la proliferación de las
células B.
El ligando CD40 también ha sido expresado
transitoriamente como la forma de membrana en fibroblastos. Aunque
este material también es suficiente para inducir la proliferación de
células B, la extensión de la respuesta está en gran medida
disminuida puesto que se obtenía por células Th intactas (Armitage
et al., Nature 357:80-82 (1992); Grabstein
et al., J immunol. 150:3141-3147 (1993)). En
presencia de las linfocinas apropiadas y el ligando CD40
recombinante de la membrana, tiene lugar la diferenciación de las
células B (Grabstein et al., J. Immunol.
150:3141-3147 (1993); Armitage et al., J
immunol. 150:3671-3680 (1993); Spriggs et
al., J. Exp. Med. 176:1543-1550 (1992);
Maliszewski et al., Eur. J. Immunol.
23:1044-1049 (1993)). Sin embargo, parece que haya
algunas diferencias en los requerimientos de linfocinas entre las
células B estimuladas con las células Th y el ligando CD40
recombinante (Grabstein et al., J. Immunol.
150:3141-3147 (1993); Armitage et al., J.
Immunol. 150:3671.3680 (1993)). Estudios recientes también han
demostrado una discrepancia entre el nivel de expresión del liando
CD40 y la capacidad de las células Th para dirigir la proliferación
de las células B (Castle et al., J. Immunol.
151:1777-1788 (1993); Roy et al., J.
Immmunol. 151:2497.2510 (1993)). Parece que el ligando nuevamente
sintetizado en células Th no es completamante competente para
liberar la señal de contacto a las células B en reposo. Pueden
haber algunos requerimientos para las asociaciones con otras
proteínas de superficie de las células Th (es decir el
coestimulador de moléculas activadoras de células B) o para el
ajuste del ligando CD40 nuevamente sintetizado consigo mismo o con
el citoesqueleto (Castle et al., J. Immunol.
151:1777-1788 (1993)). Es posible que una cierta
densidad del ligando CD40 podría ser crítica en inducir respuestas
máximas de células B. A partir de estos estudios parece ser que
moléculas activadoras de células B adicionales pueden quedar para
descubrir.
Las características del ligando CD40 como una
molécula activadora de células B también son consistentes con la
incapacidad para reconstituir la actividad proliferativa de las
células B después de la solubilización con detergentes de las
membranas de las células Th (descrito arriba). Las homologías que el
ligando CD40 comparte con TNF-\alpha y
TNF-\beta están restringidas a regiones de
hoja-\beta particulares de las moléculas TNF que
están implicadas en formar una estructura asociada trímera (Farrah
& Smith, Nature 358:26 (1992)). Esto implica que una estructura
cuaternaria nativa del ligando CD40 de la membrana puede ser un
trímero. Como el ligando CD40 no se une asimismo con un disulfuro,
se puede esperar que esta estructura se disocie bajo la
solubilización con un detergente y que solamente se regenere bajo
condiciones muy específicas. Además si se requieren asociaciones no
covalentes con otras proteínas de membrana de las células Th o
coestimuladores para inducir la interacción de la superficie de las
células B para una respuesta máxima de proliferación, éstos pueden
ser rápidamente disociados bajo la solubilización con
detergente.
detergente.
La activación y proliferación de las células B en
el bazo tiene lugar en dos sitios, el foco proliferativo y el
centro germinal. Para iniciar el foco, que primero son detectables 2
o 3 días después de la inmunización, la célula B estimulada por el
antígeno migra al área de la vaina linfoide periarteriolar externa
rica en células T (VLPA) de la pulpa blanca esplénica (Kupfer &
Singer, J. Exp. Med. 170:1697-1713 (1991)). Si el
contacto se hace con una célula T apropiada, tiene lugar la
proliferación de ambas células T y B y las células B permutan y
secretan subclases de IgG. También pueden migrar a lo largo de las
arteriolas terminales hacia la pulpa roja, posiblemente saliendo
del bazo (Van Rooijen, N., Immunol. Today 11:436-439
(1990)). La mayoría de los anticuerpos primarios en una respuesta
inmune se originan en las células B en ese foco (Tsiagbe et
al., Immunol. Rev. 126:113-141 (1992)). La
respuesta del centro germinal se inhibe unos días después de la
formación del foco. Las células B del centro germinal son
posiblemente derivadas de las células B activadas en el foco (Jacob
& Kelose, J. Exp. Med. 176:679-687 (1992)). El
centro germinal es un sitio de proliferación intensa de células B
necesaria para la generación y selección de células B que produzcan
anticuerpos hipermutados con una afinidad superior.
El mecanismo de la activación de las células B,
reproducido in vitro por las membranas de Th y linfocinas,
se parece estrechamente al mecanismo de activación de células B en
el foco primario proliferativo visto in vivo (Kehry, M.R.,
and Hodgkin, P.D., Sem. Immunol. 5:393-400 (1993)).
Estudios inmunohistoquímicos elegantes recientes de la localización
in situ del ligando CD40 en órganos linfoides de ratones
inmunizados son consistentes con esta conclusión. El ligando CD40
solamente se encontró en células T en la región VLPA externa o
asociadas a las arterias terminales (Van der Eertwegh et
al., J. Exp. Med. 178:1555-1656 (1993)).
Adicionalmente la cinética de aparición del ligando CD40 se
correlacionó con la de formación del foco en lugar de la cinética
de formación del centro germinal. De hecho no se observó ningún
ligando CD40 en los centros germinales.
A causa de que no ha sido posible mantener las
células B no transformadas normales vivas in vitro durante
periodos largos de tiempo, (Tish et al., Immunol. Today
9:145-150 (1988)) los sistemas in vitro
existentes para estudiar las respuestas de las células B utilizan
células B recién aisladas del bazo, o de la sangre periférica.
Estas poblaciones de células B son inherentemente diferentes y
heterogéneas, y esta variabilidad puede ser la responsable de
muchos resultados experimentales erróneos, no sólo entre diferentes
laboratorios, sino que también entre estudios de células B humanas
y de ratón. No ha sido posible establecer líneas de células B que
sean análogas a los clones de células T (Tish et al.,
Immunol. Today 9:145-150 (1988)). En la media, las
células B cultivadas permanecen vivas durante menos de dos días en
ausencia de estimulación. Una vez activadas in vitro por las
células Th, las células B parecen experimentar 2 o 3 rondas de
división celular, y cuando las linfocinas de Th2 están presentes se
diferenciarán para secretar el anticuerpo (Hodgkin et
al.,Eur. J. Immunol. 24:239-246 (1944)). Sin
embargo, después del periodo de proliferación inicial, tiene lugar
la muerte extensiva de células B, con lo que la viabilidad real
después de 7 días puede ser menos del 10% (Hodgkin et al.,
Eur. J. Immunol. 24:239-246 (1994)). Esto ha hecho
que sea imposible establecer sistemas in vitro para estudiar
algunos de los aspectos pobremente comprendidos de la respuesta de
las células B: por ejemplo, las señales que generan células B de
memoria y mecanismos moleculares que conducen mutación somática y
selección de células productoras de anticuerpos de alta afinidad.
Un sistema que utilizó IL-4 y anticuerpos
anti-CD40 inmovilizados en los fibroblastos
positivos del receptor Fc para que crecieran células durante
periodos largos de tiempo (Rousset et al., Science
251:70-72 (1991); Galibert et al., J Immunol.
152:22-29 (1994)) ha sido la aproximación más
cercana a la línea de células B. Sin embargo, el tiempo de
duplicación celular fue lento, (Galibert et al., J. Immunol.
152:22-29 (1994)), y los requerimientos para
IL-4 generaron células productoras de anticuerpo en
el cultivo heterogéneo (Banchereau et al., Science
251:70-72 (1991)).
La construcción y el aislamiento de un vector
baculoviral recombinante que dirige la expresión del ligando CD40
de ratón unido a la membrana fue como se describe a continuación. El
vector de transferencia usado en este estudio es un derivado del
plásmido ph_{\gamma 1}360, una donación del Dr. Charles Has y el
Dr. J. Donald Capra (Southwestern Medical Centre, Dallas, TX)
(Hasemann and Capra, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:3942-3946 (1990). Los plásmidos que contenían el
cDNA que codifica el ligando CD40 de ratón y el ligando CD40 de
ratón se conocen en el campo. Para insertar el cDNA del ligando
CD40 en el vector de transferencia, se utilizó mutagénesis por PCR
para introducir un sitio NcoI exactamente coincidiendo con el codón
de iniciación ATG del cDNA del ligando CD40 y un sitio Xba I
inmediatamente distal a la traslación del codón de terminación. El
DNA amplificado inicialmente se clonó en PTZ19R y luego se subclonó
en ph_{\gamma 1}360 después de que el cDNA de la cadena pesada de
la inmunoglobulina fuera eliminada por la digestión con Nco I/Xba I.
El plásmido resultante se cotransfectó con DNA viral AcMNPV
mediante el procedimiento de precipitación de CaCl_{2}. Se
aislaron placas de oclusión virales negativas y la placa se
purificó usando técnicas estándares (Summers and Smith, Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin (1987), p.
1555).
1555).
La gran cantidad de virus stock crecido en
células SF9 usando técnicas estándar (O'Reilly et al.,
Baculovirus expression vectors, a laboratory manual, W.H.
Freeman and Company, New York, New York (1992)) se usó para
infectar células SF9 crecidas en un cultivo en suspensión durante 66
h a 27ºC (MO1 de 100). Las células SF9 infectadas se recogieron por
centrifugación, se lavaron dos veces con solución salina de
Rinaldini en hielo frío (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) que
contenía 1,0 mM CaCl_{2}, y las membranas se prepararon como se
ha descrito (Hodgkin et al., J. Immunol. 145:2025 (1990);
Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:564 (1988); Maeda et
al., Biochim. Biophy. Acta 731:115 (1983)). Las membranas, el
ligando CD40 de ratón hdmb designado, se lavaron y se
resuspendieron en PBS de Dulbecco y se almacenaron con nitrógeno
líquido. La concentración total de proteínas de membrana se
determinó para cada preparación (ensayo Micro BCA, Pierce). Las
cantidades de membranas fueron tituladas en un ensayo de
proliferación de células B (ver abajo).
Preparación de Células B Humanas. Se
prepararon células B altamente purificadas como se describe (Amoroso
and Lipsky, J. Immunol. 145:3155 (1990)). Brevemente, se prepararon
PBMC a partir de sangre heparinizada de adultos sanos por
centrifugación sobre gradientes de diatrizoato sódico/ficoll
(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ). PBMC se resuspendieron en suero
libre de RPMI 1640 y se trataron con 5 mM metiléster
L-leucina HCl durante 45 minutos a temperatura
ambiente con el fin de agotar los monocitos y las células natural
killer. Las células no reestablecidas que consisten mayormente en
células B se recogieron y se trataron con 100 \muM metiléster
L-leucil-leucina durante 15 minutos
a temperatura ambiente para agotar cualquier resto de células NK y
monocitos (Thiele and Lipsky, J. Immunol. 136:1038 (1986)).
Siguiendo este tratamiento, las células se dispusieron en forma de
roseta otra vez y las células formadoras de SRBC dispuestas en forma
de roseta se eliminaron por centrifugación. Las células B
preparadas de esta manera fueron más del 90% puras como se ha
indicado por tinción con mAb de CD20 o CD19. Alternativamente, las
células B pueden ser purificadas usando glóbulos magnéticos
cubiertos con anti-CD19 como se ha descrito por el
fabricante (Dynabeads from Dynal).
Preparación de células B de ratón. Las
células B de ratón se prepararon como se describe por Hodgkin et
al., J. Immunol. 145:2025-2034 (1990).
Citoquinas. El sobrenadante de las células
D10.G4.1 activadas se obtuvo como previamente se describió (Hodgkin
et al., J. Immunol. 145:2025 (1990)). Brevemente, las células
D10 Th2 crecidas en cápsulas de petri durante 3 semanas
post-estimulación se recogieron, se lavaron dos
veces en medio careciente de IL-2, y se estimularon
con 5 \mug/ml de concavalina A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
durante 9 h. Después de la eliminación de las células por
centrifugación a baja velocidad, el sobrenadante se centrifugó a
95.000 X g, se filtró a través de una membrana de 0,22 \mum y se
absorbió en una columna de manosa-agarosa
(E-Y Laboratories, San Mateo, CA). El sobrenadante
D10 se tituló en la proliferación de células B y en ensayos de
producción de anticuerpos y se usó a una dilución final de 1/100.
Adicionalmente, las citoquinas producidas por otros tipos celulares,
incluyendo pero no limitado a células dendríticas, células
dendríticas foliculares, y otras células presentadoras de antígeno,
en presencia o ausencia de antígeno específico, pueden ser incluidas
en los cultivos.
Condiciones del cultivo. Las células B
crecieron en medio de células B (BCM): suero fetal bovino (Hyclone
caracterizado); 10 mM Hepes pH 7,3; L-glutamina;
Penicilina/Estreptomicina; aminoácidos no esenciales; piruvato
sódico; y 5 x 10^{-5} M 2-mercaptoetanol, en
RPMI-1640. El medio y los suplementos 100X se
obtuvieron de Gibco.
Para experimentos de crecimiento de larga durada,
se cultivaron células B en placas de 96 pocillos microtituladas de
fondo en V (001-010-2701, Dynatech
Laboratories, Inc., Chantilly, VA) en 150 \mul de BCM a 37ºC, 5,5%
de CO_{2}. Inicialmente, el ligando CD40 hdmb de ratón era
(concentración final 3 \mug/ml) con o sin D10 sn (dilución final
1/100) se añadieron en 100 \mul de BCM. Cada 48 horas las placas
se alimentaron con componentes de medio fresco como sigue. Las
placas se centrifugaron a 1600 rpm durante 7 minutos (centrífuga
GS-6KR, Beckman), el medio se aspiró dejando 15
\mul, y se añadió el medio fresco.
Medida de anticuerpos. Los sobrenadantes
de los cultivos se recogieron para ensayos de anticuerpos por
eliminación de 140 \mul de sobrenadante del cultivo de tres
pocillos de las muestras replicadas. Se volvieron a añadir los 140
\mul de BCM a los pocillos y se eliminaron 140 \mul de la
concentración final de anticuerpos. Estos pocillos no se usaron
más. Los niveles de IgM, IgG e IgE se midieron por ELISA
antígeno-específica como se ha descrito previamente
(Hodgkin et al., J. Immunol. 145:2025-2034
(1990; Hodgkin et al., Eur. J. Immunol.
24:239-246 (1994)). Los niveles residuales de cada
isotipo en cada pocillo después de reemplazarlos con medio fresco
(llevándolos al siguiente punto) se sustrajeron de cada valor.
Las células SF9 infectadas con un baculovirus
recombinante que contenía el ligando CD40 de ratón durante varias
veces (Figura 2). Un plasma enriquecido de fracción de membrana se
preparó y cada preparación de membrana se tituló en el ensayo de
proliferación de células B (2 x 10^{4} células B/pocillo durante
72 h). Usando la incorporación de un compuesto radiomarcado como un
marcador para la división celular, incorporación máxima de
^{3}H-TdR (pulso de 4h) se observó con membranas
preparadas a partir de células SF9 infectadas 66 h (ligando CD40
hdmb 66 h). Cuando el ligando CD40 hdmb se usó para estimular las
células B en presencia de D10 sn (1/100; sobrenadante que contiene
linfocinas a partir del clon de células T Th2 D10.G4.1 estimuladas
9h, Hodgkin et al., 1990), membranas plasmáticas a partir de
células SF9 infectadas 42 h, 66 h, y 90 h fueron equivalentes en su
capacidad para estimular células B (Figura 2B).
Para demostrar la respuesta de proliferación
observada que se midió por el ligando CD40 hdmb, las células B (2 x
10^{4}/pocillo) fueron estimuladas con una cantidad constante de
ligando CD40 hdmb (1/200) en presencia y ausencia de una proteína
de fusión CD40-IgG1 (Castle et al.,
J.Immunol. 151:1777-1788 (1993) (Figura 3).
Círculos completos, CD40-IgG incluido (35 \mug/ml
a la concentración más alta); cuadrados abiertos, no
CD40-IgG. La proliferación producida por el ligando
CD40 hdmb podría ser específicamente inhibida por
CD40-IgG, demostrando que la proliferación se
inducía por el ligando CD40 hdmb.
Para determinar los efectos de la densidad en la
proliferación celular, las células B se colocaron en placas de 96
pocillos (1 x 10^{4}/pocillo) con el ligando CD40 hdmb (1/80) y
D10 sn (1/100), Las células se contaron y el medio se reemplazó
cada 48 h. Los días 5 y 8 las células se resuspendieron y se
fraccionaron en 1/8 (Figura 4). En los triángulos completos, las
células no se fraccionaron; círculos completos, fracción 1/8 el día
5; cuadrados completos, fracción 1/8 el día 8; círculos abiertos,
fracción 1/8 multiplicada por 8; cuadrados abiertos, segunda
fracción 1/8 multiplicada por 64;. A concentraciones celulares de
entrada sobre 5 x 10^{4}/ml, fue necesario reducir el número de
células para obtener la proliferación máxima.
Para probar varios formatos de cultivo, las
células B se colocaron en placas de 96 pocillos tanto de fondo
plano como de fondo en V (1 x 10^{3} células/pocillo). Las células
se incubaron con el ligando CD40 hdmb y D10 sn (++) ó solamente con
el ligando CD40 hdmb (+-), Las células se contaron y el medio se
eliminó y se reemplazó cada 48 h (Figura 5). Cuadrados completos,
el ligando CD40 hdmb y D10 sn en placa de fondo plano; círculos
abiertos, ligando Cd40 hdmb y D10 sn en placa de fondo en V;
cuadrados abiertos, ligando Cd40 hdmb en placa de fondo plano;
círculos completos, ligando CD40 hdmb en placa de fondo en V. Como
se muestra en la Figura 5 cuando las linfocinas no estaban
presentes, números más altos de células B se recuperaron de las
placas con pocillos de fondo en V.
Para ensayar la secreción de anticuerpos de
células B proliferadas y diferenciadas, las células B se colocaron
en placas de 96 pocillos de fondo en "V" (1 x10^{3}
células/pocillo) con el ligando CD40 hdmb (1/300) y D10 sn (1/100).
Cada 48 h las células se eliminaron, se contaron, y el medio no se
reemplazó (Figura 6A). Cuadrados abiertos, número total de células
viables; círculos completos, fracción de células que fueron
viables.
El medio de los pocillos replicados se eliminó y
la concentración de anticuerpo se midió por ELISA cuantitativa
(Figura 6B). Círculos completos, IgM; cuadrados completos, IgG1;
triángulos completos, IgE. Concentraciones de anticuerpo acumulado
se proporcionan en ng/ml. El número máximo de células tuvo lugar
aproximadamente el día 8 (50 veces más de incremento en el número
de células) mientras la mayoría de la producción de IgM tuvo lugar
entre los días 8 y 12 (Figura 6B).
Para determinar el efecto del emplazamiento de
medio en la proliferación y diferenciación de células B, las
células B se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo en "V"
(1 x 10^{3} células/pocillo) con el ligando CD40 hdmb (1/300) y
D10 sn (1/100). Cada 48 h, las células se eliminaron y se contaron y
el medio viejo se eliminó y se colocó en placas con medio fresco
(Figura 7A). Cuadrados abiertos, número total de células viables;
círculos completos, fracción de células que fueron viables.
El medio de los pocillos replicados se eliminó y
la concentración de anticuerpos se midió por ELISA cuantitativa
(Figura 7B). Círculos completos, IgM; cuadrados completos, IgG1;
triángulos completos, IgE. Las concentraciones acumuladas de
anticuerpo se proporcionan en ng/ml. El número máximo de células
tuvo lugar aproximadamente el día 10 (200 veces más de incremento
en el número de células) mientras la mayoría de la producción de IgM
tuvo lugar entre el día 8 y 22.
Para probar los efectos de un protocolo de
proliferación de pasos múltiples en la secreción de anticuerpos,
las células B se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo en
"V" (1 x 10^{3} células/pocillo) con el ligando CD40 hdmb
(1/300) y D10 sn (1/100) (Figura 8). Cada 48 h las células se
eliminaron y se contaron y el medio viejo se eliminó y se reemplazó
con medio fresco (Figura 8); +-, medio que contiene el ligando CD40
hdmb; - -, medio que no contiene adiciones; ++, medio que
contiene el ligando CD40 hdmb y D10 sn;. Cuadrados abiertos, número
total de células viables; círculos completos, fracción de células
que fueron viables.
El medio de los pocillos replicados se eliminó y
la concentración de anticuerpos se midió por ELISA cuantitativa.
Los círculos completos, IgM; cuadrados completos, IgG1; triángulos
completos, IgE. Las concentraciones acumuladas de anticuerpo se
proporcionan en ng/ml (Figura 8). El número máximo de células tuvo
lugar el día 18 aproximadamente (100 veces más de incremento en el
número de células) mientras la mayoría de la producción de IgM tuvo
lugar entre los días 16 y 34.
Para determinar la frecuencia que las células B
responden al ligando CD40 hdmb, se colocaron las células B en
placas 96 pocillos de fondo en "V" de a 1, 3, 10, y 30
células/pocillo con el ligando CD40 hdmb (1/300) o el ligando CD40
(1/300) y D10 sn (1/100) (Figura 9). Después de 6 días, las células
se resuspendieron, se transfirieron a las placas de fondo plano, y
se evaluaron por la presencia de células viables divididas. En
cultivos estimulados con el ligando CD40 hdmb y D10 sn,
aproximadamente crecieron la mitad de las células B.
Para probar el efecto proliferativo del ligando
CD40 hdmb en células B humanas, las células B humanas se aislaron y
crecieron como se ha descrito para las células de ratón y antes
(Figura 10). Las células B humanas se expandieron al menos 100
veces y la producción de Ig se observó el día
10-14.
En el estudio previo, se estableció un método
para proliferar y diferenciar linfocitos B normales de ratón. El
método implicaba el uso del ligando CD40 recombinante de ratón hdmb
expresado en células de insecto en combinación con una fuente de
citoquinas capaces de soportar la diferenciación de células B. Bajo
estas condiciones, los linfocitos B de ratón se expandieron
\sim250 veces más y podrían crecer a una alta frecuencia como
clones individuales (1 en 2 células respondiendo). Todos los clones
de las células B que se expandieron también diferenciados para
secretar altos niveles de anticuerpos IgM y/o IgG. El propósito del
presente estudio es demostrar que se puede obtener una expansión y
diferenciación celular similar usando linfocitos B humanos normales
usando los métodos descritos hasta aquí. Usando los métodos
presentes, las células B humanas dieron una respuesta proliferativa
eficiente al ligando CD40 recombinante humano hdmb expresado en
células de insecto en combinación con citoquinas humanas. Fue
posible que crecieran clones de células B humanas con alta
frecuencia y obtener la diferenciación hasta la secreción de
inmunoglobulinas.
Anticuerpos y reactivos.
Anti-CD3 humano monoclonal (64.1) se produjo por el
Dr. John Hansen (Fred Hutchison Cancer Center, Seattle, WA). El
anti-CD3 humano monoclonal usado para cribar,
anti-CD8 humano, anti-CD14 humano,
anti-CD19 humano fueron adquiridos a partir de
PharMingen (San Diego, CA). Para cuantificar los niveles de
anticuerpo humano por ELISA, F(ab')_{2} de cabra
anti-IgM humana (purificado y conjugado con biotina)
y F(ab')_{2} de cabra anti-IgG humana
(específico de Fc) (purificado y conjugado con biotina), y
HRP-estreptavidina fueron de Jackson ImmunoResearch
(West Grove, PA). Para ensayos ELIPSOT en células B de ratón,
anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón fue de Zymed
(So, San Francisco, CA) y anticuerpo de cabra conjugado a biotina
anti IgM de ratón fue de Southern Biotechnology, Inc. (Birmingham,
AL). IgM, IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4 de mieloma humano purificado
usado como ELISA estándar se obtuvieron a partir del The Binding
Site, Ltd. (Birmingham, England). Se obtuvo hemocianina purificada
de lapa de forma ilícita (Imject KLH) fue de Pierce Chemical Co.
(Rockford, IL).
Citoquinas. IL-1a,
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-10, y IL-11 recombinantes humanas
se adquirieron de Genzyme (Cambridge, MA). Soluciones stock se
prepararon diluyendo cada una en medio de células B (BCM; ver
abajo), filtrando a 0,2 \muM, y almacenándolas a -80ºC.
Los sobrenadantes de las células T de sangre
periférica humana activada se obtuvieron como sigue. Las células
mononucleares de la sangre periférica después de la centrifugación
sobre Ficoll-Hypaque se cribaron secuencialmente en
placas cubiertas toda la noche con anti-CD14 (5
\mug/ml), anti-CD14 y anti-CD19
(2.5 \mug/ml cada uno), y anti-CD8 (5 \mug/ml).
El cribado fue en solución salina equilibrada de Hank, 55 FBS, 10 mM
HEPES, pH 7,3 a 4ºC durante 1 h. Las células no adherentes se
lavaron y se resuspendieron a 4 x 10^{6} células/ml en BCM
caliente [RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,3),
2 mM L-glutamina (GIBCO, Grand Island, NY), 0,1 mM
aminoácidos no esenciales (GIBCO), 1 mM piruvato sódico, 5 x
10^{-5} M 2-mercaptoetanol, y penicilina y
estreptomicina 100 U/ml de cada (GIBCO)]. Para la estimulación
anti-CD3, las células se colocaron en cápsulas de
cultivo de tejido cubiertas con 4 \mug/ml
anti-CD3 durante 48 h a 37ºC. Para la estimulación
con PHA/PMA, las células se incubaron con 2,5 \mug/ml de PHA y 10
ng/ml de PMA durante 2 h a 37ºC, se lavaron y se incubaron en BCM
recién preparado caliente durante 46 h a 37ºC. Después de la
eliminación de células por centrifugación a baja velocidad, los
sobrenadantes se centrifugaron a 100.000 X g, se filtraron a través
de una membrana de 0,2 \muM, y se almacenaron en alícuotas a
-80ºC.
Adicionalmente, las citoquinas producidas por
otros tipos celulares, incluyendo células dendríticas foliculares,
y otras células presentadoras de antígeno, en presencia o ausencia
de antígeno específico, pueden ser incluidas en los cultivos como
estímulo.
Crecimiento de baculovirus, infección de
células de insectos, y preparación de membranas. Un baculovirus
recombinante que codifica la longitud completa del ligando CD40
humano se construyó por técnicas estándar (O'Reilly, D.R.,
L.K.Miller, and V.A. Luckow.1992. Baculovirus expression vectors,
a laboratory manual. W.H. Freeman and Company, New York, New
York). Una gran cantidad de virus stock crecidos en células SF9
usando técnicas estándar (O'Reilly, D.R., L.K.Miller, and V.A.
Luckow.1992. Baculovirus expression vectors, a laboratory
manual. W.H. Freeman and Company, New York, New York) se usó
para infectar células SF9 crecidas en u cultivo en suspensión
durante 48 h a 27ºC (MOI de 1). Células SF9 infectadas se recogieron
por centrifugación, se lavaron dos veces con solución salina de
Rinaldini en hielo frío (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) que
contiene 1,0 mM CaCl_{2}, y las membranas se prepararon como se ha
descrito (Hodgkin et al., J. Immunol. 145:2025 (1990),
Brian, A.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:564. (1998), Maeda, T.,
et al., Biochim. Biophy. Acta 731:115 (1983)). Membranas,
ligando CD40 humano hdmb, se lavaron y se resuspendieron en PBS de
Dulbecco y se almacenaron bajo nitrógeno líquido. La concentración
total de proteínas de membrana se determinó para cada preparación
(Microensayo BCA, Pierce). Cantidades de membranas se titularon en
un ensayo de proliferación de células B (ver abajo).
Citometría de flujo. La expresión del
ligando CD40 en la superficie de células de insecto SF9 se
cuantificó por citometría de flujo. Las células SF9 infectadas
varias veces con un baculovirus recombinante para el ligando CD40
humano se lavaron en tampón FACS de insecto (solución salina de
Rinaldini que contenía 2% BSA y 0,2% azida sódica) y se reincubaron
30 minutos a 4ºC con 5 \mug/ml IgG1 no específica de ratón en
tampón FACS de insecto. Las células se tiñeron con 10 \mug/ml
CD40-IgG1 (Castle, et al., J. Immunol.
151:1777 (1993)) o IgG1 de control humano seguido por un anticuerpo
monoclonal biotinilado de ratón anti-IgG1 humano (10
\mug/ml; Zymed) y picoeritrina
(PE)-estreptavidina (20 \mug/ml; Jackson
immunoresearch). Toda la tinción fue en tampón FACS de insecto que
contenía 5 \mug/ml de IgG1 no específica de ratón. La
fluorescencia se analizó en un modo de registro de un único color
en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose,
CA).
Preparación de células B humanas. Se
incubaron células mononucleares humanas de la sangre periférica
obtenidas después de la centrifugación sobre
Ficoll-Hypaque se incubaron con biotinilado
anti-CD19 (CellPro, Bothell, WA), unido a glóbulos
conjugados a avidina (columna de CEPRATE LC-19;
CellPro), y se eluyeron de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las células eluidas se cribaron en cápsulas de petri
cubiertas toda la noche con 5 \mug/ml cada
anti-CD3 y anti-CD14. Las células no
adherentes (\sim1 X 10^{6}/100 ml de sangre) fueron el 84% al
93% de las células B puesto que se ensayó por tinción dual con
PE-anti-CD3 y
FITC-anti-CD19 y por tinción dual
con PE-anti-CD20 y
FITC-anti-IgM como se ha descrito
previamente (Kehry, et al., Cell. Immunol. 118:504 (1989)).
La fluorescencia se analizó en un modo de registro de dos colores en
un citómetro de flujo FACScan. Las células B también pueden
aislarse de la amígdala, bazo y médula ósea por técnicas similares
o por selección en un citómetro de flujo después de la tinción con
anti-CD19 o anti-CD20 o antígeno
específico marcado fluorescentemente.
Ensayos de Células B. Para estudios de
proliferación, las células B (entre 5 x 10^{3} y 1 x
10^{4}/pocillo) se incubaron durante 96 h a 37ºC con diluciones
en serie de membranas en 100 \mul BCM (placas Falcon 3072 de 96
pocillos). Las concentraciones finales de linfocinas recombinantes
usadas fueron 1 ng/ml IL-1\alpha, 5 ng/ml
IL-11, y 10 ng/ml cada una, IL-2,
IL-4, IL-6, y IL-10.
Durante las 6 últimas horas del cultivo, se añadió
[metil-1'2'-^{3}H]timidina
(120 Ci/mmol); Amersham, Arlington heights, IL) (1 \muCi/pocillo).
Los cultivos se recogieron en un recogedor celular automático de 96
pocillos (Tomtec, Orange, CT) para el contaje en centelleo
(Beckmann, Fullerton, CA). La medida del número de células viables
se realizó por contaje celular. Las células de los pocillos
triplicados se combinaron, se recogieron por centrifugación, se
resuspendieron en 50 \mug/ml de BCM, y se mezclaron con un
volumen equivalente de 0,4% de azul tripán en 0,85% NaCl. Las
células vivas se contaron bajo un hemocitómetro y se calculó un
número medio para los pocillos replicados.
Para experimentos de crecimiento celular de larga
durada, las células B (5 x 10^{2} o 1 X 10^{3}/pocillo) se
cultivaron en placas microtituladas de 96 pocillos de fondo en v
(001-010-2701, Dynatech
Laboratories, Inc., Chantilly, VA) en 150 \mul de BCM a 37ºC,
5,5% CO_{2}. El ligando CD40 hdmb y los sobrenadantes de las
células T que contenían linfocinas se añadieron a las
concentraciones indicadas; se añadieron linfocinas recombinantes a
las concentraciones citadas arriba. Los pocillos del cultivo se
alimentaron de los componentes del medio fresco los días indicadas
como sigue. Las placas se centrifugaron a 1600 rpm durante 7 min
(centrífuga GS-6KR, Beckman), el medio se aspiró
dejando \sim 15 \mul, y se añadió medio fresco (150 \mul).
Los niveles de IgM e IgG se midieron por ELISA
sándwich específico de isotipo como se ha descrito previamente
(Hodgkin, et al, Eur.J.Immunol.24:239 (1994)) usando los
reactivos que se han descrito. IgM humano monoclonal (50 ng/ml) y
mezclas equimolares de IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4 humanas monoclonales
(50 ng/ml en total) se usaron como estándares. Las muestras del
medio de cultivo (140 \mul/pocillo) se recogieron de los pocillos
replicados de células B creciendo.
Los ensayos ELIPSOT para detectar células
secretoras de anticuerpos específicos para antígenos fueron como se
han descrito previamente (Hodgkin et al., J. Immunol. 24:239
(1994), Czerkinsky, et al. J. Immunol. Methods 110:29
(1988)). Placas de 96 pocillos de fondo en filtro
Multiscreen-HA (Millipore, Bedford, MA) se cubrieron
con 5 \mug/ml de KLH toda la noche a 4ºC. Las placas que
contenían células B en crecimiento se centrifugaron y las células
se lavaron dos veces antes de resuspenderlas en 100 \mul de BCM
fresco. Las células de cada pocillo se transfirieron por duplicado
a las placas cubiertas de Multiscreen y se incubaron en 100 \mul
de BCM/pocillo durante 16 h a 37ºC. Las placas se desarrollaron
usando reactivos biotinilados de anti-IgM de ratón o
anti-IgG de ratón como se ha descrito previamente
(Hodgkin, et al., Eur. J. Immunol. 24:239 (1994)). Después de
parar la reacción, se dejó que los pocillos se secaran en la
oscuridad durante algunos días, y las paradas correspondientes a
anticuerpos IgM o IgG específicos se enumeraron bajo un microscopio
de disección.
La expresión óptima del ligando CD40 humano en
células SF9 de insecto se determinó por infección de células SF9
durante varias veces con un baculovirus recombinante y cuantificando
los niveles de expresión por citometría de flujo. La expresión del
ligando CD40 humano se encontró que era máximo después de 48 h de
infección. Una fracción de membrana plasmática enriquecida se
preparó a partir de células SF9 infectadas 48 h y usadas en los
subsiguientes experimentos (ligando CD40 humano hdmb). Las células B
humanas purificadas proliferaron eficientemente en respuesta al
ligando CD40 humano hdmb, y la respuesta se recogió incluyendo una
mezcla de IL-1a, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-10, y
IL-11 recombinantes humanas (Fig.11). En ausencia
del ligando CD40 humano hdmb las células B no se dividieron. (Fig
11).
Un análisis de la frecuencia de responder las
células B dispuestas al límite de dilución mostrado que después de
14 días, aproximadamente 1 de 2,5 células B crecieron en respuesta
al ligando CD40 humano hdmb y la mezcla de linfocinas humanas
recombinantes (Fig. 12B). Junto con la frecuencia de crecimiento,
esto implica que aproximadamente 1 de 28 células B que crecieron se
diferenciaron hasta secretear anticuerpos.
Puesto que la frecuencia del crecimiento clonal
de las células B humanas en respuesta al ligando CD40 humano hdmb
fuera muy similar al de las células B esplénicas de ratón, las
posibilidades para diferir frecuencias de secreción de
inmunoglobulinas entre las dos especies de células B fueron la
fuente de células B (sangre periférica frente al bazo) o las
linfocinas requeridas (linfocinas recombinantes frente al
sobrenadante de células T ayudantes activadas). Para optimizar las
linfocinas requeridas para la diferenciación de células B, los
sobrenadantes se prepararon a partir de células T de sangre
periférica activadas durante 48 h tanto anti-CD3
inmovilizado como un pulso de PHA y PMA. Los sobrenadantes de las
células T humanas se probaron por la capacidad de soportar la
diferenciación de células B humanas estimuladas por el ligando CD40
humano. Los sobrenadantes se probaron en presencia o ausencia de
linfocinas humanas recombinantes adicionales. Las linfocinas
secretadas por células T activadas de PMA y PHA no soportaron la
diferenciación de células del ligando CD40 humano hdmb y fueron
inhibitorias cuando se añadió a una combinación de
IL-2, IL-4, IL-6 y
IL-10 recombinantes humanas (Fig.13). Por lo
contrario, las linfocinas secretadas por células T activadas con
anti-CD3 soportaron la diferenciación de células B
estimuladas por el ligando CD40 humano hdmb así como linfocinas
recombinantes. Niveles ligeramente inferiores de IgM y altos
niveles de IgG se produjeron por células B estimuladas por el
ligando CD40 humano hdmb y sobrenadantes anti-CD3
relativos a células estimuladas por el ligando CD40 humano hdmb y
sobrenadantes anti-CD3 relativos a células
estimuladas con el ligando CD40 humano hdmb y IL-2,
IL-4, IL-6, y IL-10
(Figura 13). Las cantidades de IgM y IgG producidas por células B
estimuladas por el ligando CD40 humano hdmb incrementaron en una
tendencia dependiente de la dosis con incremento de las cantidades
de linfocinas secretadas por células T activadas
anti-CD3 (Figura 14). Adicionalmente, la producción
de IgM y IgG pareció ser dependiente de la presencia de linfocinas
y fue indetectable en presencia del ligando CD40 humano hdmb solo.
Los niveles de la producción de inmunoglobulinas humanas obtenidas
en el experimento representado en las Figuras 13 y 14, aunque 10
veces inferior que las producidas por células B esplénicas de ratón
estimuladas bajo condiciones análogas, son similares a los niveles
de inmunoglobulinas humanas descritas en la bibliografía por ser
secretadas por 20-100 veces más de células B humanas
(Rousset, et al., J. Exp. Med. 173:705 (1991), Armitage,
et al., J. Immunol. 150:3671 (1993), Nonoyama, et al.,
J. Exp. Med. 178:1097
(1993)).
(1993)).
Un objetivo de este trabajo es expandir los
clones de células B específicas para un antígeno por el subsiguiente
aislamiento del anticuerpo específico para un antígeno. Para
ensayar la frecuencia de células B específicas para un antígeno, se
colocaron en placas las células B esplénicas de ratón a dilución
límite en presencia de una dosis subóptima del ligando CD40 de
ratón hdmb y el sobrenadante de D10 y la frecuencia de células
secretoras de anticuerpo específico para KLH se midió después de 14
días.
Aproximadamente 1 de 2500 células secretó IgM
específico para KLH y 1 de 10.000 células secretó IgG específico
para KLH (Fig.15). Estas frecuencias son como se esperaron
analizando los sobrenadantes del cultivo desde que los pocillos
aleatorios se colocaron a 1000 células/pocillo de anticuerpos
específicos para KLH (1 de 8 positivos).
Este descubrimiento demostró que, dada la alta
frecuencia de células B respondiendo al ligando CD40 humano hdmb y
linfocinas, las células que responden a antígenos específicos pueden
ser identificadas a una frecuencia razonable en preparaciones de
células B que contenían tan poco como 1 x 10^{6} células.
Adicionalmente, el método ELIPSOT usado para identificar células
que secretan anticuerpos específicos para un antígeno puede ser
modificado para aislar células B específicas para un antígeno
cribando en pocillos cubiertos del antígeno. De este modo, las
células B expandidas pueden ser recuperadas en virtud de la
especificidad de sus inmunoglobulinas de superficie
independientemente de si tiene diferenciada la secreción de
inmunoglobulinas.
Claims (12)
1. Un método para células B proliferando que
comprenden el paso de cultivar una o más células B en presencia de
alta densidad, el ligando CD40 unido a la membrana, en donde la
membrana contiene el ligando CD40 al menos a una densidad 10 veces
superior que la encontrada en células que naturalmente expresan el
ligando CD40 y las células B son proliferadas al menos 100 veces
más.
2. El método de la reivindicación 1 en donde
dicha alta densidad, el ligando CD40 unido a la membrana está
presente en las membranas celulares a una densidad de al menos 100
veces superior que en células que expresan el ligando CD40 de forma
natural.
3. Un método para diferenciar las células B que
están proliferando en células productoras de anticuerpos que
comprenden el paso de cultivar dichas células B en presencia de una
o más citoquinas y dicha densidad, el ligando CD40 unido a la
membrana, en donde la membrana contiene el ligando CD40 al menos a
una densidad 10 veces más que la que se encuentra en células que
naturalmente expresan el ligando CD40 y las células B que son
proliferadas al menos 100 veces más.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en donde dichas células B son proliferadas
alrededor de 250 veces más.
5. El método de la reivindicación 1, en donde
dicha alta densidad, el ligando Cd40 unido a la membrana es
producido por células cultivadas de insectos con un vector que
consiste en una secuencia de nucleótidos que codifican el ligando
CD40.
6. El método de la reivindicación 1, en donde
dichas células B son células B humanas.
7. El método de la reivindicación 3, en donde
dichas citoquinas son las linfocinas Th2.
8. El método de la reivindicación 3, en donde
dichas citoquinas son
Interleucina-1\alpha(IL-1\alpha),
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-10 y IL-11 humanas
recombinantes.
9. El método de la reivindicación 3, en donde
dichas citoquinas son el sobrenadante de células T de sangre
periférica humanas estimuladas por anti-CD3.
10. El método de la reivindicación 3, en donde
dichas células B se incuban en presencia de un antígeno durante la
proliferación.
11. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho antígeno se añade durante la fase de reposo de un
procedimiento de cultivo de pasos múltiples.
12. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho antígeno se une covalentemente a la membrana que contiene
dicho ligando CD40 hdmb.
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