ES2338890T3 - Vacunacion por dna para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. - Google Patents
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Abstract
Casete de expresión de ADN que comprende una región de iniciación de transcripción, una secuencia de codificación de autoantígeno que codifica al menos una porción de un autoantígeno y una región de terminación de la transcripción, Comprendiendo la región de iniciación de la transcripción un promotor, para su utilización en el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de la insulina en un huésped humano mediante inyección intramuscular, en el que dicho autoantígeno se asocia con la diabetes mellitus dependiente de la insulina y dicho tratamiento estabiliza o mejora los síntomas clínicos de dicho humano.
Description
Vacunación por ADN para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes.
La complejidad del sistema inmunológico ha sido
un obstáculo desalentador para la comprensión de la disfunción del
sistema inmunológico. En los últimos años, las técnicas de biología
molecular han proporcionado información sobre los mecanismos y
componentes que subyacen a la inmunidad. En gran medida, la historia
de la inmunidad es la historia de los linfocitos. Los linfocitos
tienen un sistema extremadamente complejo y sutil para interactuar
entre sí, con células que presentan antígeno, y con los antígenos y
células extraños.
La modulación de la respuesta inmune varía con
los factores específicos producidos, y los receptores presentes en
la célula respondedora. Las vías para la disminución de las
respuestas son tan importantes como las requeridas para la
activación. La tolerancia de células T es un mecanismo conocido para
la prevención de una respuesta inmunitaria a un antígeno en
particular. Otros mecanismos, tales como la secreción de citocinas
de supresión, también son conocidos.
Una característica común en una serie de
enfermedades y afecciones inflamatorias es la participación de
células CD4^{+}T pro-inflamatorias. Estas células
T son responsables de la liberación de las citocinas inflamatorias,
de tipo Th1. Citocinas caracterizadas como tipo Th1 incluyen
interleucina 2 (IL-2),
\gamma-interferón, TNF\alpha e
IL-12. Estas citocinas
pro-inflamatorias actúan para estimular la respuesta
inmune, resultando en muchos casos en la destrucción del tejido
autólogo. Citocinas asociadas con la supresión de la respuesta de
células T son del tipo Th2, e incluyen IL-10,
IL-4 y TGF-\beta. Se ha encontrado
que las células T de tipo Th1 y Th2 pueden utilizar el receptor de
antígeno idéntico como res-
puesta a un inmunógeno, en la primera produciendo una respuesta estimulante y en la segundo una respuesta supresiva.
puesta a un inmunógeno, en la primera produciendo una respuesta estimulante y en la segundo una respuesta supresiva.
Las citocinas desempeñan un papel crítico en el
desarrollo y la recuperación de las enfermedades autoinmunes.
Citocinas Th1 como la interleuquina 12 (IL12) y el interferón gamma
(IFN\gamma) se han encontrado en el sistema nervioso central
(SNC) de pacientes de esclerosis múltiple (EM), así como en animales
con EAE (Issazadeh et al. (1995). J Neuroimmunol
61:205-12). Citocinas Th2 como IL4, IL5 y IL10 se
han encontrado que estaban elevadas, ya sea durante la remisión de
la EM o EAE (Waisman et al. (1997) Immunointervention in
autoimmunity by Th1/Th2 regulation, Adorini L., ed. (Austin, Texas:
R. G. Landes Co.), pp. 129-50). Estudios anteriores
han demostrado que la administración sistémica de IL4, así como la
administración CNS local de IFN\gamma pueden reducir la gravedad
de la EAE (Racke et al. (1994) J Exp Med
180:1961-6; Voorthuis, et al (1990) Clin Exp
Immunol 81:183-8). Además, la adición de IL4 a las
células T naive puede resultar en el desarrollo de células de tipo
Th2, mientras que la adición de IL12 puede resultar en el
desarrollo de células de tipo Th1 (Macatonia et al. (1993)
Int Immunol 5:1119-28).
La vacuna de ADN es eficaz en la protección de
los animales de experimentación contra los patógenos infecciosos y
el cáncer, y recientemente se ha usado para prevenir las
enfermedades autoinmunes (Waisman et al. (1996) Nat Med 2,
899-905). La encefalomielitis autoinmune
experimental (EAE), un modelo animal prototipo de la autoinmunidad
de células T, refleja muchas de las características clínicas y
patológicas de la enfermedad esclerosis múltiple humana.
Con el fin de modificar la respuesta inmune a
las vacunas de ADN, la co-vacunación de ADN se ha
realizado con genes de citocinas, junto con los genes de ciertos
patógenos. Los ejemplos incluyen la inmunización con ADN con los
antígenos de la hepatitis B y DNA IL2 con respuestas Th1 mejoradas,
antígenos del VIH con ADN IL12 que actividad citotóxica mejorada de
las células T, y antígenos de la gripe con IL6 ADN con actividad
anti-viral mejorada (véase, por ejemplo, Chow et
al. (1998) J Immunol 160 (3):1320-9).
La vacunación de ratones con ADN desnudo que
codifica la cadena principal receptor de la célula T (TCR) \beta
que se reordenará en células T reactivas de la proteína básica de la
mielina (MBP), se ha demostrado que protege a los ratones de la
EAE. Esta inmunización indujo un patrón de producción de citocinas
Th2 por las células T reactivas a la mielina, creando un ambiente
de supresión que bloquea la autoinmunidad: las células T que
reaccionan a la mielina autoantígeno desviado de un tipo ayudante T
agresivo 1 (Th1) a un tipo Th2 represivas.
El desarrollo adicional de un tratamiento que
inhibe específicamente la activación de células T sería de gran
utilidad médica.
Waisman et al. (1996) Nat. Med.
2:899-905 y) Offner et al. (1998) J. Immunol.
161:2178-2186 describen el uso de la vacuna de ADN
para evitar encehalomyelitis autoinmune experimental (EAE). La
inyección de ADN para promover la vacunación contra los microbios y
los tumores se discute en Cohen et al. (1997) Hosp. Pract.
32:169-171; Syrengelas, et al. (1996) Nat.
Med. 2:1038-1041; Ulmer et al. (1996) Curr
Opin Immunol. 8:531-536.; Pardoll et al.
(1995) Inmunity 3:165-169; Davis et al.
(1993) Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851; Ulmer et
al. (1993) Science 259:1745-1749 y Tang et
al. (1992) Nature 356:152-154. La inmunización
genética ha demostrado inducción tanto de una respuesta humoral
específica, sino también de una reacción inmune celular más amplia
en modelos animales de cáncer, micoplasma, tuberculosis, malaria y
muchas infecciones de virus, incluyendo la influenza y el VIH.
Véase, por ejemplo, Mor et al. (1995) J Immunol
155:2039-46; Xu y Liew (1995) Immunology
84:173-6 y Davis et al. (1994) Vaccine
12:1503-9.
La susceptibilidad a la esclerosis múltiple (EM)
ha sido asociada con ciertos genes MHC de clase II, Oksenberg y
Steinman (1990) Current Opinion in Immunology
2:619-621. En el nivel celular, oligoclonalidad de
las células T se ha descrito en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de
pacientes con EM, Lee et al., Ann. Neurol.
29:33-40 (1991).
Los antígenos del SNC, incluyendo proteínas de
la mielina, estudiados en el contexto de la EM se discuten en el de
Rosbo et al., J. Autoimmunity 11:287-299
(1998). Potenciadores de la respuesta inmune a las vacunas de ADN
incluyen CpG metilados dinucleótidos, Krieg et al. (1998)
Trends Microbiol. 6:23-27, y secuencias fusionadas
derivadas del patógeno, King et al. (1998) Nat. Med.
4:1281-1286.
El documento WO94/23737 describe los problemas
de tratamiento de enfermedades autoinmunes, y describe el
tratamiento de estas enfermedades mediante la administración de los
péptidos autoantigénicos junto con un adyuvante. Kolodka et
al. (1995) PNAS 11 de abril, vol. 92 no. 8:
3293-3297 describe una terapia génica para la
diabetes mellitus tipo I en ratas con una participación de
retrovirus para estimular el bajo nivel de expresión del gen de la
insulina 1 de rata mediante las células del hígado. WO97/046253
describe un tratamiento para la enfermedad autoinmune basado en la
entrega de antígeno, o antígeno de codificación de ADN a través de
una "pistola de genes". Urbanek-Ruiz et
al. (2001) Clinical Immunology, Vol. 100, nº 2,
pp.164-171 describe el uso de la vacuna de ADN en
la prevención de las enfermedades autoinmunes.
La presente invención proporciona un casete de
expresión de ADN que comprende una región de iniciación de la
transcripción, una secuencia de codificación autoantígeno de
codificación, al menos, una parte de un autoantígeno y una región
de terminación de la transcripción, la región de iniciación de la
transcripción que comprende un promotor, para su uso en el
tratamiento de la diabetes mellitus
insulino-dependiente en un huésped humano por
inyección intramuscular donde dicho autoantígeno se asocia con
diabetes mellitus insulino-dependiente y dicho
tratamiento estabiliza o mejora los síntomas clínicos de dicho
humano.
El autoantígeno puede ser una proteína humana
endógena. Por ejemplo, el autoantígeno puede ser insulina,
proinsulina, decarboxilasa del ácido glutámico 65 o antígeno de
células de los islotes. La citocina Th2 puede ser
IL-4 (por ejemplo, IL-4 humana),
IL-10 o TGF-\beta.
El casete de expresión de ADN pueden estar
presente en un vector, como un vector plásmido. El vector puede
comprender además un segundo casete de expresión de ADN que
comprende una segunda secuencia que codifica una citocina Th2 bajo
el control regulatorio de un promotor que está activo en el huésped
humano. El segundo casete puede estar presente en un segundo
constructo de ADN. El constructo de expresión que codifica la
citocina Th2 y el constructo de la expresión que codifica, al
menos, una parte de un autoantígeno puede ser
co-formulada o formulada de forma independiente. El
casete puede administrarse en una serie de al menos dos inyecciones
administradas por lo menos con 24 horas de diferencia.
Figura 1. Títulos de anticuerpos
Anti-SCH IgG (A) y
anti-PLP139-151 (B) los en ratones
SJUJ después de la inmunización de ADN con el minigen PLP.
Figura 2. Las respuestas de nodo linfático de
células proliferativas a PLP139-151 (cuadrados) y el
péptido de control PLP178-191 (triángulos) para los
animales inyectados con ADN que codifica la
PLP139-151 (A) o de control del vector, pTARGET
(B).
Figura 3. (A) Los niveles de
\gamma-interferón (barras de rayas) o
IL-2 (barras de puntos) en los animales vacunados
con el ADN de plásmido que codifica PLP139-151 o
vector solo (pTARGET). (B) la detección del ARNm de citocinas y el
análisis mediante una electroforesis en 5% gel de
poliacrilamida.
Figura 4. Expresión en la superficie de B7.1,
B7.2, e I-A^{S} de células de bazo después de la
incubación con el ADN. Los números en los cuadrantes se refieren al
porcentaje de células en el paso de los monocitos (A) o el paso de
los linfocitos (B) tal como se define mediante dispersión delantera
y lateral.
Se describen aquí los procedimientos para el
tratamiento terapéutico y de investigación de la inflamación, a
través de la supresión de respuestas patogénicas de las células T
específicas del antígeno. Un casete de expresión de ADN se inyecta
en el tejido muscular del huésped. El vector comprende una secuencia
de ADN que codifica al menos una porción de un autoantígeno. La
vacunación también puede incluir secuencias de ADN que codifica una
citocina Th2, por ejemplo IL4. En respuesta a esta
vacunación, se evoca una respuesta represiva. La proliferación de
células T antígeno específico es inhibida y la producción de
citocinas Th1 se reduce.
Se cree que los procedimientos aquí descritos
son un novedoso procedimiento de inmunidad protectora, que combina
los efectos de la vacuna de ADN y la entrega de gen local. Después
de la vacunación de ADN solo con un epítope autoantígeno, las
células T son anérgicas. Esto puede ser debido en parte a los
efectos biológicos de los motivos de ADN como dinucleótidos CpG no
metilados en particular contextos base (motivos
CpG-S) (Krieg et al. (1998) Trends in
Microbiol. 6:23-27). La adición de IL4 como
co-vacuna de ADN rescata la anergia impuesta por la
vacuna de ADN autoantígeno y conduce la respuesta a un fenotipo Th2.
STAT6 se activa drenando células de los ganglios linfáticos
mediante la vacuna de ADN IL4. Se cree que IL4 es producida a partir
de la vacuna de ADN administrada y que interactúa con el receptor
de IL4 en las células de los ganglios linfáticos, que a su vez
provoca la activación de STAT6 intermedio del receptor. La
inmunización contra los antígenos que provocan las enfermedades
autoinmunes causadas por las células Th1 autorreactivas, por
ejemplo, enfermedades como la esclerosis múltiple, la diabetes
juvenil y la artritis reumatoide, serían condiciones en las que la
co-vacunación con ADN que codifica la
IL-4 podría resultar beneficiosa.
Los autoantígenos, como se utilizan aquí, son
proteínas endógenas o fragmentos de las mismas que provocan una
respuesta patogénica inmune. De particular interés son los
autoantígenos que inducen una respuesta patogénica inflamatoria
mediada por células T. La vacunación supresora con el autoantígeno
objetivo relevante encuentra uso en el tratamiento de enfermedades
autoinmunes, caracterizadas por la participación de las células T
pro-inflamatorias, como la diabetes mellitus
insulinodependiente. Los modelos animales, en particular mamíferos
pequeños, por ejemplo murino, lagomorpha, etc. son de
interés para las investigaciones experimentales.
Los procedimientos de inmunización de supresión
descritos aquí se utilizan con fines profilácticos o terapéuticos.
El término "tratamiento" se usa aquí para referirse tanto a la
prevención de la enfermedad y al tratamiento de condiciones
pre-existentes. La prevención de la enfermedad
autoinmune que afecta a la vacuna de autoantígeno (VA), se lleva a
cabo mediante la administración de la vacuna antes de que el
desarrollo de la enfermedad declarada. El tratamiento de la
enfermedad en curso, donde la vacunación de supresión estabiliza o
mejora los síntomas clínicos del paciente, es de particular interés.
Dicho tratamiento es deseable realizarlo previamente a la pérdida
completa de la función en los tejidos afectados.
Autoantígenos conocidos por estar asociados con
la enfermedad incluyen proteínas de la mielina con enfermedades
desmielinizantes, por ejemplo la esclerosis múltiple y
mielitis autoinmune experimental; colágenos y la artritis
reumatoide, insulina, proinsulina, decarboxilasa del ácido glutámico
65 (GAD65), antígeno de células de los islotes (ICA512; ICA12) con
diabetes dependiente de insulina. Una asociación de epítopes GAD
con diabetes se describió en una serie de publicaciones, incluyendo
la Patente US No. 5.212.447, y la patente europea EP 0719340. Una
asociación de epítopes de insulina con insulitis autoinmunes se
describe en el Griffin et al. (1995) Am. J. Pathol.
147:845-857. Rudy et al. (1995) Mol. Med.
1:625-633 describe un epítope que es similar en el
GAD y proinsulina.
Los componentes de las proteínas de las
proteínas de la mielina, incluyendo la proteína básica de la
mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP), la glicoproteína
asociada a la mielina (MAG) y la glicoproteína oligodendrocito de
mielina (MOG), se utilizan como inmunógenos. La supresión de la
respuesta de células T a estos antígenos se utiliza para prevenir o
tratar enfermedades desmielinizantes.
Se describe aquí un ejemplo donde la vacuna de
autoantígeno es proteolipídica. Para mayor comodidad, una secuencia
de referencia del PLP humano se proporciona como SEQ ID NO: 1, y la
proteína básica de mielina humana como SEQ ID NO: 3. El
proteolípido es un componente importante de la mielina, y es
conocido por estar involucrado en enfermedades desmielinizantes
(véase, por ejemplo, Greer et al. (1992) J. Immunol.
149:783-788 y Nicholson (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 94:9279-9284).
La proteína de la membrana integral de PLP es un
autoantígeno dominante de la mielina. Determinantes de la
antigenicidad del PLP se han identificado en varias cepas de
ratones, así como los residuos 139-151 (Tuohy et
al. (1989) J. Immunol. 142:1523-1527),
103-116 (Tuohy et al. (1988) J. Immunol.
141:1126-1130), 215-232 (Endoh
et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.
92:433-438), 43-64 (Whitham et
al. (1991) J. Immunol. 147:3803-3808) y
178-191 (Greer, et al. (1992) J. Immunol.
149:783-788). La inmunización con PLP nativo o con
péptidos sintéticos correspondientes a epitopes PLP induce EAE.
Análogos de los péptidos PLP generados por la sustitución de un
aminoácido puede prevenir la inducción y progresión de la EAE
(Kuchroo et al. (1994) J. Immunol.
153:3326-3336, Nicholson et al. (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:9279-9284).
MBP es una proteína extrínseca de la mielina que
se ha estudiado extensamente. Al menos se han notificado 26
epítopes MBP (Meini et al. (1993) J. Clin. Invest.
92:2633-2643). De uso son los residuos
1-11, 59-76 y
87-99. Análogos de los péptidos MBP generados por el
truncamiento se ha demostrado que revierten EAE (Karin et
al. (1998) J. Immunol. 160:5188-5194). De
fragmentos de polipéptidos que codifica ADN pueden incluir
secuencias de codificación para epítopes inmunogénicos, por
ejemplo la proteína básica de la mielina
p84-102, más concretamente, la proteína básica de
la mielina p87-99, (SEQ ID NO: 11) VHFFKNIVTP RTP
(p87-99), o incluso el péptido truncado
7-mer (SEQ ID NO: 12) FKNIVTP. Las secuencias de la
proteína básica de la mielina del exón 2, incluyendo el epítope
inmunodominante bordeado por aminoácidos 59-85, son
también de interés. Para ejemplos, véase Sakai et al. (1988)
J Neuroimmunol 19:21-32; Baxevanis et al
(1989) J Neuroimmunol 22:23-30; Ota et al
(1990) Nature 346:183-187; Martin et al
(1992) J Immunol. 148:1350-1366, Valli et al
(1993) J Clin Inv 91:616. El péptido MBP Inmunodominante
(84-102) se ha encontrado que se une con gran
afinidad a DRB1*1501 y DRB5* 0101 moléculas de la enfermedad
asociada al haplotipo DR2. Segmentos de péptidos superpuestos pero
diferentes fueron importantes para la unión a estas moléculas,
residuos hidrofóbicos (Val 189 y Phe92) en el segmento MBP
(88-95) para la unión del péptido a moléculas
DRB1*1501; residuos hidrofóbicos y cargados (Phe92, Lys93) en la
secuencia MBP (89-101/102) contribuye a la unión de
DRB5*0101.
La transmembrana glicoproteína MOG es un
componente menor de la mielina que se ha demostrado que induce la
EAE. Epítopes MOG inmunodominantes que se han identificado en varias
cepas de ratón incluyen los residuos de 1-22,
35-55, 64-96 (deRosbo et al.
(1998) J. Autoimmunity 11:287-299, deRosbo et
al. (1995) Eur J Immunol. 25:985-993) y
41-60 (Leadbetter et al. (1998) J Immunol
161:504-512).
La invención proporciona un casete de expresión
de ADN que codifica al menos una parte de un autoantígeno,
usualmente como parte de un vector, que se introduce en el tejido
del receptor de la vacuna. El minigen se expresa en el tejido, y el
polipéptido codificado actúa como inmunógeno, o antígeno. La
secuencia de autoantígeno puede ser de cualquier especie de
mamíferos o aves, por ejemplo primates sp., en particular,
humanos, roedores, incluyendo ratones, ratas y hámsters, conejos,
equinos, bovinos, caninos, felinos; etc. De particular
interés son los segmentos autoantígeno humanos y de ratón. En
general, la secuencia tendrá la misma especie de origen como de
acogida de animales, preferentemente será autólogo.
El casete de expresión de ADN del objeto
comprenderá la mayor parte o la totalidad de la secuencia que
codifica un fragmento de autoantígeno, según la definición de Kabat,
et al., supra. La secuencia de codificación se puede
truncar en el término 5' o 3' y puede ser un fragmento de la
secuencia polipeptídica completa. En una realización de la
invención, la secuencia codifica un fragmento de péptido que se sabe
que se presentará a las células T patógenas, por ejemplo péptidos
presentados por moléculas de clase II de MHC del huésped. Estos
péptidos se han descrito en la literatura, y son típicamente de
aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 aminoácidos de
longitud.
longitud.
La vacuna puede ser formulada con una o un
cóctel de secuencias autoantígeno. Si bien se ha encontrado que una
única secuencia es capaz de suprimir una respuesta a múltiples
epítopes, puede ser deseable en algunos casos para incluir varias
secuencias, donde cada una codifica un epítope diferente. Por
ejemplo, véase Leadbetter et al. (1998) J. Immunol.
161:504-512. Una fórmula compuesta de múltiples
secuencias de codificación puede ser utilizada para inducir a una
respuesta de supresión más potente y/o sostenida. Apuntando
específicamente a múltiples poblaciones de células T
autorreactivas, dicha formulación puede retrasar o prevenir el
desarrollo de la resistencia autoantígeno. El uso de secuencias de
PLP en combinación con otros epítopes de proteínas de la mielina
efectivamente puede suprimir el repertorio de células T reactivas a
la mielina. Combinaciones similares de autoantígeno para suprimir
la respuesta autoinmune, por ejemplo, se contemplan la
decarboxilasa del ácido glutámico (GAD) y autoantígeno de células
de los islotes pancreáticos para el tratamiento de la diabetes
dependiente de insulina.
Además de los epítopes específicos y
polipéptidos de autoantígenos, la respuesta inmune puede ser
mejorada por la inclusión de secuencias CpG, según lo descrito por
Krieg et al. (1998) Trends Microbiol.
6:23-27, y la secuencia de ayuda, King et
al. (1998) Nat. Med. 4:1281-1286. Los efectos
biológicos de los motivos de ADN como dinucleótidos CpG no
metilados en particular en contextos base (motivos
CpG-S) pueden modular la respuesta inmune innata
cuando se inyecta a los animales. Los números bajos de los motivos
CpG, o la presencia de motivos imperfectos, pueden actuar en el
desarrollo de anergia mediante la inmunización con
autoantígenos.
La secuencia de codificación de polipéptido, que
puede ser autoantígeno o citocina, las secuencias se insertan en un
casete de expresión adecuado. El constructo de expresión se prepara
en formas convencionales. El casete tendrá las secuencias
reguladoras adecuadas de transcripción y de traducción para la
expresión de la secuencia en las células receptoras de la vacuna.
El casete en general, será parte de un vector, que contiene un
origen de replicación adecuado y dichos genes que codifican
marcadores seleccionables que sean necesarios para el crecimiento,
la amplificación y la manipulación del vector, antes de su
introducción en el receptor. Vectores adecuados incluyen plásmidos,
YACs, BACs, bacteriófagos, retrovirus, y similares.
Convenientemente, el vector de expresión será un plásmido. Antes de
la vacunación, el casete se puede aislar a partir de secuencias de
vectores mediante fragmentación, la amplificación, etc. como
se conoce en la técnica. Para la inyección, el ADN puede ser
superenrollado o lineal, de preferencia superenrollado. El casete se
puede mantener en la célula huésped por largos periodos de tiempo,
o puede ser transitorio, generalmente transitorio. El mantenimiento
estable se logra mediante la inclusión de secuencias que sirvan para
la integración y/o mantenimiento, por ejemplo vectores
retrovirales, los vectores de EBV y
similares.
similares.
El casete de expresión en general, empleará una
región de iniciación de la transcripción exógena, por
ejemplo un promotor que no sea el promotor el que está
asociado con el receptor de células T en el cromosoma que se
produce naturalmente. El promotor es funcional en las células
huésped, en particular, células huésped seleccionadas por el
casete. El promotor puede ser introducido por procedimientos
recombinantes in vitro, o como el resultado de la
integración homóloga de la secuencia mediante una célula huésped
apropiada. El promotor está operativamente unido a la secuencia de
codificación del autoantígeno para producir una transcripción
traducible del ARNm. Vectores de expresión convenientemente tendrán
sitios de restricción situados cerca de la secuencia promotora para
facilitar la inserción de secuencias de autoantígeno.
Se preparan casetes de expresión que comprenden
una región de iniciación de la transcripción, que puede ser
constitutiva o inducible, el gen que codifica la secuencia de
autoantígeno, y una región de terminación de la transcripción. Los
casetes de expresión pueden ser introducidos en una variedad de
vectores. Los promotores de interés pueden ser constitutivos o
inducibles, por lo general constitutivos, y proporcionarán altos
niveles de transcripción en las células receptoras de la vacuna. El
promotor puede ser activo sólo en el tipo de célula receptora, o
puede ser ampliamente activo en muchos tipos de células diferentes.
Muchos promotores fuertes para células de mamíferos son conocidos
en la técnica, incluido el promotor de
\beta-actina, los promotores tempranos y tardíos
de SV40, el promotor de la inmunoglobulina, el promotor de
citomegalovirus humano, LTRs retrovirales, etc. Los
promotores pueden o no estar asociados con los mejoradores, donde
los mejoradores pueden estar naturalmente asociados con el promotor
particular o asociado con un promotor distinto.
Una región de terminación provista 3' a la
región codificante, donde la región de cancelación puede estar
naturalmente asociada con el dominio de la región variable o puede
derivarse de una fuente diferente. Una amplia variedad de regiones
de terminación puede ser empleada sin afectar negativamente a la
expresión.
Las diferentes manipulaciones pueden llevarse a
cabo in vitro o puede realizarse en un huésped adecuado,
por ejemplo E. coli. Después de cada manipulación, el
constructo resultante puede ser clonado, el vector aislado, y el
ADN detectado o secuenciado para garantizar la exactitud del
constructo. La secuencia puede ser detectada por el análisis de
restricción, secuenciación, o similares.
Un pequeño número de nucleótidos se puede
insertar en el extremo de la secuencia de autoantígeno, usualmente
no más de 20, más usualmente no más de 15. La supresión o inserción
de nucleótidos usualmente será como resultado de las necesidades
del constructo, previendo sitios de restricción convenientes,
añadido de señales de procesamiento, facilidad de manipulación,
mejora en los niveles de expresión, o similares. Además, se puede
desear para sustituir uno o más aminoácidos con un aminoácido
diferente por razones similares, usualmente no sustituyendo más de
aproximadamente cinco aminoácidos en la región.
En una realización de la invención el
autoantígeno es co-vacunado con secuencias de ADN
que codifican una citocina Th2, dicho grupo incluye
IL-4, IL-10,
TGF-\beta, etc. IL4 es de particular
interés. La linfocina IL-4 tiene actividades factor
de crecimiento célular de células T y mastocitos. IL4 humana es una
glicoproteína de 18-kD. Por conveniencia, la
secuencia de aminoácidos se proporciona aquí como SEQ ID NO: 13, y
la secuencia de ADN como SEQ ID NO: 14 (Yokota et al. (1986)
P.N.A.S. 83:5894-5898). Esta secuencia es la
secuencia preferida de la invención. Sin embargo, la invención no
se limita a la utilización de esta secuencia en construcciones de
la invención. También de uso están secuencias variantes
estrechamente relacionadas que tienen la misma actividad biológica,
o una actividad biológica sustancialmente similar. Un sitio
seleccionado de enlace de ADN STAT6 específico de destino se
encuentra en el promotor del gen del receptor de IL4 y STAT6 activa
la expresión del gen IL4 a través de este sitio. Interferones
inhiben la activación inducida por IL4 de STAT6 y la expresión
génica dependiente de STAT6, al menos en parte, al inducir la
expresión de SOCS1 (véase la Kotanides et al. (1996) J.
Biol. Chem., 271:25555-25561).
Las variantes de secuencias codifican
subunidades de proteínas que, cuando se presentan en un constructo
de ADN de la invención, dan la proteína de una o más de las
propiedades biológicas de IL4 como se describió anteriormente.
Secuencias de ADN de la invención pueden diferir de una secuencia
IL4 nativa mediante la supresión, inserción o sustitución de uno o
más nucleótidos, siempre que codifiquen una proteína con la
actividad biológica apropiada como se describió anteriormente. Del
mismo modo, se pueden truncar o extenderse por uno o más
nucleótidos. Alternativamente, las secuencias de ADN adecuadas para
la práctica de la invención pueden ser secuencias degeneradas que
codifican la proteína IL4 naturalmente producida. Normalmente, las
secuencias de ADN de la invención tienen por lo menos 70%, al menos
el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% de
identidad de secuencia con una secuencia codificadora IL4 nativa.
Pueden proceder de cualquier especie, aunque los ADNs que codifican
proteínas humanas son los preferidos. Secuencias variantes pueden
ser preparadas de acuerdo a cualquier medio adecuado conocido en la
técnica.
Con respecto a las sustituciones, se prefieren
las sustituciones conservadoras. Normalmente, las sustituciones
conservadoras son sustituciones en las que el aminoácido sustituido
es de una naturaleza similar a la presente la de la proteína
naturalmente producida, por ejemplo en términos de carga y/o tamaño
y/o polaridad y/o hidrofobicidad. Similarmente, sustituciones
conservadoras suelen tener poco o ningún efecto sobre la actividad
de la proteína. Las proteínas de la invención que difieren en la
secuencia de IL4 naturalmente producida pueden ser diseñadas para
diferir en la actividad de IL4 naturalmente producida. Normalmente,
estas manipulaciones se llevarán a cabo en el nivel de ácidos
nucleicos utilizando técnicas de recombinación, como son conocidas
en la técnica.
La vacuna puede formularse con una o un cóctel
de secuencias de autoantígeno, que pueden ser vectores iguales o
diferentes. Los vectores de ADN están suspendidos en un tampón
fisiológicamente aceptable, en general, una solución acuosa por
ejemplo suero fisiológico, tampón fosfato salino, agua,
etc. Agentes estabilizantes, agentes humectantes y
emulsificantes, sales para variar la presión osmótica o tampones
para garantizar un pH adecuado y potenciadores de penetración en la
piel pueden utilizarse como agentes auxiliares. El ADN estará
usualmente presente en una concentración de al menos 1 ng/ml y no
más de 10 mg/ml, normalmente entre 100 \mug y 1 mg/ml.
En algunas realizaciones de la presente
invención, el paciente es administrado con una secuencia que
codifica autoantígenos y una secuencia que codifica citocina Th2.
Las citocinas y el autoantígeno pueden ser suministrados de forma
simultánea, o dentro de un corto período de tiempo, por la misma o
por diferentes rutas. En una realización de la invención, las dos
secuencias se co-formulan, lo que significa que se
suministran juntas como parte de una composición única. Las
secuencias de codificación pueden estar asociadas entre sí mediante
una unión covalente de una sola molécula de ácido nucleico, donde
pueden estar presentes como dos secuencias de codificación
diferentes separadas por un punto de traslación, o pueden estar
presentes como una proteína de fusión única. Las dos secuencias
también se pueden unir mediante interacción no covalente, tales
como interacción hidrofóbica, unión de hidrógeno, interacción
iónica, interacción de van der Waals, interacción magnética, o
combinaciones de los mismos. Alternativamente, los dos constructos
sólo se pueden mezclar en una suspensión común, o encapsularse
juntos en algún tipo de dispositivo de administración como, por
ejemplo, un dispositivo de alginato, un liposoma, vesícula de
quitosano, etc. (véase, por ejemplo, el documento WO 98/33520).
La vacuna puede fraccionarse en dos o más dosis
de al menos 1 \mug, más usualmente, al menos 100 \mug
aproximadamente, y preferiblemente al menos 1 mg por dosis,
administrada separada entre 4 días a una semana. En algunas
realizaciones de la invención, el individuo está sujeto a una serie
de vacunas para producir una respuesta inmunitaria más amplia.
Según este procedimiento, por lo menos dos y preferiblemente cuatro
inyecciones se administran en un período de tiempo. El período de
tiempo entre las inyecciones puede ser de 24 horas de diferencia a
dos semanas o más entre las inyecciones, preferentemente una semana
de diferencia. Alternativamente, al menos dos y hasta cuatro
inyecciones separadas se proporcionan simultáneamente en diferentes
partes del cuerpo.
La vacuna de ADN se inyecta en el músculo. De
particular interés es la inyección en la médula ósea. La vacuna
genética puede administrarse directamente en la persona a inmunizar
o ex vivo en células extraídas de la persona que se
reimplantan después de la administración. Por cualquier vía, el
material genético se introduce en las células que están presentes
en el cuerpo de la persona. Alternativamente, la vacuna genética
puede introducirse mediante diversos medios en las células que se
extraen de la persona. Estos medios incluyen, por ejemplo,
transfección, electroporación y bombardeo de microproyectiles.
Después de que el constructo genético es absorbido por las células,
se reimplanta en el individuo. De lo contrario, las células no
inmunogénico que tienen constructos genéticos incorporados en las
mismas puede escaparse de un individuo e implantarse en otro.
Un ejemplo de inyección intramuscular puede
encontrarse en Wolff et al. (1990) Science
247:1465-1468. También puede utilizarse un chorro
de inyección para la administración intramuscular, según lo descrito
por Furth et al. (1992) Anal Biochem
205:365-368. El ADN puede ser recubierto sobre
micropartículas de oro, y suministrarse por vía intradérmica,
mediante un dispositivo de bombardeo de partículas, o "pistola de
genes". La vacuna de ADN de micropartículas se ha descrito en la
literatura (véase, por ejemplo, Tang et al. (1992) Nature
356:152-154). Los microproyectiles de oro están
recubiertos con el casete de la vacuna, y a continuación, se
bombardean en las células de la piel.
Las vacunas genéticas son formuladas de acuerdo
con la forma de administración a utilizarse. Un experto en la
materia fácilmente puede formular una vacuna genética que comprende
un constructo genético. Para la inyección intramuscular se utiliza
una formulación isotónica. En general, los aditivos para la
isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol,
sorbitol y lactosa. Soluciones tales como solución salina isotónica
amortiguadora de fosfato son preferibles. Los estabilizadores
incluyen gelatina y albúmina.
Antes o simultáneamente con la administración
del constructo genético, las células pueden administrarse a un
agente estimulante celular o proliferativo celular, cuyos términos
se utilizan indistintamente y se refieren a compuestos que
estimulan la división celular y facilitan la captación de ADN y
ARN.
Bupivacaína o compuestos que tienen una
similitud funcional pueden administrarse antes o simultáneamente
con la vacuna. La bupivacaína es un homólogo de la mepivacaína y
está relacionado con la lidocaína. Hace que el tejido muscular sea
sensible a la tensión para la determinación del sodio y a los
efectos de la concentración de iones en las células. Además de
bupivacaína, mepivacaína, lidocaína y otros compuestos de acción
similar, la célula contempla otros agentes estimulantes que
incluyen lectinas, factores de crecimiento, citocinas y linfoquinas
como factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), gCSF,
gMCSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) e IL -4.
Aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 2 ml de 0,5%
bupivacaína-HCl y 0,1% metilparabeno en un portador
farmacéutico isotónico se pueden administrar en el sitio donde la
vacuna debe administrarse, preferiblemente, de 50 \mul a 1500
\mul, más preferiblemente aproximadamente 1 ml. La vacuna genética
también puede combinarse con colágeno como una emulsión y
suministrarse intraperatonalmente. La emulsión de colágeno
proporciona un medio para la liberación sostenida de ADN. Se
utilizan 50 \mul a 2 ml de colágeno.
La eficacia de la vacuna de ADN puede mejorarse
mediante la inyección de cardiotoxina en el tejido aproximadamente
una semana antes de la vacunación, según lo descrito por Davis et
al. (1993) FEBS Lett. 333:146-150, y en los
ejemplos. La cardiotoxina estimula la degeneración y regeneración
muscular. El músculo se inyecta con aproximadamente 0,1 a 10 \muM
de cardiotoxina disuelta en un vehículo farmacológicamente
aceptable.
La condición que se está tratando, y el estado
inmune del huésped determina la elección de la(s)
secuencia(s) de autoantígeno. El huésped puede ser evaluado
por la respuesta inmune a una vacuna candidata de autoantígeno
mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica.
El diagnóstico puede determinar el nivel de
reactividad, por ejemplo basado en el número de células T
reactivas en una muestra, en comparación con un control negativo de
un huésped naive, o normalizado a una curva de datos obtenida de
uno o más pacientes. Además de detectar la presencia cualitativa y
cuantitativa de células T reactivas de
auto-antígeno, las células T pueden ser escritas
como la expresión de citocinas conocidas para aumentar o suprimir
las respuestas inflamatorias. También puede ser conveniente para el
tipo de especificidad epitópica de las células T reactivas.
Las células T pueden ser aisladas de la sangre
periférica de los pacientes, los nódulos linfáticos, o
preferentemente de la inflamación en el lugar. Ensayos de
reactividad puede llevarse a cabo en las células T primarias, o las
células pueden ser fusionadas para generar hibridomas. Estas células
T reactivas también pueden ser utilizadas para análisis de
progresión de la enfermedad, mediante la monitorización de su
posición in situ, la utilización del receptor de células T,
etc. Los ensayos para monitorizar la respuesta de las células
T son conocidos en la técnica, e incluyen ensayos de proliferación
y ensayos de liberación de citocinas.
Los ensayos de proliferación miden el nivel de
proliferación de células T en respuesta a un antígeno específico, y
son ampliamente utilizados en la técnica. En un ensayo de ejemplo,
se obtienen nódulos linfáticos del paciente, sangre o células del
bazo. Una suspensión de entre 10^{4} y 10^{7} células
aproximadamente, normalmente de 10^{5} a 10^{6} células
aproximadamente se prepara y se lava, y luego se cultiva en
presencia de un antígeno de control y antígenos de prueba. Los
antígenos de prueba pueden ser péptidos de cualquier antígeno
autólogo sospechoso de inducir una respuesta inflamatoria de
células T. Las células suelen cultivarse durante varios días. La
proliferación inducida con antígenos se determina mediante la
monitorización de la síntesis de ADN mediante los cultivos, por
ejemplo la incorporación de ^{3}H-timidina
durante las últimas 18 h de cultivo.
Ensayos inmunoabsorbentes vinculados con enzimas
(ELISA) se utilizan para determinar el perfil de citocinas de las
células T reactivas, y pueden utilizarse para monitorear la
expresión de citocinas como IL-2,
IL-4, IL-5, \gammaIFN,
etc. Los anticuerpos de captura pueden ser cualquier
anticuerpo específico para una citocina de interés, donde los
sobrenadantes de los ensayos de proliferación de células T, tal como
se describe anteriormente, son convenientemente utilizados como
fuente del antígeno. Después de bloqueo y del lavado, se añaden
anticuerpos detectores marcados, y las concentraciones de proteína
presente se determinan en función de la marca que está unida.
Los ensayos de diagnóstico anteriores se pueden
realizar con varios péptidos derivados de la proteína autóloga de
interés. Una serie de péptidos que tienen la secuencia de un
auto-antígeno, por ejemplo PLP, PAM,
etc. pueden utilizarse. Los péptidos posibles pueden ser
cribados para determinar cuáles son inmunodominantes en el contexto
de la enfermedad autoinmune.
Los péptidos inmunodominantes puede definirse
mediante la detección de un panel de péptidos derivados de la
proteína de prueba. Los péptidos tienen la secuencia de aminoácidos
de una porción de la proteína, usualmente al menos, 8
aproximadamente y no más de 30 aminoácidos aproximadamente, más
usualmente no más de aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. El
panel de péptidos representará la longitud de la secuencia de
proteínas, es decir, todos los residuos están presentes en
al menos un péptido. Preferentemente, se generan péptidos solapados,
donde cada péptido se cambia de marco de 1 a 5 aminoácidos,
generando así un conjunto más completo de epítopes. Los péptidos
pueden ser inicialmente cribados en baños, y más tarde cribados para
el epítope exacto al cual responden las células T, tal como se
describió anteriormente. Los péptidos inmunodominantes son
reconocidos por una fracción significativa de los hibridomas de
respuesta restringida HLA, usualmente al menos un 10%
aproximadamente, más usualmente, al menos un 25% aproximadamente, y
puede ser tanto como del 80%.
La terapia aquí descrita deseablemente se
administrará durante la fase presintomática o preclínica de la
enfermedad, y en algunos casos durante la fase sintomática de la
enfermedad. El tratamiento temprano es preferible, para evitar la
pérdida de la función asociada con el daño del tejido inflamatorio.
La etapa presintomática, o preclínica, se define como el período, a
más tardar cuando hay participación de células T en el sitio de la
enfermedad, por ejemplo, islotes de Langerhans, tejido
sinovial, glándula tiroides, etc., pero la pérdida de la
función aún no es lo suficientemente grave como para producir los
síntomas clínicos indicativos de la enfermedad declarada. La
participación de células T puede evidenciarse por la presencia de
un número elevado de células T en el sitio de la enfermedad, la
presencia de células T específicas para autoantígenos, la
liberación de perforinas y granzimas en el sitio de la enfermedad,
la respuesta al tratamiento inmunosupresor, etc.
Las enfermedades degenerativas de las
articulaciones pueden ser inflamatorias, como con
espondiloartropatías seronegativas, por ejemplo
espondilitis anquilosante y artritis reactiva, artritis reumatoide,
gota y el lupus eritematoso sistémico. Las enfermedades
degenerativas de las articulaciones tienen una característica común,
ya que el cartílago de la articulación se desgasta, eventualmente
exponiendo la superficie del hueso. La destrucción del cartílago
comienza con la degradación de los proteoglicanos, mediada por
enzimas tales como la colagenasa y la estromelisina, resultando en
la pérdida de la capacidad para resistir la tensión de compresión.
Las alteraciones en la expresión de las moléculas de adhesión,
tales como CD44 (Swissprot P22511), ICAM-1
(Swissprot P05362), y sigue la proteína de la matriz extracelular,
tal como la fibronectina y la tenascina. Eventualmente, los
colágenos fibrosos son atacados por las metaloproteasas, y cuando se
pierde la microesqueleto de colágeno, la reparación mediante
regeneración es imposible.
Hay una actividad inmunológica significativa
dentro de la membrana sinovial en el transcurso de la artritis
inflamatoria. Si bien el tratamiento durante las primeras etapas es
conveniente, los síntomas negativos de la enfermedad pueden
aliviarse, por lo menos parcialmente, mediante tratamiento durante
las etapas posteriores. Los índices clínicos de la gravedad de la
artritis incluyen dolor, hinchazón, fatiga y rigidez matinal, y
puede controlarse cuantitativamente mediante criterios de Pannus. La
progresión de la enfermedad en modelos animales puede ser seguida
mediante la medición de la inflamación de las articulaciones
afectadas. La terapia para la artritis inflamatoria puede combinar
el tratamiento de sujetos con tratamiento NSAID convencional.
Generalmente, el tratamiento de sujetos no se combina con fármacos
modificadores de la enfermedad, tal como ciclosporina A,
metotrexato, y similares.
Un incremento cuantitativo en las células T
autorreactivas a la mieliona con capacidad de secreción de
IFN-gamma se asocia con la patogénesis de MS y EAE,
lo que sugiere que los linfocitos T inductores o que ayudan
autoinmunes en la sangre periférica de pacientes MS pueden iniciar
y/o regular el proceso de desmielinización en los pacientes con MS.
La enfermedad manifestada se asocia con debilidad muscular, pérdida
de reflejos abdominales, defectos visuales y parestesias. Durante
el período presintomático existe infiltración de leucocitos en el
líquido cefalorraquídeo, inflamación y desmielinización. Historiales
familiares y la presencia del haplotipo
HLA-DRB1*1501, DQA1*0102, DQB1*0602 son indicativos
de una susceptibilidad a la enfermedad. Los marcadores que pueden
ser monitoreados para progresión de la enfermedad son la presencia
de anticuerpos en el líquido cefalorraquídeo, "potenciales
evocados" vistos mediante electroencefalografía en la corteza
visual y el tronco cerebral, y la presencia de defectos en la
médula espinal mediante resonancia magnética o tomografía axial
computerizada. El tratamiento durante las primeras etapas de la
enfermedad ralentizará o detendrá la pérdida adicional de la
función neural.
IDDM humana es un trastorno autoinmune mediado
con células que provoca la destrucción de células b secretoras de
insulina y la manifestación de hiperglicemia. Los linfocitos T
invaden los islotes de Langerhans, y específicamente destruyen las
células b productoras de insulina. El agotamiento de las células B
resulta en una incapacidad para regular los niveles de glucosa en
la sangre. La diabetes se manifiesta cuando el nivel de glucosa en
la sangre se eleva por encima de un nivel específico, por lo general
alrededor de 250 mg/dl. En los seres humanos, un largo período
presintomático precede a la aparición de la diabetes. Durante este
período se produce una pérdida gradual de la función de las células
b pancreáticas. La progresión de la enfermedad puede ser
monitorizada en individuos diagnosticados mediante antecedentes
familiares y como susceptibles de análisis genético. El efecto
genético más importante se aprecia con genes del locus principal de
histocompatibilidad (IDDM1), Aunque otros loci, incluida la
región del gen de la insulina (IDDM2) también muestran la
vinculación con la enfermedad (véase Davies et al,
supra y Kennedy et al. (1995) Nature Genetics
9:293-298).
Los marcadores que pueden ser evaluados en la
fase presintomática son la presencia de insulitis en el páncreas,
el nivel y la frecuencia de anticuerpos de células de los islotes,
los anticuerpos de la superficie de células de los islotes, la
expresión aberrante de moléculas MHC de clase II en las células b
pancreáticas, la concentración de glucosa en la sangre, y la
concentración plasmática de insulina. Un aumento en el número de
linfocitos T en el páncreas, anticuerpos y células de los islotes de
glucosa en sangre es indicativo de la enfermedad, como lo es una
disminución en la concentración de insulina. Después de la aparición
de la diabetes manifiesta, los pacientes con función residual de
células b, evidenciada por la persistencia de péptido C de insulina
en plasma, también pueden beneficiarse del tratamiento objeto, para
evitar pérdida de la función adicional.
Las especies de mamíferos susceptibles de
enfermedades inflamatorias incluyen caninos y felinos, equinos,
bovinos, ovinos; etc. y primates, en particular, los seres
humanos. Los modelos animales, en particular pequeños mamíferos,
por ejemplo murino, lagomorfa, etc. pueden ser
utilizados para investigaciones experimentales. Los modelos
animales de interés son aquellos que participan en la producción de
anticuerpos que tienen isotipos asociados con la producción de
IL-4, por ejemplo IgE, IgG1 e IgG4. Otros
usos incluyen investigaciones de las que es conveniente investigar
un efecto específico en ausencia de inflamación mediada por células
T.
Debe entenderse que esta invención no se limita
a las formulaciones particulares y reactivos descritos, ya que
estos pueden, por supuesto, variar. También es necesario comprender
que la terminología aquí utilizada tiene el propósito de describir
realizaciones particulares solamente, y no está destinada a limitar
el alcance de la presente invención, que estará limitado sólo por
las reivindicaciones adjuntas.
Cabe señalar que, tal como se usa aquí y en las
reivindicaciones adjuntas, la forma singular "a", "y", y
"el" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto
indique claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a un
"complejo" incluye una pluralidad de tales complejos y la
referencia a "la formulación" se incluye una referencia a una
o varias formulaciones y los equivalentes de las mismas conocidas
por los expertos en la materia, y así sucesivamente.
A menos que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos que aquí se utilizan tienen el
mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a
la que pertenece esta invención. Aunque todos los procedimientos,
dispositivos y materiales similares o equivalentes a los aquí
descritos pueden ser utilizados en la práctica o el ensayo de la
invención, los procedimientos preferidos, aparatos y materiales se
describen a continuación.
Las publicaciones descritas anteriormente y a lo
largo del texto se proporcionan únicamente para su divulgación
antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada
aquí debe interpretarse como una admisión de que los inventores no
tienen derecho con anterioridad a dicha divulgación, en virtud de la
invención previa.
Los siguientes ejemplos se indican para
proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y
descripción completas de cómo hacer y utilizar la invención en
cuestión, y no están destinadas a limitar el alcance de lo que se
considera la invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la
exactitud respecto a los números utilizados (por ejemplo
cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero algunos
errores y desviaciones experimentales deberían tenerse en cuenta. A
menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso,
el peso molecular es el peso molecular promedio, y la presión está
en o cerca de la atmósfera.
Animales. Ratones hembra SJUJ de seis a
ocho semanas de edad fueron comprados al Jackson Laboratory (Bar
Harbor, ME).
Antígenos. Los péptidos fueron
sintetizados en un sintetizador de péptidos (modelo 9050: MilliGen,
Burlington, MA) mediante química
9-fluorenilmetoxicarbonil estándar. Los péptidos
fueron purificados por HPLC. La estructura fue confirmada mediante
análisis de aminoácidos y espectrometría de masas. Los péptidos
utilizados para los experimentos fueron: PLP139-151
(SEQ ID NO: 5 HSLGKWLGHPDKF), PLP139-151 L144/R147
(SEQ ID NO: 6 HSLGKLLGRPDKF), y PLP178-191 (SEQ ID
NO: 6 NTWTTCQSIAFPSK). Homogeneizado de la médula espinal (SCH) de
cobayas se utilizó después de la liofilización.
Vector de expresión de péptidos PLP. Tres
minigenes, cada uno codificando un epítope PLP, fueron construidos
mediante el recocido de dos oligonucleótidos con una secuencia
complementaria de solapamiento 16 mer (subrayado), y se extendieron
con polimerasa de ADN y dNTPs:
PLP (178-191): SEQ ID NO: 8
5'-CTGGAGACCA
GAATACCTGGACCACCTGCCAGTCTATTGCCTTCCCTA
GCAAGTCTAGAT AGCTA-3'.
GCAAGTCTAGAT AGCTA-3'.
PLP (139-151): SEQ ID NO: 9
5'-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAATGGCTAGGACATCCCGACAA
GTTTTCTAGATAGCTA-3'.
GTTTTCTAGATAGCTA-3'.
PLP (139-151) L144/R147 SEQ ID
NO: 10:
5'-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAACTACTAGGACGCC
CCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3'.
CCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos dúplex de oligonucleótidos fueron
diseñados para incorporar sitios de restricción Xho I y
Xba I.
Los productos fueron clonados en la región de
clonación múltiple de Vector pTARGET (Promega, Madison, WI), un
vector de expresión de mamíferos activado mediante el promotor CMV.
Los clones positivos fueron cribados por el color y la orientación
correcta de las inserciones fue confirmada por secuenciación
automática de ADN. La purificación del ADN plásmido fue hecho
mediante Wizard plus Maxipreps (Promega) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Protocolo de inmunización de ADN. Los
animales de experimentación se inyectaron en el cuadriceps izquierdo
con 0,1 ml de 0,25% bupivacaína-HCl (Sigma, St.
Louis, MO) en PBS. De dos a diez días después, los ratones fueron
inyectados con 0,05 ml de ADN plásmido (1 mg/ml en PBS), en el mismo
músculo.
ELISA para títulos de anticuerpos
anti-PLP139-151 o
anti-cobayas SCH. Placas de poliestireno de
microtítulo de 96 pozos (Dynatech, Chantilly, VA) se recubrieron
con 0,1 ml de péptidos o cobaya SCH, diluida en PBS con una
concentración de 0,01 mg/ml en PBS. Después de bloquear con PBS +
0,5% de suero fetal bovino (Gibco) y 0,05% Tween 20
(Bio-Rad, Hercules, CA), el suero del ratón se
incubó durante dos horas a temperatura ambiente y la unión del
anticuerpo fue probada mediante la adición IgG de
anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa
alcalina (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Después de la
adición del sustrato de enzima, las placas se leyeron a 405 nm en
un lector ELISA. La figura 1 muestra los resultados del suero tomado
siete días después de la segunda inyección intramuscular expresada
como O.D. de las muestras individuales en un grupo de diez
animales. Los valores O.D. de los sueros preinmunes fueron: dilución
1:10: 0,12, dilución 1:20: 0,08, y dilución 1,40: 0,03.
Inducción de EAE. Péptido
PLP139-151 se disolvió en PBS en una concentración
de 2 mg/ml y se emulsionó con un volumen igual de adyuvante
incompleto de Freund complementado con 4 mg/ml que mató con calor la
micobacteria de tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit,
MI). Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 0,1 ml de
emulsión de péptidos y, en el mismo día y 48 horas más tarde, por
vía intravenosa con 0,1 ml de 4 mg/ml de toxina de Bordetella
Pertussis en PBS. Los animales de experimentación se clasificaron de
la siguiente manera: 0 = sin enfermedad clínica, 1 = debilidad o
parálisis de la cola, 2 = debilidad en las extremidades traseras, 3
= parálisis de las extremidades traseras, 4 = debilidad o parálisis
en las extremidades delanteras; 5 = animales moribundos o
muertos.
muertos.
Ensayos de proliferación de células de
nódulos linfáticos. Los nódulos linfáticos de drenaje fueron
retirados de ratones después de la fase aguda de la enfermedad y las
células de los nódulos linfáticos (LNC) fueron probados in
vitro para las respuestas proliferativas específicas al péptido
PLP139-151. Los cultivos se prepararon en placas de
microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen de 0,2
ml/pocillo con una concentración de células de 2,5 x 10^{6}/ml.
Los medios de cultivo de tejidos para el ensayo consistieron en
RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (2 mM),
piruvato sódico (1 mm), aminoácidos no esenciales (0,1 mM),
penicilina (100 U/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml),
2-mercaptoetanol (5x10^{-5} M), y el 1% de suero
autólogo fresco de ratón normal. Después de 72 h de incubación a
37ºC, las células fueron pulsadas durante 18 h con 1 \muCi/pocillo
de (^{3}H) timidina. Las placas fueron cosechadas y se midió la
(^{3}H) timidina en un contador de escintilación. Después de la
recuperación de la fase aguda de la enfermedad de los animales
inyectados, ya sea con ADN que codifica para
PLP139-151 o vectores de control, se sacrificaron
pTARGET, y las LNC de drenaje fueron aisladas. Las células fueron
probadas in vitro mediante la estimulación con diferentes
concentraciones de péptido PLP139-151 o péptido de
control PLP178-191. Las respuestas proliferativas
de LNC recogido de los grupos de cinco animales se muestran en la
Figura 2 como promedio CPM \pm SD de los pocillos por triplicado.
CPM de concanavalina A (0,001 mg/ml) estimulado a LNC fue de 102401
para el grupo A y de 76702 para el grupo B.
Determinación de citocina. LNC de drenaje
(10^{7} células/ml) de animales de experimentación fueron
toma-
das después de la fase aguda de la enfermedad y estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de antígeno. Después de 24 y 48 h de estimulación, los sobrenadantes fueron recogidos y analizados mediante sándwich
ELISA.
das después de la fase aguda de la enfermedad y estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de antígeno. Después de 24 y 48 h de estimulación, los sobrenadantes fueron recogidos y analizados mediante sándwich
ELISA.
Ensayo de protección de ribonucleasa.
Para la detección de ARNm se probaron muestras de tejido de ARN de
de LNC de animales de experimentación utilizando el sistema
Multi-Probe RNase Protection Assay (RPA), RiboQuant
(Pharmigen, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Análisis Fluorocitométrico. Las células
del bazo (5 x 10^{6}/ml) de ratones SJUJ naive fueron incubadas
en presencia de ADN de plásmido que codifica la secuencia de
PLP139-151 (0,01 mg/ml) en 100 C.
Después de 24 h las células fueron recogidas y analizadas en un
citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Los conjugados de
anticuerpos utilizados fueron los siguientes: FITC
anti-ratón CD80, clon 16-10A1; FITC
anti-ratón CD86, clon GL1; FITC
anti-ratón I-A^{k}, clon
10-3.6; R-PE conjugado
anti-ratón B220, clon RA3-6B2,
R-PE anti-ratón conjugado CD11b,
clon M1170; PE anti-ratón conjugado, clon GK 1.5.
Todos los anticuerpos fueron comprados a Pharmigen, San Diego, CA.
Después de 24 h de incubación in vitro sin ADN (no) o con el
ADN de plásmido que codifica el péptido PLP139-151
[ADN (PLP139-151)], las células de bazo fueron
teñidas con anti-Mac 1 mAb,
anti-MAB B220, anti-B7.1 mAb, y
anti-B7.2 mAb tal como se indica. En blanco se
refiere al fondo de tinción no específico. Los resultados mostrados
en la Figura 4 son representativos de tres experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
El minigen, que codifica para el péptido
PLP139-151, fue clonado en un vector de expresión y
se inyecta por vía intramuscular a ratones SJUJ, dos veces, en
intervalos de una semana. Diez días después de la última inyección,
los animales de experimentación se sangraron y sus sueros fueron
probados para la presencia de anticuerpos específicos. Como se
muestra en la figura 1, títulos
anti-PLP139-151 IgG pueden ser
detectados en los ratones previamente inyectados con minigen
PLP139-151. Por lo tanto, se inducen respuestas
serológicas específicas inmunes con este constructo particular.
Para determinar si la inyección de ADN que
contiene secuencias de PLP puede ser eficaz en la protección de los
ratones a la inducción de EAE, el constructo de minigen
PLP139-151 fue inyectado por vía intramuscular, dos
veces, en intervalos de una semana. Diez días después de la última
inyección, los ratones fueron analizados con péptido
PLP139-151 emulsionado en CFA. Como se muestra en la
Tabla 1, una mejoría de la enfermedad clínica aguda se observa en
los animales vacunados con el vector de plásmido
PLP139-151, en comparación con el grupo del plásmido
de control. El inicio de la enfermedad se ha retrasado en
comparación con el grupo de plásmido control (11,5 \pm 0,5 días, p
< 0,008), la gravedad media de picos de la enfermedad se redujo
(p < 0,005), y la media de puntuación de la enfermedad se redujo
(p < 0,0005). Además, otros grupos fueron inyectados con a) un
plásmido que contiene un minigen que codifica el ligando de péptido
alterado PLP P139-151 (W144> L, H147> R), b)
un plásmido que contiene un minigen que codifica el epítope PLP
P178-191. El inicio de la enfermedad se ha retrasado
(11,6 \pm 0,5 días, p <0,009) y la media de puntuación de
picos de la enfermedad se redujo (p < 0,02) con el minigen que
codifica el ligando del péptido alterado (W144, H147). Además, se
retrasó la aparición de la enfermedad (11,5 \pm 0,4 días, p <
0,003), la gravedad media de picos de la enfermedad se redujo (p
< 0,007) y la media de puntuación de la enfermedad se redujo (P
< 0,0001) con el minigen que codifica el péptido P178 PLP
-191.
Los ratones, inyectados con ADN y también
analizados con péptido encefalitogénico PLP139-151,
fueron sacrificados después de la resolución de la fase aguda de la
enfermedad clínica. Las LNC de drenaje se volvieron a estimular
in vitro con péptido PLP139-151 y se probaron
para sus respuestas proliferativas y la producción de citocinas. La
Fig. 2 muestra que LNC de los ratones inyectados con ADN que
codifica el péptido PLP139-151 tuvieron respuestas
proliferativas menores cuando se comparan con las LNC de los
animales de control (p <0,01). La Fig. 3 (A) muestra que, cuando
son estimuladas con el PLP139-151, las LNC de los
ratones inmunizados con el plásmido de ADN que codifica la región
PLP139-151 secretan niveles más bajos de
IL-2 y \gamma-interferón en
comparación con los grupos de control. Para evaluar los niveles de
transcripciones de ARNm de citocina en el cerebro inflamado se
utilizó un ensayo de protección de la ribonucleasa en ARNm aislado
de tejido cerebral. La Fig. 3 (B) muestra una reducción en los
niveles de ARNm de interferón-\gamma e
IL-15 en ratones inmunizados con el minigen que
codifica la región PLP139-151. Por lo tanto, una
correlación entre la baja incidencia de la enfermedad clínica, la
reducción de la respuesta celular, y los bajos niveles de
IL-2, IL-15 y
\gamma-interferón es evidente en los ratones
vacunados con ADN PLP139-151. Los niveles de
expresión relativa de las bandas de ARNm de citocina que se muestran
en la figura. 3B fueron medidos mediante densitometría. Para
corregir las diferencias de carga, se normalizaron los valores de
acuerdo con el nivel de expresión del gen de limpieza, GAPDH, dentro
de cada muestra. Hay una reducción del nivel de expresión de las
citocinas probadas en cerebros de ratones vacunados con el ADN de
plásmido que codifica el determinante PLP139-151 en
comparación con los ratones vacunados con pTARGET y ADN de plásmido
PLP139-151 (L/R).
Para dilucidar un mecanismo de respuesta de las
células T disminuido, se ha probado in vitro el efecto de
APCs, cultivadas en la presencia de ADN, en las respuestas
proliferativas de células T específicas de
PLP139-151. Los esplenocitos se incubaron con ADN
plásmido que codifica el segmento de PLP139-151, o
con el péptido PLP139-151, y se utiliza como fuente
de APC para estimular las células L139, una línea de células T
específicas PLP139-151. Las respuestas
proliferativas de la línea celular T L139 en las APCs anteriores se
compararon en presencia o ausencia de cuentas de anticuerpos
anti-CD28 recubiertas. Como se muestra en la Tabla
2, las células L139 respondieron a las APCs singénicas preincubadas
con el péptido sintético PLP139-151 [cpm promedio
8512]. Esta respuesta aumenta con la adición de anticuerpos
anti-CD28 [cpm promedio 127281]. Sin embargo,
cuando las APCs fueron incubadas con la secuencia de codificación de
ADN de plásmido que contiene PLP139-151, las
células L139 fueron incapaces de responder a las APCs [cpm promedio
3358], incluso en presencia de anticuerpos anti-CD28
[cpm promedio 4532]. Esta regulación a la baja no era un efecto del
plásmido en sí, ya que las APCs que se incubaron con plásmido
contenían una secuencia irrelevante, que no afecta a la respuesta
proliferativa de las células L139 de anticuerpos
anti-CD28 [cpm 4532 frente a cpm promedio 26363, p
< 0,0001]. Por lo tanto, las células T específicas
PLP139-151 son incapaces de responder a la
co-estimulación CD28 cuando se cultivan en presencia
de APC cargadas con ADN plásmido que codifica la secuencia de
PLP139-151.
^{1} Esplenocitos (5 x 10^{6}/ml) de ratones
SJUJ naive fueron irradiados (3000 rads) e incubados
en presencia de ADN de plásmido que codifica la secuencia de
PLP139-151, plásmido solo (pTARGET), péptido
PLP139-151, o péptido de control (VHS VP16). La
concentración de plásmido de ADN fue de 0,01 mg/ml y la
concentración de péptido fue de 0,001 mg/ml. Después de las
primeras 24 horas de incubación, los esplenocitos se lavaron dos
veces y 10.000 células T de la línea de células T de péptido
PLP139-151 específicas, L139, se añadieron a cada
pocillo. Después de 48 horas de incubación adicional, la placa se
marcó con ^{3}H-timidina y la proliferación se
evaluó mediante recogida 18 después y contando la incorporación de
^{3}H-timidina. Para demostrar que el ADN desnudo
aplicado de manera exógena es absorbido por los esplenocitos, y que
se expresa, usamos la técnica de reacción en cadena inversa de
transcriptasa-polimerasa (RT-PCR).
El ARN total fue purificado a partir de los esplenocitos utilizando
el equipo RNeasy total RNA (Quiagen Inc., Valencia, CA). La
RT-PCR se realizó mediante el Access
RT-PCR System (Promega Corp., Madison, WI) y los
cebadores de oligonucleótidos específicos para el minigen
PLP139-151. Se utilizaron cebadores específicos de
vectores en una reacción RT-PCR separada para
excluir la posibilidad de contaminación de ADN. Una sola banda
correspondiente al minigen PLP139-151 fue
amplificada a partir del ARN total purificado a partir de
esplenocitos cargados con el ADN de plásmido
PLP139-151 (datos no mostrados).
^{2} La señal coestimuladora se suministró
mediante la adición de cuentas recubiertas con
anti-CD28 (5.000 por pozo), junto con las células T.
El anticuerpo anti-CD28 (clon 37.51) se obtuvo de
PharMingen (San Diego, CA). Microesferas de látex de sulfato de
poliestireno de 101 de 0,1 miera de diámetro se
obtuvieron de Interfacial Dynamics Corporation (Portland, OR). Las
cuentas (6 x 10^{6}) se suspendieron en 6 ml de PBS y se
incubaron con 24 mg de anticuerpo anti-CD28 durante
1,5 horas a 37ºC. Las cuentas se lavaron extensivamente con PBS y
se resuspendieron en RPMI-10% FCS y se dejaron
bloquear por lo menos durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
^{3} Los resultados se expresan como CPM
promedio de pocillos triplicados. * El valor P es <0,0001 para
la diferencia entre el CPM de las células T incubadas en presencia
de esplenocitos con ADN de plásmido pTARGET respecto a las células
T incubadas en presencia de esplenocitos con ADN de plásmido
PLP139-151, en presencia de anticuerpos
anti-CD28.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente estudio demuestra la protección de
la inmunización con ADN plásmido que codifica minigenes de mielina.
Una vacuna de ADN fue creada mediante la inserción de la secuencia
de codificación para la región PLP139-151 en un
plásmido bacteriano bajo el control del promotor CMV. Este vector se
inyectó en ratones SJUJ antes de la inducción de EAE mediante
inmunización con el péptido PLP139-151 en CFA. Los
animales que recibieron el plásmido que codifica para el epítope
encefalitogénico estuvieron protegidos de la inducción de EAE. El
análisis de las respuestas inmunes en los animales protegidos
demuestra la baja proliferación de células T y la disminución de la
secreción de citocinas pro-inflamatorias, tanto en
los órganos linfoides como en el órgano diana, el cerebro, en
comparación con el grupo de control. Estas características sugieren
que la inmunización con ADN energiza las células T patógenas.
La capacidad de los constructos de minigenes de
mielina para regular a la baja el efecto coestimulador de los
anticuerpos anti-CD28 en una línea de células T
específica para PLP enfatiza su capacidad para modular las
interacciones entre células T y APC. Se realizaron análisis
fluorocitométricos para determinar si la inmunización con ADN
influye en la expresión de la superficie de los ligandos CD28 de en
APCs. Después de 24 h de incubación con el ADN plásmido, los
esplenocitos fueron teñidos con anticuerpos
anti-B7.1 (CD80) o anti-B7.2 (CD86).
Tal como se muestra en la Fig. 4, se observa una regulación de B7.1
y B7.2 en células positivas Mac-1, pero no en
células B220^{+}, donde se ha observado una regulación a la baja
de B7.2. La expresión de I-A^{s} en las células
del bazo también aumentó tanto en Mac-1 como en
células positivas B220 bajo incubación con ADN.
Una regulación similar de moléculas
coestimuladoras se ha observado in vivo en linfocitos de
sangre periférica y en células del bazo de animales inoculados con
casetes de expresión de ADN que codifican la proteína 55 del núcleo
de VIH. En contraste a esta observación, se encontró que en las
respuestas autoinmunes a PLP139-151, los cambios de
expresión de moléculas coestimuladoras después de la inmunización de
ADN ejercen un efecto protector de la modulación del potencial
proliferativas y la producción de citocinas de células T
autorreactivas. Recientemente se ha informado de que en EAE, hay
aumento una de la expresión de B7.1 respecto a B7.2 en el entorno
del bazo, un hallazgo que puede ayudar a explicar cómo el sistema
inmune se inclina hacia la autoinmunidad, en lugar de su propia
ignorancia inmunológica. De manera interesante, B7.2 aumenta en el
CNS durante EAE activo y durante los brotes. La regulación a la
baja de B7.2 se correlaciona con la remisión. Los cambios en la
expresión de B7-1 y B7-2 en la
captación de ADN mediante células que presentan antígeno pueden ser
un factor clave en las respuestas de regulación de células T hacia
antígenos propios en las enfermedades autoinmunes.
Las vacunas de ADN han sido eficaces en la
generación de respuestas inmunes protectoras en varios modelos de
cáncer, y de infecciones virales, bacterianas y parasitarias. Aunque
la generación de respuestas a modo de Th1 puede ser una propiedad
de las vacunas de ADN contra antígenos que no son propios, no se han
conseguido respuestas Th1 provocadas por sí mismas con la vacuna de
ADN.
Los efectos biológicos de los motivos de ADN
como dinucleótidos CpG metilados en contextos de base particulares
(motivos CpG-S) pueden modular respuestas inmunes
innatas cuando se inyectan a animales (Krieg, A.M. et al.
1998. Trends in Microbiol. 6, 23-27). Aunque no
podemos descartar un posible efecto de estas secuencias en
constructos PLP 139-151 y PLP 139/151 (UR), los
motivos CG en estos insertos no cumplen los criterios completos
para un motivo CpG-S.
La supresión de EAE se ha reportado en ratas
Lewis mediante inmunización previa con ADN que codifica un péptido
MBP inmunodominante en tándem con receptor IgG Fc. La vacunación
suprimió los signos clínicos e hispatológicos de EAE, y redujo la
producción de interferón y después de la prueba con péptido MBP
68-85 [Lobell et al. (1998) J. Exp. Med.
187:1543-1548]. La vacunación no tuvo éxito, sin la
inclusión del constructo Fc IgG en tándem. En los experimentos aquí
presentados, aparentemente no había necesidad de ningún constructo
en tándem en relación con el minigen de mielina. En el presente
documento y en los experimentos utilizando ADN con el constructo
IgG Fc, se observó una inmunidad Th1 defectuosa a sí mismo. En
contraste, nuestro laboratorio ha informado que la inducción de
respuestas de tipo Th2 de protección mediante inmunización de ADN en
EAE [Waisman, 1996 supra]. Por lo tanto, la respuesta inmune
a una vacuna de ADN que se codifica por sí misma podría ser muy
diferente de lo observado con la vacuna de ADN para antígenos
extraños. Se podría prever que las respuestas inmunes inducidas
mediante antígenos propios codificados en vacunas de ADN se pueden
comparar con lo que se ha observado para la inmunización con el
mismo auto-antígeno en forma de péptido o proteína.
Nuestros resultados sugieren que un antígeno propio codificado en un
vector de ADN puede anergizar células T
auto-reactivas, y evitar un ataque autoinmune. La
coestimulación de las células T mediante ADN que codifica antígenos
propios se ve afectada, atenuando así las células T patógenas.
Nuestras observaciones en la EAE sugieren un modelo donde la
inmunización de ADN puede ser utilizada para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes.
El siguiente ejemplo demuestra que la
co-vacunación de los genes de las citocinas IL4,
junto con el gen para PLP_{139-151} como dos
plásmidos separados puede proporcionar inmunidad protectora contra
EAE. Además, se propone un mecanismo, en la que IL4 funcional
expresado de la vacuna de ADN actúa localmente en las células T
autorreactivas, mediante la activación de STAT6 para cambiar su
perfil a un tipo Th2. Estos resultados muestran la ingeniería de un
nuevo procedimiento de tratamiento de la enfermedad autoinmune que
combina los efectos del antígeno específico de la vacuna de ADN,
junto con los efectos beneficiosos del gen de suministro local.
\vskip1.000000\baselineskip
La vacuna de ADN IL4 produce la proteína
IL4. Para construir la vacuna de ADN IL4, la secuencia de
codificación completa para IL4 fue amplificada mediante PCR de ADNc
de bazo de ratón. Este gen fue clonado en el vector de expresión de
mamíferos pTargeT bajo el control del promotor CMV, y el plásmido se
purificó como se describe en los procedimientos. Con el fin de
demostrar que el constructo de ADNc IL4 puede producir la proteína
IL4 de longitud completa, se utilizó un sistema de traducción in
vitro. Cuando el plásmido de ADNc IL4 fue transcrito y
traducido in vitro con el ^{35}S-metionina
y resuelto mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel
de poliacrilamida) y autorradiografía, se observó un solo producto
del tamaño correcto para IL4 de ratón. Una reacción de control con
ADN de vector sin inserción o plásmido que codifica
PLP_{139-151} no produjo ningún producto
detectable. El peso molecular previsto para
PLP_{139-151} es de aproximadamente 1,5 kD y, por
tanto, sería muy difícil de visualizar mediante
electroforesis.
electroforesis.
La vacuna de ADNIL4provoca la activación de
STAT6. Para demostrar que una vacuna de ADN puede actuar como
vehículo de suministro de genes, queríamos explorar la cuestión de
si la citocina IL4 funcional se expresaba realmente a partir de la
vacuna de ADN administrada a los animales. IL4 es conocido por
actuar a través del receptor IL4 específicamente para activar
STAT6, un miembro de los transductores de señal y activadores de la
familia de transcripción (Takeda et al. (1996) Nature
380:627-30; Quelle et al. (1995) Mol Cell
Biol 15:3336-43.
Los ratones fueron vacunados por vía
intramuscular en una base de una vez por semana con ADN plásmido
que codifica ADNc IL4 tal como se describe en los procedimientos.
Los nódulos linfáticos de drenaje fueron diseccionados una semana
después de la última vacuna de ADN. Los lisados de proteínas fueron
aislados de las células de los nódulos linfáticos, y probados para
la presencia de STAT6 activado mediante Western blot utilizando un
anticuerpo policlonal específico para la forma fosforilada de STAT6.
Como controles, los ratones fueron vacunados con el vector pTargeT
solamente o sin ADN. STAT6 activado o fosforilado sólo se apreció en
los nódulos linfáticos de los ratones vacunados con ADN IL4. El
STAT6 fosforilado identificado funciona en aproximadamente 60
kD.
Resultados idénticos se obtuvieron en un
experimento independiente en el que los ratones recibieron tres
dosis diarias, en lugar de semanales, de la vacuna de ADN. Los
ratones fueron vacunados por vía intramuscular con el ADN plásmido
en una base diaria durante tres días. Un día después de la última
vacuna de ADN, los lisados de las proteínas de los nódulos
linfáticos de drenaje se obtuvieron y analizaron como anteriormente
en un Western STAT6 anti-fosforilado. Una banda de
60 kD se observó solamente en las células de los nódulos linfáticos
de los ratones vacunados con ADN IL4.
Co-vacunación con ADN que
codifica IL4 y el minigen PLP_{139-151} protege
contra la inducción de EAE. Para explorar el efecto de la
modificación de la protección conferida por la inmunización con ADN
con el gen que codifica PLP_{139-151}, los
ratones co-vacunados con los genes de IL4 y
PLP_{139-151} como dos plásmidos distintos. El
gen IL4 murino fue clonado en el vector de expresión de mamíferos
pTargeT bajo el control del promotor CMV, tal como se describió
anteriormente. El gen que codifica PLP_{139-151}
se obtuvo tal como se describe anteriormente.
Ratones SJL/J fueron inyectados con 100
microgramos de cada plásmido por vía intramuscular dos veces, a
intervalos de una semana. Los ratones de control fueron inyectados
con el vector solamente o con PBS. Diez días después de la última
inyección, los ratones fueron controlados para inducción de EAE con
el péptido encefalitogénico PLP_{139-151}
emulsionados en adyuvante completo de Freund (CFA). Tal como se
muestra en la tabla 3, hay una disminución significativa en las
puntuaciones medias de enfermedad de los ratones
co-vacunados con los plásmidos IL4 y
PLP_{139-151} en comparación con los controles
(ver la tabla para los valores p). También hay una disminución en
la incidencia de la enfermedad y la gravedad media de picos de la
enfermedad con la co-vacuna en comparación con los
controles. La aparición de la enfermedad no se retrasó
considerablemente en comparación con los grupos de control. No se
observó una protección significativa de la enfermedad en ratones
vacunados sólo con ADN que codifica IL4.
\vskip1.000000\baselineskip
Co-vacunación con ADN que
codifica IL4 rescata las respuestas proliferativas de células T en
ADN de PLP_{139-151} de animales vacunados.
Los ratones que fueron vacunados con ADN y analizados para la
inducción de la enfermedad con péptido
PLP_{139-151} fueron sacrificados después de la
recuperación de la enfermedad aguda inicial. Las células de los
nódulos linfáticos de drenaje (LNC) se obtuvieron de estos ratones y
volvieron a estimular in vitro con péptido
PLP_{139-151} para determinar su respuesta
proliferativa. Además, las líneas de células T de antígeno
específico se mantuvieron a partir de estas LNC para analizar sus
perfiles de secreción de citocinas.
LNC fueron analizados para determinar su
respuesta proliferativa al péptido PLP_{139-151}.
No hubo cambios significativos en el patrón de proliferación del
LNC desde ADN IL4 y PLP_{139-151} de ratones
co-vacunados en comparación con los ratones de
control vacunados con vectores solamente. En contraste, LNC de los
ratones vacunados sólo con ADN de PLP_{139-151}
tienen una capacidad proliferativa reducida. Hemos demostrado
previamente que estas células T son anérgicas (Ejemplo 1). Por lo
tanto, la adición de IL4 como co-vacuna de ADN es
capaz de rescatar la anergia impuesta por la vacuna de ADN
PLP_{139-151}. Por lo tanto, un mecanismo de
protección diferente puede otorgarse mediante
co-vacunación con ADN IL4 en comparación con la
vacunación con ADN PLP_{135-151} solamente.
Co-vacunación con ADN que
codifica IL4 cambia el fenotipo de las células T en un tipo Th2.
Líneas de células T específicas PLP_{139-151}
fueron aisladas y mantenidas en cultivo de ratones analizados para
la inducción de la enfermedad con el péptido
PLP_{139-151} y previamente vacunados con varias
combinaciones de ADN. Estas líneas de células T se probaron para la
producción de citocina tras la estimulación in vitro con el
péptido PLP_{139-151}. Las células T de ratones
co-vacunados con ADN IL4 y
PLP_{139-151} produjeron cantidades
significativamente mayores de IL4 (promedio de
716 \pm 237 pg/ml vs. 0,208 \pm 0,36 pg/ml de ratones vacunados con pTargeT, p < 0,0064) e IL-10 (promedio de 1073 \pm 221 pg/ml frente a 464 \pm 44 pg/ml de ratones vacunados con pTargeT, p < 0,0151) en comparación con las células T de los ratones de control. Además, las células T de IL4 y PLP_{139-151} ratones co-vacunados con ADN produjeron cantidades menores de IFN\gamma en comparación con las células T de control (promedio de 1389 \pm 108 pg/ml vs. 6,689 \pm 85 pg/ml de ratones vacunados con pTargeT, p <0,0001). Así, las células T aisladas de ratones co-vacunados y protegidos produjeron más citocinas de tipo Th2 en comparación con las células T de control. Como se indicó anteriormente, las células T de los ratones vacunados con ADN PLP_{139-151} solamente tenían una cantidad reducida de IFN\gamma, pero no sufrieron un cambio de Th2.
716 \pm 237 pg/ml vs. 0,208 \pm 0,36 pg/ml de ratones vacunados con pTargeT, p < 0,0064) e IL-10 (promedio de 1073 \pm 221 pg/ml frente a 464 \pm 44 pg/ml de ratones vacunados con pTargeT, p < 0,0151) en comparación con las células T de los ratones de control. Además, las células T de IL4 y PLP_{139-151} ratones co-vacunados con ADN produjeron cantidades menores de IFN\gamma en comparación con las células T de control (promedio de 1389 \pm 108 pg/ml vs. 6,689 \pm 85 pg/ml de ratones vacunados con pTargeT, p <0,0001). Así, las células T aisladas de ratones co-vacunados y protegidos produjeron más citocinas de tipo Th2 en comparación con las células T de control. Como se indicó anteriormente, las células T de los ratones vacunados con ADN PLP_{139-151} solamente tenían una cantidad reducida de IFN\gamma, pero no sufrieron un cambio de Th2.
\newpage
La protección de EAE en ratones
co-vacunados con IL4 y
PLP_{139-151} puede ser transferida mediante
células T. Las células T derivadas de ratones
co-vacunados con ADN IL4 y
PLP_{139-151}, que mantuvieron capacidad
proliferativa, pero sufrieron un cambio de Th2, fueron analizadas
por la capacidad de transferencia de protección. Los ratones fueron
inmunizados con el péptido encefalitogénico
PLP_{139-151} emulsionado en CFA, y ocho días más
tarde, 10 millones de células T fueron inyectadas por vía
intravenosa en cada ratón. Los animales fueron seguidos para el
fenotipo de la enfermedad. El control de las células T que son
específicas para PLP_{139-151} y capaces de
inducir EAE también se inyectaron como control. Los ratones
inyectados con células T derivadas de ratones
co-vacunados tenían una incidencia reducida (1/5
ratones en comparación con 4/5 ratones en los controles) y
resultados de enfermedad reducida en comparación con las células T
de control de ratones inyectados. Estos resultados indican que el
efecto protector alcanzado por la co-vacunación con
ADN IL4 y PLP_{139-151} puede ser transferido a
los animales naive mediante células Th2 de antígeno específicas.
Este ejemplo demuestra un procedimiento novedoso
de inmunidad protectora, que combina los efectos de la vacuna de
ADN y el suministro de genes locales. En primer lugar, hemos
demostrado que la vacuna genética IL4 proporciona IL4 funcional.
Después de confirmar que IL4 de longitud completa se expresada
incluso in vitro a partir del constructo de ADN utilizado
para la vacunación, cuando entonces se demostró que STAT6 se activa
en células de nódulos linfáticos de drenaje por la vacuna de ADN
IL4. Como STAT6 se activa específicamente mediante IL4, creemos que
la conclusión más probable es que IL4 se produce a partir de la
vacuna de ADN administradas y que interactúa con el receptor de IL4
en las células de los nódulos linfáticos, que a su vez provoca la
activación de STAT6 después del receptor. La STAT6 fosforilada
identificada en el presente estudio es de aproximadamente 60 kD.
Aunque la isoforma predominante de STAT6 descrita en la literatura
es de 100 kD, otras isoformas se han descrito en tejidos de ratón
inmune (Quelle et al., 1995). Además, un estudio reciente ha
demostrado la existencia de una isoforma 65 kD en los mastocitos de
ratón (Sherman et al., 1999). La IL4 suministrada mediante
la vacuna genética de ADN parece que activa específicamente esta
isoforma. No fuimos capaces de detectar las respuestas de
anticuerpos contra IL4 en los ratones vacunados con ADN IL4. Por lo
tanto, postulamos que el gen IL4 así suministrado y expresado es
efectivo en la generación de inmunidad protectora, sin la inducción
de una respuesta inmune contra IL4.
Cuando los ratones fueron inmunizados con la
vacuna de ADN IL4 y una vacuna de ADN para el autopéptido
PLP_{139-151}, estos ratones estaban protegidos
contra la inducción de la enfermedad mediante el péptido
PLP_{139-151} emulsionado en CFA. La vacuna de ADN
IL4 por sí sola no proporciona una protección significativa. Cuando
se examinó el perfil de citocinas de las células T ratones
co-vacunados y protegidos, se apreció un cambio a
un tipo Th2 de patrón de secreción de citocinas. Además, estas
células Th2 podrían transferir la protección contra la inducción de
la enfermedad en ratones naive. Por tanto, proponemos que la
combinación del suministro local de IL4 y la vacunación con ADN
PLP_{139-151} hace que el antígeno específico de
células T autorreactivas cambie su fenotipo a un tipo Th2 más
protector de la respuesta. Estas células T protectoras de antígenos
específicos se dirigen entonces a los sitios de daño de mielina y
atenúan la respuesta autoinmune patógena.
Un posible mecanismo de cómo este cambio
fenotípico podría ocurrir es que las vacunas de ADN IL4 y
PLP_{139-151} son captadas por células
presentadoras de antígenos (APC) en el sitio de administración de
las vacunas. El péptido PLP_{139-151} se expresa
en las células APC y se presenta en MHC de clase II en células T de
antígeno específicas que son así obtenidas. Las APC también expresan
IL4, que se secreta a nivel local durante la interacción de APC y
células T. Esta IL4 secretada entonces hace que el fenotipo de las
células T de antígeno específicas para asumir un tipo Th2 más de
fenotipo. Este modelo es compatible con estudios anteriores que
mostraron que las células T crecidas en cultivo puede hacerse que
asumen un tipo de fenotipo más Th2 mediante el crecimiento de
presencia de IL4 (Macatonia et al. (1993) Int Immunol
5:1119-28).
Estudios previos han demostrado que la APC
profesional presente en el sitio de administración u obtenida de la
médula ósea puede ocupar el ADN desnudo y viajar a los órganos
linfoides (Chattergoon et al. (1998) J Immunol
160:5707-18). Es posible que dos APC separadas o
incluso a distancia ocupen dos plásmidos diferentes. Creemos, sin
embargo, que es el microambiente local durante la interacción de APC
y células T lo que es importante, ya que no se ha observado ningún
aumento detectable en suero de IL4 en los ratones vacunados con ADN
IL4. Como procedimiento de suministro de un producto de genes
potencialmente adversos, tal como una citocina en dosis altas, esta
técnica podría ser deseable respecto a los procedimientos
tradicionales de terapia génica, ya que el gen suministrado actúa
localmente en lugar de sistémicamente.
Las vacunas de ADN han demostrado ser eficaces
en la protección contra algunos modelos animales de enfermedad
autoinmune. Una de las muchas ventajas de las vacunas de ADN
respecto a los tratamientos tradicionales de enfermedades
autoinmunes es la capacidad de modificar fácilmente el vehículo de
tratamiento. Hemos mostrado aquí que con la adición de una citocina
IL4 genéticamente suministrada en la vacuna de ADN
PLP_{139-151} se puede proteger contra EAE y,
además, llevar respuesta de protección a un tipo más Th2. La adición
de IL4 como co-vacuna de ADN rescata la anergia
impuesta por la vacuna de ADN PLP_{139-151}, y
lleva la respuesta a un fenotipo Th2. Este mecanismo de protección
conseguido mediante co-vacunación con ADN IL4 en
comparación con la vacunación con ADN
PLP_{139-151} solamente, puede tener ventajas
particulares. Esta técnica podría resultar beneficiosa en el
tratamiento de otras enfermedades autoinmunes. La inmunización
contra los antígenos que provocan las enfermedades autoinmunes
causadas por células Th1 autorreactivas, enfermedades tales como
esclerosis múltiple, diabetes juvenil y la artritis reumatoide,
serían condiciones en las que la co-vacunación con
ADN que codifica IL-4 podría resultar beneficiosa.
En conclusión, los datos presentados aquí implican una herramienta
poderosa y novedosa, a saber, la combinación del suministro local de
genes y la vacuna de ADN de antígeno específico que podría
aplicarse universalmente a todas las vacunas de ADN.
Animales. Ratones hembra SJUJ de seis a
ocho semanas de edad fueron adquiridos en The Jackson Laboratory
(Bar Harbor, ME).
Péptidos. Los péptidos fueron
sintetizados en un sintetizador de péptidos (modelo 9050; MilliGen,
Burlington, MA) mediante química
9-fluorenilmetoxicarbonil estándar. Los péptidos
fueron purificados por HPLC. Las estructuras fueron confirmadas por
análisis de aminoácidos y espectrometría de masas. Los péptidos
utilizados en estos experimentos fueron: (SEC ID NO: 15)
PLP_{139-151} (HSLGKWLGHPDKF) y (SEQ ID NO: 16)
HSVP16 P45
(DMTPADALDDRDLEM).
(DMTPADALDDRDLEM).
Vacunas de ADN. Un minigen que codifica
PLP_{139-151} fue calculado tal como se describe
anteriormente. El gen IL4 murino fue clonado por PCR a partir de
ADNc de bazo (Clontech, Palo Alto, CA) mediante el uso de los
siguientes cebadores PCR: (SEQ ID NO: 17)
5'-CGCGGATCCTTGATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTTGTC-3'
y (SEQ ID NO: 18) 5' -ACGC TC GAGGTAC TAC GAGTAATC CATTTGCATGATGC
-3'. Ambos constructos fueron clonados en la región de clonación
múltiple del vector pTargeT (Promega, Madison, WI), activado por el
promotor CMV. Los clones correctos fueron confirmados por
secuenciación de ADN automatizada. La purificación del ADN del
plásmido se realizó con el uso del equipo Qiagen
Endo-free Mega Prep (Qiagen, Santa Clarita, CA). La
pureza del ADN plásmido fue confirmada por espectrofotometría UV y
electroforesis en gel de agarosa. Solamente se utilizó ADN con una
relación de absorbancia 260 nm/280 nm mayor de 1,7.
Traducción in vitro . Constructos
de ADN utilizados para la vacunación de ADN fueron probados para la
producción del tamaño adecuado del producto mediante un ensayo de
traducción in vitro. Aproximadamente 1 \mug de ADN de
plásmido se incubó durante 2 horas a 30ºC en un volumen de 50 \mul
que contiene lo siguiente: 25 \mul de lisado de reticulocitos de
conejo TNT (Promega Corp., Madison, WI), 2 \mul de tampón de
reacción TNT (Promega Corp., Madison, WI), 1 \mul de polimerasa
de ARN TNT T7 (Promega Corp., Madison, WI), 1 \mul de una mezcla
de 1 mM de aminoácidos menos metionina (Promega Corp., Madison, WI),
4 \mul de metionina ^{35}S en 10 mCi/ml (Amersham Life Sciences
Inc., Arlington Heights, IL), y 1 \mul de inhibidor de
ribonucleasa RNasin a 40 U/\mul (Promega Corp., Madison, WI). Un
volumen de 3 \mul de los productos de esta reacción fue mezclado
con tampón de muestra SDS y se realizó en un 18% de gel de
poliacrilamida SDS. Tras el secado, el gel se expone entonces a una
película auto-
rradiografía.
rradiografía.
Westerns STAT6. Después de la disección
de nódulos linfáticos de drenaje de los ratones vacunados con ADN,
los tejidos se homogeneizaron mecánicamente en 1 ml del tampón
siguiente. 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl pH7,4, 0,001
M EDTA, 1 mg/ml aprotinina, 1,6 \muM Pefabloc SC (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN). 0,5 ml del lisado resultante fueron
usados en un análisis de la proteína BCA (Pierce, Rockford, IL),
para determinar la concentración de proteína total. Los restantes
0,5 ml se añadieron en 0,25 ml de tampón de carga SDS 3x (New
England Biolabs, Beverly, MA) que contenían DTT en una concentración
final de 0,04 M. Los productos se resolvieron en un gel
SDS-PAGE de gradiente 4-15%
(Bio-Rad, Hercules, CA). Se utilizaron marcadores
Prestained para determinar el peso molecular (Bio Rad, Hercules,
CA). Después de la electroforesis, los geles fueron borrados en
membranas PVDF (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL)
con una tensión constante de 100 V en 25 mM Tris, 192 mM glicina y
20% (v/v) de metanol, como tampón de transferencia. Las membranas
se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con solución
salina tamponada con Tris (TBS) 0,1% Tween 20, y 20% de leche en
polvo sin grasa. Después de lavar las membranas con TBS y 0,1% Tween
20, las membranas se hibridaron durante la noche a 4ºC con un
anticuerpo anti-fosfo STAT6 (New England Biolabs,
Beverly, MA) diluido 1:1000 en TBS, 0,1% Tween 20, 5% BSA. Las
membranas fueron procesadas, como en el protocolo ECL Plus
(Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL) para la
visualización de las bandas mediante quimioluminiscencia. Las
membranas fueron despojadas por incubación en 100 mM
\beta-mercaptoetanol, 2% (w/v), y 62,5 mM
Tris-HCl pH 7,4 durante 30 minutos a 60ºC. Estas
mismas membranas fueron sondeadas con un anticuerpo contra el ratón
CD3\zeta (Pharmingen San Diego, CA) como control para verificar la
carga igual de las vías.
Protocolo de inmunización con ADN. Los
animales fueron inyectados en el cuádriceps izquierdo con 0,1 ml de
0,25% bupivacaína-HCl (Sigma, St. Louis, MO) en PBS.
Dos y 9 días después, los ratones fueron inyectados con 100 mg de
ADN plásmido (en una concentración de 1 mg/ml en PBS) en el mismo
músculo. Los animales que recibieron una co-vacuna
recibieron dos inyecciones separadas de cada ADN de plásmido.
Inducción de EAE. De siete a 10 días
después de la vacuna de ADN final, EAE fue inducida en ratones con
100 mg de péptido PLP_{139-151}. El péptido se
disolvió en PBS en una concentración de 2 mg/ml y se emulsionó con
un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund complementado con
4 mg/ml de calor que mató la micobacteria de tuberculosis H37Ra
(Difco Laboratories, Detroit, MI). Los ratones fueron inyectados
por vía subcutánea con 0,1 ml de la emulsión de péptidos. Los
animales de experimentación se marcaron de la siguiente manera: 1,
debilidad o parálisis de la cola, 2, debilidad en las extremidades
traseras, 3, parálisis de las extremidades traseras, 4, debilidad o
parálisis de las extremidades delanteras, y 5, animales moribundos
o muertos.
Ensayos de proliferación celular de los
nodulos linfáticos. Después de la fase aguda de la enfermedad,
los nódulos linfáticos de drenaje fueron disecados y las células de
los nódulos linfáticos (LNC) fueron cultivadas in vitro para
la respuesta proliferativa específica para el péptido
PLP_{139-151}. LNCs se prepararon en 96 placas de
microtitulación en un volumen de 0,2 ml/pocillo en una concentración
de 2,5 X 10^{6} células/ml. El medio de cultivo consistió en RPMI
enriquecido (RPMI 1640 suplementado con L-glutamina
[2 mm], piruvato sódico [1 mm], aminoácidos no esenciales [0,1 mm],
penicilina [100 U/ml], estreptomicina [0,1 mg/ml],
2-ME [5 X 10^{-5} M]) suplementado con 1% de
suero autólogo fresco de ratón normal. Los cultivos se incubaron a
37ºC y después de 72 horas, las células fueron pulsadas durante 18
horas con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H] timidina. Las células
fueron cosechadas y se contaron en un contador beta.
Determinación del perfil de citocinas.
Las líneas de células T se establecieron a partir de LNCs derivados
de ratones vacunados con ADN. Estas células T fueron analizadas para
la producción de varias citocinas. 50 X 10^{3} células T/ml se
incubaron con 2,5 X 10^{6} APCs singénicos irradiados/ml en RPMI
enriquecido y 10% FCS. Después de 6 días de cultivo los
sobrenadantes fueron recogidos y analizados mediante ELISA
utilizando equipos ELISA estándar (Pharmingen, San Diego, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
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<110> Lawrence Steinman Pedro Ruiz Hideki
Garren
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<120> VACUNACIÓN DE ADN PARA EL
TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD AUTOINMUNE
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<130> Stan 123WO
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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
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<211> 2777
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (119)...(952)
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<210> 2
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<212> PRT
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (37)...(552)
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<221> CDS
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<221> mat_peptide
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<222> (136)...(522)
\newpage
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<400> 14
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Claims (12)
1. Casete de expresión de ADN que comprende una
región de iniciación de transcripción, una secuencia de codificación
de autoantígeno que codifica al menos una porción de un
autoantígeno y una región de terminación de la transcripción,
Comprendiendo la región de iniciación de la
transcripción un promotor,
para su utilización en el tratamiento de la
diabetes mellitus dependiente de la insulina en un huésped humano
mediante inyección intramuscular, en el que dicho autoantígeno se
asocia con la diabetes mellitus dependiente de la insulina y dicho
tratamiento estabiliza o mejora los síntomas clínicos de dicho
humano.
2. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 1, en donde dicho autoantígeno
es una proteína humana endógena.
3. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho
autoantígeno es insulina, proinsulina, decarboxilasa 65 de ácido
glutámico o antígeno de células de islotes.
4. Casete de expresión de ADN para su
utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en
la que el casete de expresión está presente en un vector.
5. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 4, en donde dicho casete de
expresión de ADN está en un vector plásmido.
6. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 4 ó 5, en el que el vector
también comprende un segundo casete de expresión que comprende una
secuencia de ADN que codifica una citocina Th2 bajo el control
regulador de un promotor que es activo en dicho huésped humano.
7. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 4 ó 5, que también comprende la
utilización de un segundo casete de ADN de expresión que comprende
una segunda secuencia que codifica una citocina Th2 bajo el control
regulador de un promotor que es activo en dicho huésped humano,
estando presente el casete un constructo de ADN separado.
8. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 7, en el que dicho constructo de
expresión que codifica de dicha citocina Th2 y dicho constructo de
expresión que codifica por lo menos una porción de un autoantígeno
están coformulados.
9. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 7, en el que dicho constructo de
expresión que codifica dicha citocina Th2 y dicho constructo de
expresión que codifica por lo menos una porción de un autoantígeno
se formulados de forma independiente.
10. Casete de expresión de ADN para su
utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el
que dicha citocina Th2 es IL-4,
IL-10 o TGF-\beta.
11. Casete de expresión de ADN para su
utilización según la reivindicación 10, en el que dicha
IL-4 es IL-4 humana.
12. Casete de expresión de ADN para su
utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
en el que el casete se administra en una serie de por lo menos dos
inyecciones administradas por lo menos con 24 horas de
diferencia.
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