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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Immunologie. Speziell
werden erfindungsgemäß Verfahren
zur Proliferation und Differenzierung von B-Zellen bereitgestellt.
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Stand der
Technik
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Während einer
Immunreaktion führt
eine Aktivierung und Differenzierung von B-Zellen zu einer Sekretion
von antigenspezifischen Antikörpern
von hoher Affinität.
Wenn sich die Antikörperreaktion
auf Protein-Antigene richtet hängt
die Bildung von Antikörpern
auch von der Aktivierung von spezifischen Helfer-T (Th)-Zellen und ihren
Wechselwirkungen mit B-Zellen ab. Während der Vorgänge der
Aktivierung und Differenzierung folgen B-Zellen einem oder mehreren
charakteristischen und irreversiblen Wegen, um eine von verschiedenen
identifizierbaren Funktionalitäten
zu erwerben. Beispielsweise unterliegen aktivierte B-Zellen zunächst einer
hochgradigen Proliferation, wobei während dieser Periode der Zellteilung mehrere
verschiedene Ereignisse ablaufen können: ein Isotypwechsel kann
erfolgen, wodurch sich eine Rekombination von Genen der variablen
(V) Region der schweren Kette proximal zu verschiedenen konstanten
Regionen (γ-Unterklassen, α, oder ε) und eine
Sekretion von verschiedenen Antikörperklassen ergibt; eine somatische
Mutation kann in den Gensegmenten der V-Region der schweren und
leichten Ketten erfolgen, wodurch Antikörper-Kombinationsstellen von
hoher Affinität
entstehen; und B-Zellen können
einer Differenzierung unterliegen und zu Gedächtniszellen oder wirksamen
Antikörper-sezernierenden
Plasmazellen werden.
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Welchen
Weg eine spezielle B-Zelle einschlägt, wird höchstwahrscheinlich durch die
Typen von Stimuli, die sie erfährt,
festgelegt; dies wird vermutlich durch das Gesamtmilieu festgelegt.
Beispielsweise kann die Anwesenheit von anderen Zelltypen (verschiedene
Typen von Th-Zellen und/oder follikulären, dendritischen Zellen)
und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Antigens unterschiedliche
Signale an B-Zellen liefern. Einige Ereignisse, wie die Signale,
die Gedächtnis
B-Zellen erzeugen, und die molekularen Mechanismen, die die somatische
Mutation und Selektion von Antikörper erzeugenden
Zellen von hoher Affinität
steuern, sind nur schlecht aufgeklärt. Weitere Vorgänge, wie
anfängliche
Aktivierungssignale, die naive B-Zellen zur Proliferation antreiben
und die durch Kontakt mit spezifischen vorbehandelten und aktivierten
Th-Zellen bereitgestellt werden, sind nunmehr gut charakterisiert
(D. Parker, Annu. Rev. Immunol., Bd.11 (1993), S. 331–360). Ferner
wurden auch die Einflüsse
von löslichen,
von Th-Zellen abgeleiteten
Lymphokinen auf aktivierte B-Zellen beschrieben (D. Parker, Annu. Rev.
Immunol., Bd. 11 (1993), S. 331–360);
Hodgkin et alI., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034; Noelle
et al., J. Immunol., Bd. 146 (1993), S. 1118–1124).
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Da
die Erzeugung von vorbehandelten und aktivierten Th-Zellen für die B-Zellaktivierung obligatorisch
ist, ist die Festlegung der Erfordernisse von B-Zellen selbst unter
Anwendung klassischer in vitro-Systeme, die für die Untersuchung von B-Zellreaktionen
verwendet werden, schwierig. Bei diesen Systemen, bei denen vielfach
gereinigte B-Zellen, antigenspezifische Th-Zellklone und Antigen
verwendet wurden, waren die Erfordernisse für die Th-Zellaktivierung ebenfalls
für die
Erzeugung einer B-Zellreaktion wesentlich.
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I. Kontaktabhängige Abgabe
von Signalen aus Th-Zellen an B-Zellen
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Die
an der B-Zellaktivierung durch Th-Zellen beteiligten Stufen lassen
sich erstens in die durch den Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC) eingeschränkte
Aktivierung und das Priming von spezifischen Th-Zellen und zweitens
in die Wechselwirkung von sekundären,
aktivierten Th-Zellen mit B-Zellen unter Induktion von B-Zellaktivierung,
Proliferation und Differenzierung unterteilen (D. Parker, Annu. Rev.
Immunol., Bd. 11 (1993), S. 331–360).
Naive Th-Zellen unterliegen einem Priming durch Wechselwirkungen
mit Antigenen, die zu Peptiden gespalten (prozessiert) worden sind,
die eine Bindung mit Klasse II-MHC-Molekülen an der
Oberfläche
von Antigene aufweisenden Zellen eingegangen sind. Bei der Th-Zell-Primingstufe
sind ruhende B-Zellen nicht in der Lage, als Antigene aufweisende
Zellen zu dienen, da sie offensichtlich nicht fähig sind, den Th-Zellen die
erforderlichen Costimulationssignale zu liefern. Antigene aufweisende
Zellen, die die für
das Th-Zellpriming geeigneten Costimulationssignale liefern können, sind
ineinander verflochtene dendritische Zellen, die in an T-Zellen
reichen Bereichen der Milz auftreten, und möglicherweise aktivierte B-Zellen.
Nachdem spezifische Th-Zellen einem Priming unterworfen worden sind,
sind ihre Aktivierungserfordernisse offensichtlich weniger stringent.
Einem Priming unterworfene Th-Zellen können in wirksamer Weise durch
ruhende B-Lymphozyten aktiviert werden, die mit spezifischen Antigenrezeptoren
ein Antigen eingefangen und es zu Peptiden prozessiert haben (D.
Parker, Annu. Rev. Immunol., Bd. 11 (1993), S. 331–360). Nach
der Aktivierung können
einem Priming unterworfene Th-Zellen Gene exprimieren, die sie befähigen, im
Gegenzug entsprechende Kontakt- und Lymphokin-abhängige Aktivierungssignale
an ruhende B-Zellen auszusenden (M. R. Kehry und P. D. Hodgkin,
Sem. Immunol., Bd. 5 (1993), S. 393–400).
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II. Historischer Überblick
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Mehrere
Untersuchungen in den 1980er Jahren beschrieben kritische Merkmale
von spezifischen Signalen, die durch aktivierte, einem Priming unterworfene
Th-Zellen an B-Zellen ausgesandt werden (Coffman et al., Immunol.
Rev., Bd. 102 (1988), S. 5–28;
DeFranco et al., J. Exp. Med., Bd. 159 (1984), S. 861–880). Der
B-Zell-Th-Zell-Kontakt war erforderlich. Die Th-Zell-abgeleiteten
Signale, die die Aktivierung von ruhenden B-Zellen antreiben, konnten nicht
durch lösliche
Lymphokine allein ersetzt werden (Andersson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 1612–1616; Julius et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 79 (1982), S. 1989–1993; T. Owens, Eur. J. Immunol.,
Bd. 18 (1988), S. 395–401;
Whalen et al., J. Immunol., Bd. 141 (1988), S. 2230–2239; Hirohata
et al., J. Immunol., Bd. 140 (1988), S. 3726–3744; Noelle et al., J. Immunol.,
Bd. 140 (1989), S. 1807–1814;
Julius et al., Eur. J. Immunol., Bd. 18 (1988), S. 381–386). Ein
Befund, der für
die Charakterisierung der bei der Abgabe von Kontaktsignalen an
ruhende B-Zellen beteiligten Moleküle von Bedeutung war, bestand
darin, dass voraktivierte Th-Zellen zur Abgabe von Aktivierungssignalen
verwendet werden konnten. Dies lässt
darauf schließen, dass
die durch naive B-Zellen empfangenen Kontaktsignale nicht verwandt
sein mussten; sie waren Antigen-unabhängig und nicht MHC-beschränkt. Die B-Zellen
aktivierenden Signale schienen sich von den Signalen zu unterscheiden,
die für
die Th-Zellaktivierung erforderlich waren, und waren somit befähigt, signifikante
B-Zell-Nebenreaktionen zu erzeugen (Whalen et al., J. Immunol.,
Bd. 141 (1988), S. 2230–2239).
Dies ließ darauf
schließen,
dass die B-Zellrezeptoren für
von Th-Zellen abhängige
Kontaktsignale konstitutiv exprimiert wurden und nicht polymorph
oder auf den B-Zell-Antigenrezeptor bezogen waren. Ferner war es
sehr wahrscheinlich, dass die Th-Zellmoleküle, die die Kontaktsignale
liefern, in ruhenden Th-Zellen nicht in funktionellem Zustand vorlagen.
Dies schließt
eine Rolle für
den T-Zell-Rezeptorkomplex aus, der zunächst bezüglich des Empfangs von antigenspezifischen
Th-Zellaktivierungssignalen
ins Spiel gebracht wurde.
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Diese
Untersuchungen beschrieben auch eine Rolle für von Th-Zellen abgeleitete
Lymphokine bei der Festlegung der Menge und des Isotops eines sezernierten
Antikörpers
(Coffman et al., Immunol. Rev., Bd. 102 (1988), S. 5–28). Bei
der Maus wurde gezeigt, dass die Fähigkeit eines Th-Zellklons
zur Induktion der B-Zelldifferenzierung vom Repertoire der nach
der Aktivierung sezernierten Lymphokine abhängt. Th-Zellklone vom Th2-Typ,
die IL-4 und IL-5 sezernieren, sind bei der Induktion der Produktion von
IgM und bei der Umstellung auf IgG1, IgA und IgE wirksam (Coffman
et al., Immunol. Rev., Bd. 102 (1988), S. 5–28; Mosmann & Coffman, Annu.
Rev. Immunol., Bd. 7 (1989), S. 145–173). Obgleich zunächst einige
Meinungsverschiedenheiten über
die Fähigkeit
von Th-Zellklonen vom Th1-Typ, die IL-2 und IFN-γ erzeugen, zur Stimulation der
B-Zelldifferenzierung
herrschten, hat es den Anschein, dass die meisten Th-Zellklone dazu befähigt sind,
die entsprechenden Kontakte und löslichen Signale zu liefern, um
ruhende B-Zellen zur Sekretion von Antikörpern zu aktivieren, wenn Th2-Lymphokine
bereitgestellt werden (Abbas et al., J. Immunol., Bd. 144 (1990),
S. 2031–2037).
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Obgleich
es den Anschein hatte, dass die Rolle von Lymphokinen darin besteht,
die B-Zelldifferenzierung zu induzieren, und nicht in der Einleitung von
Aktivierungsereignissen, war ein System erforderlich, das einen
Th-Zellkontakt getrennt von löslichen
Signalen lieferte. Eine frühe
Untersuchung belegte, dass Membrankomponenten aus T-Zellen auf andere
Zelltypen durch ein vom Sendai-Virus
vermitteltes Fusionsereignis übertragen
werden können (Lindquist
et al., Scand. J. Immunol., Bd. 23 (1986), S. 119–125). Diese
Zellen enthielten funktionale, T-zellspezifische Membranproteine,
die eine Leitung von Signalen für
die Aktivierung von T-zellspezifischen Genen bewirken konnten, wobei
die Zellen jedoch nicht auf ihre Fähigkeit zur Aktivierung von B-Zellen
untersucht wurden. Eine weitere Untersuchung belegte, dass Tumorzellen-Plasmamembranen
ausreichten, um allogene, zytotoxische T-Lymphozyten zu erzeugen
(Stallcup et al., Cell. Immunol., Bd. 89 (1984), S. 144–150). Dies
ließ darauf
schließen,
dass ein Zell-Zell-Kontakt kritische Signale lieferte, die die Lymphozyten-Aktivierung
regulierten. Jedoch wirkten hohe Dosen von Plasmamembranen nicht-spezifisch
hemmend sowohl auf T- als auch auf B-Lymphozyten-Reaktionen (Stallcup
et al., Cell. Immunol., Bd. 89 (1984), S. 144–150). Einige Jahre später präparierten
Sekita et al. Plasmamembranen aus einer Vielzahl von T-Zellen und
lymphoiden Zelllinien und wiesen ihre Fähigkeit zur Stimulation und Costimulation
der B-Zellproliferation
nach (Sekita et al., Eur. J. Immunol., Bd. 18 (1988), S. 1405–1410). Jedoch
stellten diese Autoren fest, dass aus den meisten Zelltypen präparierte
Membranen B-Zellen aktivieren konnten (Sekita et at., Eur. J. Immunol., Bd.
18 (1988), S. 1405–1410).
Da für
Th-Zellen oder für
aktivierte, übermäßig ruhende
T-Zellen keine Spezifität
festgestellt wurde, schien sich die aktive Komponente in diesen
Membranen von der Komponente zu unterscheiden, die durch Aktivierung
von normalen, einem Priming unterworfenen Th-Zellen induziert wurde.
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Die
vielversprechendsten Untersuchungen zur Entwicklung eines von Th-Zellen freien Systems zur
Abgabe von Kontaktsignalen an B-Zellen bedienten sich einer in Bezug
auf Plasmamembranen angereicherten Fraktion von Vesikeln, die aus
einem aktivierten Mäuse-Th2-Zellklon,
nämlich
D10.G4.1 (D10), präpariert
worden waren, um Kontaktsignale in Abwesenheit von anderen Zelltypen
zu liefern (A. A. Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S.
564–568).
Bei dieser Arbeit wurde eine Spezifität insofern nachgewiesen, als
aus ruhenden Th2-Zellen präparierte
Membranen nicht stimulatorisch für
die B-Zellproliferation waren. Jedoch war die B-Zellpopulation nicht
zur Beseitigung von voraktivierten B-Zellen gereinigt worden, die andere
Aktivierungserfordernisse als ruhende B-Zellen aufweisen. Voraktivierte B-Zellen
reagieren auf Th2-Lymphokine allein (insbesondere IL-5) durch Wachstum
und Sekretion von IgM in Abwesenheit der Th-zellabhängigen Kontaktsignale
(Takatsu et al., Immunol. Rev., Bd. 102 (1988), S. 107–135). Da
es nicht möglich
ist, verunreinigende Vesikel des endoplasmatischen Retikulums, die
Lymphokine enthalten, von Plasmamembran-Vesikeln zu trennen, war es bei der
ursprünglichen
Arbeit (A. A. Brian, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S.
564–568)
nicht klar, ob ein tatsächlicher,
kontaktabhängiger
Stimulus auf ruhende B-Zellen durch eine Plasmamembranfraktion aus
einem Th-Zellklon geliefert werden kann.
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Zusammenfassende Darstellung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass hochdichter,
membrangebundener CD40-Ligand (nachstehend "hdmb-CD40-Ligand") eine Langzeitproliferation von B-Zellen
in Kultur induzieren kann. Ferner wurde festgestellt, dass durch Variation
der Typen und der Konzentration von Lymphokinen und/oder Kontaktzellen,
die während
der Proliferation vorhanden sind, proliferierende B-Zellen zur Differenzierung
(Reifung) zu Antikörper
erzeugenden Zellen induziert werden können. Schließlich wurde
festgestellt, dass eine Proliferation und Differenzierung in Gegenwart
eines Antigens bevorzugt differenzierende Populationen von B-Zellen
proliferiert oder auswählt,
um den prozentualen Anteil von Zellen, die spezifische Antikörper gegen
das zugeführte
Antigen erzeugen, zu erhöhen.
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Auf
der Grundlage der vorstehenden Beobachtungen werden gemäß einer
Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung Verfahren zur Proliferation von B-Zellen bereitgestellt,
die die Stufe der Kultivierung von einer oder mehreren B-Zellen in Gegenwart
von hdmb-CD40-Ligand umfassen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf
B-Zellen angewandt werden, die aus einem beliebigen Säuger isoliert
worden sind, wobei es sich insbesondere um humane B-Zellen handelt.
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Die
hier beanspruchten Verfahren verbessern frühere Versuche zur Proliferation
von B-Zellen bei der Verwendung von hdmb-CD40-Ligand. Frühere Versuche
zur Proliferation von B-Zellpopulationen in Gegenwart von natürlich isoliertem,
membrangebundenem CD40-Liganden, von membrangebundenem CD40-Liganden,
der aus transfizierten Tierzellen erzeugt worden war, von rekombinant
erzeugten löslichen
Formen von CD40-Liganden und anti-CD40-Rezeptor-Antikörpern haben zu schlechten Ergebnissen
geführt
(beschrieben beispielsweise bei Armitage et al., J. Immunology,
Bd. 15 (1993), S. 3671–3680).
Es ergibt sich tendenziell eine mäßige Proliferation, die nach
1 bis 4 Replikationsrunden endet. Dabei besteht häufig die
Notwendigkeit der Anwesenheit eines Lymphokins oder Cytokins (z.
B. von Th-Lymphokinen), um die Proliferation zu stimulieren. Unter
Anwendung der vorliegenden Verfahren wurden starke Proliferationsreaktionen
in der Höhe von
250-fach erhalten.
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Das
vorliegende Verfahren kann bei einer einstufigen Proliferation oder
bei einer mehrstufigen Proliferation eingesetzt werden. Speziell
wird hdmb-CD40-Ligand
dem Kulturmedium während
der anfänglichen
Züchtungsphasen
zugesetzt. Die Anwesenheit von hdmb-CD40-Ligand wird aufrechterhalten,
bis die Proliferationsrate abnimmt. Die Zellen werden sodann durch
Züchtung
unter Bedingungen, bei denen kein hdmb-CD40-Ligand enthalten ist,
zum Ruhen veranlasst. Nach Erreichen des Ruhezustands können die
Zellen zur Fortsetzung der Proliferation und Differenzierung restimuliert
werden, indem man hdmb-gebundenen
CD40-Liganden und Cytokine erneut in die Kulturmedien gibt.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass Cytokine,
Extrakte von Zellen und/oder ausgewählte Feederzellen bei Zugabe
von B-Zellen, die unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren proliferieren
oder proliferiert haben, die B-Zellen zur Differenzierung zu Antikörper erzeugenden
Zellen stimulieren. Auf der Grundlage dieser Beobachtung stellt
die vorliegende Erfindung Verfahren zur Differenzierungs-Proliferation
von B-Zellen bereit, die die Stufe der Kultivierung von B-Zellen
in Gegenwart von hdmb-CD40-Ligand und einem oder mehreren Lymphokinen,
Feederzellen oder Extrakten davon umfassen. Zu Beispielen für die Cytokine
und Feederzellen, die verwendet werden können, gehören ohne Beschränkung hierauf
Th2-Lymphokine und follikuläre dendritische
Zellen.
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Eine
dritte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass die Differenzierung
von B-Zellen partiell gesteuert werden kann, indem man dem Kulturmedium
ein Antigen zusetzt. Speziell kann der prozentuale Anteil von B-Zellen,
die Antikörper,
die selektiv für
ein spezifisches Antigen sind, erzeugen, erhöht werden, indem man dem Kulturmedium
während
des Proliferationsstadiums, des Ruhestadiums, des Differenzierungsstadiums
oder des Reproliferationsstadiums der hier beschriebenen Verfahren
ein Antigen zusetzt.
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Zusätzlich zur
in vitro-Verwendung werden in der Literatur andere Formen des CD40-Liganden
als Mittel zur Proliferation und Aktivierung von B-Zellen in einem
Säugetierwirt
beschrieben. Im allgemeinen können
pathologische Zustände,
die zu einer Suppression der B-Zellproliferation und -aktivierung
führen,
unter Verwendung des erfindungsgemäßen hdmb-CD40-Liganden anstelle
der früher
erzeugten Formen des CD40-Liganden behandelt werden. Indem man einen
Säuger
mit dem hdmb-CD40-Liganden versorgt, können B-Zell-Populationen innerhalb des Wirts auf
ein Niveau und in einer Geschwindigkeit proliferiert werden, die
wesentlich höher
sind, als sie bei früher
isolierten Formen des CD40-Liganden festgestellt werden.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1:
Sequenzen von murinem und humanem CD40 und CD40-Liganden
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Nucleotidsequenzen
von humanem und murinem CD40-Liganden. CD40 ist ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie
(Mallett & Barclay,
Immunol. Today, Bd. 12 (1991), S. 220–223) das vier sich wiederholende,
an Cys reiche extrazelluläre
Domänen
enthält.
Der murine CD40-Ligand ist ein Typ 2-Membranglycoprotein mit einem
MG von 33 000–35
000 und einer vorhergesagten Länge
von 260 Aminosäuren,
der an aktivierten T-Zellen exprimiert wird. Er ist verwandt mit
TNF (Farrah & Smith,
Nature, Bd. 358 (1992), S. 26) und Liganden der TNF-Rezeptortamilie (Goodwin
et al., Cell, Bd. 73 (1993), S. 447–456; Smith et al., Cell, Bd.
73 (1993), S. 1349–1360;
Smith et al., Cell, Bd. 76 (1994), S. 959–962; Aruffo et al., EMBO J.
(1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., Bd. 11 (1992), S. 4313–4321).
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2:
Zeitlicher Verlauf der SF9-Zellinfektion
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- A. SF9-Zellen wurden mit einem rekombinanten Baculovirus
mit einem Gehalt an Mäuse-CD40-Liganden
für verschiedene
Zeitspannen infiziert. Eine angereicherte Plasmamembranfraktion
wurde präpariert.
Jede Membranpräparation
wurde in einem B-Zellproliferationstest titriert (2 × 104 B-Zellen/Vertiefung
für 72
h). Ausgefüllte
Kreise, 18 h Infektion; leere Quadrate, 42 h Infektion; leere Kreise,
66 h Infektion; ausgefüllte
Quadrate, 90 h Infektion.
- B. hdmb-CD40-Ligand, der im vorstehenden Abschnitt A erzeugt
worden war, wurde zur Stimulation von B-Zellen in Gegenwart von
D10 sn (1/100; Lymphokin enthaltender Überstand aus 9 h stimuliertem
D10G4.1-Th2 T-Zellklon, Hodgkin et al., J. Immunology, Bd. 145 (1990),
S. 2025–2034)
verwendet. Die Symbole sind die gleichen wie in 1A.
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3: Spezifität der B-Zellproliferation
bei Induktion durch hdmb-CD40-Ligand
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B-Zellen
(2 × 104/Vertiefung) wurden mit einer konstanten
Menge an hdmb-CD40-Ligand (1/200)
stimuliert. Ausgefüllte
Kreise, CD40-IgG-Zugabe (35 μg/ml
bei der höchsten
Konzentration); leere Quadrate, kein CD40-IgG.
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4: Einflüsse der
Ausstreichdichte auf die Proliferation von B-Zellen.
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B-Zellen
wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen (1 × 104/Vertiefung)
mit hdmb-CD40-Ligand (1/80) und D10 sn (1/100) gebracht. Die Zellen
wurden gezählt
und die Medien wurden alle 48 h ausgetauscht. Nach 5 und 8 Tagen
wurden die Zellen resuspendiert und 1/8 aufgeteilt. Ausgefüllte Dreiecke, Zellen
nicht geteilt; ausgefüllte
Kreise, 1/8-Teilung nach 5 Tagen; ausgefüllte Quadrate, 1/8-Teilung nach
8 Tagen; leere Kreise, 1/8-Teilung, multipliziert mit dem Faktor
8; leere Quadrate, zweite 1/8 Teilung, multipliziert mit dem Faktor
64.
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5: Vergleich
der B-Zellexpansion in flachbödigen Vertiefungen
gegenüber
Vertiefungen mit "V"-Boden
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B-Zellen
wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden oder "V"-Boden gebracht (1 × 103/Vertiefung).
Die Zellen wurden entweder mit hdmb-CD40-Ligand und D10 sn (++) oder nur
mit hdmb-CD40-Ligandenmembranen (+–) inkubiert. Die Zellen wurden
gezählt
und das Medium wurde alle 48 Stunden entfernt und ersetzt. Ausgefüllte Quadrate, hdmb-CD40-Ligand
und D10 sn in einer Platte mit flachem Boden; leere Kreise, hdmb-CD40-Ligand
und D10 sn in einer Platte mit "V"-Boden; leere Quadrate, hdmb-CD40-Ligand
in einer Platte mit flachem Boden; ausgefüllte Kreise, CD40-Ligand in
einer Platte mit "V"-Boden.
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6:
Wachstum und Antikörpersekretion
von B-Zellen bei Stimulation mit hdmb-CD40-Ligand und D10 sn
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- A. B-Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen
mit "V"-Boden (1 × 103 Zellen/Vertiefung) mit hdmb-CD40-Ligand
(1/300) und D10 sn (1/100) gebracht. Alle 48 h wurden die Zellen
entfernt und gezählt.
Leere Quadrate, Gesamtzahl von febensfähigen Zellen; ausgefüllte Kreise,
Bruchteil der Zellen, die lebensfähig waren.
- B. Medium von Wiederholungsvertiefungen wurden zur Messung der
Antikörperkonzentration durch
quantitativen ELISA-Test entnommen. Ausgefüllte Kreise, IgM; ausgefüllte Quadrate,
IgG1; ausgefüllte
Dreiecke, IgE. Die kumulativen Antikörperkonzentrationen sind in
ng/ml angegeben.
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7:
Wachstum und Antikörpersekretion
von B-Zellen bei Stimulation mit hdmb-CD40-Ligand und D10 sn unter
Ersetzen des Mediums
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- A. B-Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen
mit "V"-Boden (1 × 103 Zellen/Vertiefung) mit hdmb-CD40-Ligand
(1/300) und D1Q sn (1/100) gebracht. Alle 48 h wurden Zellen entnommen und
gezählt.
Altes Medium wurde entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Leere
Quadrate, Gesamtzahl der lebensfähigen
Zellen; ausgefüllte Kreise,
Bruchteil von Zellen, die lebensfähig waren.
- B. Medium von Wiederholungsvertiefungen wurde zur Messung der
Antikörperkonzentration durch
quantitativen ELISA-Test entnommen. Ausgefüllte Kreise, IgM; ausgefüllte Quadrate,
IgG1; ausgefüllte
Dreiecke IgE. Kumulative Antikörperkonzentrationen
sind in ng/ml angegeben.
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8:
Wachstum und Antikörpersekretion
von B-Zellen bei Restimulation mit hdmb-CD40-Ligand und D10 sn unter
Ersetzen des Mediums
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- A. B-Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen
mit "V"-Boden (1 × 103 ZellenN/Vertiefung) mit CD40-Ligand (1/300)
und D10 sn (1/100) gebracht. Alle 48 h wurden Zellen entnommen und gezählt. Altes
Medium wurde entfernt und durch frisches Medium ersetzt. +–, Medium
enthielt hdmb-CD40-Ligand; ––, Medium
enthielt keine Zusätze;
++, Medium enthielt hdmb-CD40-Ligand und D10 sn. Leere Quadrate,
Gesamtzahl von lebensfähigen
Zellen; ausgefüllte
Kreise, Bruchteil von Zellen, die lebensfähig waren.
- B. Medium von Wiederholungsvertiefungen wurde zur Messung der
Antikörperkonzentration durch
quantitativen ELISA-Test entnommen. Ausgefüllte Kreise, IgM; ausgefüllte Quadrate,
IgG1; ausgefüllte
Dreiecke, IgE. Kumulative Antikörperkonzentrationen
sind in ng/ml angegeben.
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9: Häufigkeit
von B-Zellen, die auf hdmb-CD40-Ligand reagieren
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B-Zellen
wurden in einer Menge von 1, 3, 10 und 30 Zellen/Vertiefung auf
Platten mit 96 Vertiefungen mit "V"-Boden entweder mit
hdmb-CD40-Ligand (1/300) oder hdmb-CD40-Ligand (1/300) und D10 sn (1/100)
ausgestrichen. Nach 6 Tagen wurden die Zellen resuspendiert, auf
flachbödige
Platten übertragen und
einer Bewertung auf die Anwesenheit von lebensfähigen Zellen (Zellen/Vertiefung)
unterzogen.
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10: Proliferation
von humanen B-Zellen
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Humane
B-Zellen wurden in Vertiefungen mit V-Boden gemäß den Angaben zu 7 mit oder ohne Zusatz von rekombinantem
humanem IL-4, IL-6 oder IL-10 je nach den Angaben inkubiert.
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11: Humaner
CD40-Ligand in Insektenzellmembranen stimuliert eine effiziente
humane B-Zellproliferation
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Gereinigte
humane periphere Blut-B-Zellen (7 000/Vertiefung) wurden in BCM
(100 μl)
mit verschiedenen Konzentrationen von humanem hdmb-CD40-Ligand in Form von
Plasmamembranen, die aus SF9-Zellen gereinigt worden waren, die
mit einem humanen CD40-Liganden enthaltenden, rekombinanten Baculovirus
(nachstehend als humaner hdmb-CD40-Ligand bezeichnet) infiziert
waren, inkubiert. (Quadrate), B-Zellen in Abwesenheit von Membranen;
(Dreiecke), humaner hdmb-CD40-Ligand; (Kreise), humaner hdmb-CD40-Ligand
und ein Gemisch von rekombinanten, humanen Lymphokinen (IL-1α, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-10 und
IL-11). 3H-Thymidin (1 μCi/Vertiefung) wurde während der
letzten 6 h der Züchtungsperiode
von 96 h zugegeben. Die einzelnen Punkte geben den Mittelwert von
zwei Vertiefungen an.
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12:
Klonale Frequenz von humanem B-Zellwachstum und -differenzierung
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Gereinigte,
humane, periphere Blut B-Zellen wurden in einer Menge von 1, 3,
10 und 30 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 96 Vertiefungen mit V-Boden
in Gegenwart von humanem hdmb-CD40-Liganden (1 μg/ml) und einem Gemisch von
rekombinantem IL-1α,
IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 und IL-11 (150 μl insgesamt) ausgestrichen.
An den Tagen 4, 8 und 11 wurde altes Medium entfernt und durch frisches
Medium mit einem Gehalt an humanem hdmb-CD40-Liganden und Lymphokinen
ersetzt. (A) Vertiefungen mit einem Gehalt an lebensfähigen Zellen
(≥4 Zellen/Vertiefung)
wurden am Tag 14 nach Resuspendieren der Zellen und Übertragen auf
Platten mit 96 flachbödigen
Vertiefungen bewertet. Gestrichelte Linien geben die Anzahl von
B-Zellen/Vertiefung wieder, wobei 37 % der Kulturen in Bezug auf
das Wachstum negativ waren. Gemäß der Poisson-Verteilung
enthält
bei dieser Zellzahl jede Vertiefung eine wachsende Zelle. (B) Am
Tag 11 von den Platten geerntete Medien wurden auf die Anwesenheit
von humanem IgM und humanem IgG durch getrennte ELISA-Tests getestet.
Die Anzahl von in Bezug auf IgG und IgM positiven Vertiefungen wurden
zur Bewertung vereinigt. Gestrichelte Linien geben die Anzahl von
B-Zellen/Viefung wieder, wobei 37 % der Kulturen in Bezug auf die
Antikörpererzeugung
negativ waren.
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13: IgM-
und IgG-Sekretion durch humane B-Zellen bei Stimulation mit verschiedenen
Lymphokin-Kombinationen
-
Humane,
periphere Blut B-Zellen (500/Vertiefung) mit 96 Vertiefungen mit
V-Boden wurden mit humanem
hdmb-CD40-Liganden (1 μg/ml)
in Gegenwart der angegebenen Lymphokine in 150 μl BCM 14 Tage inkubiert. Kulturüberstände wurden
geerntet und die Konzentrationen an IgM und IgG durch Elisa bestimmt.
Die einzelnen Punkte geben die Mittelwerte ± Standardabweichung von Wiederholungsversuchen
in vier Vertiefungen an. Die Lymphokin-Konzentrationen wurden gemäß den Angaben
in Beispiel 3, Materialien und Methoden, zugeführt. PHA/PMA sn, Kulturüberstand
von PHA- und PMA-aktivierten, peripheren Blut-T- Zellen; αCD3 sn, Kulturüberstand
von anti-CD3-aktivierten, peripheren Blut T-Zellen. Die Endkonzentrationen von humanen
T Zellüberständen sind
angegeben.
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14: Von
Cytokin abhängige
humane B-Zelldifferenzierung
-
Humane,
periphere Blut-B-Zellen (500/Viefung) wurden auf Platten mit 96
Vertiefungen mit V-Boden mit humanem hdmb-CD40-Liganden (1 μg/ml) in
Gegenwart von verschiedenen Verdünnungen
des Überstands
von anti-CD3-aktivierten,
peripheren Blut-T-Zellen in 150 μl
BCM inkubiert. Am Tag 23 wurde das Medium entfernt und die Konzentrationen
an IgM (punktierte Balken) und IgG (schraffierte Balken) durch ELISA
bestimmt. Die einzelnen Punkte geben die Mittelwerte ± Standardabweichung
für Wiederholungsversuche
in vier Vertiefungen an.
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15. Klonale
Frequenz von antigenspezifischen Mäuse B-Zellen in nicht dem Priming
unterworfener Milz
-
Dichte
murine Mäuse
B-Zellen wurden in 1 000, 3 000, 10 000 und 30 000 Zellen/Vertiefung
auf Platten mit 96 Vertiefungen mit V-Boden in Gegenwart von Maus-hdmb-human-CD40-Ligand
(0,1 μg/ml)
und D10-Überstand
(1/100) in 150 μl
BCM ausgestrichen. An den Tagen 5, 8 und 12 wurde altes Medium entfernt
und durch frisches Medium mit einem Gehalt an Sf9CD40L und
Lymphokinen ersetzt. Am Tag 14 wurden die Vertiefungen auf die Anwesenheit von
KLH-spezifischem Antikörper
sezernierenden Zellen durch ELISPOT-Analyse gemäß den Angaben in Beispiel 3,
Materialien und Methoden, getestet. Jede Vertiefung auf den ursprünglichen
Platten wurde auf zwei identische ELISPOT-Platten aufgeteilt: eine
der Platten des Doppelversuchs wurde auf IgM und die andere auf
IgG entwickelt. Die Vertiefungen wurden unter einem Schnittmikroskop
positiv auf spezifische IgM-sezernierende Zellen (≥3 Flecken/Vertiefung)
oder auf spezifische IgG-sezernierende
Zellen (≥4
Flecken/Vertiefung) bewertet. Gestrichelte Linien geben die Anzahl
von B-Zellen/Vertiefung wieder, bei der 37 % der Kulturen negativ
auf die Bildung von antigenspezifischem Antikörper waren.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
-
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, dass hochdichter,
membrangebundener CD40-Ligand (nachstehend als hdmb-CD40-Ligand
bezeichnet) eine hochgradige Proliferation von B-Zellen in Kultur
induzieren kann. Ferner wurde durch Variation der Typen und der
Konzentration von Cytokinen und/oder Kontaktzellen, die während der Proliferation
vorhanden waren, festgestellt, dass proliferierende B-Zellen einer
Induktion zur Differenzierung zu Antikörper erzeugenden Zellen veranlasst werden
können.
Schließlich
wurde festgestellt, dass die Proliferation und Differenzierung in
Gegenwart eines Antigens bevorzugt differenzierende B-Zellen proliferiert
und auswählt,
um für
das zugeführte
Antigen spezifische Antikörper
zu erzeugen.
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Auf
der Grundlage dieser Feststellungen werden gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Proliferation von B-Zellen bereitgestellt,
die die Stufe der Züchtung
von einer oder mehreren B-Zellen in Gegenwart von hdmb-CD40-Ligand
umfassen, wobei die Membran CD40-Ligand
in einer mindestens 10-fach größeren Dichte
enthält,
als sie auf Zellen gefunden wird, die CD40-Ligand natürlich exprimieren,
und die B-Zellen mindestens 100-fach vermehrt werden.
-
Der
hier verwendete Ausdruck "Proliferation" ist als der Vorgang
der Expansion (Zunahme) der Anzahl von B-Zellen definiert, und zwar
ausgehend von einer oder mehreren Zellen zu einer größeren Anzahl von
Zellen. In den folgenden Beispielen wird der Nachweis einer 250-fachen
Proliferation geführt
(8 Runden der Teilung innerhalb von 6 Tagen). Der Grad und die Menge
der Proliferation, die unter Anwendung der vorliegenden Verfahren
erzielt wird, variieren je nach dem Typ und der Art der ursprünglichen B-Zellen,
sowie je nach den angewandten Kulturbedingungen. Solange jedoch
die Anzahl an lebenden B-Zellen, die in der Kultur vorhanden sind,
als Folge einer Teilung oder einer erhöhten Überlebensrate der sich teilenden
Population zunimmt, werden die B-Zellen als "proliferierend" bezeichnet (vergl. die 2, 6, 7, 8 und 10).
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Die
hier verwendeten Ausdrücke "B-Zellen" oder "B-Zellpopulation" beziehen sich auf
eine oder mehrere Zellen, die sich von einem Explantat mit einem
Gehalt an B-Zellen oder einer davon abgeleiteten Kultur ableiten
(bezüglich
einer Definition von B-Zellen und B-Zellpopulationen wird verwiesen
auf Parker, Annu. Rev. Immunol., Bd. 11 (1993), S. 331–360). Die
bevorzugten B-Zellen zur erfindungsgemäßen Verwendung werden als "B-Zellen von geringer
Dichte" klassifiziert.
Wie in den nachstehend Beispielen beschrieben, können B-Zellen von geringer
Dichte aus Milz, peripherem Blut, Knochenmark oder Zellen, die aus
lymphoiden Organen eines Säugers
isoliert worden sind, unter Anwendung von aus dem Stand der Technik
bekannten Verfahren gereinigt werden (vergl. beispielsweise Hodgkin
et al., J. Immunology, Bd. 145 (1990), S. 2025–2034; Clark et al., J. Immunology,
Bd. 148 (1992), S. 3327–3335; Thomas
et al., J. Immunology, Bd. 150 (1993), S. 821–834; und Freudenthal et al.,
PNAS USA, Bd. 87 (1990), S. 7698).
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Die
anfängliche
Startpopulation von B-Zellen kann aus einem Explantat von isolierten
B-Zellen geringer Dichte (etwa 1000 Zellen) bestehen. Bei der Population
kann es sich um ein primäres
Explantat von einzelnen isolierten B-Zellen, um eine Population, die aus
existierenden B-Zellkulturen, die nach den hier beschriebenen Verfahren
erzeugt worden sind, oder um eine Population handeln, die aus peripheren
Blutzellen, Knochenmarkzellen und Zellen, die sich von lymphoiden
Organen ableiten, isoliert worden ist. Dem Fachmann ist es geläufig, wie
er die Züchtungsbedingungen
je nach Quelle und Größe der Ausgangspopulation
unter Heranziehung bekannter Parameter variieren kann (vergl. 4 und 11).
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können auf
B-Zellen, die aus einem beliebigen Säuger isoliert worden sind,
angewandt werden. Die nachstehenden Beispiele belegen die Fähigkeit
von hdmb-CD40-Ligand zur Proliferation sowohl von murinen als auch von
humanen B-Zellen (2, 7 und 9–12).
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Der
hier verwendete Ausdruck "Kultivierung" bezieht sich auf
den Satz von Verfahrensweisen, die in vitro angewandt werden, wenn
eine Population von Zellen (oder eine einzelne Zelle) unter Bedingungen inkubiert
wird, von denen gezeigt worden ist, dass sie das Wachstum oder die
Lebensfähigkeit
der Zellen in vitro unterstützen.
Der Stand der Technik kennt eine Reihe von Formaten, Medien, Temperaturbereichen, Gaskonzentrationen
und dergl., die in einem Kultursystem definiert werden müssen. Die
Parameter variieren auf der Grundlage des gewählten Formats und der speziellen
Bedürfnisse
der Person, die die hier beschriebenen Verfahren ausführt. Es
ist jedoch ersichtlich, dass die Bestimmung der Kultivierungsparameter
von routinemäßiger Natur
sind.
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Aus
der großen
Vielzahl von Formaten können
beliebige Formate, einschließlich
(ohne Beschränkung
hierauf) die Hohlfaser-Technologie und die Immobilisierung an festen
Trägern
oder Kulturkolben, zur Anwendung in den hier beschriebenen Verfahren
angepasst werden, da derartige Formate bereits mit Erfolg bei der
Züchtung
anderer Säugetier-Zelltypen
eingesetzt worden sind. In den folgenden Beispielen wurden B-Zellen
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit V-Boden oder flachem
Boden, die sterile Plattendeckel aufweisen, inkubiert (5, 10 und 11).
Während
der Züchtung wurden
die Platten in 5,5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Diese
Verfahren wurden zur Züchtung
von B-Zellmassen von geringer Dichte (etwa 1 000 Zellen) sowie von
1, 3 und 10 Zellen pro Vertiefung zur Züchtung ausgewählter B-Zellklone
herangezogen. Diese Verfahren wurden nur als ein Beispiel einer
großen Vielzahl
von Formaten und Bedingungen, die angewandt werden können, ausgewählt.
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Zusätzlich zu
einer großen
Vielzahl von Formaten, können
beliebige der derzeit bekannten Säugetier-Zellzüchtungsmedien
in den hier beanspruchten Verfahren eingesetzt werden. Ein Fachmann kann
die Eignung eines speziellen Mediums und einer Format/Medium-Kombination
zur Anwendung in den beanspruchten Verfahren unter Heranziehung bekannter
Verfahrensweisen festlegen. In den folgenden Beispielen wurde B-Zellmedium
(BCM), das aus 10 fötalem
Kälberserum
(HyClone-charakterisiert), 10 mM Hepes, pH-Wert 7,3, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin,
nicht-essentielle Aminosäuren, Natriumpyruvat,
5 × 10–5 M
Mercaptoethanol in RPMI 1640-Medium und 100 × Ergänzungen von Gibco verwendet.
Ausführliche Übersichtsartikel über andere
bekannte Formate und Züchtungsbedingungen, die
bei der Säugetier-Zellzüchtung eingesetzt
werden, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
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Die
hier beanspruchten Verfahren beruhen weitgehend auf der Verwendung
von hdmb-CD40-Ligand. Der hier verwendete Ausdruck "CD40-Ligand" bezieht sich auf
beliebige Proteine, die eine erhebliche Ähnlichkeit mit einer der bekannten
Aminosäuresequenzen
des CD40-Liganden besitzen und CD40-Ligandenaktivität aufweisen
(bezüglich
einer Übersicht über die
Aminosäuresequenz
und die Nucleinsäuresequenz,
die für
CD40-Liganden kodiert, wird verwiesen auf Armitage et al., Nature,
Bd. 357 (1992), S. 80–82;
Hollenbaugh et al., EMBO J., Bd. 11 (1992), S. 4313–4321).
Gemäß der hier
verwendeten Ausdrucksweise werden zwei Proteinen eine wesentliche Ähnlichkeit
in der Aminosäuresequenz zugeschrieben,
wenn eine aktive Domäne
oder eine an der Rezeptorbindung beteiligte Region eine Aminosäure-Sequenzhomologie
von 80 % oder mehr aufweist. Bei den erfindungsgemäß bevorzugten CD40-Liganden
handelt es sich um den humanen CD40-Liganden und den Mäuse-CD40-Liganden.
-
Der
erfindungsgemäße CD40-Ligand
kann aus Zellen isoliert werden, die natürlicherweise den CD40-Liganden
exprimieren, oder er kann aus Zellen gereinigt werden, die so verändert worden
sind, dass sie den CD40-Liganden exprimieren. Bezüglich einer ausführlichen Übersicht
wird auf die Anwendung von rekombinanten Verfahren zur Herstellung
von CD40-Liganden (Armitage, Nature, Bd. 357 (1992), S. 80–82; und
Hollenbaugh et al., EMBO J., Bd. 11 (1992), S. 4313–4321, sowie
auf die nachfolgenden Beispiele verwiesen.
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Beim
CD40-Liganden, der im vorliegenden Verfahren verwendet wird, handelt
es sich um eine membrangebundene Form des CD40-Liganden. Der hier
verwendete Ausdruck "membrangebundener CD40-Ligand" bezieht sich auf
einen CD40-Liganden, der an eine Lipid- oder Plasmamembran gebunden
ist. Das Anbringen des CD40-Liganden an eine Membran kann auf verschiedenen
Wegen erreicht werden. Beispielsweise kann der CD40-Ligand an eine
Membran unter Verwendung der natürlichen Transmembrandomäne des CD40-Liganden
angebracht werden, da der CD40-Ligand ein natürlich auftretendes Transmembranprotein
ist. Durch Isolieren des natürlich
auftretenden CD40-Liganden
aus Zellen, die in natürlicher
Weise den CD40-Liganden exprimieren oder die so verändert worden
sind, dass sie diesen exprimieren, wird der CD40- Ligand in membrangebundener Form erhalten.
Der angereicherte oder gereinigte CD40-Ligand wird aus Zellen als
eine Membranfraktion erhalten oder kann als ein solubilisiertes
Molekül
isoliert und mit Lipiden unter Bildung einer künstlichen Membran rekonstituiert
werden.
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Alternativ
können
der CD40-Ligand oder lösliche
Derivate des CD40-Liganden
durch Verwendung eines geeigneten Membranprotein-Linkers und eines
Protein-Vernetzungsmittels oder einer GPI-Verknüpfung an einer Plasmamembran
angebracht werden. Im allgemeinen sind das Konzept und die Verfahren
zum Verankern eines Proteins an einer Membran aus dem Stand der
Technik bekannt. Beispielsweise kann ein bekanntes Protein-Vernetzungsmittel
zur Vernetzung des CD40-Liganden mit einer Lipidmembran verwendet
werden, die integrale Membranproteine mit freiliegenden aktivierbaren Resten
enthält.
Ein Fachmann kann leicht eine von zahlreichen bekannten Membran-Verankerungstechniken
anpassen, um den membrangebundenen CD40-Liganden zu erhalten.
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Der
hier verwendete Ausdruck "hohe
Dichte" bezieht
sich auf Membranen, die den CD40-Liganden in einer mindestens 10-fach
größeren Dichte
enthalten, als sie auf Zellen gefunden wird, die den CD40-Liganden
natürlich
exprimieren, wobei dieser Wert insbesondere 100-fach größer ist.
Es wurde festgestellt, dass frühere
Versuche zur Expression des CD40-Liganden in einem rekombinanten
Wirt zur Bildung von CD40-Ligand in Dichten geführt hat, die ähnlich den
Dichten sind, die an Zellen gefunden werden, die in natürlicher
Weise CD40-Liganden exprimieren (beispielsweise gemäß den Angaben
von Armitage et al., J. Immunology, Bd. 15 (1993), S. 3671–3680).
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Eine
Vielzahl von Verfahren kann zur Bestimmung der "Dichte" des CD40-Liganden herangezogen werden. Hierzu
gehören
(ohne Beschränkung hierauf)
die Fluoreszenzmikroskopie, die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse,
der Rezeptor/Ligand-Bindungstest und die Immunoreaktivität (vergl.
beispielsweise Castle et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 1777–1788).
-
Wie
vorstehend erörtert,
kann eine Vielzahl von Verfahren dazu herangezogen werden, membrangebundenen
CD40-Liganden von hoher Dichte zu erhalten. Das erfindungsgemäß bevorzugte
Verfahren besteht in der Expression des CD40-Liganden in gezüchteten
Insektenzellen, die mit einem modifizierten Baculovirus-Vektor infiziert
sind. Es wurde festgestellt, dass der CD40-Ligand leicht in Insektenzellkulturen
als membrangebundene Form von hoher Dichte exprimiert werden kann.
Der Fachmann kann leicht bekannte Baculovirus-Expressionssysteme
anpassen, um den CD40-Liganden in membrangebundener Form von hoher
Dichte zu erzeugen. Die nachstehenden Beispiele belegen die Verwendung
von gezüchteten
SF9 Zellen zur Erzeugung des hdmb-CD40-Liganden zur Verwendung in
den hier beanspruchten Verfahren (vergl. 2).
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Frühere Versuche
mit proliferierenden B-Zellen in Gegenwart von natürlich isoliertem,
membrangebundenem CD40-Liganden, membrangebundenem CD40-Liganden, der aus
transfizierten Tierzellen erzeugt worden ist, oder rekombinant exprimierten,
löslichen
Derivaten des CD40-Liganden haben zu schlechten Ergebnissen geführt. Die
Proliferation ist tendenziell mäßig und
endet nach 1 bis 4 Replikationsrunden. Die vorliegende Erfindung
führt zu
Verbesserungen gegenüber
der Verwendung früherer Formen
des CD40-Liganden insofern, als starke Proliferationsreaktionen
in einer Höhe
von 250-fach nachgewiesen wurden. Die Gegenwart von Lymphokinen
bei Verwendung des hdmb-CD40-Liganden führt zur Differenzierung der
proliferierenden B-Zellen zu Antikörper erzeugenden Zellen.
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Das
vorliegende Verfahren kann in einem einstufigen Proliferationsverfahren
oder in einem mehrstufigen Verfahren eingesetzt werden. Bei einem
mehrstufigen Verfahren wird der hdmb-CD40-Ligand dem Kulturmedium
während
der Anfangsphasen der Züchtung
zugesetzt. Die Anwesenheit des hdmb-CD40-Liganden wird aufrechterhalten, bis
die Proliferationsrate abnimmt. Anschließend werden die Zellen durch
Züchtung
unter Bedingungen, bei denen hdmb-CD40-Ligand nicht vorhanden ist, in den Ruhezustand
versetzt. Nach Einstellen des Ruhezustands können die Zellen restimuliert
werden, um die Proliferation fortzusetzen, indem man den hdmb-CD40-Liganden
und Cytokine wieder der Kultur zusetzt (vergl. 8).
Der Mechanismus, der einem Proliferationsstadium im Anschluss an
ein Ruhestadium unter Verwendung des hdmb-CD40-Liganden zugrunde
liegt, ist unbekannt. Es wurde jedoch festgestellt, dass zahlreiche
aktivierte B-Zellpopulationen eine derartige Ruhephase benötigen, nachdem
die Geschwindigkeit der anfänglichen
Proliferation abgenommen hat. Ein Fachmann kann leicht die B-Zellproliferation überwachen
und den hdmb-CD40-Liganden aus dem Kulturmedium entfernen, wenn
die Geschwindigkeit der Proliferation der B-Zellen abnimmt.
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Verschiedene
Verfahren können
zur Überwachung
der Proliferation von B-Zellen
herangezogen werden. Hierzu gehören
(ohne Beschränkung hierauf)
die Messung des Einbaus einer markierten Verbindung, wie tritiertes
Thymidin, oder direkte Zell-Zähltechniken.
Diese beiden Verfahren werden ausführlich in den folgenden Beispielen
beschrieben.
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Spezielle
Zeitpunkte für
ein mehrstufiges Proliferationsverfahren lassen sich vom Fachmann leicht
unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmen.
In den folgenden Beispielen bestand das angewandte Verfahren in einer
6-tägigen
Züchtung
von B-Zellen (eine isolierte Population von geringer Dichte) in
Gegenwart von hdmb-CD40-Ligand (Proliferationsstadium). Nach 6-tägiger Züchtung wurde der hdmb-CD40-Ligand aus
dem Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden weitere 6 Tage gefüttert (Ruhestadium).
Nach der 6-tägigen
Ruhephase, in der der hdmb-CD40-Ligand nicht vorhanden war, wurden
die Zellen erneut in Gegenwart von hdmb-CD40-Ligand und von geeigneten
Cytokinen gezüchtet
(Reproliferationsstadium).
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beruht auf der Feststellung, dass Cytokine,
Extrakte von ausgewählten
Zellen, Mittel, die Oberflächenrezeptoren
und Ig-Moleküle
vernetzen, und/oder ausgewählte
Feederzell-Populationen bei Zusatz zu B-Zellen, die unter Anwendung
der vorstehend beschriebenen Verfahren proliferieren oder eine Proliferation
durchgemacht haben, die B-Zellen zur Differenzierung zu Antikörper erzeugenden
Zellen stimulieren. Auf der Grundlage dieser Feststellung werden
erfindungsgemäß Verfahren
zur Differenzierung von proliferierenden B-Zellen, die den Schritt
der Kultivierung von B-Zellen in Gegenwart des hdmb-CD40-Liganden
und eins Cytokins, von Feederzellen oder eines Extrakts davon umfassen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Cytokine" bezieht sich auf
die Klasse von Molekülen,
von denen gezeigt worden ist, dass sie eine zelldifferenzierende und/oder
wachstumsfördernde
Aktivität
besitzen. Cytokine lassen sich identifizieren und dem Kulturmedium
in hochgereinigter Form zusetzen, beispielsweise als gereinigtes
Interleukin-1, IL-2, IL-4, INF-α und dergl.,
oder sie können
als Überstände oder
Extrakte, die aus stimulierten Zellen, die Cytokine erzeugen, erhalten
worden sind, zugesetzt werden. Erfindungsgemäß wurden Th2-Lymphokine zur
Differenzierung von murinen Milz B-Zellen verwendet, während entweder
Lymphokine, die durch anti-CD3-aktivierte T-Zellen sezerniert worden
sind, oder eine Kombination von rekombinanten IL-2, IL-4, IL-6 und
IL-10 die Differenzierung von hdmb-CD40L-stimulierten, humanen,
peripheren Blut B-Zellen
unterstützten.
Speziell wurde für
murine B-Zellen der Th2-Klon D10.G4.1 9 Stunden mit Concanavalin
A stimuliert und die Kulturüberstände wurden
an Mannose/Agarose absorbiert, 30 Minuten mit 100 000 g ultrazentrifugiert,
steril filtriert und vor der Verwendung bei –80 °C gelagert (Th2 SN oder Th2-Überstand)
(vergl. Hodgkin et al., J. Immunology, Bd. 145 (1990), S. 2025–2034).
Der isolierte Th2-Überstand
wurde sodann zur Stimulation der Differenzierung der proliferierenden
murinen B-Zellen verwendet.
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Zur
Differenzierung von humanen, peripheren Blut B-Zellen wurde ein
lymphokinhaltiger Überstand
folgendermaßen
hergestellt. Periphere, mononukleare Blutzellen, die nach Zentrifugation über Ficoll-Hypaque
erhalten worden waren, wurden nacheinander an Platten einem "Panning" unterzogen, die über Nacht
mit anti-CD14 (5 μg/ml),
anti-CD14 und anti-CD19 (jeweils 2,5 μg/ml) und anti-CD8 (5 μg/ml) beschichtet
worden waren, unterzogen. Das "Panning" erfolgte in ausgewogener
Hank-Salzlösung,
5 % FBS, 10 mM HEPES, pH-Wert 7,3, 1 Stunde bei 4 °C. Nicht-anhaftende
Zellen wurden gewaschen und in einer Menge von 4 × 106 Zellen/ml in warmem BCM (RPMI 1640, ergänzt mit
10 % FBS, 10 mM HEPES (pH-Wert 7,3), 2 mM L-Glutamin (GIBCO, Grand
Island, NY), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren (GIBCO), 1 mM Natriumpyruvat,
5 × 10–5 M
2-Mercaptoethanol und 100 U/ml jeweils an Penicillin und Streptomycin
(GIBCO)) resuspendiert. Für
die anti-CD3-Stimulation wurden die Zellen auf Gewebekulturschalen
gebracht, die 48 Stunden bei 37 °C
mit 4 μg/ml
anti-CD3 beschichtet worden waren. Zur Stimulation mit PHA/PMA wurden
Zellen 2 Stunden bei 37 °C
mit 2,5 μg/ml
PHA und 10 ng/ml PMA inkubiert, gewaschen und 46 Stunden bei 37 °C in frischem, warmem
BCM inkubiert. Nach Entfernen der Zellen durch Zentrifugation mit
niedriger Drehzahl wurden die Überstände mit
100 000 × g
zentrifugiert, durch eine 0,2 μM-Membran
filtriert und in Aliquotanteilen bei –80 °C aufbewahrt.
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Ferner
können
Cytokine, die von anderen Zelltypen einschließlich dendritischen Zellen,
follikulären
dendritischen Zellen und anderen Antigenen präsentierenden Zellen, in Gegenwart
oder Abwesenheit eines spezifischen Antigens erzeugt worden sind,
den Kulturen als Stimuli zugesetzt werden. Zusätzlich zum Th2- und anti-CD3-stimulierten Überstand,
der in den Beispielen verwendet wurde, kann der Fachmann in den
vorliegenden Differenzierungsverfahren leicht beliebige bekannte
Cytokine einsetzen.
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Zusätzlich zu
spezifischen Cytokinen oder Cytokine enthaltenden Überständen können Feederschichten,
zelluläre
Extrakte, die aus anderen Zellen, die an der B-Zelldifferenzierung
beteiligt sind, erhalten worden sind, und/oder Mittel, die B-Zelloberflächenmoleküle vernetzen,
den proliferierenden B-Zellen zur Stimulierung der Differenzierung
zugesetzt werden. Beispielsweise ist es bekannt, dass B-Zellen mit
follikulären,
dentritischen Zellen während
der Reifung in Wechselwirkung treten. Membranextrakte, Kulturüberstände oder
gereinigte Moleküle,
die sich von follikulären
dentritischen Zellen ableiten (auf die gleiche Weise erhalten, wie
es vorstehend für Th2-Überstände beschrieben
worden ist) oder eine Feederschicht von follikulären, dendritischen Zellen können zur
Stimulation der Differenzierung der proliferierenden B-Zellen oder
zur Verstärkung
der Differenzierung, die durch die Verwendung anderer Cytokine,
wie sie vorstehend beschrieben wurden, stimuliert werden, verwendet
werden. Ferner können
Mittel, wie Antikörper,
die Oberflächenrezeptoren
vernetzen, die Differenzierung der proliferierten und proliferierenden
B-Zellen signalisieren (in einigen Fällen induzieren diese Mittel
eine somatische Hypermutation in den CDRs der variablen Regionen
der für
den Antikörper
kodierenden DNA innerhalb der B-Zelle). Von anti-IgD- oder anti-IgM-Antikörpern, die
membrangebundene Ig-Moleküle an der
B-Zelle vernetzen, wurde gezeigt, dass sie einen Klassenwechsel
der sezernierten Antikörper
stimulieren (wobei sie beispielsweise zur Erzeugung hoher Konzentrationen an
IgA-Antikörpern
führen).
-
Die
Cytokine, Zellextrakte/Überstände oder Feederzellen,
die zur Stimulation der Differenzierung verwendet werden, können den
B-Zellen zu zahlreichen verschiedenen Zeitpunkten während der
Züchtung
zugesetzt werden. Beispielsweise können die Cytokine zu Züchtungsbeginn
zugesetzt werden. Bei Anwendung eines derartigen Verfahrens beginnt
die Antikörpererzeugung
normalerweise nach 8 bis 10 Tagen (6, 7, 10 und 13).
Alternativ können
Cytokine während
der Ruhephase oder der Reproliferationsphase zugesetzt werden, wenn
ein mehrstufiges Verfahren herangezogen wird. Der Vorteil einer
mehrstufigen Vorgehensweise besteht darin, dass er die Proliferation
einer anfänglichen
kleinen B-Zellpopulation und/oder deren Selektion vor der Differenzierung
ermöglicht.
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Eine
Vielzahl von Verfahren kann zur Überwachung
der Differenzierung von B-Zellen herangezogen werden. Zu derartigen
Verfahren gehören
(ohne Beschränkung
hierauf) die Prüfung
der morphologischen Eigenschaften der proliferierenden Zellen, Tests,
die die Anwesenheit von Antikörperprotein
bestimmen, Tests auf Zelloberflächenmarker
und Verfahren, die die Anwesenheit von Nucleinsäuresequenzen, die für Antikörper kodieren,
bestimmen (6, 7, 10, 13 und 14).
Der Fachmann kann beliebige dieser Verfahren leicht an die Überwachung
der Differenzierung von proliferierenden B-Zellen, die durch die
hier beschriebenen Verfahren erhalten werden, anpassen.
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Während der
Differenzierung kann es bevorzugt sein, ausgewählte Individuen oder Subpopulationen
der proliferierenden B-Zellen herauszuklonen, um klonale Zelllinien
zu erhalten. Derartige Verfahren lassen sich besonders leicht unter
Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Zellausstrichtechniken
durchführen
(vergl. die 9, 12 und 15).
Der Fachmann kann leicht derartige Klonierungsverfahren auf die
proliferierenden und differenzierenden B-Zellen, die durch die hier
beschriebenen Verfahren erzeugt werden, anwenden.
-
Eine
dritte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beruht auf der Feststellung, dass die Differenzierung
von proliferierenden B-Zellen partiell durch Zusatz eines Antigens
zum Kulturmedium gesteuert werden kann. Speziell kann der prozentuale Anteil
von B-Zellen, die einen für
ein spezifisches Antigen selektiven Antikörper erzeugen, erhöht werden, indem
man dem Kulturmedium während
der Proliferationsphase, der Differenzierungsphase oder der Reproliferationsphase
der hier beschriebenen Verfahren ein Antigen zusetzt.
-
Gemäß der hier
verwendeten Terminologie handelt es sich bei einem Antigen um eine
Verbindung, von der gezeigt worden ist oder es sich zeigen lässt, dass
sie eine Antikörperreaktion
stimuliert, wenn sie einem Säugetierwirt
verabreicht wird. Antigene liegen in einer Vielzahl von Formen vor
und umfassen (ohne Beschränkung
hierauf) Proteine, Kohlenhydrate, synthetische Verbindungen und
Vitaminderivate. Der Fachmann kann leicht bekannte Verfahren anwenden,
um die Antigenizität
einer speziellen Verbindung festzustellen.
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Bei
einer Anwendung des vorstehenden Verfahrens wird ein Antigen dem
Kulturmedium zugesetzt, wenn das Cytokin (oder ein anderes Differenzierungsmittel)
vorhanden ist. Beispielsweise wird bei Verfahren, bei denen das
Cytokin während
der anfänglichen
Proliferation zugesetzt wird, das Antigen in diesem Stadium der
Inkubation zugesetzt. Bei Verfahren, bei denen das Cytokin nach
dem anfänglichen
Proliferationsstadium zugesetzt wird, wird das Antigen in diesem
Stadium zugegeben. Ferner kann der Fachmann leicht bekannte Verfahren
anwenden, um die Antigenizität
eines Antigens zu erhöhen
sowie um zu gewährleisten,
dass das Antigen in Kontakt mit den proliferierenden und differenzierenden
B-Zellen kommt. Zu derartigen Verfahren können die Kupplung des Antigens
an einen Protein- oder Kohlenhydratträger zur Verstärkung von
Eigenschaften, wie Löslichkeit
und Antigenizität,
oder die Kupplung des Antigens an die Oberfläche einer Membran oder einer
Kunststoff-Kulturvertiefung, um selektiv differenzierende B-Zellen
exprimierende Oberflächenantikörper an
das gekuppelte Antigen anzuheften ("Panning"), gehören.
-
Bei
einem Beispiel der Antigenanwendung wird das Antigen an die Membran,
die den hdmb-CD40-Liganden enthält,
gekuppelt. Die Kupplung eines Antigens an den hdmb-CD40-Liganden bewirkt
eine bevorzugte Zielrichtung des hdmb-CD40-Liganden auf B-Zellen,
die das bestimmte Antigen erkennen. Bei einem weiteren Beispiel
werden das Antigen oder der Antigen/hdmb-CD40-Ligand als ein Dextran-Copolymeres
bereitgestellt. Eine Copolymerisation mit Dextran stellt ein bekanntes
Verfahren zur Erhöhung
der Epitopdichte eines Antigens dar, wodurch die Anzahl und der
Grad der verfügbaren
B-Zellkontakte erhöht werden.
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Obgleich
festgestellt wurde, dass eine Antigenstimulation den prozentualen
Anteil an B-Zellen, die unter Erzeugung von gegen das Antigen gerichteten
Antikörpern
differenzieren, gilt eine derartige Bevorzugung nicht vollständig über die
gesamte Population von proliferierenden B-Zellen hinweg. Daher muss
der Fachmann bekannte Klonierungs- oder Panning-Techniken anwenden,
um spezielle Klonierungslinien von differenzierten B-Zellen zu isolieren, die
gegen das zugeführte
Antigen gerichtete Antikörper
erzeugen.
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Die
vorstehenden Verfahren zur Proliferation und Differenzierung können für eine Vielzahl
von Aufgaben und Anwendungsmöglichkeiten
eingesetzt werden. Der Fachmann erkennt leicht den Wert der Tatsache,
dass es möglich
ist, eine große
Anzahl von B-Zellen zu proliferieren und zu erhalten, und insbesondere
von humanen B-Zellen. Speziell entfällt bei derartigen Verfahren
die Notwendigkeit der Immortalisierung von B-Zelllinien, um verwendbare/bearbeitbare
Mengen von Materialien, die sich von B-Zellen ableiten, zu erhalten.
Von B-Zellen abgeleitete Materialien gelten als wertvoll bei der
Entwicklung von pharmazeutischen Verbindungen auf Antikörperbasis.
Vor der Erfindung der Anmelder war die auf humane B-Zellen gerichtete
Forschung eingeschränkt, was
auf die Verfügbarkeit
des Ausgangsmaterials zurückzuführen war.
Erfindungsgemäß werden
nunmehr für
solche Aufgaben Vorräte
an expandierten B-Zellen bereitgestellt.
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Proliferierte
B-Zellen, die differenziert sind oder nicht, können als Quelle für mRNA dienen,
die für
eine Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpermoleküls kodiert. Aufgrund der beschränkten Menge einer
für einen
Antikörper
kodierenden mRNA, die von einer B-Zelle gebildet wird und aufgrund
der polyklonalen Natur und der begrenzten Klonzahl von B-Zellen,
die innerhalb eines Säugetierwirts
gefunden wird, ist es schwierig, ausreichende Mengen einer mRNA,
die für
den gewünschten
Antikörper
kodiert, aus einzelnen B-Zellen zum Einsatz in rekombinanten Antikörper-Produktionstechniken
zu erhalten. Durch Bereitstellung eines Verfahrens zum Proliferieren
und Differenzieren von B-Zellen stellt die vorliegende Erfindung
eine Quelle für
Ausgangsmaterial bereit, das ein Fachmann zur Gewinnung von mRNA, die
für einen
Antikörper
kodiert, verwenden kann.
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Ferner
kann ein Fachmann B-Zellen identifizieren, die zur weiteren Verwendung
mit spezifischen Antigenen reagieren. Bevor man sich mit der gentechnischen
Antikörperbearbeitung
befasst, ist es zu bevorzugen, die Spezifität (welches Antigen erkannt wird)
des durch eine B-Zelle oder einen B-Zellklon erzeugten Antikörpers zu
bestimmen. Obgleich PCR-Verfahren die Isolierung der Nucleotidsequenz, die
für einen
Antikörper
kodiert, aus nur einer einzigen Zelle ermöglichen, sind Zellmassen von
mindestens 100 Zellen erforderlich, um die Natur eines sezernierten
Antikörpers
zu isolieren und zu charakterisieren. Die vorliegende Erfindung
stellt Verfahren zur Gewinnung eines derartigen Materials bereit.
-
Zusätzlich zur
in vitro-Verwendung wird in der Literatur ausgeführt, dass ein CD40-Ligand ein Mittel
zur Proliferation und Aktivierung von B-Zellen innerhalb eines Säugetierwirts
bereitstellt. Im allgemeinen können
pathologische Zustände,
die zu einer Unterdrückung
der B-Zellproliferation und -aktivierung führen, unter Verwendung des
hier beschriebenen hdmb-CD40-Liganden behandelt werden. Durch Bereitstellen
eines hdmb-CD40-Liganden bei einem Säuger können B-Zellpopulationen innerhalb eines Wirts
auf ein Niveau proliferiert werden, das wesentlich über dem
Niveau liegt, das bei bisher produzierten Formen eines CD40-Liganden
gefunden wird. Ferner kann der hdmb-CD40-Ligand zur in vitro-Proliferation und/oder
-Differenzierung von B-Zellen verwendet werden, die dann wieder
dem Wirt, dem sie entnommen worden sind oder einem anderen verträglichen
Wirt zugeführt
werden können.
Ein derartiges Verfahren ermöglicht
die Proliferation von B-Zellen außerhalb des Wirts, wodurch
die Gefahr von negativen Einflüssen
von in vivo-Therapeutika verringert wird.
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Bei
der Versorgung eines Patienten mit dem hdmb-Liganden varriert die
Dosierung des verabreichten Mittels in Abhängigkeit von Faktoren, wie
Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht,
Allgmeinzustand und medizinische Vorgeschichte des Patienten und dergl.
Im allgemeinen ist es erstrebenswert, den Empfänger mit einer Dosierung des
Mittels im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des
Patienten) zu versorgen, obgleich auch niedrigere und höhere Dosen
verabreicht werden können.
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Die
therapeutisch wirksame Dosis kann bei Verwendung der vorstehend
beschriebenen Zusammensetzung in Kombination mit einem anderen Mittel,
das eine immunostimulatorische Aktivität besitzt (z. B. II-4, IL-14,
ein spezifisches Antigen oder ein anti-Immunoglobulin-Antikörper), gesenkt
werden. Die hier verwendete Ausdrucksweise, dass zwei oder mehr
Verbindungen "in
Kombination" miteinander
zu verabreichen sind, bezieht sich auf die Fälle, dass (1) die physiologischen
Wirkungen der einzelnen Verbindungen oder (2) die Serumkonzentrationen
der einzelnen Verbindungen gleichzeitig gemessen werden können.
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Die
hier beschriebenen Mittel sollen bei den Empfängern in einer ausreichenden
Menge bereitgestellt werden, um die Anzahl der B-Zellen im Wirt
zu erhöhen.
Die Verabreichung der hier beschriebenen Mittel kann zu prophylaktischen
oder therapeutischen Zwecken erfolgen. Bei prophylaktischer Verwendung
werden die Mittel vor einem etwaigen Absinken der Anzahl an B-Zellen oder Antikörper-Serumspiegel
im Wirt bereitgestellt. Die prophylaktische Verabreichung des oder
der Mittel dient dazu, eine etwaige anschließende Verringerung der B-Zellzahl
zu verhindern oder abzuschwächen.
Bei therapeutischer Anwendung werden das oder die Mittel beim Einsetzen
(oder kurz danach) einer Verringerung der Anzahl an B-Zellen oder
Antikörper,
die in einer Blutprobe vorhanden sind, verabreicht. Die therapeutische
Verabreichung der Verbindungen) dient dazu, jede tatsächliche
Verringerung der B-Zellzahl oder Antikörperspiegel abzuschwächen.
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Die
hier beschriebenen Mittel werden einem Säuger in einer pharmazeutisch
verträglichen
Form und in einer therapeutisch wirksamen Konzentration verabreicht.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmakologisch
verträglich" bezeichnet, wenn
ihre Verabreichung vom Empfänger
toleriert werden kann. Von der Verabreichung einer "therapeutisch wirksamen
Menge" eines derartigen
Mittels spricht man, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant
ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit
zu einer nachweisbaren Veränderung
der Physiologie eines Patienten führt.
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Die
hier beschriebenen Mittel können
nach bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch wertvollen
Zusammensetzungen zubereitet werden, wobei diese Materialien oder
ihre funktionellen Derivate im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen
Trägervehikel
vereinigt werden. Geeignete Vehikel und ihre Zubereitung, einschließlich anderer
humaner Proteine, z. B. Humanserumalbumin, werden beispielsweise
in Remington's Pharmaceutical
Sciences (16. Auflg., A. Osol, Hrsg., Mack, Easton, PA (1980)) beschrieben.
Um eine pharmazeutisch verträgliche
Zusammensetzung zu bilden, die sich für eine wirksame Verabreichung
eignet, enthalten derartige Zusammensetzungen eine wirksame Menge
von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Mittel zusammen mit einer
geeigneten Menge eines Trägervehikels.
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Weitere
pharmazeutische Verfahren können zur
Steuerung der Wirkungsdauer herangezogen werden. Präparate mit
kontrollierter Freisetzung lassen sich unter Vewrendung von Polymeren
erhalten, um eines oder mehrere der hier beschriebenen Mittel zu
komplexieren oder absorbieren. Die kontrollierte Abgabe kann vorgenommen
werden, indem man entsprechende Makromoleküle (z. B. Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon,
Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder
Protaminsulfat) und die Konzentration von Makromolekülen sowie
die Verfahren zur Einverleibung, um die Freisetzung zu kontrollieren,
auswählt.
Ein weiteres mögliches
Verfahren, die Wirkungsdauer durch Präparate mit kontrollierter Freisetzung
zu steuern, besteht in der Einverleibung der hier beschriebenen
Mittel in Teilchen eines polymeren Materials, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele,
Poly-(milchsäure) oder
Ethylen-Vinylacetat-Copolymere. Alternativ ist es anstelle einer
Einverleibung dieser Mittel in polymere Teilchen möglich, diese
Materialien in Mikrokapseln einzuschließen, die beispielsweise durch Koazervierungstechniken
oder durch Grenzflächenpolymerisation
hergestellt worden sind, z. B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln und
Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln,
oder in kolloidalen Arzneistoff-Abgabesystemen,
z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen.
Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflg.,
A. Osol Hrsg., Mack, Easton, PA (1980) beschrieben.
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Im
Anschluss an diese allgemeine Beschreibung der Erfindung ergibt
sich ein leichteres Verständnis
unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die der Erläuterung
dienen und den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken sollen,
sofern nichts anderes angegeben ist.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Identifikation von Faktoren,
die bei der B-Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind.
-
A. Trennung von Zellkontakt-
und Lymphokin-Signalen
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Obgleich
die Rolle von Lymphokinen anscheinend in einer Induktion der B-Zelldifferenzierung
und nicht in einer Einleitung von Aktivierungsereignissen besteht,
erscheinen sowohl der Zellkontakt als auch Lymphokine für die Erzeugung
einer Antikörperreaktion
als wesentlich. Ob Zellkontakt- und Lymphokin-Signale charakteristische
Wirkungen auf ruhende B-Zellen ausüben, bedurfte noch einer klaren
Bewertung. Ferner war die Identität der Lymphokine, die die B-Zellaktivierung,
Differenzierung und den Isotyp-Wechsel stützten, nicht klar. Da der Th2-Zellklon
D10 sämtliche
erforderlichen Kontakt- und Lymphokinabhängigen Signale an ruhende B-Zellen
liefern konnte, wurde dieser antigenspezifische Klon für anfängliche
Untersuchungen und die Präparation
von Plasmamembranen ausgewählt. Eine
antigenunabhängige
Aktivierung von D10-Zellen
wurde durch Inkubation von Zellen entweder mit dem Mitogen Concanavalin
A (Con A) oder mit anti-CD3-Antikörpern, die an Kunststoffschalen
adsorbiert waren, erreicht. Nach der Ernte wurden die Zellen zur
Herstellung von Membranvesikeln, die in Bezug auf Plasmamembranen
angereichert waren, gemäß den Angaben
von A. A. Brian, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S.
564–568),
verwendet. Der Kulturüberstand
wurde als Quelle für
Th2-Lymphokine verwendet,
wobei eine Ultrazentrifugation zur Entfernung etwaiger Membrankomponenten
und eine Absorption von etwaigem verbleibendem Con A durchgeführt wurde.
Weitere Untersuchungen bedienten sich ähnlicher Verfahren zur Herstellung
von in Bezug auf Plasmamembran angereicherten Fraktionen (Noelle
et al., J. Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1118–1124; Sekita et al., Eur.
J. Immunol., Bd. 18 (1988), S. 1405–1410).
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1. Rolle des Zellkontakts
-
Aus
aktivierten D10-Th-Zellen präparierte Membranen
induzierten eine starke Proliferation von kleinen ruhenden B-Zellen.
Die stimulatorische Aktivität
war 3 Stunden nach Th-Zellaktivierung mit Con A nachweisbar und
erreichte nach 6 Stunden ein Maximum und fiel dann auf niedrige
Werte ab. Diese Kinetik folgte eng der Kinetik der Lymphokin-Erzeugung
durch die gleichen Zellen, was auf einen gemeinsamen regulatorischen
Weg sowohl für
Zelloberflächen-
als auch sezernierte B-Zell-Stimulationskomponenten schließen lässt (Hodgkin
et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034). Ein weiterer Hinweis
auf einen gemeinsamen Signalgebungsweg bestand darin, dass der Immunophilinbindende,
immunosuppressive Arzneistoff Cyclosporin A (Bram et al., Molec.
Cell. Biol., Bd. 13 (1993), S. 4760–4769) sowohl die Lymphokin-Sekretion
als auch die Induktion der B-Zellen-Stimulationsaktivität hemmte
(P. D. Hodgkin und M. R. Kehry, Advances in Molec. Cell. Immunol.,
Bd. IA, S. 127–160,
Greenwich, CT: JAI Press, Inc. (1993)). Ähnlich den frühen Ergebnissen von
Stallcup et al. über
die nicht-spezifischen Hemmeigenschaften von Plasmamembranen (Stallcup
et al., Cell. Immunol., Bd. 89 (1984), S. 144–150) erzeugten hohe Dosen
von Membranen aus aktivierten Th-Zellen eine nicht-spezifische Hemmwirkung
auf die B-Zellproliferation (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145
(1990), S. 2025–2034).
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Ein
auffallendes Merkmal der B-Zellaktivierung durch Th-Membranen bestand
darin, dass sie antigenunabhängig
und MHC-unbeschränkt
war. In Einklang mit diesen Beobachtungen war die Th-Membranstimulation
polyklonal und induzierte bei bis zu 70 % der kleinen ruhenden B-Zellen
einen Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus innerhalb von 48 Stunden
der Stimulation (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S.
2025–2034).
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Ferner
handelte es sich bei der induzierten Aktivität offensichtlich um ein nicht
beschriebenes Molekül,
da es nicht durch Antikörper
gegen in Frage stehende Moleküle,
z. B. Klasse II-MHC, T-Zellrezeptor, CD4, LFA-1, Thy-1 oder CD28,
blockiert wurde. Somit schien das Kontaktsignal in Abwesenheit von Lymphokinen
sämtliche
erforderlichen Signale für
die Induktion der polyklonalen B-Zellen-DNA-Synthese zu liefern.
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B-Zellen,
die durch aktivierte Th-Zellmembranen stimuliert waren, sezernierten
kein Immunoglobulin, wenn nicht der Lymphokin enthaltende Überstand
von D10-Zellen der Kultur zugesetzt wurde. Bemerkenswerterweise
glichen die Mengen der erzeugten Hauptimmunoglobulin-Isotypen (IgM,
IgG1 und IgE) den Mengen, die durch B-Zellen, die direkt durch intakte
D10-Zellen stimuliert worden waren, erzeugt wurden. Somit schien
die antigenunabhängige Aktivierung
von B-Zellen durch Th-Membranen und Lymphokine sämtliche Signale zu liefern, die
für die Induktion
der B-Zellproliferation, den Immunoglobulin-Klassenwechsel und die
Differenzierung zur Immunoglobulin-Sekretion erforderlich waren
(Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034; Noelle
et al., J. Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1118–1124).
-
2. Rolle von Lymphokinen
-
Die
Zellklone lassen sich aufgrund ihres Lymphokin-Sekretionsprofils
im Anschluss an die Aktivierung einteilen (Mosmann & Coffman, Annu.
Rev. Immunol., Bd. 7 (1989), S. 145–173). Die Th1 T-Zellen sezernieren
in besonderer Weise IL-2 und IFN-γ und
sind im allgemeinen schlechte Stimulatoren der in vitro-B-Zellen-Immunoglobulinsekretion.
Th2-Zellen sezernieren IL-4 und IL-5 und induzieren eine starke
Immunoglobulinsekretion aus B-Zellen. Die verschiedenen Fähigkeiten
zur Induktion der Immunoglobulinsekretion könnten entweder auf Unterschiede
in den sezernierten Lymphokinen oder auf eine Behinderung der Th1-Zellen
zur Erzeugung geeigneter stimulatorischer Zelloberflächenliganden
zurückzuführen sein.
Um diese Möglichkeiten
zu testen, wurden Membranen aus sechs verschieden aktivierten Th1-Zellklonen
hergestellt. Sie stimulierten jeweils eine starke B-Zellen-Proliferation
und wie bei Th2-Membranen induzierten die Th1-Membranen allein keine
Immunoglobulinsekretion (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 147 (1991),
S. 3696–3702).
Wenn Überstände von
aktivierten Th2-Zellen
zu Th1-Membranen gegeben wurden, waren die durch B-Zellen sezernierten
Immunoglobulin-Isotopen identisch mit denen, die im Anschluss an
eine Aktivierung mit Th2-Membranen und Th2-Lymphokinen sezerniert wurden.
Ferner waren Lymphokin enthaltende Überstände von jedem der Th1-Zellklone
nicht befähigt, eine
Immunoglobulinsekretion aus B-Zellen zu induzieren, die mit Membranen
stimuliert worden waren, die entweder aus Th1- oder Th2-Zellen hergestellt worden
waren (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 147 (1991), S. 3696–3702).
Daher hat es den Anschein, dass das Lymphokin-Repertoire von Th1-Zellen und nicht
die Unfähigkeit
zur Bereitstellung von kontaktabhängigen Signalen dafür verantwortlich
ist, dass Th1-Zellen in vitro schlechte B-Zellstimulatoren sind.
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Die
Th2-Lymphokine IL-4 und IL-5 spielten beide eine Rolle bei der Erzielung
der Differenzierung von Membran-stimulierten B-Zellen zur Immunoglobulin-Sekretion.
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Die
Kombination von rekombinantem IL-4 und IL-5 reproduzierte die Fähigkeit
von Th2-Überständen zur
Induktion der IgM-, IgG1- und IgE-Synthese, und anti-IL-4-Antikörper verhinderten
vollständig
die Immunoglobulinsekretion (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145
(1990), S. 2025–2034;
Noelle et al., J. Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1118–1124 (unveröffentlichte
Ergebnisse)). Die Cytokine, die für die humane B-Zellproliferation
verwendet werden, können
sich von den Cytokinen unterscheiden, die für die murine Zelldifferenzierung
eingesetzt werden. Eine ausführlichere
Untersuchung der Kombination von IL-4 und IL-5 ergab, dass der Einfluss
von jedem dieser Lymphokine recht kompliziert war. IL-4 allein verstärkte die
B-Zellproliferation, die durch Th-Zellmembranen induziert wird (Hodgkin
et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034). IL-4 war für den Eintritt von
B-Zellen in die S-Phase des Zellzyklus nicht wesentlich, erhöhte aber
die Empfindlichkeit von B-Zellen auf den Th-Membran-Stimulus um
etwa das 10-fache.
Im Gegensatz dazu besaßen
andere Lymphokine, einschließlich
IL-5, keinen Einfluss auf die Th-Membran-induzierte Proliferation.
IL-4 allein konnte ferner Membran-stimulierte B-Zellen zur Induktion
der Sekretion von Immunoglobulin veranlassen (Hodgkin et al., J.
Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034). Es bestand jedoch eine
ausgeprägte Dosis-Wirkungs-Disparität; die Verstärkung der B-Zellproliferation
erforderte 100-fach weniger II-4 als die Induktion der Immunoglobulinsekretion.
Der Einfluss von IL-5 schien die Fähigkeit von IL-4 zur Induktion
der B-Zelldifferenzierung zur Immunoglobulinsekretion zu verstärken und
zeigte die größte Wirkung
bei niedrigen IL-4-Konzentrationen. Ferner ist es klar, dass die
Unfähigkeit
von IL-4 allein, Th1-Membran-stimulierte B-Zellen zur Sekretion von Immunoglobulin
zu veranlassen (Noelle et al., J. Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1118–1124; Hodgkin
et al., J. Immunol., Bd. 147 (1991), S. 3696–3702) sowohl durch diese Dosis-Wirkungs-Disparität als auch durch
die Anwesenheit von restlichem IFN-γ in Th1-Membranvesikeln erklärbar ist,
da durch Th1-Membranen und IL-4 stimulierte B-Zellen in Gegenwart
von anti-IFN-γ große Mengen
an Immunoglobulin synthetisieren (unveröffentlichte Beobachtungen).
-
Die
Fähigkeit
des Th-Membransystems einzelne Ereignisse der B-Zellaktivierung zu trennen, ermöglichte
es uns festzustellen, wann Lymphokine zur Induktion der Immunoglobulinsekretion
erforderlich waren. Durch Initiieren von Kulturen mit Th-Membranen
und durch Zugabe oder Entfernen von D10-Überstand
zu verschiedenen Zeitpunkten stellten wir fest, dass Lymphokine
in kritischer Weise während
eines Zeitfensters erforderlich waren, das eng der Periode der B-Zellproliferation
entsprach (Hodgkin et al., Eur. J. Immunol., Bd. 24 (1994), S. 239–246). Diese
Experimente zeigten, dass die von Lymphokin abhängige Festlegung zur Differenzierung
zu einer Immunoglobulinsezernierenden Zelle vor der ersten Runde
der Zellteilung erfolgte. Ferner war die Wahrscheinlichkeit von
Zellen zur Differenzierung zur Sekretion von IgE um so größer, je
länger die
Zellen den Lymphokinen während
der Proliferation ausgesetzt waren. Untersuchungen über den
zeitlichen Verlauf zeigten, dass IgM- sezernierende Zellen zuerst in Kulturen
am dritten Tag auftraten und den IgG1-sezernierenden Zellen um 24 Stunden
vorausgingen. IgE-sezernierende Zellen traten am 5. Tag auf und
nahmen zahlenmäßig mit
der Abnahme der Anzahl der IgM-sezernierenden Zellen zu.
-
B. Architektur der B-Zellaktivierung
durch Th-Zellmembranen
-
Zahlreiche
Merkmale des Mechanismus, nach dem Moleküle B-Zellen aktivieren, wurden durch
Untersuchungen charakterisiert, die ursprünglich dafür vorgesehen waren, biochemisch
Th-Zelloberflächenmoleküle in Membranvesikeln
zu isolieren und zu rekonstituieren. Ursprünglich wurde gezeigt, dass
eine Detergens-Solubilisierung von Th-Membranen die Fähigkeit
dieser Membranen zur Aktivierung von ruhenden B-Zellen beseitigt.
Jedoch konnte eine lösliche
Fraktion dazu verwendet werden, mit der Fähigkeit von intakten Th-Membranen
zur Stimulation der B-Zellproliferation zu konkurrieren (M. R. K.,
unveröffentlichte
Feststellungen). Da ein Waschen von Th-Membranen mit 3M Salzlösungen keinen
Einfluss auf die Aktivität
hatte (M. R. K., unveröffentlichte
Ergebnisse), schienen die B-Zellen-aktivierenden Moleküle integrale
Membranproteine zu sein.
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Der
physikalische Charakter von aktiven Th-Membranvesikeln wurde geprüft, indem
man die Membranaktivität
zu verschiedenen Zeitpunkten während
der Präparation
und nach einer kurzen Ultraschallbehandlung testete. Parallel mit
den biologischen Tests wurde eine Transmissionselektronenmikroskopie
an jedem Membranpräparat
durchgeführt
(Kehry et al., "Mechanisms
of Lymphocyte Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications,
Plenum Press, New York (1992), S. 139–148). Es wurde festgestellt,
dass Membranvesikel, die frisch hergestellt und auf einem Saccharosekissen
zentrifugiert worden waren, wenig Aktivität enthielten und großenteils
vereinzelt und nicht-aggregiert waren. Nach Ultrazentrifugation
zu einem Pellet und nach Resuspension wiesen diese Vesikel eine maximale
Aktivität
in Bezug auf eine Stimulation der B-Zellproliferation auf und bestanden
aus zahlreichen, äußerst großen Aggregaten.
Gleichermaßen verringerte
eine Ultraschallbehandlung von aktiven Membranvesikeln ihre Aktivität und führte zur
Bildung von kleinen, nicht aggregierten Vesikeln. Eine Ultrazentrifugation
von der Ultraschallbehandlung unterzogenen Vesikeln stellte die
vollständige
Aktivität wieder
her und erzeugte größere Aggregate
(Kehry et al., "Mechanisms
of Lymphocyte Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications,
Plenum Press, New York (1992), S. 139–148). Diese Ergebnisse ließen darauf
schließen,
dass Th-Membranvesikel
mit einer maximalen B-Zellstimulationsaktivität tatsächlich Vesikelaggregate mit
der Fähigkeit zur
weitgehenden Vernetzung der B-Zelloberfläche waren.
-
Die
Bindung und das Schicksal der Th-Membranvesikel in Kulturen mit
ruhenden B-Zellen wurden ebenfalls geprüft. B-Zellen konnten durch
Färbung
mit anti-B220-Antikörper
sichtbar gemacht werden, und da anti-CD4 die Fähigkeit der Th-Membranen zur
Aktivierung von B-Zellen nicht blockierte (Hodgkin et al., J. Immunol.,
Bd. 145 (1990), S. 2025–2034),
konnte anti-CD4 zur Sichtbarmachung von Th-Membranvesikeln, die
an B-Zellen gebunden waren, verwendet werden. Die weitgehend aggregierten
Th-Membranen konnten durch eine 24-stündige Kultur an B-Zellen gebunden
werden und die Aggregation der B-Zellen wurde durch eine 72-stündige Kultur
in maximaler Weise induziert. Obgleich im Verlauf von 4 Tagen (zu
diesem Zeitpunkt trat eine maximale B-Zellproliferation auf) die
Th-Membranvesikel desaggregierten, wurde ein Kontakt zwischen Th-Membranen
und den B-Zellen aufrechterhalten und es wurde keine Aufnahme oder
Bedeckung von Membranvesikeln beobachtet (Kehry et al., "Mechanisms of Lymphocyte
Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications, Plenum Press, New
York (1992), S. 139–148).
-
Ferner
wurde festgestellt, dass durch Waschen von mit Th-Membranen stimulierten
B-Zellen mit eiskaltem Pufer mit einem Gehalt an Chelatbildnern
für zweiwertige
Metalle die funktionelle B-Zellstimulation gestoppt werden konnte.
Dies wurde herangezogen, um die Länge der Th-Membran-B-Zellen-Kontaktzeit
festzustellen, die für
die Induktion der B-Zellproliferation erforderlich war. Th-Membranen wurden
nach verschiedenen Züchtungszeiten
gewaschen. Es wurde festgestellt, dass, obgleich ein Kontakt früh erfolgte,
eine längere
Kontaktperiode (24–36 Stunden)
zwischen B-Zellen und Th-Membranen erforderlich war, um ein maximales
B-Zellwachstum zu induzieren. Dies lässt darauf schließen, dass
ruhende B-Zellen eine kontinuierliche Signalgebung während dieser
Zeitspanne benötigen,
um eine Induktion der DNA-Synthese zu erreichen (Kehry et al., "Mechanisms of Lymphocyte
Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications, Plenum Press,
New York (1992), S. 139–148).
Somit benötigten
B-Zellen aktivierende Moleküle
zur umfangreichen Vernetzung der B-Zelloberfläche und zur Bereitstellung
von funktionellen Signalen mindestens 24 Stunden, um ruhende B-Zellen
zur Proliferation anzutreiben.
-
C. Identität eines
Rezeptor-Liganden-Paares
-
Eine
anfängliche
Charakterisierung der B-Zellen aktivierenden Moleküle, die
bei der Abgabe des Kontaktsignals an ruhende B-Zellen beteiligt sind,
ergab sich aus biochemischen Untersuchungen über aktive Th-Zellmembranen
(Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034).
Unter Anwendung zahlreicher Wasch-, Proteolyse- und Detergenssolubilisierungstechniken
wurde festgestellt, dass B-Zellen aktivierende Moleküle integrale
Membranproteine darstellen, die für ihre Expression neue m-RNA
und eine neue Proteinsynthese benötigen. In jeglicher Hinsicht
handelt es sich bei B-Zellen aktivierenden Molekülen um Lymphokin-artige Komponenten
der aktivierten Th-Zellmembran (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd.
145 (1990), S. 2025–2034):
sie wurden de novo nach Th-Zellaktivierung
synthetisiert; ihre Synthese durch aktivierte Th-Zellen war rasch
und vorübergehend;
und sie übten
ihre Einflüsse
auf andere Zelltypen in einer nicht-verwandten Art und Weise aus.
In einem ersten Schritt zur Identifizierung der B-Zellen aktivierenden
Moleküle
isolierten Lederman et al. einen Antikörper gegen ein Th-zellspezifisches Molekül, das alle
vorstehenden Eigenschaften aufwies (Lederman et al., J. Exp. Med.,
Bd. 175 (1992), S. 1091–1101).
Eine gleichzeitige Herangehensweise zog mögliche Kandidaten für einen
konstitutiv exprimierten Rezeptor für B-Zellen aktivierende Moleküle auf der
Oberfläche
von ruhenden B-Zellen
in Betracht. Mehrere Beweisketten ließen darauf schließen, dass
das CD40-Molekül
ein mutmaßlicher B-Zellrezeptor
für die
Aktivierung von B-Zellen war. Eine Stimulation von humanen B-Zellen
durch Antikörper
gegen CD40 in Gegenwart von Lymphokinen schien zahlreiche Merkmale
der Th-abhängigen B-Zellaktivierung,
-proliferation und -differenzierung zu reproduzieren (Jabara et
al., J. Exp. Med., Bd. 172 (1990), S. 1861–1864; Rousset et al., J. Exp.
Med., Bd. 173 (1991), S. 705–710;
Zhang et al., J. Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1836–1842; Banchereau
et al., Science, Bd. 251 (1991), S. 70–72). CD40 gehört zu der
TNF-Rezeptorfamilie,
deren Mitglieder durch wiederholte, Cys-reiche, extrazelluläre Domänen gekennzeichnet
sind. Aufgrund von funktioneller Homologie zum TNF-Rezeptor wurde eine
Suche nach einem löslichen
Liganden für
CD40 unternommen (E. A. Clark, Tiss. Antigens, Bd. 35 (1990), S.
33–36).
Jedoch machte es die Aktivität
von anti-CD40-Antikörper
und die Fähigkeit
dieser Antikörper,
die an Fc-Rezeptor exprimierenden L-Zellen immobilisiert waren, zur
Induktion eines Langzeitwachstums von humanen B-Zellen (Banchereau
et al., Science, Bd. 251 (1991), S. 70–72 möglich, dass ein Ligand für CD40 membrangebunden
sein konnte.
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Mehrere
Laboratorien erzeugten eine lösliche
Form von CD40, die die extrazelluläre Domäne von humanem CD40 mit dem
Fc-Bereich von humanem IgG1 verknüpfte (Fanslow et al., J. Immunol., Bd.
149 (1992), S. 655–660;
Castle et al., J. Immunol. Bd. 151 (1993), S. 1777–1788).
Dieses Fusionsprotein war zu einer Blockade der Th-zellabhängigen B-Zellaktivierung
befähigt
(Castle et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 1777–1788; Noelle
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 6550–6554) und
wurde zur Identifizierung und Klonierung eines Liganden für CD40 verwendet
(Armitage et al., Nature, Bd. 357 (1992), S. 80–82). Der CD40-Ligand wurde
als ein Glycoprotein mit einem MG von 33 000–35 000 identifiziert, das
nicht kovalent mit anderen Proteinen assoziiert war und durch aktivierte T-Zellen
exprimiert wurde. Wenn der rekombinante CD40-Ligand an der Oberfläche von
Fibroblasten exprimiert wurde, war er zur Stimulation der B-Zellproliferation
befähigt,
wenngleich auch in relativ niederen Konzentrationen (Armitage et
al., Nature, Bd. 357 (1992), S. 80–82). Gleichzeitig wurden Antikörper erzeugt,
die sowohl humane (Lederman et al., J. Exp. Med., Bd. 175 (1992),
S. 1091–1101)
als auch murine (Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd.
89 (1992), S. 6550–6554)
B-Zellen aktivierende Moleküle
erkannten. Diese Antikörper
wiesen die Fähigkeit zur
Blockade der Th-zellabhängigen
B-Zellaktivierungsereignisse
auf und es wurde gezeigt, dass sie den Liganden für CD40 erkennen.
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Der
CD40-Ligand weist sämtliche
Eigenschaften von B-Zellen aktivierenden Molekülen und eines membranassoziierten
Lymphokins auf (Farrah & Smith,
Nature, Bd. 358 (1992), S. 26). Das auffallendste Strukturmerkmal
des CD40-Liganden
liegt in seiner Homologie zu TNF-α und
TNF-β (Farrah & Smith, Nature,
Bd. 358 (1992), S. 26; Smith, Cell, Bd. 76 (1994), S. 959–962) und
in seiner mutmaßlichen Orientierung
als ein Membranglycoprotein vom Typ 2. Es wurde festgestellt, dass
die Regulierung der Expression des CD40-Ligandengens in Th-Zellklonen ähnlich wie
bei der IL-2-Genregulation ist (Castle et al., J. Immunol., Bd.
151 (1993), S. 1777–1788),
was erneut darauf schließen
lässt,
dass der CD40-Ligand ein
Mitglied einer neuen Klasse von membranassoziierten Lymphokinen
ist. Dies wird durch die kürzlich erfolgte
Klonierung von verwandten Zelloberflächenliganden für zwei weitere
Mitglieder der TNF-Rezeptorfamilie gestützt, nämlich CD27 (Goodwin et al., Cell,
Bd. 73 (1993), S. 447–456)
und CD30 (Smith et al., Cell, Bd. 73 (1993), S. 1349–1360).
Die kritische Rolle des CD40-Liganden bei der Th-zellabhängigen B-Zellaktivierung
wurde durch Korrelation bei einer Immunmangelkrankheit, dem X-verknüpften Ultra-IgM-Syndrom, mit einer
mangelnden Expression von funktionellen CD40-Liganden an Th-Zellen
nachgewiesen. Der Defekt ergibt sich aus einer Vielzahl von Mutationen
im CD40-Ligandengen (Allen et al., Science, Bd. 259 (1993), S. 990–993; Aruffo
et al., Cell, Bd. 72 (1993), S. 291–300; Korthauer et al., Nature,
Bd. 361 (1993), S. 539–541;
DiSanto et al., Nature, Bd. 361 (1993), S. 541–543). Dieses Syndrom ist durch
das Fehlen von umgestellten IgG-, IgA- und IgE-sezernierenden B-Zellen
und durch einen Mangel des entsprechenden Antikörpers charakterisiert.
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Neuere
Untersuchungen über
verschiedene Formen von rekombinanten, humanen und murinen CD40-Liganden
haben unser Verständnis
für die
Anforderungen von ruhenden B-Zellen für eine Induktion der Aktivierungs-
und Proliferationsereignisse vertieft. Als ein Fusionsprotein mit
der extrazellulären Domäne von CD8a
wurde für
den löslichen
CD40-Liganden ein geringer Aktivitätsgrad in Bezug auf die Stimulierung
der B-Zellproliferation festgestellt (Laue et al., J. Exp. Med.,
Bd. 177 (1993), S. 1209–1213; Hollenbaugh
et al., EMBO J., Bd. 11 (1992), S. 4313–4321). Bei fehlender externer
Vernetzung wirkte der lösliche
CD40-Ligand vorwiegend als ein Costimulator der B-Zellproliferation
in Verbindung mit Phorbolestern, anti-CD20, oder anti-μ (Lane et
al., J. Exp. Med., Bd. 177 (1993), S. 1209–1213; Hollenbaugh et al.,
EMBO J., Bd. 11 (1992), S. 4313–4321). Wir
haben beobachtet, dass das CD8-CD40-Ligandenfusionsprotein dazu
befähigt
ist, die Proliferation von ruhenden B-Zellen erst nach einer Vernetzung mit
anti-CD8 oder bei Verwendung als Costimulator mit Th2-Lymphokinen anzutreiben
(B. Castle und M. R. K., Sem. Immunol., Bd. 6 (1994), S. 287–294) oder nach
Oberflächen-IgM-
oder IgD-Vernetzung (C. M. Snapper et al., J. Immunol., Bd. 154
(1995), S. 1177–1187).
Da lösliches
CD40 nicht monomer ist (B. Castle und M. R. K., unveröffentlichte
Feststellungen), lässt
dies darauf schließen,
dass ruhende B-Zellen ein hohes Maß an CD40-Vernetzung zur Induktion
der Proliferation benötigen.
Ferner scheint IL-4 die Empfindlichkeit von ruhenden B-Zellen auf geringe
Grade der CD40-Vernetzung zu erhöhen, wie
unter Verwendung von anti-CD40-Antikörpern festgestellt wurde (E.
A. Clark, Tiss. Antigens, Bd. 35 (1990), S. 33–36; Rousset et al., J. Exp.
Med., Bd. 173 (1991), S. 705–710;
Gordon et al., Eur. J. Immunol., Bd. 17 (1987), S. 1535–1538). Ähnliche
Reaktionen wurden unter Verwendung von IL-4- und anti-μ-Antikörpern festgestellt
(Hodgkin et al., Cell. Immunol., Bd. 134 (1991), S. 14–30). Somit
scheint unter Bedingungen, die eine weitgehende Vernetzung induzieren,
der CD40-Ligand zur Aktivierung von ruhenden B-Zellen ausreichend
zu sein. Unter suboptimalen Vernetzungsbedingungen wirkt der CD40-Ligand
als Costimulator mit Lymphokinen oder anderen B-Zelloberflächenmolekülen. Welche
Bedingungen der B-Aktivierung den Bedingungen ähnlich sind, die durch normale
Th-Zellen induziert werden, bleibt noch zu ermitteln.
-
Die
Fähigkeit
von Th2-Lymphokinen zur Costimulation der B-Zellproliferation mit
dem löslichen CD40-Liganden
liefert eine Erklärung
für die
Diskrepanz der Wirkungen von IL-4 auf die durch Th-Membranen induzierte
B-Zellproliferation (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990),
S. 2025–2034;
Noelle et al., J. Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1118–1124).
In einer Untersuchung wurde festgestellt, dass Th-Membranen dazu
befähigt
sind, einen Anstieg der NA-Synthese
in ruhenden B-Zellen zu stimulieren, jedoch für die Durchführung der
DNA-Synthese die Zugabe von IL-4 benötigten (Noelle et al., J. Immunol., Bd.
146 (1991), S. 1118–1124).
In einer anderen Untersuchung wurde festgestellt, dass Th-Membranen zur
Stimulation der B-Zellproliferation in Abwesenheit von zugesetzten
Lymphokinen befähigt
sind, obgleich IL-4 in signifikanter Weise die B-Zellproliferation verstärkte (Hodgkin
et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034). Es ist nunmehr bekannt,
dass die rekombinante Membranform des CD40-Liganden allein zur Stimulation der
B-Zellproliferation befähigt ist
(Armitage et al., Nature, Bd. 357 (1992), S. 80–82) (vergl. die nachstehenden
Ausführungen).
Es hat den Anschein, dass die zur Präparation von Th-Membranen in
den beiden Untersuchungen eingesetzten Verfahren sich möglicherweise
insofern unterschieden, als in einem Fall, bei dem ein unterschiedliches Homogenisierungsverfahren
an aktivierten Th-Zellen durchgeführt wurde (Noelle et al., J.
Immunol., Bd. 146 (1991), S. 1118–1124) möglicherweise kleinere, weniger
aggregierte Vesikel erhalten wurden. Dies stünde in Analogie zu ultraschallbehandelten Th-Membranvesikeln
gemäß den vorstehenden
Angaben (Kehry et al., "Mechanisms
of Lymphocyte Activation and Immune Regulation IV": Cellular Communications,
Plenum Press, New York (1992), S. 139–148) oder zu löslichem
CD40-Liganden und würde
eine Costimulation zur Induktion der B-Zellproliferation erfordern.
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Der
CD40-Ligand wurde ferner vorübergehend
als Membranform in Fibroblasten exprimiert. Obgleich dieses Material
ebenfalls zur Induktion der B-Zellproliferation
ausreichend ist, ist das Ausmaß der
Reaktion im Vergleich zu der mit intakten Th-Zellen erhaltenen Reaktion
stark verringert (Armitage et al., Nature, Bd. 357 (1992), S. 80–82; Grabstein
et al., J. Immunol., Bd. 150 (1993), S. 3141–3147). In Gegenwart der geeigneten
Lymphokine und des rekombinanten Membran-CD40-Liganden erfolgt eine B-Zelldifferenzierung
(Grabstein et al., J. Immunol., Bd. 150 (1993), S. 3141–3147; Armitage
et al., J. Immunol., Bd. 150 (1993), S. 3671–3680; Spriggs et al., J. Exp.
Med., Bd. 176 (1992), S. 1543–1550;
Maliszewski et al., Eur. J. Immunol., Bd. 23 (1993), S. 1044–1049).
Es hat jedoch den Anschein, dass einige Unterschiede in den Lymphokin-Anforderungen zwischen
B-Zellen, die mit Th-Zellen stimuliert sind und rekombinantem CD40-Liganden bestehen (Grabstein
et al., J. Immunol., Bd. 150 (1993), S. 3141–3147; Armitage et al., J.
Immunol., Bd. 150 (1993), S. 3671–3680). Neuere Untersuchungen
haben eine Diskrepanz zwischen dem Grad der CD40-Ligandenexpression und der Fähigkeit
von Th-Zellen, die B-Zellproliferation anzutreiben, ergeben (Castle
et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 1777–1788; Roy et al., J. Immunol.,
Bd. 151 (1993), S. 2497–2510).
Es hat den Anschein, dass der neu synthetisierte CD40-Ligand in
Th-Zellen nicht vollständig
kompetent ist, um das Kontaktsignal an ruhende B-Zellen abzugeben.
Möglicherweise
gibt es bestimmte Erfordernisse für Assoziationen mit anderen
Th-Zelloberflächenproteinen
(d. h. ein Costimulator für
B-Zellen aktivierende Moleküle)
oder für
die Aggregation des neu synthetisierten CD40-Liganden mit sich selbst
oder mit dem Zytoskelett (Castle et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993),
S. 1777–1788).
Es ist möglich,
dass eine bestimmte Dichte des CD40-Liganden kritisch in Bezug auf
die Induktion maximaler B-Zellreaktionen ist. Aus diesen Untersuchungen
ergibt sich offensichtlich, dass weitere, B-Zellen aktivierende
Moleküle
noch aufgefunden werden können.
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Die
Eigenschaften des CD40-Liganden als ein B-Zellen aktivierendes Molekül stimmen
auch mit der Unfähigkeit
zur Rekonstitution der B-Zellen Proliferationsaktivität nach einer
Detergenssolubilisierung von Th-Zellmembranen überein (vorstehend beschrieben).
Die Homologien, die der CD40-Ligand mit TNF-α und
TNF-β gemeinsam
hat, beschränken sich
auf spezielle β-Blattregionen
der TNF-Moleküle, die
bei der Bildung einer assoziierten, trimeren Struktur beteiligt
sind (Farrah & Smith,
Nature, Bd. 358 (1992), S. 26). Dies lässt darauf schließen, dass
eine native quaternäre
Struktur des Membran-CD40-Liganden ein Trimeres sein kann. Da der
CD40-Ligand selbst nicht disulfidverknüpft ist, ist zu erwarten, dass eine
derartige Struktur bei Detergenssolubilisierung dissoziiert und
nur unter sehr speziellen Bedingungen wiederhergestellt wird. Wenn
ferner nicht-kovalente Assoziationen mit anderen Th-Zellmembranproteinen
oder Costimulatoren zur Induktion der Vernetzung der B-Zelloberfläche für eine maximale
proliferative Reaktion erforderlich sind, können diese bei Detergenssolubilisierung
ebenfalls leicht dissoziieren.
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D. B-Zellen-Th-Zellen-Wechselwirkung
in einem in vivo-Kontext
-
In
der Milz verläuft
eine B-Zellaktivierung und -proliferation an zwei Stellen, den proliferativen
Foci und dem Keimzentrum. Zur Initiierung der Foci, die erstmals
2 bis 3 Tage nach der Immunisierung nachweisbar sind, wandert die
antigenstimulierte B-Zelle zu der T-Zelle, die reicher an äußeren periartiolären, lymphoiden
Scheidebereichen (PALS) der weichen Pulpa der Milz ist (Kupfer & Singer, J. Exp.
Med., Bd. 170 (1991), S. 1697–1713).
Wenn ein Kontakt mit einer geeigneten T-Zelle hergestellt wird,
findet eine Proliferation sowohl von T- als auch von B-Zellen statt
und die B-Zellen unterliegen einem Wechsel und sezernieren IgG-Unterklassen.
Sie können
auch entlang terminalen Arteriolen zur roten Pulpa wandern und dabei
möglicherweise
die Milz verlassen (N. Van Rooijen, Immunol. Today, Bd. 11 (1990),
S. 436–439). Der
Grossteil der primären
Antikörper
bei einer Immunreaktion entsteht aus B-Zellen in diesen Foci (Tsiagbe
et al., Immunol. Rev., Bd. 126 (1992), S. 113–141). Die Reaktion des Keimzentrums
wird wenige Tage nach der Bildung der Foci eingeleitet. B-Zellen
des Keimzentrums leiten sich möglicherweise
von B-Zellen, die in den Foci aktiviert worden sind, ab (Jacob & Kelsoe, J. Exp.
Med., Bd. 176 (1992), S. 679– 687).
Beim Keimzentrum handelt es sich um eine Stelle von intensiver B-Zellproliferation,
die für die
Erzeugung und Selektion von B-Zellen notwendig ist, die hypermutierte
Antikörper
von höherer
Affinität erzeugen.
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Der
Mechanismus der B-Zellaktivierung, der in vitro durch Th-Membranen
und Lymphokine reproduziert wird, gleicht stark dem Mechanismus
der B-Zellaktivierung
in den primären
proliferativen Foci, die in vivo zu erkennen ist (M. R. Kehry und
P. D. Hodgkin, Sem. Immunol., Bd. 5 (1993), S. 393–400). Neuere
elegante immunohistochemische Untersuchungen der in situ-Lokalisierung
des CD40-Liganden in lymphoiden Organen von immunisierten Mäusen stimmen
mit dieser Schlussfolgerung überein. Der
CD40-Ligand wurde nur an T Zellen in der äußeren PALS-Region oder in Assoziation
mit terminalen Arteriolen gefunden (van der Eertwegh et al., J.
Exp. Med., Bd. 178, (1993), S.1555–1656). Ferner korrelierte
die Kinetik des Auftretens des CD40-Liganden mit der Kinetik der
Bildung von Foci statt mit der Kinetik der Bildung des Keimzentrums.
Tatsächlich wurde
in Keimzentren kein CD40-Ligand festgestellt.
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E. Ein neues System zur
Untersuchung der B-Zellen-T-Zellen-Wechselwirkung
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Da
es nicht möglich
ist, normale, untransformierte B-Zellen in vitro über längere Zeitspannen
hinweg am Leben zu erhalten (Tisch et al., Immunol. Today, Bd. 9
(1988), S. 145–150)
verwenden die existierenden in vitro-Systeme zur Untersuchung von B-Zellreaktionen
frisch isolierte B-Zellen aus Milz, Mandeln oder peripherem Blut.
Diese B-Zellpopulationen sind von Natur aus unterschiedlich und
heterogen. Diese Variabilität
kann für
zahlreiche differierende experimentelle Ergebnisse nicht nur zwischen verschiedenen
Laboratorien, sondern auch zwischen Untersuchungen an murinen und
humanen B-Zellen verantwortlich sein. Es war nicht möglich, B-Zelllinien zu
erhalten, die analog zu T-Zellklonen
sind (Tisch et al., Immunol. Today, Bd. 9 (1988), S. 145–150). Im Durchschnitt
bleiben gezüchtete
B-Zellen bei fehlender Stimulation weniger als 2 Tage am Leben.
Nach einer in vitro-Aktivierung durch Th-Zellen unterliegen B-Zellen offensichtlich
2 bis 3 Runden der Zellteilung. Bei Gegenwart von Th2-Lymphokinen differenzieren sie
zur Sekretion von Antikörper
(Hodgkin et al., Eur. J. Immunol., Bd. 24 (1994), S. 239–246). Jedoch kommt
es nach der anfänglichen
Proliferationsperiode zu einem weitgehenden B-Zelltod, so dass die
tatsächliche
Lebensfähigkeit
nach 7 Tagen weniger als 10 % betragen kann (Hodgkin et al., Eur.
J. Immunol., Bd. 24 (1994), S. 239–246). Dadurch wurde es unmöglich, in
vitro-Systeme zur Untersuchung der wenig verstandenen Aspekte der
B-Zellreaktion einzuführen: beispielsweise
bezüglich
Signalen, die Gedächtnis-B-Zellen erzeugen,
und bezüglich
der molekularen Mechanismen, die die somatische Mutation und Selektion
von Zellen, die Antikörper
hoher Affinität
erzeugen, antreiben. Ein System, bei dem IL-4 und anti-CD40-Antikörper in
immobilisierter Form an Fc-Rezeptor-positiven Fibroblasten zur Züchtung von
humanen B-Zellen über
längere
Zeiträume
hinweg verwendet wurden (Rousset et al., J. Exp. Med., Bd. 173 (1991),
S. 705–710;
Banchereau et al., Science, Bd. 251 (1991), S. 70–72; Galibert
et al., J. Immunol., Bd. 152 (1994), S. 22–29), näherte sich am stärksten einer
B-Zelllinie an. Jedoch verlief die Verdopplung langsam (Galibert
et al., J. Immunol., Bd. 152 (1994), S. 22–29) und die Notwendigkeit
von IL-4 erzeugte Antikörper
bildende Zellen in der heterogenen Kultur (Banchereau et al., Science,
Bd. 251 (1991), S. 70–72).
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Beispiel 2
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Wirksame Proliferation
und Differenzierung von B-Zellen unter Verwendung des hdmb-CD40-Liganden
-
Materialien
und Methoden
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Die
Konstruktion und Isolierung eines rekombinanten Baculovirus-Vektors,
der die Expression von hochdichtem, membrangebundenem Mäuse-CD40-Liganden dirigiert,
erfolgte folgendermaßen.
Bei dem bei dieser Untersuchung verwendeten Transfervektor handelte
es sich um ein Derivat des Plasmids phγ1360
(zur Verfügung
gestellt von Dr. Charles Has und Dr. J. Donald Capra, Southwestern Medical
Center, Dallas, TX) (Hasemann und Capra, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Bd. 87 (1990), S. 3942–3946).
Plasmide, die die cDNA. die für
den murinen CD40-Liganden kodieren, enthalten, und der murine CD40-Ligand
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zur Insertion der CD40-Liganden-cDNA
in den Transfervektor wurde eine PCR-Mutagenese herangezogen, um
eine Nco I-Stelle
in exakter Übereinstimmung
mit dem ATG-Initiationscodon der CD40-Liganden-cDNA und eine Xba I-Stelle
unmittelbar distal zum Translationsterminationscodon einzuführen. Die
amplifizierte DNA wurde zunächst
in PTZ19R geklont und sodann in phγ11360
subkloniert, nachdem die cDNA der schweren Immunoglobulinkette durch
Nco I/Xba I-Verdau entfernt worden war. Das erhaltene Plasmid wurde
mit AcMNPV-Virus-DNA durch das CaCl2-Fällungsverfahren kotransfiziert.
Okklusions negative, virale Plaques wurden isoliert und unter Anwendung üblicher
Techniken gereinigt (Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment
Station Bulletin (1987), S. 1555).
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Ein
Virusvorrat von hohem Titer, der in SF9-Zellen unter Anwendung üblicher
Techniken gezüchtet
worden war (O'Reilly
et al. Baculovirus expression vectors, a laboratory manual, W. H.
Freemann and Company, New York, New York (1992)) wurde zur Infektion
von Sf9-Zellen verwendet, die 66 Stunden bei 27 °C in Suspensionskultur gezüchtet worden
waren (MOI-Wert 100). Infizierte Sf9-Zellen wurden durch Zentrifugation
geerntet, 2-mal mit eiskalter Rinaldini-Salzlösung (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) mit einem Gehalt an 1,0 mM CaCl2 gewaschen,
und Membranen wurden gemäß Literaturangaben
präpariert
(Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025; Brian, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 564; Maeda et al., Biochim.
Biophys. Acta, Bd. 731 (1983), S. 115). Membranen mit der Bezeichnung
hdmb-Maus-CD40-Ligand wurden gewaschen und in Dulbecco-PBS resuspendiert
und unter flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Die Gesamtkonzentration an Membranprotein
wurde für
jedes Präparat
bestimmt (Micro BCA-Test, Pierce). Membranchargen wurden in einem
B-Zellproliferationstest (vergl. die nachstehenden Ausführungen)
titriert.
-
Präparation
von humanen B-Zellen. Hochgereinigte B-Zellen wurden gemäß Literaturangaben präpariert
(Amoroso und Lipsky, J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 3155). Kurz
zusammengefasst, PBMC wurden aus heparinisiertem Blut von gesunden
Erwachsenen durch Zentrifugation über Natriumdiatrizoat/Ficoll-Gradienten präpariert
(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ). PBMC wurde in serumfreiem RPMI 1640
resuspendiert und 45 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 mM L-Leucin-methylester-HCl
behandelt, um eine Verarmung an Monozyten und natürlichen Killerzellen
durchzuführen.
Sich nicht-absetzende Zellen, die weitgehend aus B-Zellen bestanden,
wurden gewonnen und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 μM L-Leucyl-leucin-methylester
behandelt, um eine Verarmung an etwaigen verbleibenden NK-Zellen
und Monozyten vorzunehmen (Thiele und Lipsky, J. Immunol., Bd. 136
(1986), S. 1038). Im Anschluss an diese Behandlung wurden die Zellen
erneut rosettiert und die SRBC-Rosetten bildenden Zellen wurden
durch Zentrifugation entfernt. Auf diese Weise präparierte
B-Zellen waren zu mehr als 90 % rein, wie sich durch Färbung mit
mAb gegen CD20 oder CD19 zeigte. Alternativ lassen sich B-Zellen
unter Verwendung von anti-CD19-beschichteten,
magnetischen Perlen gemäß den Angaben
des Herstellers reinigen (Dynabeads der Fa. Dynal).
-
Präparation
von Mäuse-B-Zellen.
Mäuse-B-Zellen
wurden gemäß den Angaben
von Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034 präpariert.
Cytokine. Überstand
von aktivierten D10.G4.1 (D10)-Zellen wurden gemäß Literaturangaben erhalten
(Hodgkin et al., J. Immunol., Bd.145 (1990), S. 2025). Kurz zusammengefasst, D10-Th2-Zellen,
die 3 Wochen nach der Stimulation in Petri-Schalen gezüchtet worden
waren, wurden geerntet, 2-mal in Medium ohne IL-2 gewaschen und mit
5 μg/ml
Concanavalin A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 9 Stunden stimuliert.
Nach Entfernen der Zellen durch Zentrifugation mit niedriger Drehzahl wurde
der Überstand
mit 95 000 × g
zentrifugiert, durch eine 0,22 μm-Membran
filtriert und an einer Mannose-Agarose-Säule absorbiert (E-Y Laboratories,
San Mateo, CA). Der D10-Überstand
wurde in B-Zellproliferations- und
Antikörpererzeugungs-Tests titriert
und in einer endgültigen
Verdünnung
von 1/100 verwendet. Ferner können
den Kulturen Cytokine zugesetzt werden, die durch andere Zelltypen erzeugt
worden sind, einschließlich
(ohne Beschränkung
hierauf) dendritische Zellen, follikuläre, dendritische Zellen und
andere Antigene aufweisende Zellen, und zwar in Gegenwart oder Abwesenheit
eines spezifischen Antigens.
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Kulturbedingungen.
B-Zellen wurden in B-Zellmedium (BCM) gezüchtet:: 10 % fötales Kälberserum
(Hyclone-charakterisiert); 10 mM Hepes, pH-Wert 7.3; L-Glutamin;
Penicillin/Streptomycin; nicht-essentielle Aminosäuren; Natriumpyruvat;
und 5 × 10–5 M2-Mercaptoethanol,
in RPMI-1640. Das Medium und 100 × Ergänzungen wurden von Gibco erhalten.
-
Für Langzeitzüchtungsversuche
wurden B-Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit V-Boden
(001-010-2701, Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) in 150 μl BCM bei
37 °C und
5,5 % CO2 gezüchtet. Zunächst wurde hdmb-Mäuse-CD40-Ligand (3 μg/ml Endkonzentration)
mit oder ohne D10 sn (1/100 endgültige
Verdünnung)
in 100 μl BCM
zugegeben. B-Zellen geringer Dichte (1 000/Vertiefung) wurden in
50 μl BCM
zugegeben. Alle 48 Stunden wurden die Platten gemäß folgenden Angaben
mit frischen Medienkomponenten versorgt. Die Platten wurden 7 Minuten
mit 1600 U/min zentrifugiert (GS-6KR-Zentrifuge, Beckman), das Medium wurde
unter Zurücklassen
von ~15 μl
abgesaugt und frisches Medium (150 μl) wurde zugegeben.
-
Antikörpermessung. Überstände der
Kulturen wurden für
Antikörpertests
geerntet, indem 150 μl Kulturüberstand
von 3 Vertiefungen mit Wiederholungsproben entnommen wurden. 140 μl BCM wurden
in die Vertiefungen zurückgegeben
und 140 μl
für die
verbleibende Antikörperkonzentration
entfernt. Diese Vertiefungen wurden nicht mehr verwendet. Die Konzentrationen
an IgM, IgG und IgE wurden durch isotypenspezifischen ELISA-Test
gemäß Literaturangaben
gemessen (Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025–2034; Hodgkin
et al., Eur. J. Immunol., Bd. 24 (1994), S. 239–246). Die Restkonzentrationen
der einzelnen Isotypen in jeder Vertiefung nach Ersetzen mit frischem
Medium (Übertrag zum
nächsten
Zeitpunkt) wurden von jedem Wert subtrahiert.
-
Ergebnisse
-
SF9-Zellen
wurden mit einem rekombinanten Baculovirus mit einem Gehalt an Mäuse-CD40-Ligand
für verschiedene
Zeitspannen infiziert (2). Eine angereicherte
Plasmamembranfraktion wurde präpariert
und jede Membranpräparation
in einem B-Zellproliferationstest titriert (2 × 104 B- Zellen/Vertiefung
für 72
h). Unter Einbau einer radioaktiv markierten Verbindung als Marker
für die Zellteilung
wurde ein maximaler Einbau von 3H-TdR (4
h-Puls) bei Membranen beobachtet, die aus 66 h infizierten SF9-Zellen
präpariert
worden waren (66 h-hdmb-CD40-Ligand). Wenn der hdmb-CD40-Ligand
zur Stimulation von B-Zellen in Gegenwart von D10-sn (1/100; Lymphokin
enthaltender Überstand von
9 h stimuliertem D10.G4.1-Th2-T-Zellklon, Hodgkin et al., 1990)
verwendet wurde, waren Plasmamembranen aus 42 h, 66 h und 90 h infizierten SF9-Zellen
bezüglich
ihrer Fähigkeit
zur Stimulation von B-Zellen gleichwertig (2B).
-
Zum
Nachweis, dass die beobachtete Proliferationsreaktion durch den
hdmb-CD40-Liganden vermittelt wurde, wurden B-Zellen (2 × 104/Vertiefung) mit einer konstanten Menge
an hdmb-CD40-Ligand (1/200) in Gegenwart und Abwesenheit eines CD40-IgG1-Fusionsproteins
stimuliert (Castle et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 1777–1788) (3). Ausgefüllte Kreise,
CD40-IgG zugesetzt (35 μg/ml
in der höchsten
Konzentration); leere Quadrate, kein CD40-IgG. Die durch den hdmb-CD40-Liganden
erzeugte Proliferation konnte spezifisch durch CD40-IgG gehemmt
werden, was beweist, dass die Proliferation durch den hdmb-CD40-Liganden
induziert wurde.
-
Zur
Bestimmung der Einflüsse
der Dichte auf die Zellproliferation wurden B-Zellen mit hdmb-CD40-Ligand (1/80) und
D10-sn (1/100) auf Platten mit 96 Vertiefungen gebracht (1 × 104/Vertiefung). Die Zellen wurden ausgezählt und
das Medium wurde alle 48 Stunden ersetzt. An den Tagen 5 und 8 wurden
die Zellen resuspendiert und 1/8 aufgeteilt (4). Ausgefüllte Dreiecke,
Zellen nicht aufgeteilt; ausgefüllte
Kreise, 1/8-Aufteilung am Tag 5; ausgefüllte Quadrate, 1/8-Aufteilung am Tag
8; leere Kreise, 1/8-Aufteilung, multipliziert mit dem Faktor 8;
leere Quadrate, zweite 1/8-Aufteilung, multipliziert mit dem Faktor
64. Bei Eingangszellkonzentrationen über 5 × 104/ml,
war eine Verringerung der Zellzahl erforderlich, um eine maximale
Proliferation zu erzielen.
-
Zum
Test verschiedener Kulturformate wurden B-Zellen auf Platten mit
96 Vertiefungen, die entweder einen flachen Boden oder einen "V"-Boden aufwiesen, gegeben (1 × 103 Zellen/Vertiefung). Die Zellen wurden entweder
mit hdmb-CD40-Ligand
und D10-sn (++) oder hdmb-CD40-Ligand allein (+–) inkubiert. Alle 48 Stunden
wurden die Zellen ausgezählt
und das Medium wurde entfernt und ersetzt (5). Ausgefüllte Quadrate,
hdmb-CD40-Ligand und D10-sn auf Platten mit flachem Boden; leere Kreise,
hdmb-CD40-Ligand und D10-sn auf Platten mit "V"-Boden; leere Quadrate,
hdmb-CD40-Ligand auf Platten mit flachem Boden; ausgefüllte Kreise, hdmb-CD40-Ligand
auf Platten mit "V"-Boden. Wie in 5 dargestellt,
wurde bei Abwesenheit von Lymphokinen eine höhere Anzahl an B-Zellen aus Platten mit
Vertiefungen mit "V"-Boden gewonnen.
-
Zum
Testen der Antikörpersekretion
aus proliferierten und differenzierten B-Zellen wurden B-Zellen auf Platten mit
96 Vertiefungen mit "V"-Boden (1 × 103 Zellen/Vertiefung) mit hdmb-CD40-Ligand (1/300)
und D10-sn (1/100) gebracht. Alle 48 Stunden wurden Zellen entfernt
und ausgezählt
und das Medium wurde nicht ersetzt (6A). Leere
Quadrate, Gesamtzahl an lebensfähigen
Zellen; ausgefüllte Kreise,
Bruchteil von lebensfähigen
Zellen.
-
Das
Medium aus 3 Vertiefungen (Wiederholungsversuchen) wurde entnommen
und die Antikörperkonzentration
wurde durch quantiativen ELISA-Test gemessen (6B).
Ausgefüllte
Kreise, IgM; ausgefüllte
Quadrate, IgG1; ausgefüllte
Dreiecke, IgE. Die kumulativen Antikörperkonzentrationen sind in
ng/ml angegeben. Die maximale Zellzahl trat nach etwa 8 Tagen auf
(50-fache Zunahme der Zellzahl), während der Großteil der
IgM-Erzeugung zwischen den Tagen 8 und 12 erfolgte (6B).
-
Zur
Bestimmung des Einflusses, den der Ersatz des Mediums auf die B-Zellproliferation
und -differenzierung hatte, wurden B-Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen
mit "V"-Boden (1 × 103 Zellen/Vertiefung) mit hdmb-CD40-Ligand
(1/300) und D10-sn (1/100) gebracht. Alle 48 Stunden wurden Zellen
entnommen und ausgezählt
und das alte Medium wurde entfernt und durch frisches Medium ersetzt
(7A). Leere Quadrate, Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen;
ausgefüllte
Kreise, Bruchteil von lebensfähigen Zellen.
-
Das
Medium von Vertiefungen mit Wiederholungsversuchen wurde entnommen
und die Antikörperkonzentration
wurde durch quantitativen ELISA-Test
gemessen (7B). Ausgefüllte Kreise, IgM; ausgefüllte Quadrate,
IgG1; ausgefüllte
Dreiecke, IgE. Die kumulativen Antikörperkonzentrationen sind in
ng/ml angegeben. Die maximale Zellzahl trat nach etwa 10 Tagen auf
(200-fache Zunahme der Zellzahl), während der Großteil der
IgM-Erzeugung zwischen den Tagen 8 und 22 erfolgte.
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Um
die Einflüsse
eines mehrstufigen Proliferationsverfahrens auf die Antikörpersekretion
zu testen, wurden B-Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen mit "V"-Boden (1 × 103 Zellen/Vertiefung)
mit hdmb-CD40-Ligand (1/300) und D10-sn (1/100) gegeben (8). Alle 48 Stunden wurden Zellen entfernt
und ausgezählt
und das alte Medium wurde entfernt und durch frisches Medium ersetzt
(8); +–, das Medium enthielt hdmb-CD40-Ligand; ––, das Medium
enthielt keine Zusätze;
++, das Medium enthielt hdmb-CD40-Ligand und D10-sn. Leere Quadrate,
Gesamtzahl an lebensfähigen
Zellen; ausgefüllte Kreise,
Bruchteil an lebensfähigen
Zellen.
-
Das
Medium aus Vertiefungen mit Wiederholungsversuchen wurde entnommen
und die Antikörperkonzentration
wurde durch quantitativen ELISA- Test
gemessen. Ausgefüllte
Kreise, IgM; ausgefüllte
Quadrate, IgG1; ausgefüllte
Dreiecke IgE. Die kumulativen Antikörperkonzentrationen sind in
ng/ml angegeben (8). Die maximale
Zellzahl trat nach etwa 18 Tagen auf(100-fache Zunahme der Zellzahl), während der
Großteil
der IgM-Erzeugung zwischen den Tagen 16 und 34 erfolgte.
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Um
die Häufigkeit
zu bestimmen, mit der B-Zellen auf den hdmb-CD40-Liganden reagieren, wurden B-Zellen
in Mengen von 1, 3, 10 und 30 Zellen/Vertiefung auf Platten mit
96 Vertiefungen mit "V"-Boden entweder mit
hdmb-CD40-Ligand (1/300) oder hdmb-CD40-Ligand (1/300) und D10-sn
(1/100) ausgestrichen (9). Nach 6 Tagen wurden die
Zellen resuspendiert, auf Platten mit flachem Boden übertragen
und auf die Anwesenheit von geteilten lebensfähigen Zellen bewertet. In Kulturen,
die mit dem hdmb-CD40-Liganden stimuliert worden waren, wuchsen
etwa 1/8 der B-Zellen; in Kulturen, die mit dem hdmb-CD40-Liganden
und D10-sn stimuliert worden waren, wuchsen etwa 1/2 der B-Zellen.
-
Um
den proliferativen Einfluss des hdmb-CD40-Liganden auf humane B-Zellen zu testen,
wurden humane B-Zellen gemäß den vorstehenden
Angaben für
Mäusezellen
isoliert und gezüchtet (10).
Humane B-Zellen expandierten mindestens 100-fach und die Ig-Erzeugung
wurde am Tag 10–14
beobachtet.
-
Beispiel 3
-
Proliferation und Differenzierung
von humanen B-Zellen
-
In
der früheren
Studie wurde ein Verfahren zur Proliferation und Differenzierung
von normalen Mäuse-B-Lymphozyten
bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltete die Verwendung von rekombinantem hdmb-Mäuse-CD40-Ligand, der in Insektenzellen
in Kombination mit einer Quelle für Cytokine, die zur Unterstützung der
B-Zelldifferenzierung befähigt
waren, exprimiert worden war. Unter diesen Bedingungen expandierten
Mäuse-B-Lymphozyten
250-fach und konnten mit hoher Frequenz als individuelle Klone gezüchtet werden
(1 von 2 Zellen reagierten). Sämtliche
B-Zellklone, die expandierten, differenzierten auch unter Sekretion
von hohen Konzentrationen an IgM- und/oder IgG-Antikörper. Der
Zweck der vorliegenden Untersuchung besteht darin, den Nachweis
zu führen,
dass eine ähnliche
zelluläre
Expansion und Differenzierung unter Verwendung von normalen, humanen
B-Lymphozyten erreicht werden kann, indem man sich der hier beschriebenen
Verfahren bedient. Unter Verwendung der vorliegenden Verfahren ergaben
humane B-Zellen eine wirksame proliferative Reaktion auf rekombinanten,
humanen hdmb-CD40-Liganden, der in Insektenzellen in Kombination
mit humanen Cytokinen exprimiert worden war. Es war möglich, humane
B-Zellklone mit hoher Frequenz zu züchten und eine Differenzierung
zur Immunoglobulin-Sekretion zu erreichen.
-
Materialien
und Methoden
-
Antikörper und
Reagenzien. Monoklonales anti-human-CD3 (64.1) wurde von Dr. John
Hansen (Fred Hutchison Cancer Center, Seattle, WA) hergestellt.
Monoklonales anti-human-CD3, das für das Panning verwendet wurde,
anti-human-CD8,
anti-human-CD14 und anti-human-CD19 wurden von der Fa. PharMingen
(San Diego, CA) bezogen. Zur quantitativen Bestimmung von humanen
Antikörperkonzentrationen
durch ELISA-Test wurden F(ab')2-Ziegen-anti-human-IgM
(gereinigt und Biotin-konjugiert) und F(ab')2 Ziegen-anti-human-IgG (Fc-spezifisch) (gereinigt
und Biotin-konjugiert) und Streptavidin-HRP von Jackson ImmunoResearch
(West Grove, PA) bezogen. Für
ELISPOT-Tests an Mäuse-B-Zellen
wurden Biotin-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgM von Zymed (So. San
Francisco, CA) und Biotin-Ziegen-anti-Maus-IgG von Southern Biotechnology,
Inc. (Birmingham, Al) bezogen. Gereinigtes, humanes Myelom-IgM,
-IgG1, -IgG2, -IgG3 und -IgG4, die als ELISA-Standards verwendet
wurden, wurden von The Binding Site, Ltd. (Birmingham, England)
bezogen. Gereinigtes Napfschnecken-Schlüsselloch-Hämocyanin
(Imject KLH) wurde von Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) bezogen.
-
Cytokine.
Rekombinantes humanes IL-1a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 und IL-11 wurden
von Genzyme (Cambridge, MA) bezogen. Vorratslösungen wurden hergestellt,
indem die einzelnen Bestandteile in B-Zellmedium (BCM; vergl. die
nachstehenden Ausführungen),
verdünnt,
mit 0,2 μm-Filtern
filtriert und in Aliquotanteilen bei –80 °C aufbewahrt wurden.
-
Überstände von
aktivierten, humanen, peripheren Blut-T-Zellen wurden folgendermaßen erhalten.
Periphere, mononukleare Blutzellen, die nach Zentrifugation über Ficoll-Hypaque
erhalten worden waren, wurden nacheinander auf Platten, die über Nacht
mit anti-CD14 (5 μg/ml),
anti-CD14 und anti-CD19 (jeweils 2,5 μg/ml) und anti-CD8 (5 μg/ml) beschichtet
worden waren, ausgestrichen. Das Ausstreichen erfolgte in ausgewogener
Hank-Salzlösung mit
einem Gehalt an 5 % FBS, 10 mM HEPES, pH-Wert 7,3, 1 Stunde bei
4 °C. Nicht-haftende Zellen wurden
gewaschen und in einer Menge von 4 × 106 Zellen/ml
in warmem BCM (RPMI 1640, ergänzt mit
10 % FBS, 10 mM HEPES (pH-Wert 7,3), 2 mM L-Glutamin (GIBCO, Grand
Island, NY), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren (GIBCO), 1 mM Natriumpyruvat,
5 × 10–5 M
2-Mercaptoethanol und 100 U/ml jeweils an Penicillin und Streptomycin
(GIBCO)) resuspendiert. Für
die anti-CD3-Stimulation wurden Zellen auf Gewebekulturschalen gebracht,
die mit 4 μg/ml
anti-CD3 48 Stunden bei 37 °C
beschichtet worden waren. Zur Stimulation mit PHA/PMA wurden Zellen
mit 2,5 μg/ml
PHA und 10 ng/ml PMA 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, gewaschen und 46
Stunden bei 37 °C
in frischem warmem BCM inkubiert. Nach Entfernen von Zellen durch
Zentrifugation mit geringer Drehzahl wurden die Überstände mit 100 000 × g zentrifugiert,
durch eine 0,2 μM
Membran filtriert und in Aliquotanteilen bei –80 °C aufbewahrt.
-
Ferner
können
Cytokine, die durch andere Zelltypen, einschließlich dendritische Zellen,
follikuläre
dendritische Zellen und andere Antigene aufweisende Zellen, in Gegenwart
oder Abwesenheit eines spezifischen Antigens erzeugt worden sind,
den Kulturen als Stimuli zugesetzt werden.
-
Baculovirus-Wachstum,
Infektion von Insektenzellen und Präparation von Membranen. Ein
rekombinantes Baculovirus, das für
den humanen CD40-Liganden
von voller Länge
kodiert, wurde durch übliche
Techniken konstruiert (D. R. O'Reilly,
L. K. Miller und V. A. Luckow (1992), Baculovirus expression vectors,
a laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York, New York).
Ein Vorrat von Virus von hohem Titer, das in SF9-Zellen unter Anwendung üblicher
Techniken (D. R. O'Reilly
L. K. Miller und V. A. Luckow (1992), Baculovirus expression vectors,
a laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York, New York)
gezüchtet
worden war, wurde zur Infektion von SF9-Zellen verwendet, die in
Suspensionskultur 48 Stunden bei 27 °C (MOI-Wert 1) gezüchtet worden
waren. Infizierte SF9-Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet
und 2-mal mit eiskalter
Rinaldini-Salzlösung
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mit einem Gehalt an 1,0 mM CaCl2 gewaschen und Membranen wurden gemäß Literaturangaben
präpariert
(Hodgkin et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 2025, A. A. Brian,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 564, T. Maeda et al.,
Biochim. Biophys. Acta, Bd. 731 (1983), S. 115). Membranen und humaner
hdmb-CD40-Ligand wurden
gewaschen und in Dulbecco-PBS resuspendiert und unter flüssigem Stickstoff
aufbewahrt. Die gesamte Konzentration an Membranprotein wurde für jede Präparation
bestimmt (Micro BCA-Test, Pierce). Chargen von Membranen wurden
in einem B-Zellproliferationstest titriert (vergl. die nachstehenden
Ausführungen).
-
Fließzytometrie.
Die Expression des CD40-Liganden an der Oberfläche von SF9-Insektenzellen
wurde quantitativ durch Fließzytometrie
bestimmt. SF9-Zellen, die verschiedene Male mit einem in Bezug auf
humanen CD40-Liganden rekombinanten Baculovirus infiziert worden
waren, wurden in Insekten-FACS-Puffer
(Rinaldini-Salzlösung
mit einem Gehalt an 2 % BSA und 0,2 % Natriumazid) gewaschen und
30 Minuten bei 4 °C
mit 5 μg/ml
nicht-spezifischem Mäuse-IgG1
in Insekten-FACS-Puffer vorinkubiert. Die Zellen wurden mit 10 μg/ml CD40-IgG1 (Castle
et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 1777) oder humanem Kontroll-IgG1 unter
anschließender Zugabe
von biotinyliertem, monoklonalem Mäuse-anti-human-IgG1 (10 μg/ml; Zymed) und Phycoerythrin
(PE)-Streptavidin (20 μg/ml;
Jackson ImmunoResearch) gefärbt.
Sämtliche
Färbungen
wurden in Insekten-FACS-Puffer
mit einem Gehalt an 5 μg/ml nicht-spezifischen
Mäuse-IgG1
durchgeführt.
Die Fluoreszenz wurde in einem einzigen logarithmischen Farbmodus
an einem FACScan-Fließzytometer
(Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
-
Präparation
von humanen B-Zellen. Humane, periphere, mononukleare Blutzellen,
die nach Zentrifugation über
Ficoll-Hypaque erhalten worden waren, wurden mit biotinyliertem
anti-CD19 (CeIIPro, Bothell, WA) inkubiert, an Avidinkonjugierte
Perlen (CEPRATE LC-19-Säule;
CeIIPro) gebunden und gemäß den Angaben
des Herstellers eluiert. Eluierte Zellen wurden auf Petri-Schalen,
die über
Nacht mit 5 μg/ml
jeweils an anti-CD3 und anti-CD14 beschichtet worden waren, ausgestrichen.
Nicht-haftende Zellen (~1 × 106/100 ml Blut) waren zu 84 % bis 93 % B-Zellen,
gemäß Bestimmung
durch Zweifachfärbung
mit PE-anti-CD3 und FITC-anti-CD19 und durch Zweifachfärbung mit
PE-anti-CD20 und FITC-anti-IgM, gemäß Literaturangaben (Kehry et al.,
Cell. Immunol., Bd. 118 (1989), S. 504). Die Fluoreszenz wurde im
logarithmischen Zweifarbenmodus an einem FACScan-Fließzytometer analysiert. B-Zellen
können
auch aus Mandeln, Milz und Knochenmark durch ähnliche Techniken oder durch
Sortieren an einem Fließzytometer
nach Färbung
mit fluoreszierend markiertem anti-CD19 oder anti-CD20 oder spezifischem
Antigen isoliert werden.
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B-Zelltests.
Für Proliferationsuntersuchungen
wurden B-Zellen (zwischen 5 × 103 und 1 × 104/Vertiefung) 96 Stunden bei 37 °C mit Reihenverdünnungen
von Membranen in 100 μl
BCM (Falcon 3072 Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen) inkubiert. Die
Endkonzentrationen der verwendeten rekombinanten Lymphokine betrugen
1 ng/ml IL-1α,
5 ng/ml IL-11 und 10 ng/ml jeweils für IL-2, IL-4, IL-6 und IL-10.
Während
der letzten 6 Stunden der Züchtung wurde
[Methyl-1',2'-3H]-Thymidin (120 Ci/mmol; Amersham,
Arlington Heights, IL) zugegeben (1 μCi/Vertiefung). Die Kulturen
wurden an einem automatisierten Zell-Erntegerät für 96 Vertiefungen (Tomtec,
Orange, CT) zur Durchführung
der Szintillationszählung
(Beckman, Fullerton, CA) geerntet. Die Bestimmung der Anzahl an
lebensfähigen
B-Zellen wurde durch Zellzählung
vorgenommen. Zellen aus Dreifachversuchen in verschiedenen Vertiefungen wurden
vereinigt, durch Zentrifugation geerntet, in 50 μl BCM resuspendiert und mit
einem gleichen Volumen an 0,4 % Trypanblau in 0,85 % NaCl vermischt. Lebende
Zellen wurden unter einem Hämozytometer gezählt. Die
durchschnittliche Anzahl für
die Vertiefungen mit Wiederholungsversuchen wurde berechnet.
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Für Langzeit-Züchtungsexperimente
wurden B-Zellen (5 × 102 oder 1 × 103/Vertiefung)
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit V-Boden (001-010-2701, Dynatech Laboratories,
Inc., Chantilly, VA) in 150 μl
BCM bei 37 °C
und 5,5 % CO2 gezüchtet. Humaner hdmb-CD40-Ligand
und T-Zellüberstände mit
einem Gehalt an Lymphokinen wurden in den angegebenen Konzentrationen
zugesetzt; rekombinante Lymphokine wurden in den vorstehend aufgeführten Konzentrationen
zugesetzt. Die Kulturzellen wurden an den nachstehend angegebenen
Tagen mit frischen Medienkomponenten versetzt. Die Platten wurden
7 Minuten mit 1600 U/min zentrifugiert (GS-6KR-Zentrifuge, Beckman),
das Medium wurde unter Zurücklassen
von ~15 μl
abgesaugt und frisches Medium (150 μl) wurde zugegeben.
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Die
IgM- und IgG-Konzentrationen wurden durch den vorstehend beschriebenen
isotypspezifischen Sandwich-ELISA-Test (Hodgkin, et al., Eur. J. Immunol.
Bd. 24 (1994), S. 239 unter Verwendung der vorstehenden beschriebenen
Reagenzien gemessen. Monoklonales humanes IgM (50 ng/ml) und äquimolare
Gemische von monoklonalem humanem IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 (insgesamt
50 ng/ml) wurden als Standard verwendet. Kulturmediumproben (140 μl/Vertiefung)
wurden aus den Vertiefungen der Mehrfachversuche mit wachsenden
B-Zellen geerntet.
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ELISPOT-Tests
zum Nachweis von Zellen, die antigenspezifische Antikörper sezernierten,
wurden gemäß Literaturangaben
durchgeführt
(Hodgkin et al., Eur. J. Immunol., Bd. 24 (1994), S. 239, Czerkinsky,
et al., J. Immunol. Methods, Bd. 110 (1988), S. 29). Multiscreen-HA-Filterbodenplatten
mit 96 Vertiefungen (Millipore, Bedford, MA) wurden über Nacht bei
4 °C mit
5 μg/ml
KLH beschichtet. Platten mit einem Gehalt an wachsenden B-Zellen
wurden zentrifugiert und die Zellen wurden 2-mal gewaschen, bevor
sie in 100 μl
frischem BCM resuspendiert wurden. Zellen aus jeder Vertiefung wurden
in Zweifachversuchen auf beschichtete Multiscreen-Platten übertragen
und 16 Stunden bei 37 °C
in 100 μl
BCM/Vertiefung inkubiert. Platten wurden unter Verwendung von biotinylierten
anti-Maus-IgM- oder anti-Maus-IgG-Reagenzien gemäß Literaturangaben (Hodgkin
et al., Eur. J. Immunol., Bd. 24 (1994), S. 239) entwickelt. Nach
Stoppen der Reaktion wurden die Vertiefungen im Dunkeln mehrere
Stunden getrocknet. Die Flecken, die spezifischen IgM- oder IgG-Antikörpern entsprachen,
wurden unter einem Schneidemikroskop gezählt.
-
Ergebnisse
-
Humaner CD40-Ligand in
Insektenzellmembranen stimuliert in wirksamer Weise die humane B-Zellproliferation.
-
Die
optimale Expression von humanem CD40-Liganden in SF9-Insektenzellen wurde
bestimmt, indem SF9-Zellen verschiedene Male mit rekombinantem Baculovirus
infiziert wurden und die Expressionsniveaus durch Fließzytometrie
bestimmt wurden. Die Expression des humanen CD40-Liganden wurde
nach 48-stündiger
Infektion als maximal festgestellt. Eine angereicherte Plasmamembranfraktion
wurde aus 48 Stunden infizierten SF9-Zellen präpariert und für anschließende Experimente
verwendet (humaner hdmb-CD40-Ligand). Gereinigte humane B-Zellen
proliferierten in wirksamer Weise in Reaktion auf den humanen hdmb-CD40-Liganden. Die
Reaktion wurde durch Zugabe eines Gemisches von rekombinantem humanem
1L-1α, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-10 und IL-11 verstärkt (11). In
Abwesenheit des humanen hdmb-CD40-Liganden teilten sich humane B-Zellen
nicht (11).
-
Klonale Frequenz
von humanem B-Zellwachstum und -differenzierung
-
Eine
Frequenzanalyse von reagierenden B-Zellen, die in Grenzverdünnung ausgestrichen worden
war, zeigte nach 14 Tagen bei etwa 1 von 2,5 B-Zellen ein Wachstum
in Reaktion auf den humanen hdmb-CD40-Liganden und das Gemisch von
rekombinanten humanen Lymphokinen, das vorstehend verwendet wurde
(12A). Zahlreiche B-Zellklone enthielten etwa 20
bis 50 Zellen. Um die Frequenz der B-Zelldifferenzierung zu erhalten,
wurden Kulturüberstände der
Kulturen in Grenzverdünnung
am 11. Tag geerntet und durch ELISA-Test auf die Gegenwart von humanem
IgM und IgG abgesucht. Etwa eine von 70 B-Zellen differenzierte
unter Sekretion entweder zu IgM oder IgG in Reaktion auf den humanen
hdmb-CD40-Liganden und rekombinante humane Lymphokine ( 12B). Zusammen mit der Wachstumsfrequenz lässt dies
darauf schließen, dass
etwa eine von 28 B-Zellen, die wuchsen, unter Sekretion von Antikörpern differenzierten.
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Optimierung
der humanen B-Zelldifferenzierung zur Immunoglobulin-Sekretion
-
Da
die Frequenz des klonalen Wachstums von humanen B-Zellen in Reaktion
auf den humanen hdmb-CD40-Liganden sehr ähnlich wie bei Mäuse-Milz-B-Zellen war,
bestanden als Möglichkeiten für die unterschiedlichen
Frequenzen der Immunoglobulin-Sekretion zwischen den beiden Spezies
von B-Zellen entweder
die B-Zellquelle (peripheres Blut gegenüber Milz) oder die erforderlichen
Lymphokine (rekombinante Lymphokine gegenüber dem Überstand von aktivierten Helfer-T-Zellen).
Um die für
die humane B-Zelldifferenzierung erforderlichen Lymphokine zu optimieren,
wurden Überstände von
peripheren Blut-T-Zellen, die 48 Stunden entweder mit immobilisiertem
anti-CD3 oder einem Impuls von PHA oder PMA aktiviert worden waren,
präpariert. Die
humanen T- Zellüberstände wurden
auf die Fähigkeit
zur Unterstützung
der Differenzierung von humanen B-Zellen, die durch den humanen hdmb-CD40-Liganden
stimuliert worden waren, getestet. Die Überstände wurden in Gegenwart oder Abwesenheit
von zusätzlichen
rekombinanten, humanen Lymphokinen getestet. Lymphokine, die durch
PHA- und PMA-aktivierte T-Zellen sezerniert worden waren, unterstützen die
Differenzierung der mit humanem hdmb-CD40-Liganden stimulierten B-Zellen
nicht und erwiesen sich bei Zugabe zu einer Kombination von rekombinanten
humanen IL-2, IL-4, IL-6 und IL-10 als hemmend (13).
Im Gegensatz dazu unterstützten
Lymphokine, die durch anti-CD3-aktivierte T-Zellen sezerniert worden
waren, die Differenzierung von mit humanem hdmb-CD40-Liganden stimulierten
B-Zellen ebenso wie rekombinante Lymphokine. Geringfügig niedrigere
Konzentrationen an IgM und höhere
Konzentrationen an IgG wurden durch B-Zellen gebildet, die mit humanem
hdmb-CD40-Liganden und anti-CD3-Überstand
stimuliert worden waren, relativ zu Zellen, die mit humanem hdmb-CD40-Liganden und rekombinanten
IL-2, IL-4, IL-6 und IL-10 stimuliert worden waren (13).
Die Mengen an IgM und IgG, die durch mit humanem hdmb-CD40-Liganden stimulierte
humane B-Zellen erzeugt wurden, stiegen in dosisabhängiger Weise
mit zunehmenden Mengen an Lymphokinen, die durch anti-CD3-aktivierte
T-Zellen sezerniert wurden, an (14). Ferner
schien die Bildung an IgM und IgG von der Anwesenheit von Lymphokinen
abhängig
zu sein und war in Gegenwart des humanen hdmb-CD40-Liganden allein
nicht nachweisbar. Die Konzentrationen des gebildeten humanen Immunoglobulins,
die bei dem in den 13 und 14 dargestellten
Experiment erhalten wurden, waren zwar ~10-fach niedriger als die durch
Mäuse-Milz
B-Zellen, die unter analogen Bedingungen stimuliert worden waren,
erzielten Konzentrationen, sind aber ähnlich den Konzentrationen an
humanem Immunoglobulin, die in der Literatur bei Sekretion durch
20- bis 100-fach höhere
Anzahlen an humanen B-Zellen angegeben werden (Rousset et al., J.
Exp. Med., Bd. 173 (1991), S. 705, Armitage et al., J. Immunol.,
Bd. 150 (1993), S. 3671, Nonoyama, et al., J. Exp. Med., Bd. 178
(1993), S. 1097).
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Frequenz der antigenspezifischen
B-Zelldifferenzierung in einer nicht dem Priming unterworfenen Population
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Ein
Ziel dieser Arbeit besteht in der Expansion von antigenspezifischen
B-Zellklonen zur
anschließenden
Isolierung eines antigenspezifischen Antikörpers. Zur Bestimmung der Frequenz
von antigenspezifischen B-Zellen in einer nicht dem Priming unterworfenen
Population von Zellen wurden Mäuse-Milz-B-Zellen
in einer Grenzverdünnung
in Gegenwart einer suboptimalen Dosis von Mäuse-hdmb-CD40-Liganden und D10-Überstand
ausgestrichen und die Frequenz von KLH- spezifischem Antikörper sezernierenden Zellen
wurde nach 14 Tagen gemessen. Etwa 1 von 2 500 Zellen sezernierte KLH-spezifisches
IgM und 1 von 10 000 Zellen sezernierte KLH-spezifisches IgG (15).
Diese Frequenzen entsprechen den Erwartungen aufgrund einer Analyse
von Kulturüberständen aus
willkürlichen Vertiefungen
bei Ausstreichen von 1 000 Zellen/Vertiefung für KLH-spezifische Antikörper (1
von 8 positiv).
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Dieser
Befund beweist, dass aufgrund der hohen Frequenz von B-Zellen, die
auf den humanen hdmb-CD40-Liganden und Lymphokine reagieren, antigenspezifische,
reagierende Zellen in einer vernünftigen
Frequenz in B-Zellpräparaten
mit einem Gehalt von nur 1 × 106 Zellen identifiziert werden können. Ferner
lässt sich
das ELISPOT-Verfahren, das zur Identifizierung von B-Zellen, die antigenspezifischen
Antikörper
sezernieren, verwendet wird, so modifizieren, dass antigenspezifische
B-Zellen durch Ausstreichen auf antigenbeschichtete Vertiefungen isoliert
werden können.
Auf diese Weise lassen sich expandierte B-Zellen aufgrund der Spezifität ihres Oberflächenimmunoglobulins
gewinnen, unabhängig davon,
ob sie einer Differenzierung zur Immunoglobulin-Sekretion unterworfen
worden sind.