SK738982A3 - Human immune interferon and derivative thereof, dna-fragment, replicable expression vector, a recombinant microorganism or a cell culture, pharmaceutical composition and use thereof - Google Patents

Human immune interferon and derivative thereof, dna-fragment, replicable expression vector, a recombinant microorganism or a cell culture, pharmaceutical composition and use thereof Download PDF

Info

Publication number
SK738982A3
SK738982A3 SK7389-82A SK738982A SK738982A3 SK 738982 A3 SK738982 A3 SK 738982A3 SK 738982 A SK738982 A SK 738982A SK 738982 A3 SK738982 A3 SK 738982A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
human immune
immune interferon
dna
interferon
amino acid
Prior art date
Application number
SK7389-82A
Other languages
English (en)
Other versions
SK279535B6 (sk
Inventor
David V Goeddel
Patrick W Gray
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23211703&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK738982(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of SK738982A3 publication Critical patent/SK738982A3/sk
Publication of SK279535B6 publication Critical patent/SK279535B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/30—Signal or leader sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vynález sa týka ľudského imunitného interferónu a jeho derivátu, izolátu DNA obsahujúceho DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, rekombinantného klonovacieho vektora obsahujúceho DNA replikovateľného transformantnom sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, expresného vektora schopného exprimovať v mikroorganizme alebo bunkovej kultúre DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, rekombinantného mikroorganizmu alebo bunkovej kultúry schopnej exprimovať imunitný interferón, farmaceutického prípravku na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov, spôsobu výroby ľudského imunitného interferónu a jeho použitia na prípravu vyššie uvedených farmaceutických prípravkov.
Vynález sa týka oblasti technológie rekombinácie kyseliny dezoxyribonukleovej (DNK), prostriedkov a metód využívajúcich túto technológiu na stanovenie DNK sekvencie a z nej odvodené aminokyselinové sekvencie ľudského imunitného interferónu, výroby uvedeného interferónu a rôznych produktov tejto výroby a ich použitie.
Vynález sa týka hlavne spôsobu izolácie a identifikácie DNK sekvencií kódujúcich ľudský imunitný interferón, zostrojovania nosičov schopných exprimovať rekombinované DNK, ktoré obsahujú uvedené DNK sekvencie operačne viazané na expresie vyvolávajúce promótorové sekvencie, a tiež takto zostrojených prostriedkov schopných expresie. Vynález sa ďalej týka, z iného hľadiska, systémov hostiteľských kultúr ako sú kultúry rôznych mikroorganizmov a bunkových kultúr stavovcov, transformovaných nosičmi schopných expresie a usmernených na expresiu zhora uvedených DNK sekvencií. Ešte z ďalšieho hľadiska sa vynález týka prostriedkov a spôsobov na premenu konečných produktov uvedenej expresie na nové výrobky, ako na farmaceutické prostriedky, ktoré sa dajú používať na profylaktické alebo terapeutické liečenie ľudí. Vo vhodnom prevedení sa vynález týka zvlášť nosičov schopných expre i
sie, ktoré sú vhodne sekvenované tak, aby bol z hostiteľskej bunky produkovaný a vylučovaný ľudský imunitný interferón v maturovanej forme. Vynález sa týka tiež rôznych postupov použiteľných na prípravu uvedených DNK sekvencií, nosičov schopných expresie, systémov hostiteľských kultúr, konečných produktov a výrobkov z nich, ako aj príslušných špecifických a pridružených uskutočnení.
Predložený vynález vznikol čiastočne na základe stanovenia DNK sekvencie a z nej odvodenej aminokyselinovej sekvencie ľudského imunitného interferónu. Vynález ďalej poskytuje sekvenčné informácie o 3 - a 5 - priľahlých sekvencií ľudského imunitného interíerónového génu, čo uľahčuje jeho in vitro naviazanie do nosičov schopných expresie. Vynález zvlášť poskytuje informáciu o 5- DNK úseku kódujúceho predpokladaný endogénny signálny polypeptid, ktorý bezprostredne predchádza aminokyselinovej sekvencií predpokladaného maturovaného imunitného interferónu. Tieto objavy umožnili následne vývoj prostriedkov a spôsobov na výrobu dostatočného množstva ľudského imunitného interferónu cestou technológie rekombinácie DNK, čo opäť umožnilo stanovenie jeho biochemických vlastností a bioaktivity.
Doterajší btav techniky
Ľudské interferóny je možné na základe rôznej antigenicity a rôznych biologických a biochemických vlastností zatriediť do troch skupín.
Prvá Bkupina obsahuje druh leukocytárnych interferónov (oC interferón, LeIF alebo IFN-c() , ktoré sú normálne produkované základnými bunkami ľudskej krvi po vírusovej indukcii. Tieto inter feróny je možné vyrábať mikrobiálne a ziBtilo sa, že i takto vy3 robené interferóny sú biologicky aktívne ( Goeddel et al., Náture 287,411 (1980), Goeddel et al., Náture 290, 20, (1981) a Yelverton et al. , Nucleic Acids Research 9, 731 (1981) ) . Ich biologické vlastnosti podnietili ich použitie na klinikách ako terapeutické prostriedky na liečenie vírusových infekcií a maligných stavov ( Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980) ).
Do druhej skupiny je zaradený ľudský fibroblastový rón (β-interferón, FIF alebo IFN-|3) , ktorý je normálne interíeprodukovaný fibroblastami po vírusovej indukcii, ktorý je možné podob ne ako je vyššie uvedený interíerón vyrábať mikrobiálne a ktorý tiež vykazuje rozsiahlu radu biologických aktivít ( al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) ). Jeho terapeutickú hodnotu preukázali aj klinické pokusy.
Goeddel et potenciálnu
Leukocy tái— ne a fibroblastové interferóny vykazujú veľmi zjavnú podobnosť vo svojich biologických vlastnostiach napriek skutočnosti, že stupeň homologity na aminokyselinovej úrovni je relatívne nízky. Po chemickej stránke obsahujú obidve skupiny interferónov od 165 do 166 aminokyselín a sú to bielkoviny stále voči kyselinám.
Do tretej skupiny je zaradený ľudský imunitný interíerón (gama-interferón, IIF alebo IFN-gama), označovaný tiež ako ľudský gama interíerón. Ľudský imunitný interíerón ku ktorému sa vzťahuje predložený vynález, je na rozdiel od cí- a (3-interí erónov labilný pri pH 2 ; je produkovaný hlavne po mitogenetickej indukcii lymíocytov a je tiež zreteľne antigénovo odlišný. Až donedávna sa ľudský imunitný interíerón dal sledovať len vo veľmi nízkych hladinách, čo bolo evidentne prekážkou pri jeho charakterizácii. Nedávno boli publikované rozsiahle, ale ešte len čiastočné spôsoby čistenia ľudského imunitného interíerónu (Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 78, 1601 (1981) ). Uvádza sa, že východzia zlúčenina bola vyprodukovaná z lymíocytárnych kultúr stimulovaných kombináciou íytohemaglutinu s íorbolesterom, a že bola čiBtená radou chromatografických delení. Týmto postupom bol získaný produkt, ktorý mal molekulovú hmotnosť 58 000.
.r
Ľudský imunitný interferón bol vyprodukovaný vo veľmi malých množstvách transláciou mRNK ( informačná ribonukleová kyselina ) v oocytoch; produkt vykazoval rysy interferónovej aktivity ľudského imunitného interíerónu a postup dával nádej, že je možné syntetizovať a klónovať imunitnú interferónovú cDNK (komplementárnu kyselinu dezoxyribonukleovú) ( Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 78, 3469 (1981) ).
Množstvá imunitného interíerónu, ktoré boli doteraz získané, určite nepostačovali k vykonaniu jednoznačných pokusov, ktoré by charakterizovali prečistenú zlúčeninu a stanovili jej biologické vlastnosti. Napriek tomu však štúdie vykonané in vitro so surovými preparátmi, a tiež pokusy in vivo s prečistenými preparátmi gama-interíerónu naznačili, že primárny význam imunitného interíerónu môže byť v jeho použití ako imunoregulačného činidla ( Bloom, Náture 289, 593 (1980) a Sonneníeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978) ). Imunitný interíerón má nielen antivírusovú a protibunkovú účinnosť, spoločnú pre všetky ľudské interferóny, ale vykazuje tiež potenciačnú účinnosť týchto aktivít u c(- a 0-interíerónu (Fleishmann et al.,Iníection and Immunity 26, 248 (1979) ). Tiež sa publikovalo, že in vitro antiproli íeračná účinnosť gama-interíerónu na nádorové bunky je približne 10 x až 100 x výššia ako obdobná účinnosť interíerónov iných skupín ( Bloom, Náture 289, 593 (1980), Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980) a Rudin et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 77, 5928 (1980) ). Tento výsledok, spolu s vyslovenou imunoregulačnou úlohou ( Bloom, Náture 289, 593 (1980) a Sonneníeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978) ), naznačuje oveľa vyššiu protinádorovú účinnosť zmieneného IFNgama oproti IFN-a( a IFN-0. Pokusy in vivo s myšími a murine IFN -gama preparátmi dokázali ich zreteľnú nadradenosť nad antivírusovo indukované interíeróny v ich protinádorovom účinku voči osteogénnemu sarkómu ( Crane et al., J.Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978) ).
Všetky uvedené štúdie vykonané pred týmto vynálezom boli vzhľadom k veľmi malej dostupnosti imunitného interíerónu vykonané s pomerne surovými preparátmi. Napriek tomu naznačili veľ5 mi dôležité biologické vlastnosti imunitného interíerónu. Imu-;
nitný interferón má nielen Bilnú antivírusovú účinnosť, ale práv-j depodobne aj silnú imunoregulačnú a protinádorovú účinnosť,) !
ktoré ho jasne určujú ako potencionálne nádejného kandidáta kuΐ i
klinickým skúškam.ϊ r í Technológia rekombinácie DNK|
I t Technológia rekombinácie DNK dosiahla štádium, v ktoromj ľahko dochádza k niektorým chybným záverom. Molekulárni biológovia sú schopní rekombinovať rôzne DNK sekvencie s určitou ľahkosťou, a vytvárajú nové DNK jednotky, ktoré sú schopné produko-| vať rozsiahlé mnoŽBtvá exogenných bielkovinových produktov v>' transformovaných mikróboch. K,dispozícii sú všeobecné prostriedkyj
CcĹ<y a metódy pre in vitro ligásu rôznych fragmentov DNK s tupýmj alebo lepivým ( kohéznym ) koncom, ktoré produkujú potencionálne nosiče schopné expresie, ktoré sa môžu používať na transformovanie špecifických organizmov, a tým zamerať ich účinnú synté-i zu na žiadaný exogénny produkt. Ale napriek tomu, vo vzťahu na individuálny produkt, zostáva uvedená cesta o niečo zložitejšiai a veda doteraz nepokročila do štádia, kedy by už bolo možnéj správne predpovedať úspech. A skutočne tí, ktorí predpovedajú!
úspešné výsledky bez podloženia experimentálnymi výsledkami, konajú tak so značným rizikom neúčinnosti.j
Plazmid, slučka bez chromozómov dvojvláknovéj DNK, ktorá sa našla v baktériách a v iných mikróboch, často v mnohonásobných kópiách v jednej bunke, zostáva základným prvkom techno(M/ lógie rekombinácie DNK. V informácii zakódovanej v plazmidi-ckej DNK je včlenená informácia potrebná k reprodukcii plazmidov do dcérskych buniek ( t.j. začiatok replikácie ) a zvyčajne jedna alebo viac íenotypových selekčných charakteristík, ako je v prípade baktérií rezistencia voči antibiotikám; tieto selekčné charakteristiky umožňujú, že klóny hostiteľskej bunky obsahujúce plazmid, ktorý je predmetom našeho záujmu, môžu byť rozlíšené, vybrané a prednostne pestované v selektívnom rastovom prostredí. Užitočnosť plazmidov spočíva v skutočnosti, že je možné ich špecificky Štiepiť jednou alebo druhou reštrikčnou endonukleázou čiže reštrikčným enzýmom, pričom každá z týchto endonukleáz rozpoznáva na plazmid
DNK odlišné, špecifické miesto štiepenia- Po rozštiepení je možné vložiť do plazmidov heterologické gény alebo fragmenty génov buď priamym pripojením v mieste rozštiepenia, alebo pripojením na rekonštruovaných koncoch susediacich s miestom rozštiepenia. Tým sa vytvorí tzv. replikovateľný nosič schopný expresie.' Rekombinácia DNK sa vykoná mimo bunky, ale vzniknutý rekombinovaný replikovateľný, expresie schopný nosič, alebo plazmid, je možné zavádzať do buniek postupom známym ako transformácia, a kultiváciou získaného transformantu je možné pripravovať veľké množstvá rekombinovaného nosiča. Okrem toho, podľa toho kde sa gén vhodne zavedie vzhľadom k častiam plazmidov, ktoré riadia transkripciu a transláciu zakódovaných DNK informácií, je možné získaný nosič schopný expresie použiť na aktuálnu produkciu polypeptidickej sekvencie, pre ktorú je vstavaný gén kódovaný; tento postup sa v popise vynálezu označuje ako expresia.
Expresia je iniciovaná v oblasti známej ako promótor, ktorá je rozpoznávaná a na ktorú sa viaže RNK polymeráza. V transkripčnej fázi expresie sa DNK odvíja a vystavuje ako templát pre za hájenie syntézy informačnej RNK z DNK sekvencie. Informačná RNK sa ihneď premieňa do formy polypeptidu, ktorý má takú aminokyselinovú sekvenciu, aká je zakódovaná v mRNK. Každá aminokyselina je zakódovaná jediným nukleotidickým tripletom alebo kodónom , ktorých určitý súbor tvorí štrukturálny gén, t.j. tú časť, ktorá kóduje sekvenciu aminokyselín exprimovaného polypeptid^produktu- Translácia je iniciovaná štartovacím signálom ( Čo je zvyčajne kodón ATG, ktorý sa vo vzniknutej informačnej RNK stane AUG). Koniec translácie, a tým aj koniec produkovania ďalších aminokyselinových jednotiek, určujú tzv. stop - kodóny. Vzniknutý produkt sa dá získať lýzou hostiteľskej bunky, jeho oddelením od ostatných bielkovín a čistením, použitím vhodných metód.
V praxi sa môže použitím technológie rekombinácie DNK exprimovať buď len heterologný polypeptid - tzv. priama expresia, alebo sa alternatívne môže exprimovať heterológný polypeptid viazaný na časť aminokyselinovej sekvencie homológneho polypeptidu. V tomto prípade sa žiadaný bioaktívny produkt niekedy stava vo vnútri fúzovaného homológno-heterologného polypeptidu bioaktívnym až dovtedy, pokiaľ nie je zmienený íúzovaný produkt rozštiepený v extracelulárnom prostredí ; viď britský patent číslo 2 007 676 A a publikáciu Wetzela v časopise Američan Scientist 68, 664 (1980).
Technológia kultivácie buniek
Spôsob prípravy bunkových alebo tkanivových kultúr na štúdium genetiky a bunkovej fyziológie je dobre prepracovaný. Sú k dispozícii prostriedky a metódy na udržiavanie permanentných bunkových línií, pripravených postupnými sériovými prenosmi z izolátu normálnych buniek. Pre výskumné využitie sa takéto bunkové línie udržujú buď na pevnom nosiči v kvapalnom prostredí alebo kultiváciou v suspenzii, ktorá obsahuje podporné živné látky. Zväčšovanie laboratórnych kultivácií do veľkých výrobných násad je podľa všetkého Bpojené len s mechanickými problémami. Pokiaľ sa týka ďalších údajov, odkazujeme na monografiu Microbiology, 2. vydanie, Harper a Row Inc., Hagerstown, Maryland (1973), zvlášť na str. 1122 a ďalšie, a na časopis Scietific American 245, Btr.66 a ďalšie (1981).
Podgtata vynálezu
Predmetom vynálezu je ľudBký imunitný interferón a jeho derivát, obidva b aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na pripojenom obr. 5, bez iného proteínu, s ktorým je obyčajne združený, ako i jeho alely.
Derivát ľudského imunitného interíerónu b aminokyselinovou
7a sekvenciou podľa obr. 5 a jeho alela majú vo forme kyselinového derivátu funkciu ľudského imunitného interferónu.
Výhodný derivát ľudského imunitného interferónu obsahuje aminokyselinový metionín na N-konci, najmä zrelej sekvencie.
Ľudský imunitný interíerón s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát b funkciou ľudského imunitného interferónu, môžu byť bez pridruženej prirodzenej glykozylácie.
Ľudský imunitný interíerón s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 5, alebo jeho alela, alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu sú vytvárané expresiou DNft, kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu interferónu, v rekombinantnej hostiteľskej bunke.
Ľudský imunitný interíerón môže byť vytváraný expresiou kódujúoeíú- rekombinant^ DNA sekvenciu v bunkovej línii cicavcov, pričom bunkovou líniou cicavcov je najmä bunková línia COS-7 opíc.
Predmetom tohoto vynálezu je tiež izolát DNA obsahujúci DNA Bekvenciu, kódujúcu ľudský interíerón, s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.
Ďalším predmetom vynálezu je rekombinantný klonovací vektor obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu ľudský imunitný interíerón, s aminokyselinovou sekvenciou podľa obr. 2, alebo jeho alela alebo dereivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.
Predmetom tohto vynálezu je tiež replikovateľný expresný vektor schopný exprimovať v transformantnom mikroorganizme alebo bunkovej kultúre DNA sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interíerón, s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.
7b
Iným predmetom vynálezu je rekombinantný mikroorganizmus alebo bunková kultúra schopné exprimovať imunitný interferón s aminokyselinovou sekv.enciou podľa obr. 5, alebo jeho alele alebo derivát b funkciou ľudského imunitného interferónu.
Výhodným rekombinantným mikroorganizmom je kmeň E. coli alebo kvasinkový kmeň.
Bunkovou kultúrou je bunková línia cicavcov, najmä bunková línia opíc.
Ďalším predmetom tohto vynálezu je farmaceutický prípravok na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov, ktorý ako účinnú látku obsahuje terapeuticky účinné množstvo ľudského imunitného interferónu podľa vynálezu v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom, najmä určený na parenterálne podávanie.
Predmetom tohto vynálezu je ďalej spôsob výroby ľudského imunitného interferónu. Pri tom sa rekombinantné hostiteľské bunky premenené expresným vektorom, obahujúcim DNA kódujúcu ľudský imunitný interferón s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alelu alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu, kultivujú v podmienkach umožňujúcich expresiu uvedenej DNA sekvencie za vzniku ľudského imunitného interferónu, ktorý sa potom izoluje.
Posledným predmetom tohto vynálezu je použitie ľudského imunitného interferónu podľa vynálezu na prípravu farmaceutických prípravkov na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov.
Vynález je založený na zistení autorov, že sa technológia rekombinácie DNA dá úspešne používať na výrobu ľudského imunitného interferónu, s výhodou v jeho priamo použiteľnej forme a to v množstvách dostatočných na zahájenie a uskutočnenie testov na zvieratách a klinických skúšok ako nevyhnutného predpokladu na schválenie komerčných zámerov. Uvedenou technológiou získaný produkt je vhodný, vo všetkých svojich formách, na použitie na profylaktické alebo terapeutické ošetrovanie pacientov s vírusovými infekciami alebo s malígnymi, imunosuprimovanými alebo imunodeíicitnými stavmi. Pod pojmom rôzne formy imunitného interferónu sú zahrnuté rôzne možné oligomérne formy, ktoré môžu zahrňovať i glykozylované formy. Produkt je možné vyrábať geneticky skonštruovanými transformovanými mikroorganizmami alebo systémami transformovaných bunkových kultúr. Termín transformovaná bunka, ako je tu používaný, sa týka buniek, do ktorých bola vložená DNA. Táto DNA vznikla rekombináciou exogénnej DNA. Termín transformovaná bunka, ako je tu používaný, sa týka potomstva akejkoľvek takejto kultúry, ktorá obahuje takto zavedenú DNA.
Existuje tak teraz potenciál, ako pripraviť a izolovať ľudský imunitný interferón účinnejším spôsobom ako to bolo možné doteraz. Významným rysom predloženého vynálezu v jeho najvýhodnejšom uskutočnení je uskutočnenie genetického riadenia mikroorganizmu alebo bunkovej kultúry tak, aby produkovali ľudský imunitný interferón v izolovateľných množstvách, vylučovaných z hostiteľskej bunky v maturovanej forme.
Vynález sa týka ľudského imunitného interferónu produkovaného vyššie uvedeným postupom, prostriedkov a spôsobov na jeho výrobu. Vynález sa týka ďalej replikácie schopných DNK nosičov schopných expresie, ktoré obsahujú zakotvené génové sekvencie kódujúce ľudský imunitný interferón v exprimovateľnej forme. Vynález je tiež zameraný na kmene mikroorganizmov alebo na bunkové kultúry transformované vyššie popísanými nosičmi, schopnými expresie a na mikrobiálne alebo bunkové kultúry takto transformovaných kmeňov alebo kultúr, ktoré sú schopné produkovať ľudský imunitný interferón.
Z iného pohľadu sa vynález týka rôznych postupov použiteľných na prípravu sekvencií génu na uvedený imunitný interferón, DNK nosičov Bchopných expresie, potrebných kmeňov mikroorganizmov a bunkových kultúr, a ďalších špecifických prostriedkov. Vynález je tiež zameraný na prípravu fermentačných kultúr zmienených mikroorganizmov a bunkových kultúr. Vynález sa týka aj prípravy ľudského imunitného interferónu ako produktu
8a priamej expresie, vylučovaného z hostiteľskej bunky v maturovanej forme. Týmto postupom sa môže využiť gén, ktorý kóduje sekvenciu maturovaného ľudského imunitného interíerónu plus 5 susediacou DNK, ktorá kóduje signálny polypeptid. Predpokladá sa, že signálny polypeptid podporuje transport molekuly k bunkovej stene hostiteľského organizmu, kde sa Štiepi počas procesu vylučovania maturovaného ľudského interíerónu. Tento spôsob umožňuje, že sa požadovaný maturovaný imunitný interferón môže izolovať a čistiť bez použitia postupov určených na elimináciu nečistôt povahy bunkových zvyškov alebo intracelulárnych bielkovín hostiteľa.
Výraz maturovaný ľudský imunitný interferón znamená mikrobiálnu alebo bunkovú kultivačnú produkciu ľudského imunitného interíerónu, ktorý nie je sprevádzaný signálnym peptidom, alebo presekvenčným peptidom, ktorý bezprostredne sprevádza transláciu ľudskej imunitnej interferónovej mRNK. Podľa vynálezu sa zistilo, že prvý rekombinantný ľudský imunitný interferón má vo svojej sekvencii ako prvú aminokyselinu metionín (prítomný prostredníctvom ATG štartovacieho signálneho kodónu, vloženého na začiatok štrukturálneho génu) alebo, v prípade, že metionín je intra- alebo extracelulárne odštiepený, svoju normálne prvú aminokyselinu cysteín. Maturovaný ľudský imunit9 ný interferón môže byť tiež podľa vynálezu produkovaný spolu s konjugovanou bielkovinou iného druhu ako je zvyčajný signálny polypeptid, pričom zmienený konjugát sa dá Špecificky Štiepiť v intra- alebo extracelulárnom prostredí; viď tiež britský patent číslo 2 007 676 A. Potom môže byť produkovaný matúrovaný ľudský imunitný interferón aj priamou expresiou, bez potreby odštiepenia akéhokoľvek cudzieho, nadbytočného polypeptidu. Tento spôsob je zvláSť významný vtedy, keď použitý hostiteľ nemôže, alebo nemôže dostatočne účinne, odstrániť signálny peptid v prípade, že nosič schopný expresie je určený k expresii maturovaného ľudského interferónu spolu s naviazaným signálnym peptidom. Vyprodukovaný maturovaný ľudský imunitný interferón sa izoluje a čistí až do úrovne vhodnej na použitie pri ošetro— vaní vírusových, maligných, imunosuprimovaných alebo imunodeficitných stavov.
Podľa vynálezu sa ľudský imunitný interferón získava nasledujúcim postupom:
1. Ľudské tkanivá, napríklad tkanivo ľudskej sleziny alebo periférne krvné lymfocyty, sa kultivujú v prítomnosti mitogénov, ktoré stimulujú produkciu imunitného interferónu.
2. Bunkové pelety z uvedených bunkových kultúr sa extrahujú v prítomnosti inhibítora ribonukleázy a izolujú sa všetky cytoplazmické RNK.
3. Na stĺpci oligo-deoxytyminribozidu (oligo-dT) sa izoluje celková mRNK v polyadenylátovej forme. Táto mRNK sa frakcionuje podľa veľkosti molekuly použitím sacharózového gradientu s rôznou hustotou a elektroforézy na kyselino-močovinovom géli.
4. Vhodná mRNK (s molekulovou hmotnosťou odpovedajúcou sedimentačnej konštante 12 až 18S) sa prevedie na zodpovedajúcu dvojvláknovú komplementárnu DNK (cDNK). Po jej zakončení poly— deoxycytidínom (poly—dC) sa vykoná inzercia tejto cDNK do vhodného vektoru, napríklad do plazmidu, ktorý nesie jeden alebo viac fenotypových markérov.
5. Takto pripravené vektory sa použijú na transformáciu bakteriálnych buniek, z ktorých sa zostaví banka kolónií. Rádioaktívne označená cDNK pripravená z indukovanej ale aj z neindu— kovanej mRNK, odvodenej vyššie uvedeným spôsobom, sa použije na separátne preskúmanie duplikátu banky kolónií. Prebytočná cDNK sa potom odstráni a kolónie sa exponujú na film citlivý na X — lúče a tak sa identifikujú k Ióny s indukovanou cDNK.
6. Z klónov obsahujúcich indukovanú cDNK sa izoluje odpovedajúca plazmidická DNK a vykoná sa stanovenie sekvencie báz nukleových kyselín.
7. V prvom usporiadaní sa potom DNK so stanovenou sekvenciou prispôsobí in vitro k inzercii do vhodného nosiča schopného expresie, ktorý sa potom použije k transformovaniu hostiteľskej bunky E.coli. ktorá sa následne podrobí kultivácii v živnom prostredí, pri ktorej dochádza k expresii žiadaného ľudského imunitného interferónu.
Θ. Takto exprimovaný ľudský imunitný interferón má v svojej maturovanej forme určite 146 aminokyselín, začína aminokyselinou cysteínom a má veľmi bázický charakter. Jeho monomerická molekulová hmotnosť bola vypočítaná na 17 140. Pravdepodobne v dôsledku prítomnosti mnohých bázických zvyškov, hydrofobicity, tvorby soľných mostíkov a podobných vplyvov sa jeho molekuly navzájom spájajú do oligomerných foriem, napríklad do formy di— méru, triméru alebo tetraméru. Vysoké molekulové hmotnosti pozorované u prirodzeného materiálu (Yip et al.. Proc. Natl. flcad. Sci. (ĽJSft) 78. 1601 (1981) ), ktoré nemôžu byť vysvetlené len na základe samej aminokyselinovej sekvencie, môžu byť pripočítané na stranu uvedeným oligomerným formám a tiež príspevku šacha11 ridov z glykolyzácie, ku ktorej dochádza po translácii.
9. Maturovaná forma ľudského imunitného interferónu je v niektorých hostiteľských bunkových systémoch, zvlášť keď je viazaná na nosič schopný expresie tak, aby bola exprimovaná spoločne s jeho signálnym peptidom, vylučovaná do živného prostredia bunkovej kultúry, čo významne pomáha pri izolácii produktu a pri čistiacich postupoch.
Výhodné vykonanie spôsobu podľa vynálezu je podrobné popísané nižšie.
A* Mikroorganizmy a bunkové kultúry //.Bakteriálne kmene a promótory
Práce uvedené v popise vynálezu boli vykonané za požitia, okrem iných, mikroorganizmu Escherichia coli K-12, kmeňa 294 (zakončenie A, thi- , hsr-, κhsm+), ktorý je popísaný v britskej patentovej publikácii číslo 2 055 382 A. Tento kmeň je uložený v Americkej zbierke typových kultúr (ATCC) pod ATCC príjmovým číslom 31 446. Použiteľné sú však i mnohé iné mikrobiálne kmene, ako aj známe kmene E. coli, napríklad E. coli B, E. coli x 1776 (ATCC číslo 31 537) a E. coli W 3110 F-, λ-, protrofický) (ATCC číslo 27 325), alebo ďalšie mikrobiálne kmene, z ktorých mnohé sú uložené a potencionálne dostupné v uznávaných ústavoch pre ukladanie mikroorganizmov, ako už vo vyššie menovanej Americkej zbierke typových kultúr (ATCC); viď ATCC katalógový zoznam. Viď tiež NSR patentový zverejňovací spis 2 644 432. Ako príklad týchto ďalších mikroorganizmov je možné uviesť rôzne druhy Bacilli, ako je Bacillus subtilis a iné enterobakteriálne mikroorganizmy, z ktorých sú za zmienku napríklad mikroorganizmy Salmonella typhimurium a Serratia marcesans, využívajúce plazmidy, ktoré môžu replikovať a exprimovať heterologické génové sekvencie, ktoré obsahujú.
Na iniciáciu a udržiavanie mikrobiálnej produkcie heterologných polypeptidov je možné výhodné používať napríklad betalaktamázové a laktúzové promótorové systémy.
2,Kvasinkové kmene a kvasinkové promótory
Systém schopný expresie týchto mikroorganizmov môže byť tiež využívaný plazmidom YRp7 ( Stinchcomb et al.. Náture 282. 39 (1979), Kingsman et al.. Gene 7. 141 (1979) a Tschumper e± al. . Gene 1O. 157 (1980) ), ktorý je schopný selekcie a repliká— cie ako v mikroorganizme E. coli, tak i v kvasinkách Sacharomyces cerevisiae. Pre selekciu v kvasinkách obsahuje tento plaz— mid gén TRPÍ ( Stinchcomb et al.. Náture 282. 39 (1979), Kingsman et al.. Gene 7. 141 (1979) a Tschumper et al.. Gene 10. 157 (1980) ), ktorý doplňuje (t.j. pripúšťa rast v neprítomnosti tryptofanu) kvasinky, ktoré majú mutácie na tomto géne (objavené na chromozóme IV kvasiniek, Mortimer et al. . Microbiolonical Rev-iews 44 , 519 (1980). Pri spôsobe podľa vynálezu je používaný kvasinkový kmeň RH 218 ( ľliozzari et al.. Journal dť Bacteriology 134. 48 (1978) ), ktorý je uložený v Americkej zbierke typových kultúr pod ATCC číslom 44 076. Je však zrejmé, že akýkoľvek kmeň Sacharomyces cerevisiae obsahujúci mutáciu, ktorá vytvára bunkový typ 1, môže byť účinným prostredím k expresii plazmidov, ktoré obsahujú systém schopný expresie. Príkladom ďalšieho kmeňa, ktorý sa môže používať na tieto účely, je pep4-l (Jones, Genetics 85. 23 (1977) ). Tento tryptofanový auxotrofný kmeň má tiež bodovú mutáciu v TRPÍ géne.
Keď sa umiestni na 5 — stranu nekvasinkového génu 5^- priľahlá DNK sekvencia (promótor) a z kvasinkového génu (pre alkoholdehydrogenázu 1), môže tento gén podporovať expesiu cudzieho génu v kvasinkách, keď sa umiestni do plazmidu použitého k transformovaniu kvasinky. Správna expresia nekvasinkového génu v kvasinkách vyžaduje vedľa promótoru ešte druhú kvasinkovú sekvenciu umiestnenú na 3 — konci nekvasinkového génu v plazmide, ktorá umožňuje vhodnú termináciu transkripcie a polyadenylácie v kvasinkách. Vo výhodnom prevedení sa 5* priľahlá sekvencia kvasinkového 3—fosfoglycerátkinázového génu ( Hitzeman, et al. . J. Biol. Chem. 255. 12073 (1980) ) umiestnia proti prúdu od štrukturálneho génu a potom nasleduje opäť DNK obsahujúca signály pre termináciu - polyadenyláciu, napríklad TRPÍ gén ( Stinchcomb et al. . ..Natuce. 2BZ>. 39 (1979), Kingsman et al. . Gene 7. 141 (1979) a Tschumper et al.. Gene 10. 157 (1980) ) alebo fosfoglycerátkinázový gén (PGK) ( Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255. 12073 (1980) ).
Pretože kvasinková 5 — priľahlá sekvencia (v spojení s 3 kvasinkovou terminálnou DNK) môže fungovať ako promótor expre— sieschopných cudzorodých génov v kvasinkách, je možné analogicky predpokladať, že sa pre expresiu dôležitých génových produktov môže používať 5- priľahlých sekvencií akéhokoľvek vysoko exprimovaného kvasinkového génu. Pretože pri niektorých okolnostiach exprimujú kvasinky až 65 Z svojej rozpustnej bielkoviny vo forme glykolytických enzýmov ( Hess et al.. J. Adv. Enzýme Regúl. 7. 149 (1968) ) a pretože sa ukazuje, že toto vysoké množstvo vyplýva z produkcie vysokých hladín individuálnych mRNK ( Holi and et al._. Biochemistrv 17. 4900 (1978) ), bolo možné používať 5- priľahlých sekvencií akéhokoľvek iného glykolytického génu pre uvedené exprimačné účely, napríklad enolázy, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, hexokinázy, pyruvátdekarboxylázy, fosfofruktokinázy, glukózo-6-fosfátizomerázy, 3-fosfoglycerátmutázy, pyruvátkinázy, triozofosfátizomerázy, fosfoglukózoizomerázy a glukokinázy. Akékoľvek 3- priľahlé sekvencie týchto génov by bolo možné používať tiež pre vhodnú termináciu a mRNK polyadenyláciou v takomto expresie schopnom systéme. Niektoré iné vysokoexprimované gény sú napríklad gé14 ny pre kyselé fosfatázy ( Bostian et al.. Proc. Natl. ftcad. Sci. (USA) 77. 4504 (1980) ) a gény, ktoré exprimujú vysoké hladiny produktov v dôsledku mutácií v 3 — priľahlých oblastiach (mutanty, ktoré zvyšujú expresiu), zvyčajne v dôsledku prítomnosti TY1 prevoditeľného prvku ( The Molecular Biology oť Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring1 Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) ).
Predpokladá sa, že všetky vyššie uvedené gény sú transkribované kvasinkovou RNK polymerázou II ( The Molecular Biology of Yeast (Aug 11—18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York) >- Je možné, že by v podobných konštrukciách schopných expresie boli tiež použiteľné RNK polymerázy I a III, ktoré transkribujú gény pre ribozomálne RNK, 5S RNK a tRNK < The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York a Chambon, Ann. Rev.Biochemistry. 44. 613 (1975) ).
Mnohé kvasinkové promótory obsahujú tiež transkripčné kontroly, takže ich možno odpojiť alebo zapojiť zmenou rastových podmienok. Ako príklady takýchto kvasinkových promótorov je možné uviesť gény, ktoré produkujú nasledujúce bielkoviny: alkoholdehydrogenáza II, izocytochróm-c, kyslá fosfatáza, degradačné enzýmy spojené s metabolizmom dusíka, glyceraldehyd -3fosfátdehydrogenáza a enzýmy zodpovedné za využívanie maltózy a ga laktózy ( Holi and et al.·, BiochemistrY- 17-, 4900 (1978) ).
Uvedená kontrolná oblasť by mohla byť veľmi užitočná pri kontrole expresie bielkovinového produktu, zvlášť keď tieto produkty sú toxické voči kvasinke. Tiež by bolo možné pripojiť kontrolnú oblasť jednej 5'- priľahlej sekvencie na 5'- priľahlú sekvenciu ktorá obsahuje promótor z vysoko exprimovaného génu. Viedlo by to však k hybridnému promótoru a bolo by to možné, pretože sa zdá, že kontrolná oblasť a promótor majú fyzikálne odlišné DNK sekvencie.
J.Systémy bunkových kultúr a vektory bunkových kultúr
Propagácia buniek stavovcov v kultúre (tkanivová kultúra) sa stala v posledných rokoch rutinnou záležitosťou. Pri spôsobe podľa vynálezu sa používali Ťibroblasty z obličiek opíc línie COS—7 ako hostitelia na produkciu imunitného interferónu (Gluzman, Celí 23.175 (1981) ). Avšak pokusy, ktoré sú tu detailne popísané je možné vykonať s akoukoľvek bunkovou líniou, ktorá je schopná replikácie a expresie kompatibilného vektoru, napríklad s bunkovými líniami WI 38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERO a HeLa buniek. Pokiaľ sa týka požiadaviek na expresie schopný vektor, vyžaduje sa tiež prítomnosť zdroja replikácie a promótora umiestneného v čele exprimovaného génu, spolu s požiadavkou prítomnosti ribozómových viažúcich miest, miest pre spájanie RNK, miest pre polyadenyláciu a sekvencie pre transkripčné terminátory. I keď tieto základné prvky obsiahnuté vo víruse SV 40 sú využívané pri spôsobe podľa tohoto vynálezu, je potrebné zdôrazniť, že vynález, aj keď je popísaný na príkladoch výhodného prevedenia, nie je obmedzený len na tieto sekvencie. Tak napríklad, je možné používať ako zdroje replikácie iné vírusové vektory ( napríklad polyoma, adeno, VSV, BPV a tak ďalej ), a tiež bunkové zdroje DNK replikácie, ktoré môžu plniť svoju funkciu v neintegrovanom stave.
B. Vektorové systémy
-/.Priama expresia maturovaného imunitného interferónu v E. coli.
Postup použitý na dosiahnutie priamej expresie imunitného
IFN—gama v mikroorganizme E. coli vo forme maturovaného interferónového polypeptidu (mínus signálna sekvencia) je variantou postupu použitého predtým pre expresiu ľudského rastového hor— mónu ( Goeddel et al.. Náture 281. 544 (1979) ) a ľudského leukocytárneho interferónu ( Goeddel et al.. Náture 287. 411 (1980) ), pokiaľ sa týka kombinácie syntetických (N-terminálnych) a cDNK kyselín.
Uvažovalo sa, že z nukleotidickej sekvencie plazmidu p69, ktorý je nižšie popísaný, a z porovnania so známym miestom štiepenia medzi signálnym peptidom a maturovaným polypeptidom v prípade niekoľkých interferónov IFN—a (Goeddel et al.. Náture 290. 20 (1981) ), má interferón IFN-gama hydrofóbny signálny peptid s 20 aminokyselinami nasledovaný 146 aminokyselinami maturovaného IFN-gama (viď obrázok 5.). Ako je znázornené na obrázku 7., miesto štiepenia reštrikčnou endonukleázou BstNI je umiestnené výhodne pri aminokyseline 4 maturovaného IFN—gama. Boli zostavené dva syntetické deoxyoligonukleotidy, ktoré obsahujú ATG kodón pre iniciáciu translácie, kodóny pre aminokyseliny 1, 2 a 3 (cysteín - tyrozín - cysteín) a vytvárajú EcoRI kohézny koniec. Tieto deoxyoligonukleotidy boli naviazané na BstNI až PstI fragment plazmidu p69 so 100 pármi báz a bol skonštruovaný synteticko-prirodzený hybridný gén so 1115 pár— mi báz, ktorý kóduje interferón IFN-gama a ktorý je viazaný EcoRI a PstI reštrikčnými miestami. Tento gén bol vložený do plazmidu pLelF A typ 103 medzi jeho EcoRI a PstI reštrikčné miesta a bol získaný plazmid pIFN-gama typ 48 schopný expre— sie. V tomto plazmide je exprimovaný IFN-gama gén pod kontrolou typ promótoru E. coli. Plazmid pLelF A typ 103 je derivátom plazmidu pLelF A 25, v ktorom EcoRI reštrikčné miesto umiestnené na povrchuu LeIF A génu bolo odstránené ; postup používaný na odstránenie tohoto EcoRI miesta bol popísaný už skôr ( Itakura et al.. Science 198. 1056 (1977) ).
2..Expresia v kvasinkách
Za účelom expresie heterológneho génu, ako je cDNK pre imunitný interferón, v kvasinke je potrebné skonštruovať pla midický vektor ktorý obsahuje štyri komponenty. Prvým kompo— nentom je časť.
ktorá berie do úvahy transformáciu obidvoch mikroorganizmov, ako E. coli tak aj kvasinky, a preto musí obsahovať gén schopný výberu každého tohoto organizmu; v prípáde spôsobu podľa vynálezu je to gén pre ampicilínovú rezis tenciu z E. coli a gén TRPÍ z kvasiniek. Tento komponent vyžaduje tiež zdroj replikácie z obidvoch organizmov, aby sa mohla udržovať plazmidická DNK v obidvoch organizmoch; v tu uvedenom prípade je to E. coli zdroj z plazmidu pBR 322 a ars 1 zdroj z chromozómu III kvasinky.
Druhým komponentom plazmidu je 5 -priľahlá sekvencia z vysoko exprimovaného kvasinkového génu, ktorá podporuje transkripciu po prúde umiestneného štrukturálneho génu. V prípade tu uvedenom, sa ako 5 — priľahlá sekvencia používa sekvencia z kvasinkového génu pre 3—fosfoglycerátkinázu <PGK). Tento fragment bol skonštruovaný takým spôsobom, že bol odstránený ATG kodón z PGK štrukturálnej sekvencie a ďalej ešte 8 párov báz (bp) proti prúdu” od tohoto ATG. Uvedená sekvencia bola nahradená sekvenciou, ktorá obsahuje nielen Xbal ale aj EcoRI reštrikčné miesta, za účelom vhodného naviazania tejto 5 —priľahlej sekvencie na štrukturálny gén.
Tretím komponentom systému je štrukturálny gén, ktorý bol skonštruovaný takým spôsobom, aby obsahoval nielen ATG štartovací signál pre transláciu, ale aj ATG stop signál pre transláciu. Izolácia a skonštruovanie takéhoto génu je popísané nižšie.
Štvrtým komponentom je kvasinková DNK sekvencia, obsahujúca 3 -priľahlú sekvenciu kvasinkového génu, ktorá obsahuje vhodné signály na zakončenie transkripcie a pre polyadenyláciu.
Keď sú prítomné všetky vyššie uvedené komponenty, môže byť v kvasinkách produkovaný imunitný interferón.
3. Expresia v bunkovej kultúre cicavcov
Stratégia syntézy imunitného interferónu v bunkovej kultúre cicavcov spočíva na vyvinutí vektora schopného nielen autonómnej replikácie, ale i expresie cudzorodého génu kontrolou heterológnej transkripčnej jednotky. Replikácie tohoto vektoru v tkanivovej kultúre boli dosiahnuté tým, že sa získal zdroj DNK replikácie (odvodený od vírusu SV 40) a že sa umožnila pomocná funkcia (T antigén ) zavedením vektoru do bunkovej línie, ktorá endogénne exprimuje tento antigén ( Lusky et al.. Náture 293. 79 (1981) a Gluzman et al.. Cold Spring Harbor...). Niekdajší promótor vírusu SV 40 predchádza štrukturálny gén interferónu a zaisťuje transkripciu génu.
Vektor, používaný na dosiahnutie expresie interferónu IFN -gama sa skladá zo sekvencií plazmidu pBR 322, ktoré zabezpečujú nielen voliteľný markér pre selekciu v E. coli ( ampicilínovú rezistenciu ), ale aj E. coli zdroj pre DNK replikáciu. Tieto sekvencie sú odvodené z plazmidu pML—1 ( Lusky et al. . Nature 293. 79 (1981) ) a obsahujú oblasť, ktorá zahrňuje EcoRI a
BamHI reštrikčné miesta. Zdroj SV 40 je odvodený z PvuII až
HindlII fragmentu s 342 pármi báz, ktorá zahrňuje túto oblasť ( Fiers et al.. Náture 273. 113 (1978) a
Reddy et al.. Science..2Q0,
494 (1978) ); obidva konce sú pritom prevedené na EcoRI zakončenie. Tieto sekvencie, okrem toho, že obsahujú vírusový zdroj DNK replikácie, kódujú promótor nielen pre prvotnú ale aj pre neskoršiu transkripčnú jednotku. Orientácia oblasti zdroja SV 40 je taká, že promótor je pre neskoršiu transkripČ nú jednotku umiestnený bližšie ku génu kódujúcemu interferón.
Autori vynálezu predpokladali, že aplikácia technológie rekombinácie DNK by bola najefektívnejšou cestou na zaistenie potrebného veľkého množstva ľudského imunitného interferómn Ci už bude alebo nebude takto vyprodukovaný materiál glykozylovaný, čo sa pokladá za charakteristické pre natívnu, z ľudských zdrojov získanú surovinu, bude pravdepodobne vykazovať bioakti— vitú umožňujúcu jeho klinické použitie na liečenie širokého okruhu vírusových, neoplastických a imunosuprimovaných stavov a— lebo ochorení.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 je znázornená sacharózová gradientová centrifugácia indukovanej periférnej krvnej lýmfocytárnej (PBL) poly (A) + RNK ( 5 až 25 sacharóza v 70 Z formamide ). Boli pozorované dve maxima interferónovej aktivity ( ako je znázornené vyčiarkovanými stĺpcami ) veľkosti odpovedajúcej sedimentačnej konštante 12S a 16S. Umiestnenie ribozomálnych RNK markérov ( ktoré boli odstreďované nezávisle ) je označené nad krivkou ab— sorbance.
Na obrázku 2 je znázornený priebeh elektroforézy indukovanej PBL poly (A) + RNK na kyselino-močovinovej agaróze ( 1,7^ Z agaróza v 6 M močovine ). Pozorovaný bol len jeden vrchol aktivity, ktorý sa pohybuje spoločne so štandardou RNK vo veľkosti 18S. Polohy ribozomálnych RNK markérov, ktoré boli podrobené súčasne elektroforéze na vedľajšej dráhe a ktoré boli delegované vyfarbením etidiumbromidom, sú označené nad profilom aktivity.
Obrázok 3 znázorňuje hybridizačné vzorky 96 kolónií s indukovanými a neindukovanými sondami cDNK, značenými rádioaktívnym sa p. Na mikrotitračnej doštičke bolo vypestovaných 96 individuálnych transformantov, bola zhotovená ich kópia na dvoch nitrocelulózových membránach a potom boli membrány hybridizované so skúšobnými vzorkami -,2P-cDNK, pripravenými buď z indukovanej mRNK ( horný obrázok ) alebo z mRNK izolovanej z neindukovaných PBL kultúr ( neindukované sondy, spodný obrázok ). Mem— rány boli premyté, aby sa odstránila nehybridizovaná RNK a potom boli exponované na film citlivý na X—lúče. Uvedený súbor membrán je reprezentatívnym typom 86 takýchto súborov ( 8300 nezávislých kolónií ). Príklad indukovaného klónu je označený ako H 12.
Na obrázku 4 je znázornená mapa reštrikčných endonukleázových miest klónu 69 s cDNK inzerciou. cDNK inzercia je naviazaná PstI reštrikčnými miestami ( na obrázku znázornené malými krúžkami na obidvoch koncoch ) a oligo dC-dG úsekmi ( znázornené jednoduchou čiarou na obidvoch koncoch ). Počet a veľkosť fragmentov, ktoré vznikli štiepením reštrikčnými nukleázami bol stanovený elektroforézou na 6 7. akry 1 amidovom géli- Umiestnenie reštrikčných miest bolo potvrdené stanovením sekvencie nukleotidov ( uvedené na obrázku 5 ). Kódovacia oblasť najväčšej otvorenej čítacej jednotky je označená prázdnym rámčekom, vyčiarkovaná oblasť označuje predpokladanú sekvenciu signálneho peptidu s 20 zvyškami a vybodkovaná oblasť znamená sekvenciu maturovaného IIF so 146 aminokyselinami. 5 -koniec mRNK je na ľavej strane obrázku, zatiaľ čo 3*-koniec je napravo.
/
Λ-z
Na obrázku 5 je znázornená nukleotidiťricá sekvencia cDNK inzercie plazmidu p69T ktorá ilustruje najbežnejšiu alelickú formu IFN-gama. Tiež je uvedená predpokladaná aminokyselinová sekvencia najdlhšej otvorenej čítacej jednotky. Predpokladaná signálna sekvencia je reprezentovaná zvyškami označenými SI «2 Š2O.
Na obrázku 6 je znázornené porovnanie štruktúry imunitného IFN-gama mRNK s analogickou štruktúrou leukocytárneho (IFN—« ) a fibroblastového CIFN-β ) interferónu. mRNK z klónu 69 ( označená ako imúnna ) obsahuje signifikantne väčšie množstvá neprelomených sekvencií.
Na obrázku 7 je uvedený schématický diagram skonštruovania plazmidu pIFN-gama typ 48 exprimujúceho interferón IFN-gama. Východzím materiálom pre uvedenú konštrukciu je PstI cDNK inzercia plazmidu p69 s 1250 pármi báz'.
Na obrázku 8 je znázornený diagram plazmidu používaného na expresiu IFN-gama v opičích bunkách.
Na obrázku 9 je znázornená Southernova hybridizácia ôsmich p ~fck/ J /7 H aO rôznych ľudských genomšrc-kéí^e-h DNK da-gerovanýc-h- reštrikčným enzýmom EcoRI a hybridizovaných s 32P značeným Odel fragmentom cDNK inzercie plazmidu p69 s 600 pármi báz. Dva vyššie uvedené EcoRI fragmenty zreteľne hybridizujú so skúšobnou vzorkou v každej DNK vzorke.
Na obrázku 10 je znázornená Southernova hybridizácia frag^'Q>ÍÍ.L~í^ * mentov získaných digose-iott- ľudské j genomtcd^j- DNK šiestimi rôznymi reštrikčnými endonukleázami a hybridizovaných s 32 p— značenou skúšobnou vzorkou z plazmidu p69.
Na obrázku 11 je schématický znázornená reštrikčná endonukleázová mapa inzercie HindlII vektoru pBl s 3100 pármi báz, z ktorej bol izolovaný PGK promótor. Je uvedená inzercia EcoRI a Xbal reštrikčného miesta v 5 -priľahlej DNK PGK génu pre 3—fosfoglycerát.
Na obrázku 12 je uvedená 5*-priľahlá sekvencia plus iniciačná kódovacia sekvencia pre PGK gén pred inzerciou Xbal a EcoRI reštrikčných miest.
Na obrázku 13 je schématický znázornená pracovná technika použitá na inzerciu Xbal miesta do polohy 8 v PGK promótore a na izoláciu fragmentu s 39 pármi báz z 5'-priľahléj sekvencie PGK, ktorá obsahuje toto Xbal zakončenie a Sau3A zakončenie.
Na obrázku 14 je schématicky znázornené skonštruovanie fragmentu s 300 pármi báz, obsahujúceho vyššie uvedený fragment s 39 pármi báz, ďalší PGK 5 -priľahlú sekvenciu ( s 265 pármi báz ) od Pvul až po Sau3A reštrikčné miesto (viď obrázok 11), a EcoRI reštrikčné miesto susediace s Xbal miestom.
Na obrázku 15 je schématicky znázornené skonštruovanie fragmentu PGK promótoru s 1500 pármi báz ( HindlII až EcoRI ), ktorý obsahuje, okrem fragmentu skonštruovaného podľa obrázku 14, fragment HindlII až Pvul s 1300 pármi báz z PGK 5 —priľahlej sekvencie ( viď obrázok 11 ).
Na obrázku 16 je znázornené zloženie expresie schopného vektoru pre ľudský imunitný interferón v kvasinke, obsahujúci modifikovaný PGK promótor, interferónovú IFN-gama, cDNK a terminačnú oblasť kvasinkového PGK génu, ako je podrobnejšie popísané v nasledujúcom popise.
Príklady.uskutočnenia vynálezu
Príklad
Á.Zdroj interferónovej IFN-gama mRNK
Periférne krvné lymfocyty (PBL) boli získané od ľudských darcov leukoforézou. Získané PBL boli čistené ďalej Ficoll-Hypaque gradientovou centrifugáciou a potom kultivované pri koncentrácii 5 x 10& buniek/ml na živnej pôde RPM I 1640 obsahujúcej 1 Z L—glutamín, 25 mM HEPES a 1 Z roztok penicilínu so streptomycínom ( Gibco, Grand Island, NY ). Bunky boli indukované k produkcii interferónu-gama mitogénnym stafylokokovým enterotoxínom B ( pri koncentrácii 1 pg/ml ) a kultivova né 24 až 48 h pri 37 °C v prostredí s 5 Z kysličníkom uhličitým. Za účelom zvýšenia relatívneho výťažku IFN-gama aktivity bol k PBL kultúram pridávaný dezacety1tymozín-a-1 ( pri koncentrácii 0,1 pg/ml )β.Izolácia informačnej RNK
Celková RNK bola extrahovaná z PBL kultúr v podstate spôsobom, ktorý popísal Berger S. L. so spolupracovníkmi ( Berger et al.. Biochemistrv 18. 5143 (1979) ). Bunky boli peletované odstredením a opäť suspendované v roztoku 10 mM chloridu sodného, 10 nM hydrochloride tris-hydroxymetylamínometánu ( TrisHC1 ) ( pH 7,5 ), 1,5 nM bezvodom chloride horečnatom a 10 nM ribonukleozid-vanádylovom komplexe. Bunky boli lýzované pridaním NP-40 ( tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 1 7. ) a bunkové jadrá boli peletované odstredením. Supernatant, ktorý obsahoval celkovú RNK, bol niekoľkonásobne extrahovaný fenolom a chloroformom. Vodná fáza bola upravená chloridom sodným na koncentráciu 0,2 M NaCl a potom bola celková RNK vyzrážaná pridaním dvoch objemov etanolu. RNK z neindukovaných ( nestimulovaných ) kultúr sa izolovala rovnakými metódami. Na izoláciu mRNK z vyzrážanej celkovej RNK bola použitá chromatografia na oligo-dT celulóze ( Aviv et al.. Proc. Natl. Acad._Sci« USA 6?-χ1408 (1972) )- Typické výťažky z 1 až 2 litrov kultivovaných PBL lymfocytov boli 5 až 10 mg celkovej RNK a 50 až 200 pg poly (A) + RNK.
C.Frakcionácia mRNK podľa veľkosti molekuly
Na frakcionáciu mRNK preparátov boli použité dve metódy.
Tieto metódy boli aplikované nezávisle na sebe ( skôr ako sú časne ) a každá viedla k signifikantnému obohateniu IFN—gama mRNK.
Na frakcionáciu mRNK bola použitá centrifugácia na šacha— rózovom gradiente v prítomnosti formamidu ako denaturačného činidla. Odstreďovanie sa vykonalo v 70 7. formamide s gradientom sacharózy od 5 do 25 7. pri 154 000 násobku zemského gravitačného zrýchlenia ( g ) počas 19 h pri 20 °C ( Boedtker et al.. Prog. in Nucleic Acids Res. ĽIclL. EjjxL. 19. 253 (1976) ). Z hornej časti gradientu boli postupne odoberané frakcie po 0,5 ml, vyzrážané etanolom a alikvotný podiel bol injikovaný do oocytov žaby Xenopus laevis za účelom translácie mRNK ( Gurdon et al. . J. Mo— lec. Biol. 80. 539 (1975) ). Po inkubácii počas 24 h pri izbovej teplote bolo testované kultivačné prostredie na antivírusovú ú— činnosť pomocou štandardného testu inhibície cytopatického účinku, pomocou vírusu vezikulóznej stomatitídy ( kmeň Indiana ) alebo vírusu encefalomyokarditídy na WISH bunkách ( ľudské amniónové ), spôsobom popísaným Stewartom ( Stewart, The Interfernn Systém. Springer, New York, p. 13-26 (1979) ), s tým rozdielom, že vzorky boli inkubované s bunkami počas 24 h ( namiesto 4 h ) predtým, ako boli vystavené pôsobeniu vírusu. Pri RNK získanej frakcionáciou použitím sacharózového gradientu boli pozorované zhodne dva vrcholy aktivity ( viď obrázok 1 )- Jeden vrchol zodpovedal vypočítanej veľkosti molekuly so sedimentačnou konštantou 12S .< svedbergov ) a obsahoval 100 až 400 jednotiek antivírusovej účinnosti v 1 ml (v porovnaní so štandardou IFN-α ) na mikrogram injikovanej RNK. Druhý vrchol aktivity zodpovedal veľkosti molekuly so sedimentačnou konštantou 16S a vykazoval asi polovičnú aktivitu pomalšie sedimentujúcej molekuly. Je samozrejmé, že každý z týchto vrcholov aktivity je potrebné pripísať interferónu IFN—gama, pretože nebola pozorovaná žiadna aktivita, keď boli tie isté frakcie testované na línii hovädzích buniek ( MDBK ), ktorá nie je chránená ľudským IFN-gama. Aktivita IFN-α a IFN-β sa dá ľahko detegovať zmieneným MDBK testom ( Goeddel et al.. Nucleic Acids Research
8, 4057 (1980) ).
Frakcionácia mRNK ( 200 pg ) bola podľa druhej metódy vykonaná elektroforézou na kyselino-močovinových agarozových géloch. Doštička s uvedeným agarózovým gélom ( Lehrach et al. . Biochemistrv 16. 4743 (1977) a Lynch et al.. Virolonv 98. 251 (1979) ) sa skladá z 1,75 Z agarózy, 0,025 M citrátu sodného s pH 3,8 a 6 M močoviny. Elektroforéza sa vykonávala počas 7 h pri 25 mA a pri 4 °C. Potom sa gél rozrezal žiletkou podľa frakcií. Jednotlivé plátky boli roztavené pri 70 °C a dvakrát extrahované fenolom a raz chloroformom. Získané frakcie boli potom vyzrážané etanolom a potom sa stanovovala prítomnosť in— terferónovej IFN-gama mRNK antivírusovým testom po injikovaní do oocytov Xenopus laevis. Len jeden vrchol aktivity bol pozorovaný vo vzorkách rozfrakcionovaného gélu ( viď obrázok 2 ). Tento vrchol aktivity sa pohybuje spoločne s RNK so sedimentačnou konštantou 18S a vykázal aktivitu 600 jednotiek/ml na mikrogram injikovanej RNK. Táto aktivita bola tiež špecifická pre interferón IFN—gama, pretože nechránila MDBK bunky.
Rozdiely pozorované medzi veľkosťami molekuly zodpovedajúce .vrcholom aktivity pri frakcionácii pomocou sacharózového gradientu C sedimentačné konštanty 12S a 16S ) a pomocou kyse1ino-močovinového gélu ( 18S ) sa môžu vysvetliť pozorovaním, že tieto nezávislé frakcionačné metódy neboli vykonané pri úplne denaturujúcich podmienkach.
P.Príprava banky kolónií obsahujúcich sekvencie IFN-gama mRNK (3 pg ) pripravená gélovou frakcionáciou bola použitá na prípravu dvojvláknovéj cDNK štandardnými postupmi ( Ste— wart, The Interferón Svstem. Springer, New York, p. 13-26 (1979) a Wickens et al. . J. Biol, Chem. 253, 2483 (1978) ). Získaná DNK bola frakcionovaná podľa veľkosti molekuly na 6 Z polyakrylami— dovom géli. Elektroeluciou boli získané frakcie s dvomi veľkosťami molekuly jedna s 800 až 1500 pármi báz ( 138 ng ) a druhá s viac ako 1500 pármi báz ( 204 ng ). Podiely po 35 ng každej vyššie uvedenej veľkosti cDNK boli predĺžené deoxycytidínovými í deoxy-C ) zvyškami použitím terminálnej deoxynukleodyltransferázy ( Chang et al.. Náture 275. 617 (1978) ) a anelované s
300 ng plazmidu pBR 322 ( Bolivar et al. . Gene 2. 95 (1977) ), ktorý bol podobne zakončený deoxyguanosinovými ( deoxy—G ) zvyškami v mieste PstI štiepenia ( Chang et al. Náture 275. 617 (1978) ). Každá, takto získaná anelovaná zmes bola potom transformovaná do mikroorganizmu E. coli K 12 kmeňa 294. Získalo sa približne 8000 transformantov s cDNK s 800 až 1500 pármi báz a 400 transformantov s cDNK s viac ako 1500 pármi báz.
E.Triedenie banky kolónií na kolónie s indukovanou cDNK
Kolónie boli individuálne inokulované do jamiek mikrotitračných doštičiek obsahujúcich živnú pôdu LB ( Miller Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold*Spring Harbor, New York (1972) ) plus 5 ug/ml tetracyklínu, doštičky boli po pridaní dimetylsulfoxidu ( DMSO ) pri koncentrácii 7 7. uložené pri -20 °C. Vypestovali sa dve kópie banky kolónií na nitrocelulózových filtroch a DNK z každej kolónie boli fixované na filtri Grunsteinovým-Hognessovým postupom ( Grunstein et al.. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 72. 3961 (1975) )
Použitím mRNK veľkosti zodpovedajúcej 18S, získanej gólovou frakcionáciou z indukovaných ale aj neindukovaných PBL kultúr boli pripravené skúšobné vzorky cDNK značené rádioaktívnym s 2 p, Ako primér bol použitý oligo-dTia-ia < oligo-deoxytymínribozid ), za reakčných podmienok už skôr popísaných ( Goeddel et al.. Náture 2B7, 411 (1980) ). Membrány obsahujúce 8000 transformantov z fragmentu cDNK veľkosti 600 až 1500 párov báz a 400 transformantov z fragmentu cDNK veľkosti vyššej ako 1500 párov báz boli hybridizované s 20 x 1O cpm indukovaných sap-cDNK. Duplikát banky kolónií na membránach bol hybridizovaný s 20 x 10A cpm neindukovaných -^P-cDNK. Hybridizácia bola vykonávaná počas 16 h použitím podmienok popísaných Fritschom a spolupracovníkmi ( Fritsch et al. , Cel1 19, 959 (1980) ). Membrány boli dôkladne premyté ( Fritsch et al. , Cel1 19, 959 (1980) ) a potom exponované na film Kodak XR-5, citlivý na Xlúče, použitím DuPont Lightning-F'lus zosilovacej fólie počas 16 až 48 h. Hybridizačná vzorka z každej kolónie bola porovnaná s uvedenými dvomi skúšobnými vzorkami. Približne 40 Z kolónií zreteľne hybridizovalo s obidvomi skúšobnými vzorkami, a približne 50 Z kolónií nehybridizovalo s ani jednou vzorkou ( porovnaj s obrázkom 3 ). 124 kolónií hybridizovalo signifikantne s indukovanou skúšobnou vzorkou, ale nedetegovateľne a— lebo oveľa slabšie hybridizovalo s neindukovanou skúšobnou vzorkou. Uvedené kolónie boli individuálne inokulované do jamiek mikrotitračných doštičiek, kultivované, prenesené na nitrocelulózové membrány a hybridizované s rovnakými dvomi skúšobnými vzorkami hore uvedeným spôsobom. Plazmidická DNK izolovaná z každej z týchto kolónií zrýchlenou metódou ( Birnboim et al., Nucleic Acids Res._Z*. 1513 (1979) ) bola tiež fixovaná na nitrocelulózových membránach a hybridizovaná ( Kafatos et al.. Nucleic Acids Res. 7. 1541 (1979) ) s indukovanými a neindukovanými skúšobnými vzorkami. DNK z 22 kolónií hybridizovali len s indukovanou skúšobnou vzorkou a boli označené ako indukované kolónie.
F. Charakterizácia indukovaných kolónií /
čž-ví
Z 5 indukovaných kolónií sa pripravili plazmidteké' DNK ( Clewel et al.. Biochemistrv 9. 4428 (1970) ) a použili sa na charakterizáciu cDNK inzercií. Mapovanie piatich indukovaných plazmidov ( p67, p68, p69, p71 a p72 ) pomocou reštrikčných endonukleáz naznačilo, že štyri z nich majú podobné reštrikčné nukleázové mapy. Každý z týchto štyroch plazmidov ( p67, p69, p71 a p72 ) má štyri Ddel miesta štiepenia, dve Hinfl miesta a jedno Rsal miesto v cDNK inzercii. Piaty plazmid ( p68 ) obsahuje spoločný Ddel fragment a zdá sa, že to je krátky cDNK klón, príbuzný s ostatnými štyrmi. Homológia, naznačená reštrikčným endonukleázovým mapovaním bola potvrdená hybridizáciou. Z Ddel fragmentu plazmidu p67 s 600 pármi báz bola pripravená -2P označená DNK skúšobná vzorka ( Taylor et al- -_Biochim. Biophvs. ftcta 442, 324 (1976) ), ktorá bola použitá k hybridizácii ( Grunstein et al., Proc. Natl. ftcad. Sci U.S.O. 72. 3961 (1975) ) s ostatnými indukovanými kolóniami. Všetkých päť zmapovaných kolónií pomocou reštrikčných nukleáz, skrížené hybridizovalo s touto skúšobnou vzorkou, rovnako tak, ako 17 ostatných indukovaných kolónii vybraných zo 124 kolónií pri triedení na indukované a neindukované. PstI netrávením a gélovou elektroforézou bola stanovená dĺžka uvedených cDNK inzercií v každom z týchto skrížené hybridizujúcich plazmidov.
f
Klónom s najdlhšou cDNK inzerciou je klón 69 s dĺžkou inzercie 1200 až 1400 párov báz. Táto DNK bola používaná pri všetkých ďalších pokusoch, a jej reštrikčná endonukleázová mapa je znázornená na obrázku 4.
Pomocou produktov expresie produkovaných v troch nezávislých systémoch, schopných expresie, vykazujúce antivírusovú aktivitu, ako je podrobnejšie popísané nižšie, preukázalo sa, že cDNK inzercia v plazmide p69 je interferónová IFN-gama cDNK.
(^Sekvenčná analýza cDNK inzercie plazmidu p69
- 29 Uplna nukleotidtcká sekvencia cDNK inzercie plazmidu p69 bola stanovená nielen terminačnou metódou dideoxynukleotidovaného reťazca ( Smith, Methods Enzvmol- 65. 560 (1980) ) po subklónovaní fragmentov do M13 vektoru mp7 ( Messing e t al. . Nucleic Acids Res. 9. 309 (1981) ) ale tiež chemickým postupom podľa ľlaxama a Gilberta ( Ma x am et al.. Methpds in Enzvmol. 65, 490 (1980) ). Najdlhšia otvorená čítacia jednotka kóduje bielkovinu so 166 aminokyselinami, znázornenú na obrázku 5. Prvým zakódovaným aminokyselinovým zvyškom je prvý met kodón umiestnený na 5* konci cDNK. Prvých 20 aminokyselinových zvyškov na aminokonci slúži pravdepodobne ako signálna sekvencia pre sek— réciu zvyšných 146 aminokyselín. Táto myslená signálna sekvencia má spoločné vlastnosti s ostatnými charakteristickými signálnymi sekvenciami, ako je veľkosť a hydrofobicita. Okrem toho štyri aminokyseliny , ktoré sa našli v myslenej Štiepnej sek— vencii ( ser-leu-gly-cys ) sú identické so štyrmi aminokyselinovými zvyškami, ktoré sa našli v mieste štiepenia mnohých leu— k oc y táS^crh interferónov ( LeIF B, C, D, F a H ) ( Goeddel £±.
al·. Náture 290. 20 (1981) ). Zakódovaná maturovaná aminokyselinová sekvencia 146 aminokyselín ( tu označená ako rekombinantný ľudský interferón ) má molekulovú hmotnosť 17 140.
V zakódovanej bielkovinovej sekvencii sú dve potenciálne miesta glykozylácie ( Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic Press, New York. p. 1 (1973) >, u aminokyselín na pozíciách 28 až 30 ( asn-gly-thr ) a u aminokyselín na pozíciách 100 až 102 ( asn-tyr-ser ). Existencia týchto miest je v súlade s pozorovanou glykozyláciou ľudského interferónu IFN-gama ( Yip et al.. Proc. Natl. Acad._StJu._(USA) 78, 1601 (1981) a Nathan et al.. Náture 292. 842 (19B1) ). Okrem toho sú prítomné len dva cysteínové zvyšky ( v polohách 1 a 3 ) stéricky veľmi nahustené, takže nemôžu tvoriť disulfidický môstik, čo je v súlade s pozorovanou stabilitou interferónu
IFN-gama v prítomnosti redukčných činidiel, ako fl-merkaptoetanolu ( Nathan et al.. Náture 292. 842 (1981) >- Odvodená matu30 rovaná aminokyselinová sekvencia je vo všeobecnosti dosť bázická, spolu s 30 zvyškami lyzínu, arginínu a histidínu, a len s 19 zvyškami kyseliny asparágovej a kyseliny glutámovej.
mRNK štruktúra interferónu IFN-gama, tak ako bola odvodená z DNK sekvencie plazmidu p69, t.j. úplne odlišná od štruktúry interferónovej IFN-α ( Goeddel et al.. Náture 287. 411 (
1980) a Goeddel et al.. Náture 290. 20 (1981) ) alebo IFN-fi ( Goeddel et al... Nucleic Acids Research 8. 4057 (1980) ) mRNK. Ako je znázornené na obrázku 6, kódovacia oblasť interferónu IFN-gama je kratšia, pretože 5 -nepreložené a 3 -nepreložené oblasti sú oveľa dlhšie ako analogické oblasti nielen v inter— feróne IFN-« , ale aj v IFN-fl.
/-/. Expresia rekombinantného ľudského interferónu v mikroorganizme E. coli
Tak, ako je znázornené na obrázku 7, bolo 50 pg plazmidu p69 reštrikčnou endonukleázou Pstl. Elektroforézou na 6 Z polyakrylamidovom géli bola izolovaná inzercia s 1250 pármi báz. 'Elek troelúciou sa z gélu získalo približne asi 10 pg uvedenej inzercie. 5 pg tohoto fragmentu Pstl sa parciálne -dXgepevaie· 3 jednotkami endonukleázy BstNI (dodávateľ Bethesda Research Labs.) počas 15 min pri 37 θΕ a reakčná zmes sa čistila na 6 Z polyakrylamidovom géli. Izolovalo sa približne 0,5 pg požadovaného BstNI - Pstl fragmentu s 1100 pármi báz. Fosfotriesterovou metódou ( Crea et al.. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 75. 5765 (1978) ) boli syntetizované dva deoxyoligonukleotídy (uvedené na obrázku 7) 5 —dAATTCATGTGTTATTGTC a 5 —dTGACAATAACACATG, ktoré boli fosforylované nasledujúcim spôsobom. Do roztoku 100 pmol každého z uvedených deoxyoligonukleotidov v 30 mikrolitroch obsahujúcich 60 mM Tris—HC1 (pH 8), lOmM chlorid horečnatý, 15 mM 0—merkaptoetanol a 240 pCi ( ga ma—-<2Ρ ) ATP (dodávateľ Amersham, aktivita 5000 Ci/mmol ) bolo pridaných 12 jednotiek T4 polynukleotidkinázy a reakčná zmes sa nechala reagovať 30 min pri 37 °C. K reakčnej zmesi sa pridal 1 mikroliter 1O mM ATP a reakcia prebiehala ďalších 20 min.
Po extrakcii reakčnej zmesi fenol-chloroformom sa získali oligoméry kombinované s BstNI—PstI fragmentom s 1100 pármi báz a produkty sa vyzrážali etanolom. Ligácía fragmentov bola vykonávaná pri 20 o c počas 2 h v 30 mikrolitroch obsahujúcich 20 mM Tris-HCl (pH 7,5>, 10 mM bezvodý chlorid horečnatý, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATE^ a 10 jednotiek T4 DNK—ligázy. Zmes sa po skončení reakcie d i ge r o va-La- 1 h 30 jednotkami endonukleázy PstI a 30 jednotkami EcoRI ( produktov, ktoré vznikli za účelom odstránenia polymerizačných
a podrobená elektroforéze na 6 Z polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa získal produkt s 1115 pármi báz ( 11O 000 cpm ).
Plazmid pLelF A typ 103 ( viď obrázok 7 ) je derivátom plazmidu pLelF A 25 ( Goeddel et al·. Náture.-28Z-, 411 (1980) ), v ktorom bolo odstránené EcoRI miesto štiepenia distálne k LeIF
A génu midu
Itakura et al.._Scxence. lg.8. 1056 (1977) ) ami ( __________ _______________________________ pLelF A typ 103 boli di-gerované 20 jedno t k ug plaz— endonukleázy EcoRI a 20 jednotkami PstI počas 90 min pri 37 «C a zmes sa podrobila elektroforéze na 6 Z polyakrylamidovom géli. Elek— troelúciou bol izolovaný veľký vektorový fragment s asi 3900 pármi báz. Vyššie uvedený EcoRI—PstI IFN-gama DNK fragment s 1115 pármi báz bol naviazaný do 0,15 jjg takto pripraveného vektoru. Transformáciou do E. coli K-12 kmeňa 294 ( ATCC číslo 31 446 ) sa získalo 120 kolónií rezistentných voči tetra cyklínu. Zo 60 z týchto
J' diek á DNK a dž-gerovaJa sa transformantov endonukleázami sa pripravila
EcoRI a PstI.
plazmiTri z uvedených plazmidov obsahovali požadovaný EcoRI—PstI fragment s 1115 pármi báz. DNK sekvenčnou analýzou _bolo overené, že tieto plazmidy majú požadovanú nukleotidicku sekvenciu pri spojení medzi typ promótorom, syntetickou DNK a cDNk. Jeden z týchto plazmidov, označený pIFN—gama typ 48, bol vybraný pre ďalšie štúdium. Tento plazmid bol použitý k transformovaniu E. coli K—12 kmeňa W3110 ( uložený pod ATCC Číslom 27 325 >.
iGénová štruktúra sekvencie kódujúca interferón IFN-gama
Štruktúra génu kódujúca interferón IFN-gama bola analyzovaná pomocou Southernovej hybridizácie. Pri tomto postupe ( Southern, J. Molec. Biol. 98. 503 (1975) ) sa 5 jig ľudskej lymfocy t^Fržbj- DNK s vysokou molekulovou hmotnosťou ( pripravenej spôsobom podľa BI in el al.. Nucleic Acids Res. 3. 2303 (1976) ) dige ržvaít> až do dokončenia rôznymi reštrikčnými endonukleázami, zmes sa podrobila elektroforéze na 1 Z agarózových géloch ( Lawn et al.. Science 212. 1159 (1981) ) a Škvrny fragmentov prenesené na nitrocelulózový filter ( Southern, J. Molec. Biol. 98. 503 (1975) ). Z Ddel fragmentu so 600 pármi báz z cDNK inzercie plazmidu p69 bola pripravená 32P-značená skúšobná vzor— ka DNK ( Taylor et al.. Biochim. Biophvs. Acta 442. 324 (1976) ) a hybridizovaná ( Fritsch et.al.. Celí 19. 959 (1980) ) so škvrnou DNK na nitrocelulózovom filtri. Skúšobná vzorka s 107 impulzmi za minútu bola hybridizovaná počas 16 hodín a potom bol filter premytý popísaným spôsobom ( Fritsch pt.al·, Celí / rv)
19. 959 (1980) ). Osem genomiej^^eh DNK vzoriek od rôznych ľudských darcov sa digeržva-lo reštrikčnou endonukleázou EcoRI a fragmenty sa hybridizovali s s2 P- značenou skúšobnou vzorkou z plazmidu p69. Tak ako je znázornené na obrázku 9, boli pozorované dva zreteľné hybridizačné signály zodpovedajúce veľkosti 8,8 tisícom párov báz (kbp) a 2,0 kbp, ako sa odhadlo porovnaním ich pohyblivosti s pohyblivosťou fragmentu, ktorý sa získal natrávením XDNK endonukleázou Hind III. Tento výsledok by zodpovedal buď dvom génom IFN-gama alebo jedinému génu rozštiepenému v Ecol mieste štiepenia. Pretože plazmidické p69 cDNK neobsahuje EcoRI miesto štiepenia, bola by potrebná na vysvetlenie '-možnosti jediného génu intervenujúca sekvencia ( intrón ) s interným miestom EcoRI štiepenia. Za účelom rozlíšenia týchto možností bola vykonaná ďalšia Southernová hybridizácia rovnakej skúšobnej vzorky s piatimi odlišnými fragmentárni endonukleázových jedinej ľudskej DNK ( viď obrázok 10 >. Boli pozorované dva hybridizujúce DNK fragmenty s dvomi inými fragmentárni endonukleázového štiepenia, PvuII ( 6,7 kbp a 4,0 kbp ) a HincII ( 2,5 kbp a 2,2 kbp ). Tri vzorky z endonukleázovej· digeocic poskytli však len jeden hybridizujúci DNK fragment: HindlII ( 9,0 kbp ), BglII ( 11,5 kbp ) a BamHI ( 9,5 kbp ). Dva gény IFN-gama by museli byť viazané v neobvykle blízkej vzdialenosti ( menej ako 9,0 kbp ), aby boli obsiahnuté v rovnakom HindlII hybridizujúcom fragmente. Tento výsledok naznačuje, že v ľudskej genomiokiej- DNK je prítomný len jediný ho— mológny interferónový IFN-gama gén ( na rozdiel od mnohých príbuzných IFN-α génov ), a Že tento gén je štiepený v oblasti jedného alebo viacerých intrónov, ktoré obsahujú EcoRI, PvuII a HincII miesta štiepenia. Táto predpoveď bola podporená hybridizáciou -*2 P-značeného fragmentu ( Taylor et al.. Biochim. Bio— phvs. Acta 442. 324 (1976) ) pripraveného z 3 - nepreloženej oblasti cDNK z plazmidu p69 ( Ddel fragment so 130 pármi báz od
Θ60 páru báz k 990 páru báz, viď obrázok 5 ) s EcoRI fragmentárni získanými natrávením ľudskej genomickej DNK. S uvedenou skúšobnou vzorkou hybridizoval len EcoRI fragment s 2,0 kbp, podľa čoho možno usudzovať, že tento fragment, obsahuje 3 -neprelože— né sekvencie, zatiaľ čo EcoRI fragment s 8,8 kbp obsahuje 5 sekvencie. Štruktúra génu IFN-gama (génu, ktorý obsahuje aspoň jeden intrón ) je zreteľne odlišná od interferónového génu IFN-a / niekoľkonásobný gén ( Goeddel et al.. Náture 290. 20 (1981) ) bez intrónov ( Lawn et al.. Science 212. 1159 (1981) ) / alebo IFN-C / jediný gén bez intrónov ( Lawn et al.. Nucleic Acids Res. 9. 1045 (1981) ) /.
J.Príprava bakteriálnych extraktov
Kultúra E. coli W 3110/pIFN—gama typ 48 kultivovaná cez noc na živnej pôde Luria, ktorá obsahovala 5 pg/ml tetracyklínu, sa použila na inokuláciu živnej pôdy M9 ( Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431—3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972) ) obsahovala 0,2 hmotnostných Z glukózy, 0,5 hmotnostných Z kazamino-kyselín ( CAA ; zmes aminokyselín získaná kydrolýzou kazeínu ) a 5 jig/ml tetracyklínu, zriedené 1 s 100. Keď dosiahla absorbcia pri 550 nm ( As5<>> hodnotu 0,1 až 0,2, pridala sa do média kyselina indolylakrylová tak, aby sa dosiahla výsledná koncentrácia 20 pg/ml. Po dosiahnutí Aeso = 1,0 sa 10 ml vzorky kultúry centrifugovali a získaná biomasa sa ihneď opäť suspendovala v 1 ml roztoku fosfátového pufru v roztoku chloridu sodného, obsahujúceho 1 mg/ml hovädzieho sérumalbumínu ( PBS—BSA ). Bunky sa rozrušili ultrazvukom a bunkové zvyšky boli odstránené odstredením. Supernatanty boli uložené pri 4 °C až do otestovania aktivity. Porovnaním so štandardou IFN-α sa pomocou testu inhibície cytopatického účinku ( CPE ) stanovilo, že interferónová aktivita supernatantov je 250 jednotiek/ml.
K.Transformácia kvasinkových kmeňov a živné prostredia
Kvasinkové kmene boli transformované už skôr popísaným spôsobom ( Beggs, Náture 275. 104 (1978) ). Na výber plazmidov obsahujúcich funkčný TRP I gén bol použitý mikroorganizmus E. coli kmeňa JA300 ( thr leuB6 thi thyA trpCl117 hsdm~ hsdR~ str^ > ( Hitzeman, et al.. J. Biol. Chem. 255. 12073 (1980) ). Ako kvasinkový transformačný hostiteľ sa použil kvasinkový kmeň RH 218, ktorý mal génotyp ( trpí gal2 SUC2 mal CUPI ) ( Miozzari et al.. Journal of Bacteriology 134. 48 (1978) ). Kmeň
RH 218 je uložený v Americkej zbierke typových kultúr pod ATCC číslom 44 076. K minimálnemu živnému prostrediu M9 s 0,25 hmotn. Z CAA a k bohatému médiu LB, ktoré popísal Miller ( Miller, Ex35 periments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972) ), sa pridalo 20 pg/ ml ampicilínu ( firmy Sigma ) po autoklávovaní a ochladení. Kvasinky sa kultivovali v nasledujúcich živných pôdach: YEPD, ktorá obsahuje 1 hmotnostné Z kvasničného extraktu, 2 hmotnostné Z peptonu, 2 hmotnostné Z glukózy a 3 hmotnostné Z agaru Difco; YNB + CAA, obsahujúce 6,7 g kvasinkových dusíkatých látok ( bez aminokyselín ) ( YNB ) Difco, 10 mg adenínu, 10 mg uracilu, 5 g CAA, 20 g glukózy a 30 g agaru v jednom litri.
[..Konštrukcia expresie schopného kvasinkového vektoru
1. 10 pg plazmidu YRp7 ( Stinchcomb et al.. Náture 282. 39 (1979), Kingsman et al.. Gene 7. 141 (1979) a Tschumper et al.. Gene 1O. 157 (1980) ) sa digerovalo reštrikčnou endonukleázou EcoRI. Kohézne ( lepivé ) konce získanej DNK boli prevedené pomocou DNK polymerázy I ( Klenowov fragment ) na tupé. Vektor a inzercia sa naniesli na 1 Z agarózový gél ( SeaKem ), po rozdelení boli frakcie vyrezané, elektroeluované, vyextrahované 2 x rovnakými objemami chloroformu a fenolu a produkt sa vyzrážal etanolom. Získané molekuly DNK s tupými koncami sa podrobili vzájomnej ligácii počas 12 h pri 12 °C vo výslednom objeme 50 mikrolitrov. Získaná ligačná zmes sa použila na transformovanie E. coli kmeňa JA 300 na ampicilínovú rezistenciu a tryptofánovú prototrófiu. Izolovali sa plazmidy obsahujúce TRPÍ gén v obidvoch orientáciách: plazmid pFRWl mal TRPÍ gén v rovnakej orientácii ako plazmid YRp7, zatiaľ čo plazmid pFRW2 mal TRPÍ gén v opačnej orientácii.
pg plazmidu pFRW2 sa linearizovalo reštrikčným enzýmom HindlII a získaná zmes sa delila elektroforézou na 1 Z agarózovom géli. Lineárne molekuly boli z gélu eluované a 200 ng produktu sa potom podrobilo ligácii s 500 ng HindlII inzercie plazmidu pBl s 3,1 kbp ( Crane et al.. J. Natl. Ľancer Inst.
61. 871 (1978) ), ktorá je reštrikčným fragmentom obsahujúcim kvasinkový 3-fosfoglycerátkinázový gén. Ligačná zmes sa použila na transformovanie E. coli kmeňa 294 na rezistenciu voči ampicilínu a citlivosť voči tetracyklínu. Plazmid pripravený z jedného takéhoto rekombinantu mal neporušený TRPÍ gén s Hind
III fragmentom s 3,1
III mieste štiepenia kbp z DNK inzercie plazmidu pBl v Hind— tetracyklínovej rezistencie génu. Tento šfiz.pÍC.?PFRM31 sa úplne ďigecovaTrj endonukleázou plazmid bol označený ako
PFRM31. 5pg uvedeného plazmidu
EcoRI, zmes sa dvakrát extrahovala fenolom a chloroformom a produkt sa vyzrážal etanolom. Kohézne konce molekuly sa vyplnili použitím DNK po lymerázy I ( Klenowov fragment ); na reakciu sa použilo po
250 pH každého deoxynukleozidtrifosfátu. Reakcia prebiehala minút pri 14 °C, potom sa DNK extrahovala dvakrát fenolom a chloroformom a produkt sa vyzrážal etanolom. DNK sa opäť susígcrovaki reštrikčným enzýmom Clal a pendovala, kompletne zmes sa delila elektroforézou na 6 Z akrylamidovom géli. Vekto rový fragment bol z gélu eluovaný, extrahovaný fenolom a chlo roformom, vyzrážaný etanolom.
Šesť N-terminálných aminokyselín 3-fosfoglycerátového enzýmu prečisteného po izolácii z ľudských zdrojov má nasledujúce zloženie:
1-2-3 -4-5-6
SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU Jedna z translačných čítacích jednotiek, generovaná z DNK sekvencie Sau3A až Sau3A reštrikčného fragmentu so 141 pármi báz ( obsahujúca vnútorne HincII miesto štiepenia; viď PGK reštrikčnú mapu na obrázku 11 ) produkuje nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:
- 2- 3- 4- 5- 6
MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU 37
Je zrejmé, že po odstránení iniciačnej aminokyseliny metionínu má N—terminálna aminokyselinová sekvencia PGK 5 zo 6 aminokyselín homológnych s N—terminálnou aminokyselinovou sekvenciou ľudského PGK.
Výsledok tohoto určenia sekvencie naznačuje, že štart kva— f sinkového PGK štrukturálneho génu je kódovaný pomocou DNK, ktorá je v Sau3A reštrikčnom fragmente plazmidu pBl so 141 pármi báz. Predchádzajúce práce ( Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255. 12073 (1980) ) naznačili, že DNK sekvencie špecifikujúce
PGK mRNK by mohli byť v oblasti HindlII fragmentu. Ďalšie sekvenovanie Sau3A fragmentu so 141 pármi báz poskytlo podrobnejšie údaje o DNK sekvencií PGK promótora ( viď obrázok 12 ).
Štandardnými metódami sa syntetizoval syntetický oligonukleotid so sekvenciou 5 -ATTTGTTGTAAA3 / viď Crea a spolupracovníci, Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980) /. 100 ng tohoto priméru sa označilo na 5 —konci použitím 10 jednotiek T4 polynukleotidkinázy v objeme 20 mikrolitrov reakčnej zmesi, ktorá obsahovala tiež 200 pCi ( gama-^sp ) - ATP. Roztok získaného značeného priméru sa použil na reakciu obnovenia párov báz, plánovanú ako prvý stupeň v mnohostupňovom postupe zameranom na zavedenie EcoRI reštrikčného miesta do PGK 5 -koncovej DNK, predchádzajúcej sekvencie PGK Štrukturálneho génu.
100 pg plazmidu pBl ( Hitzeman, et al.. J. Biol. Chem.
✓ r.
255. 12073 (1980) ) sa úplne ^vaJrO reštrikčným enzýmom
HaelII a zmes sa rozdelila na 6 Z polyakrylamidovom géli. Pr vý pás fragmentu na géli po etidiumbromidovej detekcii ( ktorá obsahuje časť PGK promótoru ) sa izoloval elektroelúciou vyššie popísaným spôsobom. Získaný HaelII fragment DNK s 1200 pármi báz sa rozštiepil nukleázou HincII a zmes sa rozdelila na 6 Z akrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci fragment so 650 pármi báz; získalo sa 5 ug DNK. Táto HaelII až HincII časť DNK s 650 pármi báz sa opäť suspendova la v 20 mikrolitroch vody a roztok sa zmiešal s 20 mikrolit— rami roztoku fosforylovaného priméru pripraveného vyššie popísaným spôsobom. Zmes sa extrahovala jedenkrát fenolom a chloroformom, produkt sa vyzrážal etanolom. Vysušená DNK bola resuspendovaná v 50 mikrolitroch vody a zmes sa zahrievala 7 min na vriacom vodnom kúpeli. Roztok sa rýchle ochladil v kúpeli suchý ľad — etanol ( 1O až 20 s') a potom sa preložil do kúpeľa ľad - voda. K roztoku sa pridalo 50 mikrolitrov roztoku zloženého z 10 mikrolitrov roztoku lOx DNK polymerázy I v pufri ( Boehringer, Mannheim ), 10 mikrolitrov roztoku vopred upraveného na 2,5 mM každého z použitých deoxynukleotidtrifosfátov ( dATP, dTTP, dDTP a dCTP ), 25 mikrolit— rov vody a z 5 jednotiek DNK polymerázy I ( Klenowov fragment ). Táto reakčná zmes s objemom 100 pl sa inkubovala 4 h pri 37 °C. Potom sa roztok extrahoval jedenkrát fenolom a chloroformom, produkt sa vyzrážal etanolom, vysušil sa lyofilizáciou a potom sa štiepil 10 jednotkami reštrikčnej endonukleázy Sau— 3A. Získaná zmes sa naniesla na 6 Z polyakrylamidový gél a delila sa elektroforézoii. Pás, obsahujúci fragment zodpovedajúcej veľkosti 39 párom báz sa z gélu vyrezal a produkt sa izoloval elektroelúciou vyššie popísaným spôsobom- Získaný fragment s 39 pármi báz má jeden koniec tupý a jeden kohézny Sau3A koniec. Tento fragment bol nakldŕnovaný do modifikovaného vektoru pFIF typ 69 ( Goeddel et al.. Nucleic Acids Research 8. 4057 (1980) ) nasledujúcim spôsobom: 10 pg plazmidu pFIF typ 69 bolo linearizovaných pôsobením enzýmu Xbal, zmes sa extrahovala jedenkrát fenolom a chloroformom, produkt sa vyzrážal etanolom. Xbal kohézny koniec sa vyplnil použitím DNK polymerá— zy I ( Klenowov fragment ) v 50 pl reakčnej zmesi obsahujúcej po 250 pM každého použitého nukleozidtrifosfátu. Získaná DNK bola rozštiepená enzýmom BamHI a zmes sa delila elektroforézou na 6 Z polyakrylamidovom géli. Vektorový fragment sa z gélu izoloval elektroelúciou a opäť suspendoval v 20 pl vody. 20 ng tohoto vektoru sa podrobilo ligácii s 20 ng fragmentu s 39 pár— mi báz pripraveného vyššie uvedeným spôsobom, počas 4 h pri iz— hovej teplote. Jedna pätina ligačnej zmesi sa použila k transformovaniu mikroorganizmu E. coli kmeňa 294 na rezistenciu voči ampicilínu ( doštičky s LB živnou pôdou + 20 pg/ml ampicilí— nu ). Plazmidy z transformantov sa hodnotili rýchlou vyhľadáva— cou metódou ( Birnboim et al.. Nucleic Acids Res. 7. 1513 <1979) ). Jeden z týchto piazmidov, pPGK—39, bol zvolený pre sekvenč— f -J f ŕ / Sú ~ nú analýzu. 20 pg tohoto plazmidu sa ďargeroval-o endonukleázou Xbal, produkt sa vyzrážal etanolom a potom sa na neho pôsobilo 1000 jednotkami bakteriálnej alkalickej fosfatázy 45 min pri 68 °C. DNK sa extrahovala trikrát fenolom a chloroformom, potom sa vyzrážala etanolom. Defosforylované konce sa potom rádioaktívne označili v 20 pl reakčného roztoku obsahujúceho 200 pCi ( gama-32P ) ATP a 10 jednotiek T4 polynukleotidkinázy. Plazmid sa rozštiepil endonukleázou Sali a zmes sa delila elek— troforézou na 6 Z polyakrylamidovom gél i. Pás, obsahujúci značenú inzerciu, sa z gélu vyizoloval a podrobil sa sekvenčnej a— nalýze chemickou degradačnou metódou (Maxam et al.. Methods in Enzvmol. 65. 490 (1980) ). DNK sekvencia na 3 -konci tejto promótorovej časti mala očakávané poradie.
2. Konštrukcia Pvul až EcoRI PGK promótorového fragmentu s 312 pármi báz.
. 25 pg plazmidu pPGK—39 ( viď obrázok 13 ) bolo súčasne ď±= reštrikčnými endonukleázami Sali a Xbal ( po 5 jednotkách z každej ) a získaná zmes sa podrobila elektroforéze na 6 Z géli. Elektroelúciou sa izoloval fragment s 390 pármi báz obsahujúci promótorovú časť s 39 pármi báz. Získaná DNK bola resuspendovaná vo vode, štiepená endonukleázou Sau3A a zmes sa delila elektroforézou na 8 Z polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci PGK promótorovú časť s 39 pármi báz. Táto DNK obsahovala 39 párov báz z 5- konca PGK promótora na Sau3A až Xbal fragmente.
pg plazmidu pBl sa rozštiepilo reštrikčnými enzýmami
Pvul a KpnI a zmes sa delila elektroforézou na 6 Z akrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci DNK s 800 pármi báz; uvedená DNK bola rozštiepená reštrikčnou endonukleá— zou Sau3A a zmes sa delila elektroforézou na 6 Z polyakrylami— dovom gél i. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci fragment z PGK promótoru s 265 pármi báz ( viď obrázok 11 ).
t
Získaná DNK sa podrobila ligácii vyššie uvedeným promótorovým fragmentom s 39 pármi báz počas dvoch hodín pri izbovej teplote. Zmes sa po ligácii rozštiepila endonukleázami Xbal a Pvul a rozdelila sa elektroforézou na 6 Z polyakrylamidovom gé— li. Elektroelúciou sa izoloval Xbal až Pvul reštrikčný fragment s 304 pármi báz. Tento fragment bol vložený do ligačnej zmesi obsahujúcej 200 ng fragmentu plazmidu pBR322 ( Bolivar et al.. Gene 2. 95 (1977) ) získaného po odstránení Pvul až PstI reštrikčného fragmentu so 162 pármi báz, a 200 ng Xbal až PstI fragmentu LeIF A cDNK génu izolovaného predtým z 20 pg plazmidu pĽelF typ A 25. Táto trojzložková ligačná zmes sa použila na transformovanie E. coli kmeňa 294 na rezistenciu voči tetracyklínu. Kolónie transformantov sa podrobili skrátenému triedeniu ( Birnboim et al.. Nucleic Acids Res. 7. 1513 (1979) ) a izolovala sa jedna z kolónií, pPGK—300, ktorá má fragment PGK 5 —priľahlej DNK s 304 pármi báz fúzovaný na LeIF A gén vo vektore založenom na plazmide pBR 322. 5 -koniec LeIF A génu má nasledujúcu nukleotidickú sekvenciu: 5 —CTAGAATTC-3 . Fúzia Xbal reštrikčného miesta z PGK promótorového fragmentu do tejto sekvencie dovoľuje adíciu EcoRI reštrikčného miesta na uvedené Xbal miesto. Plazmid pPGK-300 tak obsahuje časť PGK promótoru izolovaného v Pvul až EcoRI fragmente.
3. Konštrukcia EcoRI až EcoRI PGK promótorového fragmentu s 1500 pármi báz.
pg plazmidu pBl bolo digĽTuvJliŕ reštrikčnými endonukleázami Pvul a EcoRI a zmes sa delila elektroforézou na 6 Z poly— akrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval pás obsahujúci
Pvul až EcoRI časť DNK s 1,3 kbp z PGK 5'-priľahlej DNK. 10 pg plazmidu pPGK-3O0 sa digcFevalo endonukleázami EcoRI a Pvul a po rozdelení zmesi elektroforézou na 6 Z polyakrylamidovom gé— li bol elektroelúciou izolovaný promótorový fragment s 312 pár— mi báz. 5 pg plazmidu pFRL4 sa rozrezalo endonukleázou EcoRI, t
produkt sa vyzrážal etanolom a potom sa na neho pôsobilo 45 min pri 68 °C bakteriálnou alkalickou fosfatázou. DNK bola trikrát extrahovaná fenolom a chloroformom, vyzrážaná etanolom a resuspendované v 20 ml vody; 200 ng tohoto vektoru sa podrobilo ligácii so 100 ng EcoRI až Pvul fragmentu DNK z pPGK-300 s 312 pármi báz a so 100 ng EcoRI až Pvul fragmentu DNK z plazmidu pBl. Táto trojzložková ligačná zmes sa použila na transformáciu E. coli kmeňa 294 na rezistenciu voči ampicilínu. Jeden zo získaných transformantov sa označil pPGK—1500. Tento plazmid obsahuje PGK promótorový fragment s 1500 bármi báz ako EcoRI až EcoRI alebo HindlI až EcoRI časť DNK.
pg získaného plazmidu pPGK-1500 sa kompletne ói-gerovalo enzýmami Clal a EcoRI a získaná zmes sa rozdelila elektroforézou na 6 Z polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa izoloval fragment s 900 pármi báz obsahujúci PGK promótor. 10 pg plazmidu pIFN—gamatyp 48 sa kompletne digerovalo enzýmami EcoRI a HincII a zmes sa delila elektroforézou na 6 Z polyakrylamidovom géli. Elektroelúciou sa z gélu izoloval pás obsahujúci priamo exprimovateľnú IFN-gama cDNK s 938 pármi báz.
Vektor, schopný kvasinkovej expresie bol skonštruovaný v trojzlôžkovej reakcii vzájomnou ligáciou PGK promótorového fragmentu < na Clal až EcoRI časti ), deletovaného plazmidu pFRM—31 a zhora izolovanej IFN-gama cDNK. Ligačná zmes sa inkubovala 12 h pri 14 o C. Potom sa získaná ligačná zmes použila na transfor— movanie mikroorganizmu E. coli kmeňa 294 na ampicilínovú rezistenciu. Získané transformanty boli analyzované na prítomnosť správne skonštruovaného expresie schopného plazmidu pPGK—IFN—ga— ma ( viď obrázok 16 ). Plazmidy, obsahujúce expresie schopný systém sa použili na transformovanie sféroblastov kvasinkového kmeňa RH 218 na tryptofánovu prototrofiu v agarovej pôde, s chýbajúcim tryptofánom. Tieto rekombinované kvasinky sa potom analyzovali na prítomnosť rekombinantného ľudského imunitného interferónu.
Kvasinkové extrakty sa pripravili nasledujúcim spôsobom: Kultúry v objeme 10 ml sa kultivovali na YNB + CAA živnej pôde až do dosiahnutia A 66o asi 1 až 2, potom sa bunky odstredili a opäť suspendovali v 500 pl PBS pufru ( 20 mM dihydrofosforečňa— nu sodného s pH 7,4 a 150 mM chlorid sodný ). Po pridaní rovnakého objemu sklenených perál ( priemeru 0,45 až 0,5 mm ) sa zmes intenzívne miešala počas 2 min. Extrakty sa odstreďovali 30 s pri 14 000 otáčkach za minútu a v supernataňte bola stanovená interferónová aktivita; v porovnaní s IFN-<x štandardou a použitím testu inhibicie CPE sa našla aktivita 16 000 jednotiek/ml.
^.Konštrukcia bunkovej kultúry s vektorom pSV gama 69
Hind III až PvuII fragment s 342 pármi báz obsahujúci SV 40 zdroj bol premenený na fragment s naviazaným EcoRI reštrikčným miestom. HindlII reštrikčné miesto sa konvertovalo adíciou syntetického oligoméru ( 5 —dAGC__/TGAATTC ) a PvuII reštrikčné miesto sa konvertovalo tupou“ ligáciou na vyplnené EcoRI miesto použitím polymerázy I ( Klenowov fragment ). Získaný EcoRI fragment bol vložený do EcoRI reštrikčného miesta plazmidu pML-1 ( Lusky et al.. Náture 293. 79 (1981) ). Plazmid s SV 40, bývalým promótorom orientovaným ďaleko od génu pre ampicilínovú rezistenciu ( amp^^ ), sa ďalej modifikoval odstránením EcoRI reštrikčného miesta najbližšieho k ampR génu plazmidu pML-1 ( Itakura et al.. Science 198. 1056 (1977) ).
Bol izolovaný Hpal až BglII fragment s 1023 pármi báz, klónované HBV DNK' ( Valenzuela et al . Ani mal Virus Genenics (ed.Fields, Jaenisch and Fox) p. 57, Academic Press, New York (1980) ) a Hpal reštrikčné miesto vírusu hepatitídy B ( HBV ) sa konvertovalo na EcoRI reštrikčné miesto syntetickým oligomérom ( 5-dGCGAATTCGC ). Tento EcoRI až BglII naviazaný fragment bol priamo naklónovaný do EcoRI až BamHI reštrikčných miest vyššie uvedeného plazmidu nesúceho zdroj SV 40.
Do zvyškového EcoRI reštrikčného miesta sa vložil interferónový IFN-gama gén na PstI fragmente plazmidu p69 s 1250 pármi báz, po konverzii jeho PstI koncov na EcoRI konce. Izolovali sa kIóny, v ktorých bývalý promótor SV 40 predchádzal štrukturálnemu génu interferónu IFN-gama. Získané plazmidy boli potom zavedené do buniek tkanivovej kultúry ( Gluzman et al.Cold Spring Harbor... ) použitím diétylaminoetyldextranovej ( DEAE dextranovej ) pracovnej techniky ( McCuthan et al.. J. Natl. Cancer Inst. 41. 351 (1968) ), modifikovanej tým spôobom, že transformácia v prítomnosti DEAE-dextrÁnu prebiehala počas 8 h. Bunkové médium sa menilo každé 2 až 3 dni. Denne sa odoberalo 200 pl kvapaliny pre biologické hodnotenie interferónovej aktivity. Typické výťažky boli 50 až 100 jednotiek/ml vo vzorkách testovaných za tri až štyri dni po transfekcii.
Podľa analýzy chýba v produkte expresie časť CYS-TYR-CYS na N-konci ľudského imunitného interferónu ( porovnaj obrázok 5 ). Z toho vyplýva, že na spojení CYS-GLN ( aminokyseliny 3 a 4 na obrázku 5 ) dochádza k štiepeniu signálneho peptidu, takže maturovaný polypeptid by sa v skutočnosti skladal zo 143 aminokyselín.
MČiastočné čistenie des-CYS-TYR-CYS rekombinantného ľudského imunitného ir.terferónu
Za účelom produkcie väčšieho množstva ľudského interferónu IFN-gama, ktorý pochádza z buniek opíc, boli transfektované čerstvé monomolekulárne vrstvy buniek COS-7 na desiatich 10 cm doštičkách s 30 ug pDLIF 3 v 110 ml DEAE-dextranu ( obsahujú/ cich 200 ug/ml DEAE-dextranu molekulovej hmotnosti 500 000, 0,05 M Tris s pH 7,5 v DMEM ). Po 16 hodinách inkubácie pri 37 °C sa doštičky premyli dvakrát DMEM. Na ' každú doštičku sa potom pridalo 15 ml čerstvého DMEM doplneného 10 hmôt. Z f. b. s. séra, 2 mM glutamínu, 50 yll/ml penicilínu G, 50 mg/ml streptomycínu. Nasledujúci dert bolo médium nahradené DMEM bez séra. Čer— stvé médium bez séra sa pridávalo každý dert. Média sa zbierali a uchovávali pri 4 °C pokiaľ neboli otestované; podiely, ktoré vykazovali aktivitu boli zpracované použitím CPG na viazanie aktívnych zložiek ( viď nižšie ). Testovaním sa zistilo, že média odobrané za 3a za 4 dni po transfekcii vzoriek obsahovali v podstate všetkú aktivitu.
K 100 ml bunkového supernatantu sa pridalo 0,5 g CPG ( porézne sklo s kontrolovateľnou veľkosťou pórov, CPG 350 firmy Electronucleonics, veľkosť pórov 120/200 ) a zmes sa miešala 3 h pri 4 o C. V podstate všetká aktivita sa naviazala na CPG. Po krátkom odstredení zmesi na stolnej odstredivke sa usadené guličky preniesli do trubice a stĺpec sa dôkladne premyl roztokom pufru, ktorý obsahoval 20 mM metafosforečrtanu sodného, IM chloridu sodného a 0,1 hmotn. Z β-merkaptoetanolu, pH 7,2. Potom bola aktivita eluovaná rovnakým pufrom, ktorý obsahoval 30 hmotn. Z etylénglykolu a ďalej sa eluovala uvedeným pufrom obsahujúcim 50 hmotn. Z etylénglykolu. 75 hmotn. Z všetkej aktivity sa našlo vo frakciách eluovaných pufrom s 30 hmotn. Z ety— lénglykolu. Tieto frakcie sa spojili a roztok sa zriedil pufrom, ktorý obsahoval 20 mM metafosforečrtan sodný a 1 M chlorid sodný s pH 7,2 tak, aby výsledná koncentrácia etylénglykolu bola 10 hmotn. Z, a zmes sa naniesla priamo na stĺpec pripravený z 10 ml Con A Sepharozy ( firmy Pharmacia ). Po dôkladnom premytí stĺpca pufrom, ktorý obsahoval 20 mM metafosforečŕlan sodný a
M chlorid sodný s pH 7,2 sa aktivita eluovala roztokom, ktorý obsahoval 20 mM metafosforečrtan sodný, 1 M chlorid sodný a 0,2 M a-metyl-D-manozid. Podstatné množstvo aktivity ( 55 hmotn. Z ) sa na uvedený lektín nenaviazalo; 45 hmotn. Z aktivity sa eluovalo α-mety1-D-manozidom.
0.Farmaceutické prípravky
Zlúčeniny podľa vynálezu je možné, za účelom farmaceutický použiteľných prípravkov formulovať známymi metódami, pri ktorých sa známy ľudský imunitný interferón mieša s farmaceutický vhodným nosným vehikulom. Vhodné vehikulum a vhodné spôsoby for— mulovania do formy farmaceutických aplikačných foriem sú popísané E. W. Martinom v monografii Remington ' s Pharmaceutical Sciences, na ktorú tu odkazujeme. Vhodné farmaceutické kompozície obsahujú účinné množstvo interferónovej bielkoviny podľa vynálezu spolu s vhodným množstvom vehikula, čím sa získajú farmaceutický prípustné prípravky vhodné na účinné podávanie chorým.
Ľudský imunitný interferón podľa vynálezu je možné parenterálne podávať jedincom, ktorí potrebujú antitumorálnu alebo antivírusovú liečbu, alebo ktorí vykazujú imunosupresívne stavy. Dávkovanie, alebo počet dávok sú analogické tým, že sa bežne používajú pri klinických skúškach iných ľudských interferónov, napríklad približne ( 1 až 10 ) x 10 6 jednotiek denne a v prípade materiálu s vyššou čistotou ako 1 hmotn. Z, účelne rovnako až do tejto čistoty, napríklad 50 x 10* jednotiek denne. Dávkovanie interferónu IFN-gama je možné za účelom zvýšenia účinku podstatne zvýšiť vzhľadom k tomu, že v ňom nie sú v podstate prítomné okrem IFN-gama žiadne iné ľudské bielkoviny, ktoré u materiálov získaných z ľudských zdrojov môžu indukovať niektoré nežiadúce účinky.
Vhodná dávkovacia forma pre v podstate homogénny IFN-gama na parenterálnu aplikáciu sa pripraví napríklad nasledujúcim spôsobom: 3 mg interferónu IFN-gama so špecifickou aktivitou napríklad 2 x 10 8 U/mg sa rozpusti v 25 ml 5 N ľudského sérumalbumínu ( čistoty podľa USP ), roztok sa prefiltruje cez bakteriologický filter a filtrát sa rozdelí do 100 ks injekčných ampuliek, z ktorých každá obsahuje 6 x 10* jednotiek čistého interferónu vhodného na parenterálne podanie. Injekčné ampulky sa pred použitím účelne skladujú v mrazničke pri teplote -20 °C.
^.Biologická účinnosť
a) Charakterizácia antivírusovej účinnosti
Pre stanovenie neutralizácie antivírusovej účinnosti protilátkami rôzneho pôvodu sa vzorky zriedili podľa potreby pufrom PBS-BSA ( viď vyššie ) na koncentráciu 500 až 1000 jednotiek/ml. Rovnaké objemy vzorky sa inkubovali 2 až 12 h pri 4 °C so sériovo riedenými vzorkami králičieho protihumánneho, leukocytárneho, fibroblastového alebo imunitného interferónového antiséra. Änti-IFN-α a anti-IFN-β sa získali z ústavu National Inštitúte of Allergy and Infectious Diseases. Anti-IFN-gama sa pripravila použitím autentického interferónu IFN-gama ( čistoty 5 až 20 hmotn. Z ), ktorá sa získala čistením stimulovaných periférnych krvných lymfocytov. Tri minúty pred testovaním sa vzorky odstreďovali počas 3 minút pri preťažení 12 000 x g. Na testovanie stability pri pH 2 sa vzorky upravili na pH 2 pridaním 1 M kyseliny chlorovodíkovej, inkubovali sa 2 až 12 h pri 4°C a pred hodnotením sa zneutralizovali pridaním 1 M hydroxidu sodného. Na testovanie citlivosti voči dodecylsulfátu sodnému ( SDS ) sa inkubovali všetky vzorky s rovnakým objemom 0,2 hmotn. Z SDS počas 2 až 12 h pri 4 °C.
b) Charakterizácia interferónu IFN-gama produkovaného E. coli a bunkami COS—7
Antivírusová účinnosť (jednotky/ml)
extrakt Supernatant
E.coli W bunky COS-
3110/pIFN- —7/pSV-gama-
Pôsobenie činidiel IFN-a IFN-tt IFN-j« gama-typ48 69
Bez úpravy vzorky 375 125 250 250 62,5
pH 2 375 125 < 6 <12 < 4
0,1 hmotn. Z SDS 375 - < 4 < 8 -
králičie anti-IFN—a < 8 125 250 250 187
králičie anti-IFN—0 375 < 8 187 250 125
králičie anti—IFN— 375 125 < 4 < 8 < 4
V tabuľke je uvedené charakteristické chovanie štandartov interferónov IFN-a, IFN-β a IFN gama pôsobením rôznych činidiel. Interferónová aktivita produkovaná mikroorganizmom E. roli W3110/pIFN-gama typ 48 a bunkami C0S-7/pSVgama69 vykazuje citlivosť voči kyselinám, čitlivosť voči SDS a je neutralizovaná antisérom imunitného interferónu; nie je neutrálizovaná protilátkami voči IFN-α alebo IFN-β. Tieto výsledky potvrdzujú, že produkty produkované v uvedených systémoch sú imunitné interferóny a že cDNK inzercia plazmidu p69 kóduje interferón IFN-gama.
R.Čistenie interferónu IFN-gama
Jedna z metód, ktorou je možné čistiť interferón IFN-gama» ktorý pochádza napríklad z baktérií, je popísaná v nasledujúcej všeobecnej schéme:
1. Bunky sa extrahujú v lýzujúcom pufri s vysokou vodivosťou < asi pri pH 8 ) pasážou homogenizátorom pri vysokom tlaku a eluent sa chladí v ľadovom kúpeli.
f
2. DNK sa vyzráža pridaním polyetylénimínu za miešania pri teplote napríklad 4 °C.
3. Bakteriálne bielkoviny sa vyzrážajú pri vhodnom pH, pričom IFN-gama zostane v roztoku.
4. Pevné podiely sa oddelia odstredením pri 4 o C.
5. Supernatant sa skoncentruje ( po úprave pH ) napríklad ultrafiltráciou.
6. Koncentrát sa dialyzuje oproti pufru s nízkou vodivosťou.
7. Pevné podiely sa odstánia odstredením a získa sa roztok interferónu IFN-gama.
8. Vykoná sa ionexová chromatografia na karboxymetylcelulóze, použitím gradientovej elúcie so vzrastajúcou ionýovou silou.
9. Produkt sa čistí chromatograficky na kalciumfostátovom géli použitím gradientovej elúcie so vzrastajúcou ion^ovou silou.
10. Vykoná sa ionexová chromatografia na karboxymetylcelulóze, za mierne denaturujúcich podmienok, použitím gradientovej e— lúcie so vzrastajúcou ion^ovou silou.
11. Produkt sa separuje gélovou filtračnou chromatografiou.
Uvedeným postupom sa získa materiál čistoty vyššej ako 95 hmotn. Z.
Imunitná interferónová bielkovina podľa vynálezu je definovaná pomocou stanoveného DNK génu a z neho odvodenej aminokyselinovej sekvencie — viď obrázok 5. Je zrejmé, že k tomuto špeciálnemu interferónu, uvádzanému na tomto mieste, existujú individuálne sa vyskytujúce rôzne alel'ické variácie. Tieto variácie je možné demonštrovať ako rozdiel(y) v druhu jednotlivých aminokyselín v celkovej aminokyselinovej sekvencii inter— ferónu alebo delécie, substitúcie, inzercie, inverzie alebo a— dície jednej alebo viacerých aminokyselín v uvedenej sekvencii. Všetky takéto alelické variácie patria do rozsahu tohoto vynálezu.
Skutočne existuje možnosť použiť technológiu rekombinácie DNK na prípravu rôznych derivátov ľudského interferónu IFN-gama rôzne modifikovaných výslednou jednotlivou alebo niekoľkonásobnou substitúciou, deléciou, adíciou alebo náhradou aminokyseliny. Všetky takéto modifikácie vedúce k príslušným derivátom ľudského interferónu IFN-gama sú začlenené do rozsahu tohoto vynálezu, pokiaľ druh základnej charakteristickéj aktivity ľudského IFN-gama zostáva nezmenený.
Teraz, keď je k dispozícii poznanie DNK a aminokyselinovej sekvencie IFN-gama.< viď obrázok 5 ), bude najvýhodnejší spôsob reprodukcie predloženého vynálezu viesť k príprave buď kompletného génu syntetickými prostriedkami ( Goeddel et al.. Náture 281. 544 (1979) ) alebo k príprave syntetických deoxyoligonukleotidov, s ktorými bude možné vyšetrovať cDNK zdroje za účelom izolácie génu štandardnými hybridizačnými pracovnými technikami. Keď už bola stanovená nukleotiddteká sekvencia kódujúca požadovanú IFN-gama bielkovinu, mohli by sa podľa vyššie uvedeného popisu sledovať rôzne prostriedky na dosiahnutie expresie, izolácie a čistenie , ktoré zabezpečujú vysokú čistotu preparátov IFN-gama.
Napriek tomu, že bola vyššie popísaná špecifická výhodná podstata vynálezu, je zrejmé, že predložený vynález nie je limitovaný uvedeným popisom a že jeho právoplatný rozsah vyplýva z nasledujúceho predmetu vynálezu.
Priemyselná využiteľnosť
Produkt, získavaný uvedenou technológiou, je vhodný vo všetkých svojich formách, na použitie k profylaktickému alebo terapeutickému ošetrovaniu pacientov s vírusovými infekciami alebo s malignými, imunosuprimovanými alebo imunodeficitnými stavmi.
Pod pojmom rôzne formy imunitného interferónu sú zahrnuté rôzne možné oligomerné formy, ktoré môžu obsahovať aj glykozylované formy. Produkt je možné vyrábať s geneticky skonštruovanými trans^or^movanými mikroorganizmami alebo systémami transformovaných bunkových kultúr, t.j. do ktorých bola vložená DNK, ktorá vznikla rekombináciou exogennej DNK.
Teraz existuje potenciál, ako pripraviť a izolovať ľudský imunitný interferón účinnejším spôsobom ako to bolo možné doteraz. Významým rysom predloženého vynálezu, v jeho najvýhodnejšej podstate, je uskutočnenie genetického riadenia mikroor— ganizmu alebo bunkovej kultúry tak, aby produkovali ľudský imunitný interferón v izolovateľných množstvách, vylučovaných z hostiteľskej bunky v maturovanej forme.

Claims (18)

  1. P A T E NTOVÉ NÁROKY
    1. Ľudský imunitný interferón a jeho derivát, obidva s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, bez iného proteínu, s ktorými je obyčajne spojený, ako i jeho alely.
  2. 2. Derivát ľudského imunitného interferónu podľa nároku 1, s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, a jeho alela, pričom kyselinový derivát má funkciu ľudského imunitného interferónu.
  3. 3. Derivát ľudského imunitného interferónu podľa nároku 2 • s aminokyselinovým metionínom na N-konci.
  4. 4. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 1, s aminokyselinovým metionínom na N-konci zrelej sekvencie.
  5. 5. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 1 s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu bez pridruženej prirodzenej glykozylácie.
  6. 6. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 1 s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu, vytvárané &) expresiou DNK, kódujúcou aminokyselinovú sekvenciu interferónu v rekombinantnej hostiteľskej bunke.
  7. 7. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 6, vytváraný expresiou kódujúcej rekombinantnej DNK sekvencie v bunkovej línii cicavcov.
  8. 8. Ľudský imunitný interferón podľa nároku 7, v ktorom bunkovou líniou je bunková línia COS-7 opíc.
  9. 9. Izolát DNK obsahujúci DNK sekvenciu kódujúcu ľudský imunitný interferón, s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.
  10. 10. Replikovateľný expresný vektor schopný exprimovať v transformantnom mikroorganizme alebo v bunkovej kultúre DNK sekvenciu, kódujúcu ľudský imunitný interferón, s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.
  11. 11. Rekombinantný mikroorganizmus alebo bunková kultúra schopné exprimovať imunitný interferón s aminokyselinovou sekvenciou, znázornenou na obr. 5, alebo jeho alela alebo derivát s funkciou ľudského imunitného interferónu.
  12. 12. Rekombinantný mikroorganizmus podľa nároku 11, ktorým je kmeň E. coli.
  13. 13. Rekombinantný mikroorganizmus podľa nároku 11, ktorým je kvasinkový kmeň.
  14. 14. Bunková kultúra podľa nároku 11, ktorou je bunková línia cicavcov.
  15. 15. Bunková kultúra podľa nároku 11, ktorou je bunková línia opíc.
  16. 16. Farmaceutický prípravok na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje terapeuticky * účinné množstvo ľudského imunitného interferónu podľa niektorého z nárokov 1 až 8 v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom.
  17. 17. Farmaceutický prípravok podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že účinná látka s farmaceutický prijateľným nosičom je vo forme na parenterálne podávanie.
  18. 18. Použitie ľudského imunitného interferónu podľa niektorého z nárokov 1 až 8 na prípravu farmaceutických prípravkov na liečenie tumorových alebo vírusových ochorení alebo imunosupresívnych stavov.
SK7389-82A 1981-10-19 1982-10-18 Ľudský imunitný interferón a jeho derivát, izolát SK279535B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31248981A 1981-10-19 1981-10-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK738982A3 true SK738982A3 (en) 1998-12-02
SK279535B6 SK279535B6 (sk) 1998-12-02

Family

ID=23211703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK7389-82A SK279535B6 (sk) 1981-10-19 1982-10-18 Ľudský imunitný interferón a jeho derivát, izolát

Country Status (43)

Country Link
US (4) US4762791A (sk)
EP (1) EP0077670B1 (sk)
JP (3) JPS5890514A (sk)
KR (1) KR840001837A (sk)
AT (1) ATE44289T1 (sk)
AU (1) AU561343B2 (sk)
BG (2) BG42527A3 (sk)
BR (1) BR8206068A (sk)
CA (1) CA1341590C (sk)
CH (1) CH663619A5 (sk)
CZ (1) CZ282154B6 (sk)
DD (1) DD208822A5 (sk)
DE (4) DE19375065I2 (sk)
DK (1) DK163187C (sk)
DZ (1) DZ467A1 (sk)
ES (1) ES516620A0 (sk)
FI (1) FI86559C (sk)
FR (1) FR2514783B1 (sk)
GB (1) GB2107718B (sk)
GR (1) GR78391B (sk)
GT (1) GT198277746A (sk)
HK (1) HK66289A (sk)
HU (1) HU202287B (sk)
IE (1) IE54371B1 (sk)
IL (1) IL66992A (sk)
IT (1) IT1153265B (sk)
LU (1) LU88327I2 (sk)
MX (2) MX166499B (sk)
MY (1) MY102546A (sk)
NL (1) NL930040I2 (sk)
NO (2) NO164177C (sk)
NZ (1) NZ202190A (sk)
OA (1) OA07233A (sk)
PH (1) PH26963A (sk)
PL (1) PL153202B1 (sk)
PT (1) PT75696B (sk)
RO (1) RO89534A (sk)
RU (3) RU2056460C1 (sk)
SG (1) SG76988G (sk)
SK (1) SK279535B6 (sk)
YU (1) YU45871B (sk)
ZA (1) ZA827569B (sk)
ZW (1) ZW22282A1 (sk)

Families Citing this family (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
JPS58146281A (ja) * 1981-10-19 1983-08-31 Suntory Ltd 酵母細胞の形質転換法
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
JPS62223191A (ja) * 1981-12-24 1987-10-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチドの製法
ZA831094B (en) * 1982-02-22 1983-11-30 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
US5004689A (en) * 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
GB8406910D0 (en) * 1984-03-16 1984-04-18 Biogen Nv Gamma interferon
US6432677B1 (en) 1982-03-08 2002-08-13 Genentech, Inc. Non-human animal interferons
US5827694A (en) * 1982-03-08 1998-10-27 Genentech, Inc. DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
AU571460B2 (en) * 1982-09-27 1988-04-21 Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Alpha interferon dna, recombinant plasmid, engineered organism and alpha interferon polypeptide
EP0121569B1 (en) * 1982-10-08 1990-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel vector
US5831023A (en) * 1982-11-01 1998-11-03 Genentech, Inc. Recombinant animal interferon polypeptides
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
WO1984002129A1 (en) * 1982-11-22 1984-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd Human immune interferon protein and process for its preparation
US4620948A (en) * 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4599197A (en) * 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) * 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4518526A (en) * 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
GR79124B (sk) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4511502A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
JPH0740925B2 (ja) * 1983-03-14 1995-05-10 協和醗酵工業株式会社 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド
US7198919B1 (en) * 1983-04-25 2007-04-03 Genentech, Inc. Use of alpha factor sequences in yeast expression systems
ZA843275B (en) * 1983-05-05 1984-12-24 Hoffmann La Roche Novel vectors for interferon expression
NZ208309A (en) * 1983-06-01 1988-04-29 Hoffmann La Roche Recombinant leukocyte, fibroblast, or immune interferons (rifn-#a#, b or #g#) with one cys residue replaced
JP2551746B2 (ja) * 1983-07-19 1996-11-06 サントリー株式会社 改良プラスミドベクタ−およびその利用
DE3484374D1 (de) * 1983-08-04 1991-05-08 Green Cross Corp Gamma-interferonzusammensetzung.
JPS6034919A (ja) * 1983-08-04 1985-02-22 Green Cross Corp:The ガンマ・インタ−フェロン組成物
IL72773A0 (en) * 1983-08-29 1984-11-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
US4681930A (en) * 1983-09-20 1987-07-21 Hoffmann-La Roche Inc. Immune interferon and a method for its extraction and purification
US4476049A (en) * 1983-09-20 1984-10-09 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the extraction of immune interferon
ZA846554B (en) * 1983-09-20 1985-04-24 Hoffmann La Roche Immune interferon and method for its purification
US4604284A (en) * 1983-09-20 1986-08-05 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous immune interferon fragment
JPS6079000A (ja) * 1983-10-04 1985-05-04 Takeda Chem Ind Ltd ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法
JPH0788398B2 (ja) * 1983-10-17 1995-09-27 サントリー株式会社 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法
GB8328820D0 (en) * 1983-10-28 1983-11-30 Searle & Co Synthetic human gamma interferon gene
FR2556365B1 (fr) * 1983-12-09 1987-07-31 Transgene Sa Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
JPS60145098A (ja) * 1984-01-09 1985-07-31 Suntory Ltd 糖付加ポリペプチドの製造法
WO1985004420A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel dna and its use
DE3414831A1 (de) * 1984-04-19 1985-10-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet
GB8414354D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Biogen Nv Purifying protein
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof
WO1985005618A1 (en) * 1984-06-06 1985-12-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing interferon derivative
CA1302320C (en) * 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
JPS60262594A (ja) * 1984-06-11 1985-12-25 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ヒトインタ−フエロン−γ
GB8414911D0 (en) * 1984-06-12 1984-07-18 Searle & Co Producing human gamma interferon
JPS6124599A (ja) * 1984-07-11 1986-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体
GB2164650A (en) * 1984-09-25 1986-03-26 Fujisawa Pharmaceutical Co Process for production of y-interferon
ATE66375T1 (de) * 1984-10-05 1991-09-15 Bioferon Biochem Substanz Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von verschiedenen erkrankungen des menschen in niedriger dosierung.
IL76591A0 (en) * 1984-10-05 1986-02-28 Bioferon Biochem Substanz Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof
US4946674A (en) * 1984-10-05 1990-08-07 Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. Process for treatment of rheumatic diseases
DE3436638C2 (de) * 1984-10-05 1992-10-08 Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) enthaltenden Präparationen zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen
JPS6188875A (ja) * 1984-10-05 1986-05-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ヒトインタ−フエロン−γ
JPS61108397A (ja) * 1984-10-31 1986-05-27 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法
WO1986004067A1 (en) * 1984-12-27 1986-07-17 Suntory Limited Method for purifying an interferon
JPS6156195A (ja) * 1985-03-01 1986-03-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規生理活性ペプチド
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
JP2615027B2 (ja) * 1985-04-08 1997-05-28 アムジェン インコーポレイテッド 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター
US4873312A (en) * 1985-04-25 1989-10-10 Amgen Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby
FR2583429B1 (fr) * 1985-06-18 1989-11-03 Transgene Sa Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u
US4845196A (en) * 1985-06-24 1989-07-04 G. D. Searle & Co. Modified interferon gammas
US5104795A (en) * 1985-11-13 1992-04-14 Zoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
EP0245479B1 (en) * 1985-11-13 1993-02-17 Xoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
EP0237019A3 (en) * 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US6238889B1 (en) * 1986-12-16 2001-05-29 Dsm N.V. Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3
US4939088A (en) * 1987-02-18 1990-07-03 Meloy Laboratories Inc. Sustained production of recombinant gamma interferon using an Epstein-Barr virus replicon
US4944941A (en) * 1987-08-07 1990-07-31 Genentech, Inc. Methods and compositions for the treatment of lung conditions
US6384194B1 (en) * 1987-12-16 2002-05-07 Dsm N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
US5258287A (en) * 1988-03-22 1993-11-02 Genentech, Inc. DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
US5198212A (en) * 1988-10-31 1993-03-30 University Of Lousville Research Foundation Incorporated Method and compositions for treatment of trauma-associated sepsis with gamma interferon
US20020168750A1 (en) * 1988-12-23 2002-11-14 James Rasmussen Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US6451600B1 (en) * 1989-12-22 2002-09-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5236838A (en) * 1988-12-23 1993-08-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5196191A (en) * 1989-03-17 1993-03-23 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
US5112605A (en) * 1989-03-17 1992-05-12 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US5281520A (en) * 1990-09-12 1994-01-25 Zymogenetics, Inc. Method for producing acyloxyacyl hydrolase
CA2092541A1 (en) * 1990-09-27 1992-03-28 Gail F. Seelig Antagonists of human gamma interferon
EP0487298A3 (en) * 1990-11-21 1992-12-16 Schering Corporation Human gamma interferon antagonist/agonist screen
AU1268192A (en) * 1991-01-04 1992-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Cloning and expression of tissue transglutaminases
WO1992013077A1 (en) * 1991-01-29 1992-08-06 Brigham And Women's Hospital A cDNA ENCODING THE TYPE I IODOTHYRONINE 5' DEIODINASE
US5272078A (en) * 1991-01-29 1993-12-21 Brigham And Women's Hospital CDNA encoding the type I iodothyronine 5'deiodinase
US6180602B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Sagami Chemical Research Center Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent
WO1994003599A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Sagami Chemical Research Center HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR
AU5590394A (en) * 1992-11-03 1994-05-24 Oklahoma Medical Research Foundation Transglutaminase gene
DE69322289T2 (de) * 1992-12-29 1999-05-20 Genentech Inc Behandlung von entzündlichen darmerkrankungen mit interferon-gamma-inhibitoren
JPH09503657A (ja) 1993-09-15 1997-04-15 チロン ビアジーン インコーポレイティド 組換えアルファウイルスベクター
ATE386811T1 (de) 1996-04-05 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Alphaviren-vektors mit eine reduzierte inhibierung der synthese von zellmakromolekülen
EP0935659A1 (en) 1996-09-17 1999-08-18 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
US20020168634A1 (en) * 1999-05-05 2002-11-14 Christine Marie Debouck Methods for identifiying genes essential to the growth of an organism
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
CA2296770A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CN1201814C (zh) 1998-04-02 2005-05-18 基因技术股份有限公司 心脏肥大的治疗方法
WO2000039302A2 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
KR20020065517A (ko) 1999-11-12 2002-08-13 맥시겐 홀딩스 리미티드 인터페론 감마 접합체
CA2405563A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP4873818B2 (ja) * 2000-05-16 2012-02-08 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 遊離システイン残基を含有するタンパク質をリフォールディングする方法
JP4220235B2 (ja) * 2000-11-03 2009-02-04 インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド 短期及び長期の薬剤薬量決定のための方法
CN100536919C (zh) * 2001-01-09 2009-09-09 贝勒研究院 干扰素拮抗剂和Flt3L拮抗剂的用途
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
EP2280074A3 (en) 2001-07-05 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
CA2457485C (en) * 2001-08-17 2012-08-14 Arthur M. Krieg Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
JP2005509647A (ja) * 2001-11-06 2005-04-14 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ エストロゲン応答性乳癌の治療方法
IL161630A0 (en) * 2001-11-06 2004-09-27 Applied Research Systems Methods of treating endometreosis
KR20040053291A (ko) * 2001-11-09 2004-06-23 바이오메디신즈 인코포레이티드 오메가 인터페론을 이용한 질환 치료 방법
WO2003049760A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Intermune, Inc. Compositions and method for treating hepatitis virus infection
ES2500918T3 (es) 2001-12-21 2014-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta
ES2627445T3 (es) 2002-05-01 2017-07-28 Miltenyi Biotec Technology, Inc. Partículas de vector de lentivirus resistentes a la inactivación por el complemento
US7524931B2 (en) 2002-07-03 2009-04-28 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
AU2003251763A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-23 The Brighamn And Women's Hospital, Inc. Interferon gamma in the detection and treatment of angiomyolipomas
US7335743B2 (en) 2002-10-16 2008-02-26 Amgen Inc. Human anti-IFN-γ neutralizing antibodies as selective IFN-γ pathway inhibitors
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2005074524A2 (en) 2004-02-02 2005-08-18 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
US20100015211A1 (en) 2004-11-01 2010-01-21 Barnett Susan W Combination Approaches For Generating Immune Responses
AU2005317684B2 (en) 2004-12-23 2012-02-16 Molmed Spa Conjugation product
SG173313A1 (en) 2005-01-05 2011-08-29 Biogen Idec Inc Cripto binding molecules
PT1848744E (pt) * 2005-01-27 2012-04-24 Novimmune Sa Anticorpos anti-interferão gama e os seus processos de utilização
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
DE602007009377D1 (de) 2006-05-30 2010-11-04 Intarcia Therapeutics Inc Zweiteiliger flussmodulator mit einem internen kanal für ein osmotisches ausgabesystem
ES2398126T3 (es) 2006-08-09 2013-03-13 Intarcia Therapeutics, Inc Sistemas de liberación osmótica y unidades de pistón
EP2102355B1 (en) 2006-12-14 2016-03-02 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
MX2009011123A (es) 2007-04-23 2009-11-02 Intarcia Therapeutics Inc Formulaciones de suspensiones de peptidos insulinotropicos y sus usos.
AU2008247815B2 (en) * 2007-05-02 2012-09-06 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CN101896276A (zh) * 2007-11-28 2010-11-24 智能管公司 用于生物标本的收集、刺激、稳定化和分析的装置、系统和方法
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
DK2240155T3 (da) 2008-02-13 2012-09-17 Intarcia Therapeutics Inc Indretninger, formuleringer og fremgangsmåder til levering af flere gavnlige midler
EP2248903A1 (en) 2009-04-29 2010-11-10 Universitat Autònoma De Barcelona Methods and reagents for efficient and targeted gene transfer to monocytes and macrophages
NZ747990A (en) 2009-09-28 2020-06-26 Intarcia Therapeutics Inc Rapid establishment and/or termination of substantial steady-state drug delivery
TW201217526A (en) 2010-07-09 2012-05-01 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
RU2446172C1 (ru) * 2011-03-24 2012-03-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)
EA023379B1 (ru) * 2011-06-21 2016-05-31 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарма Ген" ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА
WO2013012733A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
WO2013024156A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2013024158A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection
HUE039033T2 (hu) 2012-01-10 2018-12-28 Biogen Ma Inc Terápiás molekulák transzportjának fokozása a vér-agy gáton keresztül
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
EP3608401A1 (en) 2012-07-05 2020-02-12 Ohio State Innovation Foundation Compositions and methods related to viral vaccines
WO2014033266A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection
TWI788044B (zh) 2013-03-15 2022-12-21 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
EP2940128A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Adenovirus comprising an albumin-binding moiety
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
EP3253875B1 (en) 2015-02-04 2020-01-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Tau antisense oligomers and uses thereof
EP3254104B1 (en) 2015-02-04 2021-08-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of selecting therapeutic molecules
US11091543B2 (en) 2015-05-07 2021-08-17 Swedish Orphan Biovitrum Ag Methods, compositions and dosing regimens for treating or preventing interferon-gamma related indications
EA037532B1 (ru) 2015-05-07 2021-04-08 Новиммун Са Способы и композиции для диагностики и лечения заболеваний у пациентов, имеющих повышенные уровни cxcl9 и других биомаркеров
NZ738102A (en) 2015-06-03 2024-02-23 Intarcia Therapeutics Inc Implant placement and removal systems
US11324816B2 (en) 2015-08-31 2022-05-10 Technovax, Inc. Human respiratory syncytial virus (HRSV) virus-like particles (VLPS) based vaccine
JP7250520B2 (ja) 2016-04-13 2023-04-03 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 組換えアルテリウイルスレプリコン系およびその使用
TWI814219B (zh) 2016-05-16 2023-09-01 美商因塔希亞治療公司 升糖素受體選擇性多肽和彼之使用方法
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
AU2017347725B2 (en) 2016-10-17 2024-01-04 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Recombinant virus replicon systems and uses thereof
BR112019011661A2 (pt) 2016-12-05 2020-01-07 Synthetic Genomics, Inc. Composições e métodos para aumentar expressão de gene
US10835580B2 (en) 2017-01-03 2020-11-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Methods comprising continuous administration of a GLP-1 receptor agonist and co-administration of a drug
EP3672488A4 (en) 2017-08-23 2021-07-14 Wayne State University IN VIVO IMMUNOIMAGING OF INTERFERON GAMMA
US11389531B2 (en) 2017-12-19 2022-07-19 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines
US11021692B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
EA202091516A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv)
KR20200111729A (ko) 2018-01-19 2020-09-29 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 재조합 레플리콘 시스템을 이용한 면역 반응 유도 및 증진
KR20230013021A (ko) 2020-03-19 2023-01-26 트리젤 엘티디. 온도-반응성 바이러스 저장 시스템
AU2021250709A1 (en) 2020-03-30 2022-10-13 Trizell Ltd. Compositions and methods for treating cancer

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
JPS5598118A (en) * 1979-01-18 1980-07-25 Hayashibara Takeshi Preparation of type-2 interferon and drug containing the same
AU538665B2 (en) * 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
GB2068970B (en) * 1980-02-06 1983-06-22 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DE3005897A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4460685A (en) * 1980-05-29 1984-07-17 New York University Method of enhancing the production of human γ Interferon
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
US4376821A (en) * 1981-04-17 1983-03-15 Meloy Laboratories, Inc. Production of human IFN-gamma (immune) interferon
IL65475A0 (en) * 1981-04-17 1982-07-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna

Also Published As

Publication number Publication date
AU561343B2 (en) 1987-05-07
IL66992A (en) 1991-07-18
CZ282154B6 (cs) 1997-05-14
FI823528A0 (fi) 1982-10-15
JP2515308B2 (ja) 1996-07-10
BR8206068A (pt) 1983-09-13
YU45871B (sh) 1992-09-07
BG42527A3 (en) 1987-12-15
PL153202B1 (en) 1991-03-29
US4929554A (en) 1990-05-29
PH26963A (en) 1992-12-28
NL930040I2 (nl) 1993-09-16
NO1994025I1 (no) 1994-12-20
NO823467L (no) 1983-04-20
DK163187B (da) 1992-02-03
GB2107718B (en) 1985-11-20
US4925793A (en) 1990-05-15
PT75696B (en) 1987-03-24
ZW22282A1 (en) 1983-05-11
DE3238554A1 (de) 1983-05-05
US4762791A (en) 1988-08-09
YU233582A (en) 1985-03-20
IL66992A0 (en) 1983-02-23
FR2514783B1 (fr) 1985-11-29
ES8402351A1 (es) 1984-02-01
NO164177B (no) 1990-05-28
AU8935282A (en) 1983-04-28
SK279535B6 (sk) 1998-12-02
OA07233A (fr) 1984-04-30
EP0077670B1 (en) 1989-06-28
FR2514783A1 (fr) 1983-04-22
DK163187C (da) 1992-06-22
DD208822A5 (de) 1984-04-11
GR78391B (sk) 1984-09-27
IE54371B1 (en) 1989-09-13
RU2056460C1 (ru) 1996-03-20
CZ738982A3 (en) 1997-03-12
JPS62265986A (ja) 1987-11-18
US4727138A (en) 1988-02-23
FI823528L (fi) 1983-04-20
BG44877A3 (sk) 1989-02-15
GT198277746A (es) 1984-04-11
CA1341590C (en) 2009-02-03
EP0077670A2 (en) 1983-04-27
HU202287B (en) 1991-02-28
NO164177C (no) 1990-09-12
MX9206041A (es) 1994-04-29
DE3238554C2 (sk) 1989-11-23
GB2107718A (en) 1983-05-05
JPH07106144B2 (ja) 1995-11-15
IE822517L (en) 1983-04-19
IT8223795A0 (it) 1982-10-18
PT75696A (en) 1982-11-01
JPH0135639B2 (sk) 1989-07-26
LU88327I2 (fr) 1994-05-04
DE19375065I2 (de) 2004-07-01
ES516620A0 (es) 1984-02-01
NZ202190A (en) 1987-06-30
ATE44289T1 (de) 1989-07-15
JPS5890514A (ja) 1983-05-30
MX166499B (es) 1993-01-12
NL930040I1 (nl) 1993-08-02
PL238671A1 (en) 1983-07-18
SG76988G (en) 1989-03-23
RU2092561C1 (ru) 1997-10-10
FI86559C (fi) 1992-09-10
FI86559B (fi) 1992-05-29
RU2107728C1 (ru) 1998-03-27
IT1153265B (it) 1987-01-14
DE3279788D1 (en) 1989-08-03
KR840001837A (ko) 1984-06-07
HK66289A (en) 1989-08-25
DE77670T1 (de) 1987-09-03
DZ467A1 (fr) 2004-09-13
RO89534A (ro) 1986-07-30
EP0077670A3 (en) 1984-07-04
DK460882A (da) 1983-05-27
ZA827569B (en) 1983-11-30
JPH03246232A (ja) 1991-11-01
MY102546A (en) 1992-07-31
CH663619A5 (de) 1987-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK738982A3 (en) Human immune interferon and derivative thereof, dna-fragment, replicable expression vector, a recombinant microorganism or a cell culture, pharmaceutical composition and use thereof
US5096705A (en) Human immune interferon
US5582824A (en) Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
KR910001809B1 (ko) Csf 단백질 생산방법 및 정제방법
US4853332A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
EP0041313B1 (en) Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon
US6610830B1 (en) Microbial production of mature human leukocyte interferons
EP0158198A1 (en) DNA and use thereof
WO1985005618A1 (en) Process for preparing interferon derivative
HRP950157A2 (en) Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics
BG61060B2 (bg) човешки имунен интерферон
PH26492A (en) Recombinant human immune interferon
KR890001828B1 (ko) 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법
BG60889B2 (bg) човешки имунен интерферон
NZ214261A (en) Human immune interferon: production by recombinant dna technology
BG60888B2 (bg) човешки имунен интерферон
BG60939B2 (bg) човешки имунен интерферон
BG60890B2 (bg) човешки имунен интерферон
JPH08245695A (ja) 抗腫瘍活性物質