JP4302513B2 - 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents

抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP4302513B2
JP4302513B2 JP2003510815A JP2003510815A JP4302513B2 JP 4302513 B2 JP4302513 B2 JP 4302513B2 JP 2003510815 A JP2003510815 A JP 2003510815A JP 2003510815 A JP2003510815 A JP 2003510815A JP 4302513 B2 JP4302513 B2 JP 4302513B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
sequence
cells
hiv
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2003510815A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2004537303A (ja
Inventor
メゲーデ， ヤーン ツア
スーザン ダブリュー． バーネット，
イン リアン，
Original Assignee
ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド filed Critical ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド
Publication of JP2004537303A publication Critical patent/JP2004537303A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4302513B2 publication Critical patent/JP4302513B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

（発明の分野）
抗原性ＨＩＶポリペプチド（例えば、表Ｃにおいて示される抗原性ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドが記載される。そして免疫原性組成物の処方およびこれらの使用を含む、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の使用が、記載される。
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医学が直面している最も大きな健康の脅威の１つとして認識される。現在もなお、この疾患についての療法は存在しない。
１９８３年〜１９８４年においては、３つのグループが、ＡＩＤＳの推測される病因学的な因子を別々に同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，ＥｓｓｅｘおよびＧｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら、（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２を参照のこと。これらの単離物は、リンパ節腫脹症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と、様々に呼ばれた。これらの単離物の全てが、同じウイルスの株であり、そして後にまとめて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれた。関連するＡＩＤＳを引き起こすウイルスの単離物を用いて、最初にＨＩＶと呼ばれた株が、現在ＨＩＶ−１であり、そして関連するウイルスが、ＨＩＶ−２と呼ばれている。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６２２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：６９１−６９５を参照のこと。
多くの情報が、ＨＩＶウイルスについては蓄積されているが、しかし、有効なワクチンは今日までには同定されていない。ＨＩＶによってコードされるｅｎｖ遺伝子およびＧａｇ遺伝子産物を含むワクチンの開発のためのいくつかの標的が、試験されている。Ｇａｇ遺伝子産物として、Ｇａｇ−ポリメラーゼおよびＧａｇ−プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝子産物として、単量体のｇｐ１２０ポリペプチド、オリゴマーの（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ）ｇｐ１４０ポリペプチドおよびｇｐ１６０ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｈａａｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）：３１５−３２４、１９９６）は、ＨＩＶ−１による選択的なコドン使用が、ウイルスのタンパク質合成の実質的にわずかな非効率性を説明するようであることを示唆した。Ａｎｄｒｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７−１５０３、１９８８）は、改変されたコドン使用を有する合成ｇｐ１２０配列を使用するＤＮＡのワクチン接種によって誘発される、増大された免疫応答を記載した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３、１９９７）は、Ｇａｇコード配列およびＧａｇプロテアーゼコード配列のコード配列内に配置された阻害（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）の不活化を議論している。
ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、ウイルス様の粒子のアセンブリに必要である。ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、アセンブリ、粒子の放出後のビリオンの成熟、およびウイルスの複製における初期の侵入後の工程を含む、ウイルスの生存周期の多くの段階に関連している。ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質の役割は多数あり、そして複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：１−１５、１９９８）。
Ｗｏｌｆら、（１９９６年１０月３日に公開された、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／３０５２３；１９９１年１０月２日に公開された、欧州特許出願公開番号第０ ４４９ １１６ Ａ１号）は、非感染性のレトロウイルス様の粒子キャリアとして作用するように、特に、免疫学的に重要なエピトープの提示のために、変更されたＨＩＶ−１のｐｒ５５ Ｇａｇの使用を記載した。Ｗａｎｇら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００：５２４−５３４、１９９４）は、ビリオンへのＨＩＶ Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質のアセンブリを研究するための系を記載している。彼らは、ＨＩＶ Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコードする配列の構築、ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質の存在下でのこのような配列の発現、およびウイルス粒子へのこれらのタンパク質のアセンブリを記載する。
Ｓｈｉｖｅｒら（１９９８年８月１３日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／３４６４０号）は、ＨＩＶ Ｇａｇをコードする合成ＤＮＡ分子、およびＨＩＶ Ｇａｇの改変を産生するための、ＨＩＶ−１（ＣＡＭ１）Ｇａｇコード配列の変更を記載した。合成分子のコドンは、計画された宿主細胞によって好まれるコドンであった。
最近、免疫原性の組成物中でのＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドの使用が記載されている。（異なるＨＩＶ ｅｎｖ改変体をそれぞれ発現する少なくとも４つの異なる組換えウイルスの混合物を含む免疫原性の組成物を記載している、１９９８年１２月８日に発行されたＨｕｒｗｉｔｚらの米国特許第５，８４６，５４６号；および、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチドを記載している、１９９８年１１月２４日に発行された、Ｖａｈｌｎｅらの米国特許第５，８４０，３１３号を参照のこと）。さらに、１９９９年３月２日に発行された、Ｓｉａらの米国特許第５，８７６，７３１号は、配列ＧＰＧＲを含有しているＨＩＶ−１単離物のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して直接連結されたＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含有しているＨＩＶに対する候補のワクチンを記載している。
（発明の要旨）
本明細書中に記載されるものは、新規のＨＩＶ配列、これらの新規配列によってコードされるポリペプチド、ならびにこれらおよび他のＨＩＶ配列から生成される合成発現カセットである。１つの局面において、本発明は、改良されたＨＩＶ発現カセットに関する。第２の局面において、本発明は、本発明の発現カセットを用いて被験体における免疫応答の発生に関する。さらなる局面において、本発明は、本発明の発現カセットおよび本発明の発現カセットによってコードされるポリペプチドを用いた被験体における免疫応答の発生に関する。別の局面において、本発明は、被験体におけるＨＩＶに対する抗体および／または細胞性免疫応答を強力な中和を誘導するための増強されたワクチン技術に関する。
特定の実施形態において、本発明は、ＨＩＶポリペプチド（Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｐｒｏｔ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖならびに／またはそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない）をコードする、単離された野生型のポリヌクレオチドおよび／または発現カセットに関する。さらに、本発明また、ＨＩＶポリペプチドの発現の改善、およびウイルス様粒子の産生に関する。ＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ−，ｐｏｌ−，プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）−、逆転写酵素、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅＨ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆおよび／またはＥｎｖを含有するポリペプチド）をコードする合成発現カセットが記載され、この発現カセットの使用も記載される。免疫応答を発生させるこれらの遺伝子の能力に悪影響を与えることなしに、遺伝子産物の活性を低減するかまたは取り除くためのこれらの遺伝子のいくつかのおける変異が記載されている。例示的な合成ポリヌクレオチドとしては、Ｂ型抗原を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチド、およびＣ型抗原を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、この合成ポリヌクレオチド配列は、以下から選択されるがこれらに限定されることがない配列を含む：
Figure 0004302513
Figure 0004302513
従って、本発明の１つの局面は、発現カセットおよびこの中に含まれるポリヌクレオチドに関する。この発現カセットは、代表的には、発現カセット骨格に挿入されたＨＩＶポリペプチドコード配列を含む。１つの実施形態において、発現カセットは、１以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、約８５％と１００％との間、およびこの間の任意の整数値（例えば、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％、およびより好ましくは約９８％）の配列同一性を有する配列を含む。
本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、さらなるポリペプチドをコードする配列を含み得る。ポリペプチドをコードするこのようなさらなるポリヌクレオチドは、例えば、他のウイルスタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎あるいは他のＨＩＶのタンパク質）についてのコード配列（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および／またはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆのうちの１以上をコードするポリヌクレオチド）；サイトカインまたは他の導入遺伝子を含み得る。
１つの実施形態において、ＨＩＶ Ｐｏｌポリペプチドをコードする配列は、逆転写酵素およびインテグラ−ゼに対応するコード領域の欠失によって改変され得る。このポリメラーゼポリペプチドにおけるこのような欠失はまた、作製され得、その結果、このポリヌクレオチド配列は、ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬのエピトープを保存する。目的の他の抗原は、同様にポリメラーゼに挿入され得る。
別の実施形態において、発現ベクターは、Ｂ型抗原を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチド、およびＣ型抗原を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチドを含み、ここで、上記の合成ポリヌクレオチド配列は、以下：
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 から選択されるがこれらに限定されることはないコード配列を含み、ここで、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、約８５％〜１００％の間、およびこの間の任意の整数値（例えば、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そしてより好ましくは約９８％）の配列同一性を有する配列を含む。
本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするネイティブなポリヌクレオチド配列および合成ポリヌクレオチド配列は、代表的には、本明細書中に教示される配列と、約８５％〜１００％の間、およびこの間の任意の整数値（例えば、少なくとも約８５％、好ましくは、約９０％、より好ましくは、約９５％、そしてより好ましくは、約９８％）の配列同一性を有する。さらに、特定の実施形態において、本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中に教示される配列と、１００％の配列同一性を示す。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術またはそれらの組み合わせによって生成され得る。
本発明は、さらに、選択した宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含し、ここで、この組換え発現系は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドおよび発現カセットを用いる。このような系において、ポリヌクレオチド配列は、選択した宿主細胞における発現と適合性のコントロールエレメントに作動可能に連結される。多数の発現コントロールエレメントが、当該分野で公知であり、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を最適化するための配列、および翻訳終止配列。例示的な転写プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒおよびメタロチオネインから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
別の局面において、本発明は、１つ以上の発現カセットを含む細胞を含み、ここで、ポリヌクレオチド配列は、選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。１つの実施形態において、このような細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用であり得る他の細胞、細胞型、組織型などとしては、以下から得られるものが挙げられるがこれらに限定されない：昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎ５）およびＳｆ９）、細菌、酵母、植物、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞）、一次細胞、不死化細胞、腫瘍誘導細胞。
さらなる局面において、本発明は、免疫学的応答を発生するための組成物を包含し、ここで、この組成物は、代表的には、本発明の少なくとも１つの発現カセットを含有し、そして例えば、発現カセット（例えば、Ｐｏｌ誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット、Ｇａｇ誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット、付随ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ネイティブもしくは合成の、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ）を有する１つ以上の発現カセット、および／またはＥｎｖ誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット）の組み合わせを含有し得る。このような組成物は、さらに、アジュバント（単数または複数）を含有し得る。これらの組成物はまた、１つ以上のＨＩＶポリペプチドを含有し得る。このＨＩＶポリペプチドは、組成物中の発現カセットによってコードされるポリペプチドに対応し得るか、または発現カセットによってコードされるポリペプチドとは異なり得る。発現カセット（または、本発明のポリヌクレオチド）およびポリペプチドの両方を含有する組成物において、本発明の種々の発現カセットが混合され得、そして／または本明細書中に記載される種々のＨＩＶポリペプチドと適合され得る。
別の局面において、本発明は、被験体の免疫化の方法を包含する。本方法において、上記の組成物のいずれかは、被験体中の発現カセットの発現に適合性である条件下で、被験体中にある。１つの実施形態において、発現カセット（または、本発明のポリヌクレオチド）は、遺伝子送達ベクターを使用して導入され得る。この遺伝子送達ベクターは、例えば、非ウイルスベクター、またはウイルスベクターであり得る。例示的なウイルスベクターとしては、真核層状開始系（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｌａｙｅｒｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（または他のαウイルス）由来ベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。他の例示的なベクターとしては、ｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶ６ａ、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋ、およびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的応答を生じるために有用な組成物はまた、特定のキャリア（例えば、ＰＬＧ微粒子またはＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）を使用して送達され得る。さらに、このような組成物は、例えば、金粒子またはタングステン粒子、および例えば、遺伝子銃を使用して被験体に送達されるコーティングされた粒子上にコーティングされ得る。これらの組成物はまた、リポソームとして処方され得る。この方法の１つの実施形態において、被験体は、哺乳動物であり、そして例えば、ヒトであり得る。
さらなる局面において、本発明は、被験体において免疫応答を生じる方法を包含する。本明細書中に記載される任意の発現カセットは、適切な細胞において発現されて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＨＩＶポリペプチドの発現を提供し得る。次いで、ポリペプチドは単離（例えば、実質的な精製）され、免疫応答を誘発するのに十分な量で被験体に投与される。特定の実施形態において、本方法は、本明細書中に記載される遺伝子送達技術のいずれかを使用して、本発明の１つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドを投与する工程を包含する。他の実施形態において、本方法は、本発明の１つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドおよび１つ以上のポリペプチドを同時投与する工程を包含し、ここで、これらのポリペプチドは、これらのポリヌクレオチドから発現され得るか、または他のＨＩＶポリペプチドであり得る。他の実施形態において、本方法は、本発明の複数の発現カセットまたはポリヌクレオチドを同時投与する工程を包含し得る。なおさらなる実施形態において、本方法は、複数のポリペプチド、例えば、本発明のポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドおよび／または他のＨＩＶポリペプチドを同時投与する工程を包含する。
本発明はさらに、被験体において免疫応答を生じる方法を包含し、ここで、被験体の細胞は、選択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチド（例えば、本発明の任意の発現カセットによってコードされる）の産生が可能な条件下で、上記の発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドのいずれかを用いてトランスフェクトされる。この方法によって、ポリペプチドに対する免疫応答が、被験体で誘発される。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入される。あるいは、またはさらに、細胞は被験体においてインビボでトランスフェクトされ得る。この免疫応答は、体液性および／または細胞媒介性（細胞性）であり得る。さらなる実施形態において、この方法はまた、被験体への発現カセットの導入前、導入時および／または導入後に、ＨＩＶポリペプチドを投与する工程を包含し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、単独または組み合わせて使用され得る。ＨＩＶ誘導体化ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、種々の方法において発現され得る。これらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プロモーターから発現される単一の遺伝子産物（またはそれらの一部分）をコードするポリヌクレオチド；１つより多い遺伝子産物（またはそれらの一部分）をコードする複数のポリヌクレオチド（例えば、ポリシストロニックコード配列）；単一のポリタンパク質を産生するための複数のポリヌクレオチドインフレーム；およびポリタンパク質がポリタンパク質を含む１つ以上のポリペプチドの間にタンパク質切断部位を有する、単一のポリタンパク質を産生するための複数のポリヌクレオチドインフレーム。
１つの局面において、本発明は、２つ以上の免疫原性ＨＩＶポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含み、ここで、これらのポリペプチドのうち少なくとも２つは、異なるＨＩＶサブタイプ（例えば、ＨＩＶサブタイプＢおよびＨＩＶサブタイプＣ）由来である。さらに、他のＨＩＶサブタイプ（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｏ型など）が用いられ得る。
ＨＩＶポリペプチドは、任意のＨＩＶポリペプチド由来の抗原またはエピトープをコードし得、そのＨＩＶポリペプチドとしては、以下：Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆおよびこれらの組み合わせから選択されるＨＩＶポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。抗原およびエピトープを含む他のＨＩＶポリペプチドが本明細書中に記載される（例えば、表Ａを参照のこと）。１つの実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、Ｔａｔポリペプチド、ＲｅｖポリペプチドおよびＮｅｆポリペプチドをコードする。別の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、Ｖｉｆポリペプチド、ＶｐｒポリペプチドおよびＶｐｕポリペプチドをコードする。
合成ポリヌクレオチドによりコードされるＨＩＶポリペプチドは、例えば、合成ポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物の活性または機能を（野生型と比較して）減少、減衰、不活化、排除するか、またはそれを非機能的にするポリペプチドの活性または機能に影響する１つ以上の変異を有する。例えば、合成ポリヌクレオチドは、Ｐｏｌを含むＨＩＶポリペプチドをコードする。これらの変異は、例えば、プロテアーゼ機能を減少または排除する変異、逆転写酵素のプライマーグリップ領域の触媒中心を欠損させる変異、インテグラーゼのＤＮＡ結合ドメインの触媒中心を不活化する変異からなる群より選択され得る。別の例において、合成ポリヌクレオチドは、Ｅｎｖを含むＨＩＶポリペプチドをコードし得る。これらの変異としては、例えば、切断部位における変異またはグリコシル化部位における変異が挙げられ得る。別の例において、合成ポリヌクレオチドは、Ｔａｔを含むＨＩＶポリペプチドをコードし得る。これらの変異としては、例えば、トランス活性化ドメインにおける変異が挙げられる。別の例において、合成ポリヌクレオチドは、Ｒｅｖを含むＨＩＶポリペプチドをコードし得る。これらの変異としては、例えば、ＲＮＡ結合−核局在化領域における変異または活性化ドメインにおける変異が挙げられ得る。別の例において、合成ポリヌクレオチドは、Ｎｅｆを含むＨＩＶポリペプチドを含み得る。これらの変異としては、例えば、ミリストイル化シグナルの変異、オリゴマー化における変異、感染性に影響する変異、およびＣＤ４のダウンレギュレーションに影響する変異が挙げられる。なおさらなる例において、合成ポリヌクレオチドは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、および／またはｖｐｕを含むＨＩＶポリペプチドをコードし得る。これらのポリペプチドもまた変異を含み得る。
本発明のさらなる局面において、合成ポリヌクレオチドは、さらなる抗原性ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチド由来のエピトープをコードする配列を含み得る。
本発明はまた、上記合成ポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。これらの発現カセットは、組換え発現系において用いられ得る。発現カセットにおいて使用される制御エレメントとしては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な転写プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒおよびメタロチオネインから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
別の局面において、本発明は、上記の合成ポリヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、代表的な発現カセットは、合成ポリヌクレオチドを含む。例示的な細胞としては、哺乳動物細胞（例えば、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎ５）昆虫細胞およびＳｆ９昆虫細胞）、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞）、一次細胞、不死化細胞、および腫瘍誘導細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
別の局面において、本発明は、異なるサブタイプ由来の２つ以上のＨＩＶポリペプチドを含むポリペプチドを産生する方法を含み、ここで、この方法は、例えば、ポリペプチドを産生するための条件下で、ポリペプチドをコードする発現カセットを含む細胞をインキューベートする工程を包含する。
別の局面において、本発明は、例えば、異なるサブタイプ由来の２つ以上のＨＩＶポリペプチドを含むポリペプチドをコードする遺伝子送達ベクターが発現カセットを含む哺乳動物被験体における使用のための遺伝子送達ベクターを含む。この発現カセットは、代表的に、被験体における発現に適合性の制御配列に作動可能に連結された合成ポリヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、被験体のＤＮＡ免疫の方法を含む。代表的にこの方法は、被験体において発現カセットの発現に適合する条件下で、被験体に本発明の遺伝子送達ベクターを導入する工程を包含する。例示的な遺伝子送達ベクターとしては、非ウイルスベクター、粒子状キャリア、およびウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子送達ベクターは、例えば、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ得、そしてこのコーティングされた粒子は、遺伝子銃を用いて被験体に送達され得るか、またはこのベクターは、リポソーム調製物中にカプセル化され得る。被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。
別の局面において、本発明は、被験体における免疫応答を発生させる方法を含む。代表的には、この方法は、ポリヌクレオチドの発現および異なるサブタイプ由来の２つ以上のＨＩＶポリペプチドを含むポリペプチドの産生を可能にし、それによりポリペプチドの免疫学的応答を誘発する条件下で、（例えば、上記のような）遺伝子送達ベクターを用いて被験体の細胞を、トランスフェクトする工程を包含する。例示的な遺伝子送達ベクターとしては、非ウイルスベクター、粒子キャリア、およびウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子送達ベクターは、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ、そしてこのコーティングされた粒子は、遺伝子銃を用いて被験体に送達され得るか、またはこのベクターは、リポソーム調製物中にカプセル化され得る。被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。被験体の細胞は、エキソビボでトランスフェクトされ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入され得る。あるいは、トランスフェクションは、被験体においてインビボでなされ得る。発生される免疫応答は、例えば、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答であり得る。
遺伝子送達ベクターが、例えば、筋内、経粘膜、鼻腔内、皮下、経皮、皮内、経皮、経膣、直腸内、経口または静脈内に投与され得る。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示の点から、当業者が容易に想到することである。
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に述べない限り、当業者の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍら編、１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（Ｎｅｗｔｏｎ＆Ｇｒａｈａｍ編、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）を参照のこと。
本明細書中で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他でその内容が明らかに指示しない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「抗体」との言及は、２以上のこのような因子の混合物を含む。
（１．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。
本明細書中で用いられる場合、「合成」配列とは、ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいい、その発現は、本明細書中で記載されるように、例えば、コドン置換、変化した活性、および／または阻害配列の不活化によって、改変されている。本明細書中で用いられる場合、「野生型」配列または「ネイティブ」配列は、本質的に、天然において見出されるような、ポリペプチドをコードする配列（例えば、ＨＩＶ単離物（例えば、ＳＦ１６２、ＳＦ２、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、ＡＦ１１０９７５、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡまたは１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ）において見出されるようなＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｅｎｖおよび／またはＮｅｆをコードする配列）をいう。ＨＩＶゲノムの種々の領域は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（図１Ａ〜１Ｄ）に対する番号付けを用いて、表Ａに示される。従って、用語「Ｐｏｌ」は、以下のポリペプチドの１つ以上をいう：ポリメラーゼ（ｐ６Ｐｏｌ）；プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）；逆転写酵素（ｐ６６ＲＴまたはＲＴ）；ＲＮＡｓｅＨ（ｐ１５ＲＮＡｓｅＨ）；および／またはインテグラーゼ（ｐ３１ ＩｎｔまたはＩｎｔ）。任意の選択されたＨＩＶ単離物についての遺伝子領域の同定は、本明細書中に提示される技術、および当該分野で公知の情報に基づいて、例えば、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（図１Ａ〜１Ｄ）に対する整列または他の公知のＨＩＶ単離物（例えば、遺伝子領域（例えば、ＳＦ２、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号Ｋ０２００７；ＳＦ１６２、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号Ｍ３８４２８）を有するサブタイプＢ単離物、ならびに遺伝子領域（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＦ１１０９６５およびＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＦ１１０９７５）を有するサブタイプＣ単離物）に対する整列を行うことにより、当業者により実施され得る。
本明細書中で用いられる場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは、以下でさらに議論されるいくつかのウイルスのいずれかに由来する非複製ウイルスシェルをいう。ＶＬＰは、一般に、１つ以上のウイルスタンパク質（例えば、これらに限定されないが、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、シェルタンパク質、表面タンパク質、および／またはエンベロープタンパク質として言及されるタンパク質、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチド）から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現の際に、同時に形成し得る。特定のＶＬＰを産生する方法は、当該分野で公知であり、そして以下でさらに完全に議論される。ウイルスタンパク質の組換え発現の後のＶＬＰの存在は、電子顕微鏡検査、Ｘ線結晶学などによるような、当該分野で公知の従来技術を用いて検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照のこと。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離により単離され得、そして／または特徴的な密度バンドにより同定され得る。あるいは、低温電子顕微鏡検査が、問題のＶＬＰ調製のガラス化された水性サンプルに対して行われ得、そしてイメージが適切な露出条件下で記録される。
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」は、全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそのフラグメント、またはＶＬＰ形成を好む条件下でＶＬＰを形成する能力を有する内部欠失を有するウイルスタンパク質を意味する。従って、ポリペプチドは、全長配列、フラグメント、短縮型配列および部分配列、ならびに参照分子のアナログおよび前駆体形態を含み得る。従って、この用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を保持する限り、配列に対する欠失、付加および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然の改変体を含む。なぜならば、コートタンパク質のバリエーションは、頻繁に、ウイルス単離物の間で生じるからである。この用語はまた、タンパク質がＶＬＰを形成する能力を保持する限り、参照タンパク質で天然では生じない欠失、付加および置換を含む。好ましい置換は、天然で保存的である置換（すなわち、それらの側鎖に関係するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）である。詳細には、アミノ酸は、一般に、以下の４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。
用語「ＨＩＶポリペプチド」とは、ネイティブＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｒｏｔ、Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｉｎｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆおよび／またはこれらの組み合わせ）に対する配列相同性を示し、そして／または機能的である、任意のアミノ酸配列をいう。ＨＩＶポリペプチドにより示され得る機能の非制限的例としては、（例えば、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を生じるための）免疫原としての使用、診断における使用（例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおける使用のための適切な抗体により結合される）、および／または野生型ＨＩＶポリペプチドまたは合成ＨＩＶポリペプチドと関連する１つ以上の生物学的活性を示すポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中で用いられる場合、用語「Ｇａｇポリペプチド」とは、１つ以上の抗Ｇａｇ抗体により結合され；体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を惹起し；および／または粒子を形成する能力を示す、ポリペプチドを言及し得る。
用語「ＨＩＶポリペプチド」とは、ネイティブＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｒｏｔ、Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｉｎｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆおよび／またはその組み合わせ）に対して配列相同性を示す任意のアミノ酸配列および／または機能的な任意のアミノ酸配列をいう。ＨＩＶポリペプチドによって示され得る機能の非制限的な例としては、免疫原としての使用（例えば、体液性および／または細胞性の免疫応答を生成すること）、診断剤における使用（例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおける使用のために適切な抗体により結合している）および／または野生型もしくは合成のＨＩＶポリペプチドと関連する１つ以上の生物学的活性を示すポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中で使用される場合、用語「Ｇａｇポリペプチド」は、１つ以上の抗Ｇａｇ抗体によって結合されており；体液性および／または細胞性の免疫応答を惹起し；そして／または粒子を形成する能力を示す、ポリペプチドをいい得る。
「抗原」とは、体液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生じるように宿主免疫系を刺激する、１以上のエピトープを含む分子（線状、立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）のいずれか、またはその両方）をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４アミノ酸程度の少なさであり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７と１５との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５個のアミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、抗原が天然で関係している生物全体から分離されそして別個である、抗原）、ならびに殺傷されたか、弱毒化されたか、または不活性化された、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）、またはそのフラグメントおよび合成ペプチドミモトープ（これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中で使用される抗原の定義の下に捕捉される。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用において、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。
本発明の目的のために、抗原は、以下により十分に記載されるように、いくつかの既知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のいずれかに由来し得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が本明細書中に定義されるような免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換）（一般に天然で保存される）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通してのように故意であってもよく、または抗原を産生する宿主の変異を通してのように偶然であってもよい。
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答に関する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して存在しそして細胞表面上に発現される、ペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣと結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、そしてこの細胞に対する活性に焦点を当てることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）により産生される他のこのような分子の産生をいう。
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。この細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその付近に指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来的な防御を可能にするように生成され得る。
特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイによって（例えば、リンパ増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによってか、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによって）決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）を含む（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．、およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７〜１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５〜２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９〜８６５、１９９７）により総説される）。
従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの１以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原に対して特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する防御を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
「免疫原性組成物」は、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する被験体における体液性免疫応答／細胞性免疫応答の発生を生じる、抗原性分子を含む組成物である。免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、鼻腔内、および粘膜（例えば、直腸内または膣内）投与によって、レシピエント被験体に直接導入され得る。
「サブユニットワクチン」とは、目的の病原体由来（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌由来）の抗原に由来するかまたはそれに相同である、１以上の選択された抗原（しかし、全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原体細胞もしくは病原性粒子、またはこのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチドまたはそのアナログから調製され得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成産生を含み得る。
「実質的に精製される（た）」とは、一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、存在するサンプルの主要な割合を含むように、その物質を単離することをいう。代表的には、サンプル中に、実質的に精製された成分は、このサンプルの５０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度に従う沈降が挙げられる。
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含まれ得るが、これらに限定されない。終止コドンのような転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置され得る。
代表的な「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンに対して３’に位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に位置する）、および翻訳終結配列が含まれるが、これらに限定されない。例えば、本明細書中に記載される配列および／またはベクターはまた、転写および／または終結を最適化し得る１つ以上のさらなる配列を含み得、これらとしては、コドン最適化野生型リーダーのＡＴＧの前（５’）に位置するＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）、または任意の他の適切なリーダー配列（例えば、ｔｐａ１、ｔｐａ２、ｗｔＬｎａｔ（ネイティブ野生型リーダー））またはコード配列の後（３’）に位置する終結配列（例えば、ＴＡＡ、または好ましくはＴＡＡＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「ポリヌクレオチドコード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、核酸分子であり、これは、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下で配置される場合、インビボで（ＤＮＡの場合に）転写され、そして（ｍＲＮＡの場合に）ポリペプチドに翻訳される。コード配列の境界は、開始コドン（例えば、５’末端またはその付近）および翻訳終止コドン（例えば、３’末端またはその付近）によって決定される。例示的なコード配列は、本発明の改変されたウイルスのポリペプチドコード配列である。本発明のポリヌクレオチド配列のコード領域は、当業者によって同定可能であり、そして例えば、ポリヌクレオチドの３つ全てのフレームの翻訳を実行すること、およびコードされたポリペプチド（例えば、ｎｅｆ由来のポリペプチドをコードする本発明の合成ｎｅｆポリヌクレオチド）に対応するフレームを同定することによって、容易に同定され得る。転写終結配列は、コード配列の３’に位置され得る。代表的な「制御エレメント」としては、転写レギュレーター（例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、およびポリアデニル化配列）；および転写レギュレーター（例えば、翻訳の開始を最適化するための配列（例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（リボソーム結合部位）配列、Ｋｏｚａｋ配列（すなわち、例えば、コード配列の５’に配置される、翻訳の最適化のための配列）、リーダー配列、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、および翻訳終結配列）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、１つ以上の翻訳調節配列または翻訳開始配列（例えば、リーダー配列）が、野生型翻訳開始配列（すなわち、そのネイティブ状態におけるコード領域の翻訳を調節する配列）に由来する。本明細書中に記載される方法を用いて改変されている野生型リーダー配列もまた、本発明における使用が見出される。プロモーターは、誘導性プロモーター（ここで、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制プロモーター（ここで、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、および構成的プロモーターを含み得る。
「核酸」分子には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含まれ得るが、これらに限定されない。その用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を捕捉する。
「作動可能に連結した」は、エレメントの配置をいい、ここで、そのように記載された成分は、それらの通常の機能を行うように構成されている。従って、コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。そのプロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写はされるが翻訳はされない介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結」していると考えられ得る。
本明細書において、核酸分子を記載するために使用される「組換え」は、その起源または操作により、（１）天然において結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない；および／または（２）天然において結合している以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成の起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞部分として培養された原核生物微生物または真核生物細胞株を示すそのような他の用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのためのレシピエントとして使用され得るか、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされている元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学上、または元の親に相補的なゲノムＤＮＡもしくは全ＤＮＡにおいて完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴づけられるべき親に充分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する適切な部位での２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸 対 アミノ酸の比較を意味する。次いで、いわゆる「パーセント同一性」は、比較したポリペプチド配列間で決定され得る。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する（通常、ｃＤＮＡ中間体を介して）こと、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを包含する。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれの、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つ以上のアミノ酸配列は、同様に、「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸またはペプチド配列が一般に記載されているか否か）は、一般に、より短い配列の長さによって除算され、そして１００を積算された２つの整列された配列間の正確な整合の数として記載される。核酸配列についてのおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５補遺、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、そしてＧｒｉｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化された、スコア付けマトリックスを使用して、ペプチド配列を用いて使用するために拡張され得る。核酸配列およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、それらのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法についてのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）に記載される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラムは、当該分野で一般に公知である。
例えば、特定のヌクレオチド配列の、参照配列に対するパーセント同一性は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトスコア付け表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いて使用して決定され得る。本発明の状況においてパーセント同一性を確立するための別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって頒布されているＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権の帰属するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージソフトから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、スコア付表（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ拡張ペナルティ、および６のギャップ）について使用されるデフォルトパラメーターが使用される場合に、利用され得る。作成されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラム（例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴ（これはデフォルトパラメーターでも使用され得る））は、一般に、当該分野で公知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターでも使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非縮重、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
当業者は、所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを容易に決定し得、例示的な好ましいＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎベースのパラメータが上記される。例えば、検索パラメータは、問題の配列のサイズに基づいて変化し得る。従って、本発明のポリヌクレオチド配列について、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列の長さは、選択されたデータベースに対して検索され、そして本質的に同じ長さの配列と比較されて％同一性を決定する。例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書中に記載される配列（例えば、表Ｃ）の１つ以上のＹ個の連続したヌクレオチドまたはそのフラグメントに関して、少なくともほぼ選択されたレベルの％同一性を有し、そして（ｉｉ）Ｘ＝Ｙの検索目的について、Ｙは、規定された長さ（例えば、１５ヌクレオチドの長さから、選択された全長配列に存在するヌクレオチドの数まで）の選択された参照のポリヌクレオチドである。
本発明の配列は、例えば、約１５ヌクレオチドから本明細書中に記載される全長配列（例えば、図を参照のこと）に存在するヌクレオチドの数まで（上記範囲内の全ての整数値を含む）の配列フラグメントを含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のフラグメントは、３０〜６０ヌクレオチド、６０〜１２０ヌクレオチド、１２０〜２４０ヌクレオチド、２４０〜４８０ヌクレオチド、４８０〜１０００ヌクレオチド、およびこれらの間の全ての整数値であり得る。
本発明の合成の発現カセット（および精製したポリヌクレオチド）には、本明細書に開示される合成の発現カセット配列および／またはポリヌクレオチド配列に対して（例えば、本発明の配列）、本発明の配列が、（例えば、配列のデータベースに対する）問い合わせ配列として使用された場合に、約８０％〜１００％の、８０〜８５％より大きい、好ましくは、９０〜９２％より大きい、より好ましくは、９５％より大きい、そして最も好ましくは、９８％より大きい１００％までの配列同一性（これらの記載の範囲に入る全ての整数値を含む）有する関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。
２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載される場合、「選択的にハイブリダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、少なくとも部分的に、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照）を使用して評価され得る。このようなアッセイは、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェントまでの種々の条件を使用して、種々の程度の選択性を使用して行われ得る。低ストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の不在は、非特異的な結合事象の非存在下で、二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性すら欠損する二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％よりも少ない配列同一性を有するプローブ）を使用することによって評価され得る。
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムが利用される場合、標的核酸配列に対して相補的な核酸プローブが選択され、次いで適切な条件の選択により、そのプローブおよび標的配列が、互いに、「選択的にハイブリダイズする」か、または結合して、互いにハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きな配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的が特定の程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知なように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多くの等価な条件を利用して、特定のストリンジェンシーを、例えば、以下の因子を変えることで確立し得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキング因子（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）が存在するかしないか、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメータ、ならびに洗浄条件の変更。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野の標準的方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、それらの相補体の領域と同じかもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、または第１のポリヌクレオチドが、上記のような配列同一性を示す場合に、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに「由来」する。
第１のポリペプチドが、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）第１のポリペプチドが、上記のような配列同一性を第２のポリペプチドに対して示す場合に、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドに「由来」する。
ウイルスポリペプチドが、（ｉ）ウイルスのポリヌクレオチド（ウイルス性ポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、または（ｉｉ）ウイルスのポリペプチドが、上記のような配列同一性をウイルスのポリペプチドに対し示す場合に、一般に、ウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチド（ウイルス性ポリペプチド）に「由来」する。
「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を参照し、ここでこのポリペプチド配列またはその一部は、この核酸配列によりコードされるポリペプチドに由来する、少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸の配列を含む。免疫学的にこの配列によってコードされるポリペプチドと同一視され得るポリペプチド配列もまた含まれる。さらに、ポリタンパク質は、ポリペプチドまたはペプチド産物をコードする、２つ以上のポリヌクレオチド配列をインフレーム融合することによって構築され得る。さらに、ポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）コード配列は、互いに隣接するポリペプチド産物をコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を、典型的には１つのプロモーターの制御下に、配置することで産生され得、ここで各ポリペプチドコード配列は、内部リボソーム結合部位に対する配列を含むよう改変され得る。
「精製されたポリヌクレオチド」とは、目的のポリヌクレオチドと自然の状態で関連するタンパク質が実質的に除かれた（例えば、そのタンパク質の約５０％未満、好ましくは約７０％未満、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は、当該分野で周知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含む細胞を、カオトロピック剤で破壊し、そしてポリヌクレオチドおよびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に依存した沈殿法により分離する工程を含む。
「核酸免疫化」とは、１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子を、宿主細胞に、抗原またはエピトープのインビボ発現のため導入することを意味する。核酸分子は、レシピエント被験体中に直接導入（例えば、注射、吸入、経口投与、鼻腔内投与および粘膜投与などによる）され得るか、または宿主から取り出された細胞中にエキソビボ導入され得る。後者の場合に、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、免疫応答が、この核酸分子によってコードされる抗原に対して生じ得る。
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、目的のＤＮＡを宿主細胞に正確に挿入する方法またはシステムをいう。このような方法は、組みこまれていない移入ＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または移入遺伝子物質の宿主細胞ゲノムＤＮＡ中への組みこみを生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫化に用いる場合、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと呼ばれ得る。
「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、抗体を産生しないリンパ球であり、免疫系の細胞性媒介アームの一部を構成する。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺に遊走する未成熟なリンパ球から生じ、これらは、胸腺ホルモンの指令のもとで成熟過程を経ていく。ここで成熟リンパ球は、急速に分裂して、非常に多数に増加する。成熟しているＴ細胞は、特定の抗原を認識および結合する能力に基づいて、免疫応答性になる。抗原がリンパ球表面レセプター結合した場合、免疫応答性Ｔ細胞の活性化は、誘発される。
用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡの、細胞による取り込みをいうために使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は、「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術は、当該分野で一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を、適切な宿主細胞中に導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方をいい、そしてペプチド結合ＤＮＡまたは抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。
「ベクター」は、遺伝配列を、標的細胞へ移入し得る（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子性キャリアおよびリポソーム）。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子発現を指向し得る任意の核酸構築物を意味し、これらは、遺伝子配列を、標的細胞に移入し得る。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の標的細胞への移入は、正常細胞に対して比較的無毒である化合物または組成物に対して、細胞を感受性にする。Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７。自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（５）：５６７−５７３）および細菌性酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：７１３−７２０）である。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的無毒のプロドラッグであるガンシクロビル（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１）、シトシンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシトシン（細菌性シトシンデアミナーゼ）の影響に対し、感受性にされる。Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１５５０−１５５２，Ｈｕｂｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８３０２−８３０６。
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、遺伝子移入ベクターに含まれるヌクレオチド配列をいい、これらは治療的活性を持たないが、むしろ遺伝子移入ベクターの、より単純な調製、製造、特徴づけまたは試験を可能にするために含まれる。
「特異的結合因子」とは、分子の特異的結合対のメンバーをいい、ここでこれらの分子の１つは、第２の分子に対し、化学的および／または物理的手段を介して、特異的に結合する。特異的結合因子の１つの例は、選択された抗原に対して指向された抗体である。
「被験体」とは、脊椎動物の亜門のいずれかのメンバー（ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、マカク、チンパンジーおよび他の類人猿、ならびに猿種など）を含む）；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭向けの哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む）；鳥（家庭向けの鳥、野生の鳥および狩猟鳥を含む（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥、アヒル、ダチョウなど））を含むが、これらに限定されない）を意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体および新生仔の個体の両方が意図され、含まれる。これら全ての脊椎動物の免疫系は、同様に機能するので、上記の系は、上記脊椎動物種のいずれかにおける使用が意図される。
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、生物学的にもそれ以外でも所望される物質を意味する。すなわち、この物質は、処方物または組成物で個体に投与され得て、任意の所望されない生物学的影響を引き起こすことも、有害な様式で、含まれる組成物成分のいずれかと相互作用することもない。
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲にあるｐＨ」とは、約７．０〜８．０に含まれる範囲にあるｐＨを意味し、より典型的には、約７．２〜７．６に含まれる範囲にある。
本明細書で使用される場合、「処置」とは、以下のいずれかをいう：（ｉ）従来のワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の軽減または除去、および（ｉｉｉ）該当する病原体の実質的除去または完全な除去。処置は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）もたらされ得る。
「同時投与」とは、１つより多い組成物または分子の投与を意味する。従って、同時投与は、同じ投与経路または異なる投与経路を介した、同時投与または連続投与（任意の順番で）を含む。同時投与レジメンの非限定的な例としては、核酸およびペプチドの同時投与；異なる核酸（例えば、本明細書に記載されるような異なる発現カセットおよび／または異なる遺伝子送達ベクター）の同時投与；および異なるポリペプチドの同時投与（例えば、異なるＨＩＶポリペプチドおよび／または異なるアジュバント）が挙げられる。この用語はまた、同時投与される分子または組成物のうちの１つを複数回投与することを含む（例えば、本明細書に記載される１つ以上の発現カセットの複数回投与後の、ポリペプチド含有組成物の１回以上の投与）。分子または組成物が連続して送達される場合に、各投与間の時間は、本明細書の教示を考慮することで、当業者により容易に決定され得る。
「レンチウイルスベクター」および「組換えレンチウイルスベクター」とは、目的の核酸分子を運ぶ核酸構築物をいい、そして特定の実施形態において、目的の核酸分子の発現を指向し得る。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント、または遺伝子発現を他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、メッセンジャーの翻訳後修飾またはタンパク質の転写後修飾）により制御する他のエレメントを含む。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲＳ）またはその一部、ならびに使用するレトロウイルスに適した正および負のプライマー鎖結合部位を（これらがまだ、レトロウイルスベクターに存在していない場合）含まなければならない。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー（例えば、Ｎｅｏ、ＴＫ、ハイグロマイシン、プレオマイシン、ヒスチジノールまたはＤＨＦＲ）、ならびに１つ以上の制限酵素認識部位および翻訳終結配列を含み得る。例として、このようなベクターは、典型的に、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。
「レンチウイルスベクター粒子」とは、本発明の範囲内で使用される場合、少なくとも１つの目的の遺伝子を保持するレンチウイルスをいう。このレトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。この組換えレンチウイルスは、その遺伝物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに逆転写し得、そして感染の際にこの遺伝物質を宿主細胞のＤＮＡに組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、両性（ａｍｐｈｏ）エンベロープまたはＶＳＶ−Ｇエンベロープ）またはキメラエンベロープを有し得る。
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る構築物をいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の制御エレメントも同様に存在し得る。本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、細菌複製起点、１以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、マルチクローニング部位および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウイルスベクターを欠く感染性組換えレトロウイルスの産生のために必要なエレメントを含む細胞をいう。代表的には、このようなパッケージング細胞は、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をコードする、タンパク質を発現し得る１以上の発現カセットを含む。
「プロデューサー細胞」または「ベクター産生細胞」とは、組換えレトロウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。
（２．本発明を実行する様式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスパラメーターに限定されず、このようなものは、当然変動し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。
本明細書中に記載の方法および材料に類似するかまたは等価である多くの方法および材料が、本発明の実行において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
（２．１．ＨＩＶゲノム）
ＨＩＶゲノムおよび種々のポリペプチドコード領域を、表Ａに示す。ヌクレオチド位置は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（図１；ＨＩＶ Ｃ型単離株）に対して与えられる。しかし、本発明の開示の教示の観点から、例えば、配列比較プログラム（例えば、本明細書中に記載されるＢＬＡＳＴなど）または構造的特徴の同定およびアラインメント（例えば、種々の領域を同定し得る、本明細書中に記載される「ＡＬＢ」プログラムのようなプログラム）を使用して、他のＨＩＶ株または改変体（例えば、単離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４）、種々のサブタイプ由来の他のＨＩＶ−１株（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）、ＨＩＶ−２株および種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（これらおよび他の関連のウイルスの記載について、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ、ＤＭ Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ Ｈｏｗｌｅｙ、編者、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと）中の対応する領域を決定する方法は、当業者に容易に明らかである。
（表Ａ：８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡに関するＨＩＶゲノム領域）
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 当業者が、表Ａに示される任意の配列を整列させて、任意の特定のＨＩＶ遺伝子の相対的な位置を容易に決定し得ることは、容易に明らかである。例えば、本明細書中に記載されるアラインメントプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、他のＨＩＶゲノム配列を、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡと共に整列させて（表Ａ）、遺伝子の位置を決定し得る。ポリペプチド配列も同様に整列し得る。例えば、図２Ａ〜２Ｃは、種々の株由来のＥｎｖポリペプチド配列の、ＳＦ−１６２に対するアラインメントを示す。共有に係るＷＯ／３９３０３に詳細に記載されるように、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）は、βシートを形成する４つのアンチパラレルβ鎖（β−２、β−３、β−２０およびβ−２１）からなる「架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）シート」を含む。１つの対のβ鎖（β−２およびβ−３）からの突出は、２つのループ（Ｖ１およびＶ２）である。ＳＦ−１６２に対して、このβ−２シートは、ほぼアミノ酸残基１１３（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１１７（Ｔｈｒ）を占めるが、β−３は、ほぼアミノ酸残基１９２（Ｓｅｒ）〜アミノ酸残基１９４（Ｉｌｅ）を占める。この「Ｖ１／Ｖ２領域」は、ＳＦ−１６２に対して、ほぼアミノ酸残基１２０（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１８９（Ｃｙｓ）を占める。β鎖の第二の対（β−２０およびβ−２１）からの突出は、「小ループ」構造であり、本明細書中で「架橋シート小ループ」とも称される。小ループおよび架橋シート小ループの両方の位置は、本明細書中およびＷＯ／３９３０３の教示に従って、ＨＸＢ−２に対して決定され得る。図２Ａ〜２Ｃにおいて、矢印によって、βシート領域からの欠失配列のおおよその部位もまた示される。「＊」は、本明細書の教示に従って変異され得るＮ−グリコシル化部位を示す。
（２．２．０ 合成発現カセット）
本発明の１つの局面は、例えば、対応する野生型配列と比較して改善された発現を有する、ＨＩＶ−１コード配列ならびに関連の配列の作製である。
（２．２．１ ＨＩＶ−1核酸コード配列の改変）
本発明の１つの局面は、対応する野生型配列と比較して改善された発現を有する、ＨＩＶ−１コード配列ならびに関連の配列の作製である。
第１に、得られる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用法に互換性があるように、ＨＩＶ−１コドン使用法パターンを改変した。ＨＩＶコドン使用法は、コドントリプレットのヌクレオチドＡまたはＴの高い含量を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用法の効果は、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含量であり、減少した翻訳能力およびｍＲＮＡの不安定性をもたらす。比較すると、高度に発現されるヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。ＨＩＶコード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用法に互換性があるように改変された。
第２に、例えば、Ｇａｇコード配列のコード配列内に位置する、阻害性（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）が存在する。ＲＲＥは、ＨＩＶコードＲｅｖ−タンパク質と相互作用して、ＩＮＳの発現下方調節の影響を克服する二次ＲＮＡ構造である。ＲＲＥおよびＲｅｖの転写後活性化機構を克服するために、不安定性エレメントは、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点変異を導入することによって不活化され得る。
第３に、いくつかの遺伝子に関して、このコード配列は、ポリヌクレオチドコード配列が不活性または非機能的である遺伝子産物（例えば、不活性化ポリメラーゼ遺伝子産物、不活性化プロテアーゼ遺伝子産物、不活性化ｔａｔ遺伝子産物、不活性化ｒｅｖ遺伝子産物、不活性化ｎｅｆ遺伝子産物、不活性化ｖｉｆ遺伝子産物、不活性化ｖｐｒ遺伝子産物、および／または不活性化ｖｐｕ遺伝子産物）をコードするように変更される。実施例１は、いくつかの例示的な変異を記載する。実施例８は、変異Ｔａｔ抗原、変異Ｒｅｖ抗原および変異Ｎｅｆ抗原の機能的な分析に関する情報を示す。
合成コード配列は、例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）のような企業による、当該分野で公知の方法によって構築される。
Ｇａｇポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されない）の野生型コード配列に対して改善された発現を生じる。
Ｇａｇ含有ポリペプチドをコードするいくつかの例示的なポリヌクレオチド配列は、ｇａｇＣｐｏｌＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂ、ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂ、ＧａｇＴａｔＲｅｖＮｅｆ．Ｏｐｔ＿Ｂ、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃ、ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃ、ＧａｇＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃ、およびＧａｇＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃである。
同様に、本発明はまた、合成Ｅｎｖコードポリヌクレオチドおよび改変Ｅｎｖタンパク質（例えば、ＷＯ ００／３９３０３、ＷＯ ００／３９３０２、ＷＯ ００／３９３０４、ＷＯ ０２／０４４９３に記載されるもの）を含む。
得られた核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵されるように、Ｅｎｖのコドン使用法パターンを、Ｇａｇに関して上述したように改変した。本発明の支持において実施された実施例は、合成Ｅｎｖ配列が、天然のＥｎｖ配列と比較して高いレベルのタンパク質を産生し得ることを示す。
Ｅｎｖポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されない）の野生型コード配列と比較して改善された発現を生じる。類似のＥｎｖポリペプチドコード配列（Ｇａｇについて上述したものを含む）が、種々の単離物からの改善された発現について得られ、改変され、そして試験され得る。
Ｅｎｖのさらなる改変としては、その中に変異および／または欠失を有するＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成することが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、超可変領域（Ｖ１および／またはＶ２）は、本明細書中に記載されるように欠失され得る。さらに、例えば、Ｅｎｖ内の架橋シート領域および／またはＮ−グリコシル化部位に対する他の改変はまた、本明細書の教示に従って実施され得る。（図２Ａ〜Ｃ、ならびにＷＯ ００／３９３０３、ＷＯ ００／３９３０２、ＷＯ ００／３９３０４、ＷＯ ０２／０４４９３を参照のこと）。これらの改変の種々の組み合わせを使用して、本明細書中に記載されるような合成発現カセットを作製し得る。
本発明はまた、合成Ｐｏｌ配列を含む発現カセットを含む。上記のように、「Ｐｏｌ」としては、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素および／またはインテグラーゼを含有する配列を含むタンパク質−コード領域が挙げられるが、これらに限定されない（Ｗａｎら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：５６９〜５７３；Ｋｏｈｌら（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：４６８６〜４６９０；Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４３９３〜４３９７；Ｃｏｆｆｉｎ，「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４３７〜１５００頁（Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｐａｔｅｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：５３５１〜５３６３）。従って、本明細書中に例示される合成発現カセットは、１以上のこれらの領域、および生じるアミノ酸配列に対する１以上の変化を含む。Ｐｏｌ誘導体化ポリペプチドをコードする、いくつかの例示的なポリヌクレオチド配列は、表Ｃに示される。
生じる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵するように、Ｐｏｌのコドン使用法パターンを、ＧａｇおよびＥｎｖに関して上述したように改変した。
構築物は、種々の方法で改変され得る。例えば、この発現構築物は、インテグラーゼポリペプチドの最初の６アミノ酸をコードする配列を含み得る。この６アミノ酸領域は、ＨＩＶプロテアーゼによって認識される切断認識部位を提供すると考えられる（例えば、ＭｃＣｏｒｎａｃｋら（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ ４１４：８４〜８８を参照のこと）。構築物は、１つ以上の導入遺伝子の挿入のための、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を、代表的にはこの構築物の３’末端に含み得る。さらに、ＲＴにおいて触媒中心から誘導された触媒中心エピトープをコードするカセットは、代表的に、インテグラーゼの６アミノ酸をコードする配列を３’末端に含んだ。このカセットは、ＲＴのＩｌｅ１７８〜セリン１９１をコードし、そしてこの十分に保存された領域を、可能なＣＴＬエピトープとして維持するために添加され得る。さらに、これらの構築物は、リーディングフレームを保存する挿入変位を含む（例えば、Ｐａｒｋら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５１１１を参照のこと）。
特定の実施形態において、ＲＴの触媒中心および／またはプライマーグリップ領域が、改変される。ＲＴの触媒中心およびプライマーグリップ領域は、例えば、Ｐａｔｅｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：５３５１およびＰａｌａｎｉａｐｐａｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１１５７に記載されている。例えば、ｐ６６ＲＴの１８３位〜１８５位（ＡＦ１１０９７５に対して番号付けられた）においてアミノ酸ＹＭＤＤをコードする野生型配列は、アミノ酸「ＡＰ」をコードする配列と置換され得る。さらに、プライマーグリップ領域（アミノ酸ＷＭＧＹ、ｐ６６ＲＴの残基２２９〜２３２（ＡＦ１１０９７５に対して番号付けられた））が、アミノ酸「ＰＩ」をコードする配列で置換され得る。
Ｐｏｌ配列に対して、コドン使用法の変化は、代表的に、−１までのフレームシフトの領域に制限されており、そして再度、Ｇａｇリーディングフレームの末端において開始する；しかし、フレームシフト翻訳領域内の領域も同様に改変され得る。最後に、プロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に位置する阻害（すなわち、不安定性）エレメント（ＩＮＳ）も同様に、変更され得る。
本発明の支持によって実験を実施して、合成Ｐｏｌ配列がネイティブＰｏｌ配列と比較してより高レベルのタンパク質を産生し得たことを示し得る。Ｐｏｌポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されない）において、野生型コード配列と比較して、改善された発現を生じる。類似のＰｏｌポリペプチドコード配列（ＧａｇおよびＥｎｖに関して上記したものを含む）が、得られ、改変され、そして種々の単離物からの改善された発現について試験され得る。
本発明はまた、Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＰｏｌ以外のＨＩＶ遺伝子由来の合成配列を含有する、発現カセットを含み、これらには、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ内の領域、ならびにｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、およびｖｐｕが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドを含む合成ポリヌクレオチドおよび／または発現カセットを含み、ここで、この抗原性ペプチドは、少なくとも２つの異なるＨＩＶ型（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｏ型など）から選択される。本発明の合成ポリヌクレオチド配列（Ｂ型抗原を含むポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、およびＣ型抗原を含むポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む）は、例えば、以下の配列から選択され得る：
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 このような配列は、例えば、それらの全体、または特定のエピトープをコードする配列において用いられ得るか、あるいは抗原が、本明細書の教示および当該分野で公知の情報に従って、合成コード配列から選択され得る。例えば、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列は、全長配列内に抗原性ペプチドフラグメントを予想するためにコンピューター分析に供され得る。次いで、対応するポリヌクレオチドコードフラグメントは、本発明の構築物において用いられ得る。このような分析に有用な例示的アルゴリズムは、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
（ＡＭＰＨＩ）このプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予想するために用いられている（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ補遺１１：９）。ＡＭＰＨＩアルゴリズムは、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎパッケージにおいて利用可能である。
（ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＩＮＤＥＸ）このアルゴリズムは、抗原性決定因子を予想するのに有用である（ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９９８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１８１：１８６；Ｓｈｅｒｍａｎ，ＫＥら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９６年４月；２３（４）：６８８−９４；Ｋａｓｔｕｒｉ，ＫＮら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９５年３月１；１８１（３）：１０２７−３６；ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ Ｖら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４年１０月；３１（１５）：１１３３−４０；Ｆｅｒｒｏｎｉ Ｐら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９３年６月；３１（６）：１５８６−９１；Ｂｅａｔｔｉｅ Ｊら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９２年１１月１５日；２１０（１）：５９−６６；Ｊｏｎｅｓ ＧＬら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ １９９１年９月；４８（１）：１−９）。
（ＨＹＤＲＯＰＨＩＬＩＣＩＴＹ）アミノ酸配列からの抗原性決定因子を決定するために有用な１つのアルゴリズムが、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（１９８１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８により開示された。
上記のアルゴリズムのデフォルトパラメーターを使用して、抗原部位を決定し得る。さらに、上記の分析の２つ以上の結果を合わせて、特に好ましいフラグメントを同定し得る。
他の株から得られた配列を、本明細書の開示に従う類似の様式で、操作し得る。上記のように、生じる核酸コード配列が、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されたコドン使用頻度に匹敵するように、Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＰｏｌに関して上述したように、コドン使用頻度パターンを改変する。代表的に、これらの合成配列は、ネイティブ配列と比較してより高レベルにタンパク質を産生し得、そして野生型ポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されない）の野生型コード配列と比較して改善された発現を生じる。さらに、核酸配列もまた改変されて、遺伝子の１つ以上の領域に変異を導入し得、例えば、遺伝子産物の機能を変更し得（例えば、その遺伝子産物を非機能的にし得る）、そして／または改変部位（例えば、Ｎｅｆにおけるミリストイル化部位）を除去し得る。
Ｂ型抗原を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリペプチド、およびＣ型抗原を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、合成発現カセットは、例えば、以下を含むがこれらに限定されない、本明細書中に例示されるＨＩＶ Ｂ型コード配列およびＨＩＶ Ｃ型コード配列由来であり得る：
Figure 0004302513
 Ｇａｇ−完全（Ｇａｇ−ｃｏｍｐｌｅｔｅ）は、例えば、Ｇａｇおよびｐｏｌを含むインフレームポリタンパク質をいい、ここで、Ｇａｇのｐ６位が存在する。
本発明のいくつかの局面において使用され得る、さらなる配列は、ＷＯ ００／３９３０２、ＷＯ ００／３９３０３、ＷＯ ００／３９３０４、ＷＯ ０２／０４４９３に記載されている。
（２．２．２ ＨＩＶ核酸コード配列を含む配列のさらなる改変）
本明細書中に記載される、ＨＩＶポリペプチドコード発現カセットはまた、例えば、１つ以上の導入遺伝子をコードする、１つ以上のさらなる配列を含み得る。本発明の実施において有用なさらなる配列（例えば、導入遺伝子）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：さらなるウイルスエピトープ／抗原｛ＨＣＶ抗原（例えば、Ｅ１、Ｅ２；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら、米国特許第５，７１４，５９６号（１９９８年２月３日発行）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら、米国特許第５，７１２，０８８号（１９９８年１月２７日発行）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら、米国特許第５，６８３，８６４号（１９９７年１１月４日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７２８，５２０号（１９９８年３月１７日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７６６，８４５号（１９９８年６月１６日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，６７０，１５２号（１９９７年９月２３日発行））、ＨＩＶ抗原（例えば、１以上のＨＩＶ単離物由来のもの）を含むがこれらに限定されない｝をコードするさらなる配列；および腫瘍抗原／エピトープをコードする配列。さらなる配列はまた、非ウイルス供給源に由来し得る（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１Ｉ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびｆｌｔ３リガンドのようなサイトカイン（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のようないくつかの販売元から市販されている）をコードする配列）。さらなる配列は、以下に記載されている。また、Ｇａｇおよび他のコード配列の、互いに対する向きのバリエーションは、以下に記載されている。
ＨＩＶポリペプチドコード配列は、他のＨＩＶ単離物から得られ得る。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ，１９９７，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。合成発現カセットは、このようなコード配列を出発物質として使用して、本明細書の教示に従って、作製され得る。
さらに、本発明の合成発現カセットは、本明細書中に開示される合成発現カセット配列によってコードされるポリペプチドに対して、８５％より大きい配列同一性、好ましくは９０％より大きい配列同一性、より好ましくは９５％より大きい配列同一性、そして最も好ましくは９８％より大きい配列同一性を有する、関連するポリペプチド配列を含む。
例示の発現カセットおよび改変体は、実施例１に記載される。
（２．２．３ ＨＩＶ−１ポリペプチドおよび関連するポリペプチドをコードする、合成配列の発現）
本発明の合成ＨＩＶコード配列（発現カセット）は、発現のレベルを評価するため、およびＧａｇ含有構築物の場合には、ＶＬＰの産生を評価するために、多数の異なる発現ベクターにクローニングされ得る。ＨＩＶポリペプチドに対する合成ＤＮＡフラグメントは、真核生物発現ベクター（一過性発現ベクター、ＣＭＶプロモーターに基づく哺乳動物ベクター、およびバキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクターが挙げられる）にクローニングされ得る。対応する野生型配列もまた、同じベクターにクローニングされ得る。
次いで、これらのベクターは、いくつかの異なる細胞型（種々の哺乳動物細胞株（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能な細胞株である、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ）が挙げられる）にトランスフェクトされ得る。次いで、細胞株は、適切な条件下で培養され、そして任意の適切なポリペプチド産物のレベルが、上清中で評価され得る（表Ａを参照のこと）。例えば、ｐ２４は、Ｇａｇ発現を評価するために使用され得る；ｇｐ１６０、ｇｐ１４０またはｇｐ１２０は、Ｅｎｖ発現を評価するために使用され得る；ｐ６ｐｏｌは、Ｐｏｌ発現を評価するために使用され得る；ｐｒｏｔは、プロテアーゼを評価するために使用され得る；ｐ１５は、ＲＮＡｓｅＨを評価するために使用され得る；ｐ３１は、インテグラーゼを評価するために使用され得る；そして他の適切なポリペプチドは、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｕおよびＮｅｆを評価するために使用され得る。さらに、改変されたポリペプチドがまた使用され得、例えば、他のＥｎｖポリペプチドとしては、例えば、ネイティブｇｐ１６０、オリゴマーｇｐ１４０、モノマーｇｐ１２０、ならびにこれらのポリペプチドの改変配列および／または合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイの結果は、合成ＨＩＶポリペプチドコード配列の発現が、対応する野生型配列より有意に高いことを実証する。
さらに、ウエスタンブロット分析を使用して、合成発現カセットを含む細胞が、ネイティブ発現カセットを含む細胞より高い細胞あたりの濃度で、予測されたタンパク質を産生することを示し得る。ＨＩＶタンパク質は、細胞溶解物と上清との両方において見られ得る。本発明の合成発現カセットでトランスフェクトされた細胞については、産生のレベルは、細胞上清において有意により高い。
合成発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清画分を使用して、これらのカセットが、野生型配列と比較して、ＨＩＶタンパク質の優れた産生（そしてＧａｇの場合には、ＶＬＰの産生）を提供することを示し得る。
これらのＨＩＶ含有ポリペプチドの、哺乳動物細胞株における効率的な発現は、以下の利点を提供する：ポリペプチドは、バキュロウイルス夾雑物を含まない；ＦＤＡによって認可された、確立された方法による産生；増加した純度；より高い収率（ネイティブコード配列と比較して）；およびＣＨＯ細胞におけるＳｕｂ ＨＩＶ含有ポリペプチドの産生（これは、本発明の構築物を使用して得られる増加した発現の非存在下では実行不可能である）の新規方法。例示的な哺乳動物細胞株としては、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、およびＣＥＭＸ１７４（このような細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の合成Ｇａｇ発現カセットはまた、昆虫細胞にトランスフェクトされる場合に、高レベルの発現およびＶＬＰ産生を示す。本明細書中に記載される合成発現カセットはまた、昆虫細胞において高レベルの発現を示す。さらに、より高い全タンパク質収率に加えて、合成ポリペプチドからの最終生成物は、一貫して、ネイティブの配列からの最終生成物より低い量の夾雑バキュロウイルスタンパク質を含む。
さらに、本発明の合成発現カセットはまた、酵母ベクターに導入され得、このベクターは次に、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許発明第３５，７４９号（１９９８年３月１７日発行）に記載されるようなベクターを使用する）に形質転換され得、そしてそのような酵母細胞によって効率的に発現され得る。
哺乳動物ベクターおよび昆虫ベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは、選択された発現制御エレメントを使用して、種々の発現ベクターに組み込まれ得る。任意の所定の細胞に適切なベクターおよび制御エレメントは、本明細書の教示、および発現ベクターについて当該分野において公知の情報を考慮して、当業者によって選択され得る。
例えば、合成発現カセットは、所望のコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクターに挿入され得、これによって、選択された細胞型における遺伝子の発現が可能となる。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーターはイントロンＡを含み得る））、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ｌｔｒ）、アデノウイルスの主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター）もまた、哺乳動物発現のために用途を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終止コドンに対して３’に位置する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列もまた存在し、コード配列に対して５’に位置する。転写終結シグナル／ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載されるようなＳＶ４０由来のシグナル、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。スプライスドナー部位およびアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明と共に使用するための構築物中に設計され得る（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
エンハンサーエレメントもまた、本明細書中において使用されて、哺乳動物構築物の発現レベルを増加させ得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるようなヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６））が挙げられる。
所望の合成ポリペプチドをコードする配列は、多数の市販のベクターにクローニングされて、このポリペプチドの、適切な宿主系における発現を生じさせ得る。これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バキュロウイルス発現｛Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．ら，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）｝、ワクシニア発現｛Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編），Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら，米国特許第５，１３５，８５５号（１９９２年８月４日発行）｝、細菌における発現｛Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ｝、酵母における発現｛Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許発明第３５，７４９号（１９９８年３月１７日発行）；Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号（１９９７年５月１３日発行）；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．ら，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら，Ｙｅａｓｔ ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．，およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１）｝、哺乳動物細胞における発現｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，５３７−５６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（１９９１）｝、および植物細胞における発現｛植物クローニングベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｈｏｏｄ，Ｅ．ら，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ，Ｒ．ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎら，「Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、およびＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：１−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．ら，２４９−２６５頁における他のもの、ならびにＰｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．ら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９７における他のもの｝。
本発明にはまた、コード配列、および適切な宿主におけるコード領域の発現を可能にする発現制御エレメントを含む発現ベクターが含まれる。これらの制御エレメントは、一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終止配列および転写終結配列、ならびにベクターに挿入物を導入するための挿入部位を含む。翻訳制御エレメントは、Ｍ．Ｋｏｚａｋによって概説されている（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ７（８）：５６３−５７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７６（９）：８１５−８２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，およびＳｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ６０：３６０−３７５，１９７９）。
酵母系における発現は、工業的生産の利点を有する。ワクシニアおよびＣＨＯ細胞株による組換えタンパク質の産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルスの発現は、以下を含むいくつかの利点を有する：（ｉ）その広範な宿主範囲；（ｉｉ）組換えタンパク質の正確な転写後修飾、プロセシング、折り畳み、輸送、分泌およびアセンブリ；（ｉｉｉ）比較的可溶性の組換えタンパク質の高レベルな発現；ならびに（ｉｖ）外来ＤＮＡに適合する大きな能力。
合成ＨＩＶポリペプチドをコードする発現カセットから組換え的に発現されたポリペプチドは、典型的に、溶解された細胞および培養培地から単離される。精製は、当該分野で公知の方法（塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分画およびアフィニティークロマトグラフィーを含む）によって、実施され得る。免疫親和性クロマトグラフィーは、例えば、ＨＩＶ抗原に基づいて作製された抗体を使用して、用いられ得る。
哺乳動物細胞を使用して本発明のタンパク質を発現させる利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：産生のスケールアップのための十分に確立されたプロトコル；ＶＬＰを生成する能力；細胞株が優良製造プロセス（ＧＭＰ）基準を満たすように適合されること；哺乳動物細胞の培養条件が当該分野で公知であること。
合成ＨＩＶ１ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されており、例えば、図を参照のこと。本明細書中に記載される本発明の異なる実施形態の様々な形態は、組み合わされてもよい。
例示的な発現アッセイが実施例２に記載される。ウエスタンブロット分析についての例示的な条件は、実施例３に示される。
（２．３．０ ウイルス様粒子の生成およびパッケージング細胞株を作製するための本発明の構築物の使用）
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の群特異的抗原（Ｇａｇ）は、発芽によって種々の真核生物細胞から放出される非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己構築する（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：１−１５，１９９８による総説）。本発明のＧａｇ含有合成発現カセットは、種々の異なる細胞型（哺乳動物細胞が挙げられるが、これに限定されない）を使用するＨＩＶ−Ｇａｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成を提供する。
ウイルス粒子は、宿主の免疫系に対する、この粒子に捕捉または結合された抗原の適切な提示のためのマトリクスとして、使用され得る。
（２．３．１ 本発明の合成発現カセットを使用するＶＬＰ生成）
本発明のＧａｇ含有合成発現カセットは、ネイティブのＧａｇコード配列と比較して、Ｇａｇタンパク質およびＶＬＰの両方の優れた生成を提供し得る。さらに、ＶＬＰ生成の電子顕微鏡評価を使用して、推定サイズの遊離の発芽している未成熟ウイルス粒子は、この合成発現カセットを含む細胞によって生成されることが示され得る。
ウイルス様粒子の生成のために、ネイティブのＧａｇコード配列ではなく、本発明の合成発現カセットを使用することは、いくつかの利点を提供する。第１に、ＶＬＰは、増大した量で生成され得、これによりこのＶＬＰの単離および精製がより容易になり得る。第２に、ＶＬＰは、この合成発現カセットを使用して種々の細胞型で生成され得、特に、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ＶＬＰ生成のために使用され得る。ＣＨＯ細胞を使用する生成は、以下を提供する：（ｉ）ＶＬＰ形成；（ｉｉ）正確なミリストイル化および発芽；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞混入物（例えば、昆虫ウイルスおよび／または細胞）の非存在；および（ｉｖ）精製の容易さ。本発明の合成発現カセットはまた、哺乳動物細胞株以外の細胞型における発現を増大するために有用である。例えば、この合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクターで昆虫細胞を感染することにより、高レベルのＧａｇタンパク質の全収率およびより高いレベルのＶＬＰ生成が生じる（野生型コード配列と比較して）。さらに、バキュロウイルスＧａｇ合成発現カセットに感染した昆虫由来の最終産物は、野生型コード配列を使用した場合の最終産物より少ない量の混入昆虫タンパク質を一貫して含む。
ＶＬＰは、目的の粒子形成ポリペプチドが適切な宿主細胞において組換え発現される場合に、自然に形成され得る。従って、本発明の合成発現カセットを使用して生成されるＶＬＰは、組換え技術を使用して簡便に調製される。下記のように、本発明のＧａｇポリペプチドコード合成発現カセットは、目的の他のポリペプチドコード配列（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶポリメラーゼ、Ｅｎｖ；合成Ｅｎｖ）を含み得る。このような合成発現カセットの発現は、Ｇａｇポリペプチドを含むＶＬＰならびに目的のポリペプチドを生じる。
一旦、所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列が単離または合成されると、これらのコード配列は、発現に適切な任意のベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが、当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択が可能である。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。次いで、このベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。適切な組換え発現系としては、細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）ウイルス）発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系およびゼノプス発現系が挙げられるが、これらに限定されず、これらは当該分野で周知である。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株系、ワクシニア系、シンドビス系、真核生物に移植した（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始系(例えば、米国特許第６，０１５，６８６号、米国特許第５，８１４，４８２号、米国特許第６，０１５，６９４号、同第５，７８９，２４５、ＥＰ １０２９０６８Ａ２、ＷＯ ９９１８２２６Ａ２／Ａ３、ＥＰ ００９０７７４６Ａ２、ＷＯ ９７３８０８７Ａ２）、昆虫系、および酵母系である。
本発明の発現カセットについての合成ＤＮＡフラグメント（例えば、Ｐｏｌ、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒおよび／またはＶｐｕ）は、以下の真核生物発現ベクター中にクローニングされ得る：一過性発現アッセイおよびＤＮＡ免疫研究のためのｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサー、およびイントロンＡを含み、その後ろに以下に記載される合成配列のための挿入部位を含み、その後ろにウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターと、ポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されてｐＣＭＶ−ｌｉｎｋが作製されるという点でのみ異なる；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ；およびｐＡｃＣ１３、バキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクター（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２、１９９０に記載されるｐＡｃＣ１２に由来する）。
簡単に述べると、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒの構築は、以下の通りである。
ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に挿入し、ｐＥＴ−ＥＭＣＶを獲得した。ｄｈｆｒ遺伝子を、ｐＥＳＮ２ｄｈｒｆからＰＣＲ増幅して翻訳終止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を獲得し、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨ１フラグメントとして挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを獲得した。次に、希釈したｎｅｏ遺伝子をｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの特有のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）を獲得した。最後に、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺伝子の下流に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔを獲得した。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔの切断により調製した。
１つのベクター構築物において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびイントロンＡを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）からＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に移した。Ｎｄｅ１部位からＳａ１部位まで、ｐＵＣ１９のベクター骨格を欠失させた。上記のＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが、ＣＭＶプロモーターの後にくるように、この構築物に加えた。このベクターはまた、ａｍｐｒ遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
多数の哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死化細胞株を含み、この不死化細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）は、本発明の発現構築物を用いる用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用するための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ．が挙げられる。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
ウイルスベクター（例えば、ポックスファミリーのウイルス（ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む）由来のベクター）は、真核生物細胞における粒子の生成のために使用され得る。さらに、ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系はまた、Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載されるように、本発明を伴う用途を見出す。この系において、細胞を、始めに、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体で、インビトロで感染させる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを保有するテンプレートを転写するのみであるという点で、優れた特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターにより駆動される目的のＤＮＡでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されるポリメラーゼは、このトランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。あるいは、Ｔ７は、精製タンパク質として添加され得るか、または「前駆体」系の場合には酵素として添加される（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０）。この方法は、多量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルの一過性の細胞質生成を提供する。
選択された発現系および宿主に依存して、ＶＬＰは、粒子形成ポリペプチドが発現されてＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖することにより生成される。適切な増殖条件の選択は、当業者の範囲内である。ＶＬＰが細胞内で形成される場合、この細胞は、細胞を溶解するがＶＬＰを実質的にインタクトなまま保つ、化学的手段、物理的手段または機械的手段を使用して破壊される。このような方法は、当業者に公知であり、そして例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）に記載される。
次いで、この粒子は、それらの完全性を保存する方法（例えば、勾配遠心分離（例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）スクロース勾配、ペレット化など））（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−６９３６を参照のこと）、ならびに標準的な精製技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーが挙げられる）を使用して、単離される（または実質的に精製される）。
本発明の合成発現カセットを含む細胞により生成されるＶＬＰは、被験体に投与された場合に免疫応答を引き起こすために、使用され得る。本発明の１つの利点は、ＶＬＰが、以前には不可能であったレベルで、合成発現カセットを有する哺乳動物細胞により生成され得るということである。上記のように、このＶＬＰは、Ｇａｇポリペプチド（例えば、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｅｎｖ、合成Ｅｎｖなど）に加えて、種々の抗原を含み得る。本発明の合成発現カセットを使用して生成される、精製ＶＬＰは、通常はワクチン組成物の形態で、脊椎動物被験体に投与され得る。組み合わせワクチンもまた使用され得、ここで、このようなワクチンは、例えば、アジュバントサブユニットタンパク質（例えば、Ｅｎｖ）を含む。投与は、単独で処方されたＶＬＰまたは他の抗原と共に処方されたＶＬＰを使用して、行われ得る。さらに、このＶＬＰは、ＤＮＡ免疫（以下を参照のこと）および／または他のワクチンの送達のための合成発現カセットの送達の前か、これと同時か、またはこれに続いて投与され得る。また、ＶＬＰ投与の部位は、投与されている他のワクチン組成物と同じであっても異なっていてもよい。遺伝子送達は、多数の方法によって達成され得、この方法としては、ＤＮＡ、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターでの免疫が挙げられるが、これらに限定されない。
ＶＬＰ免疫刺激（または、ワクチン）組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を開始するのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、慣用的な試験により決定され得る比較的広い範囲内に含まれ、一般に、約０．１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約１μｇ〜約３００μｇの程度のＶＬＰ／抗原の量である。
キャリアが必要に応じて存在し、ここでこのキャリアは、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の生成をそれ自体は引き起こさない分子である。適切なキャリアは、典型的には、ゆっくりと代謝される大きな高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性なウイルス粒子）である。粒子性キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）から誘導される微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激因子（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、テタヌス、コレラなど由来の毒素）、およびＥ．ｃｏｌｉ由来の毒素に結合され得る。
アジュバントはまた、組成物の効力を増大するために使用され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激因子を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）（これは５％ スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％ Ｓｐａｎ ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む（以下を参照のこと）が、必要ではない）、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に処方される）、（ｂ）ＳＡＦ（これは、１０％ スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％ プルロニックブロックポリマー（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ）Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含み、サブミクロンエマルジョンに微小流体化されるか、または大きな粒子サイズのエマルジョンを作製するためにボルテックスされるかのいずれかである）、および（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（これは２％ スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む））；（３）ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、またはこれから作製された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が使用され得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）免疫刺激性ＣｐＧモチーフをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリマー分子（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：８７０−８７６，１９９８；Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２−３５４，１９９６）、または抗原／オリゴヌクレオチドの複合体｛ポリマー分子は、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、それらの骨格修飾（例えば、メチルホスホネート結合）を含む；あるいは（７）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）もしくはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここでリジンが、６３位の野生型アミノ酸と置換される）、ＬＴ−Ｒ７２（ここでアルギニンが、７２位の野生型アミノ酸と置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンが、１０９位の野生型アミノ酸と置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンが、９位の野生型アミノ酸と置換され、グリシンが１２９位で置換される））の無毒化変異体（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；および（８）免疫刺激因子として働き、組成物の効力を増大する他の物質。さらに、このようなポリマー分子は、代替のポリマー骨格構造（例えば、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０４：３９，１９７０ａ；Ｐｉｔｈａ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，９：９６５，１９７０ｂ）、およびモルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１４２，０４７号、０８／２５／９２発行；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１８５，４４４号、０２／０９／９３発行）（これらに限定されない））を含む。種々の他の電荷および無電荷のポリヌクレオチドアナログが報告されている。多数の骨格修飾が当該分野で公知であり、この修飾には、無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデートおよびカルバメート）および電荷結合（例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）が挙げられるが、これらに限定されない。｝；ならびに（７）免疫刺激因子として働いてＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物の効力を増大する他の物質。ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＭＦ５９が好ましい。
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＶＬＰ組成物を用いる投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の一次過程に、１〜１０の別個の用量が用いられ、続いて他の用量が後の時間間隔（これは、免疫応答を維持および／または強化するように選択される、例えば、第２の用量について１〜４ヶ月）で与えられ、そして必要に応じて、数ヶ月後に引き続く用量（単数または複数）が与えられる、スケジュールである。投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、被験体の要求によって決定され、そしてこれは、医師の判断に依存する。
疾患の予防が所望される場合、抗原保有ＶＬＰは一般に、目的の病原体の一次感染の前に投与される。処置（例えば、症状および再発の減少）が所望される場合、ＶＬＰ組成物は一般に、一次感染の後に投与される。
（２．３．２ パッケージング細胞株を作製するための本発明の合成発現カセットの使用）
多数のウイルスベースの系は、哺乳動物宿主細胞に対する遺伝子移入ベクターとして使用するために開発されてきた。例えば、レトロウイルス（特に、レンチウイルスベクター）は、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。目的のコード配列（例えば、遺伝子治療の用途に有用な配列）は、遺伝子送達ベクターに挿入され得、当該分野で公知の技術を使用してレトロウイルス粒子中にパッケージングされる。次いで、組換えウイルスが単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら、（１９９３） Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２；ＧＢ ２２００６５１；ＥＰ ０４１５７３１；ＥＰ ０３４５２４２；ＷＯ ８９／０２４６８；ＷＯ ８９／０５３４９；ＷＯ ８９／０９２７１；ＷＯ ９０／０２８０６；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ ９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；ＷＯ ９３／１１２３０；ＷＯ ９３／１０２１８；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｕ．Ｓ．５，２１９，７４０；Ｕ．Ｓ．４，４０５，７１２；Ｕ．Ｓ．４，８６１，７１９；Ｕ．Ｓ．４，９８０，２８９およびＵ．Ｓ．４，７７７，１２７；米国出願番号０７／８００，９２１；およびＶｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６３４９；ならびにＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １。
他の実施形態において、遺伝子移入ベクターは、サイトカインまたは他の免疫調節性分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブのＩＬ−２およびγ−インターフェロンをコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，７３８，９２７号および同第５，３２６，８５９号に記載される様にして、得られ得、一方、これらのタンパク質の有用なムテインは、米国特許第４，８５３，３３２号に記載されるようにして得られ得る。ｍＣＳＦの短い形態および長い形態をコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，８４７，２０１号および同第４，８７９，２２７号に記載されるようにして得られ得る。本発明の特定の局面において、サイトカインを発現するレトロウイルスベクターまたは免疫調節性遺伝子は、本明細書中（例えば、本発明のパッケージング細胞株を使用する）および国際出願番号ＰＣＴ ＵＳ ９４／０２９５１（表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されるようにして、生成され得る。
本明細書中で使用するために適切な免疫調節性分子の例としては、以下が挙げられる：ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：２９０−２９８，Ｗｅｂｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４および米国特許第４，７３８，９２７号）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：５０３−５１２，Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７１３−７１６および米国特許第５，０１７，６９１）；ＩＬ−５およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１および国際公開番号ＷＯ９０／０６３７０号）；ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｓｕｍｍｅｒ １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；α−インターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら、（１９９１）Ｄｒｕｇｓ ４２：７４９−７６５，米国特許第４，８９２，７４３号および同第４，９６６，８４３号、国際公開番号ＷＯ８５／０２８６２，Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６−３２０，Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４，Ｔｗｕら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２０４６−２０５０，およびＦａｋｔｏｒら、（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら（１９９１）Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００８２０１５，Ｗａｔａｎａｂｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９４５６−９４６０，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：７８２０−７８２５，Ｍａｉｏら、（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２、ならびに米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開番号ＷＯ８５／０４１８８）。
免疫調節性因子はまた、これらの分子に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはリガンドであり得る。例えば、可溶性形態のレセプターは、しばしば、変異形態の因子自体と同様に、これらの型の因子に対するアンタゴニストとして挙動し得る。
上記の基質をコードする核酸分子、および本発明での使用に有利である他の核酸分子は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託所を含む）から、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的供給源から容易に得られ得る。代表的な例としては、ＢＢＧ１２（１２７個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ６（これは、γインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９６５６（これは、ＴＮＦをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号２０６６３（これは，αインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３１９０２、３１９０２および３９５１７（これは、βインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７０２４（これは、インターロイキン１ｂをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６および３９６７３（これは、インターロイキン２をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９９、５９３９８および６７３２６（これは、インターロイキン３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５７５９２（これは、インターロイキン４をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９４および５９３９５（これは、インターロイキン５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７１５３（これは、インターロイキン６をコードする配列を含む）が挙げられる。
サイトカイン遺伝子または免疫調節遺伝子を含むプラスミド（国際公開番号ＷＯ９４／０２９５１およびＷＯ９６／２１０１５）は、適切な制限酵素で消化され得、そして目的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、遺伝子伝達ベクターに挿入され得る。
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこれを含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによって組換え方法を用いて得られ得る。例えば、変更された細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．のような寄託所からまたは商業的供給源から得られ得る。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素で消化され得、そしてこのヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学的技術を使用して遺伝子導入ベクターに挿入され得る。
あるいは、本発明による使用のためのｃＤＮＡ配列は、標準的な技術（例えば、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、配列を発現するか、または含む細胞から得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（ＤＮＡを得るためおよびＤＮＡを単離するために使用される技術の記載）を参照のこと。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡは、オリゴ−ｄＴまたはランダムプライマーを使用して、逆転写酵素で逆転写され得る。次いで、この単鎖ｃＤＮＡは、所望の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅され得る（米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと、またＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと）。
目的のヌクレオチド配列はまた、ＤＮＡ合成器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている））を使用して、クローン化ではなく合成により生成され得る。このヌクレオチド配列は、所望される発現産物の適切なコドンを用いて設計され得る。完全な配列が、標準的な方法によって調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
本発明の合成発現カセットは、レトロウイルスベクターを用いる使用のためのパッケージング細胞株の構築において使用され得る。
１つの型のレトロウイルス、マウスの白血病ウイルス、または「ＭＬＶ」は、遺伝子治療適用のために広範に利用されている（一般に、Ｍａｎｎら（Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９９３）、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９，１９８４）、ならびにＭｉｌｌｅｒら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４，１９９０を参照のこと）。
レンチウイルスベクターは、代表的に、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パーケージングシグナル、１個以上の目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、第２のＤＮＡ鎖合成の起点、および３’レンチウイルスＬＴＲを含み、ここで、このレンチウイルスベクターは、核輸送エレメントを含む。この核輸送エレメントは、目的のコード配列（例えば、本発明の合成Ｇａｇまたは合成Ｅｎｖの発現カセット）の上流（５’）または下流（３’）のいずれかに配置され得る。特定の実施形態において、核輸送エレメントは、ＲＲＥではない。一実施形態において、パッケージングシグナルは、伸長されたパッケージングシグナルである。他の実施形態において、このプロモーターは、組織特異的なプロモーターであるか、あるいはＣＭＶのようなプロモーターである。他の実施形態において、このレンチウイルスベクターは、内部リボソーム導入部位（ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をさらに含む。
広範な種々のレンチウイルスは、本発明の脈絡内で利用され得、例えば、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶからなる群から選択されるレンチウイルスが挙げられる。
本発明のなお別の局面において、宿主細胞（例えば、パッケージング細胞株）（本明細書中に記載される発現カセットのいずれかを含む）が、提供される。例えば、一局面内において、パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列、および核輸送エレメントを含む発現カセットを含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結される。パッケージング細胞株は、プロモーターおよびｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープをコードする配列をさらに含み得、ここで、このプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖをコードする配列、またはこれらのタンパク質の改変バージョンをコードする配列に作動可能に連結される。このパッケージング細胞株は、他のＨＩＶ遺伝子コード配列のいずれか１つ以上をコードする配列をさらに含み得る。
一実施形態において、発現カセット（例えば、合成Ｇａｇポリメラーゼを保有する）は、安定に組み込まれる。このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、代表的に粒子を生成する。この合成発現カセットのプロモーター調節発現は、誘導性であり得る。代表的に、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、複製コンピテントウイルスを本質的に含まない粒子を生成する。
パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子の発現を指向する発現カセットを含むか、または本明細書中に記載される合成Ｅｎｖ遺伝子の発現を指向する発現カセットを含む）が、提供される。（他の改変Ｅｎｖ配列の記載に関して、Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（２）：１４９７−１５０３、１９９８；Ｈａａｓ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）：３１５−３２４、１９９６もまた参照のこと）。レンチウイルスベクターは、ベクター産生細胞株を生成するためにパッケージング細胞株に導入される。
上記のように、レンチウイルスベクターは、目的の選択された遺伝子または配列を保有または発現するように設計され得る。レンチウイルスベクターは、広範の種々のレンチウイルスから容易に構築され得る（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。レンチウイルスの代表的な例としては、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶが挙げられる。このようなレンチウイルスは、患者の単離物から、あるいはより好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託所または収集機関から得られるか、あるいは、利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離されるかのいずれかであり得る。
レンチウイルス遺伝子送達ベクター（またはビヒクル）の部分は、異なるウイルス由来であり得る。例えば、所定の組換えレンチウイルスベクターにおいて、ＬＴＲは、ＨＩＶ、ＳＩＶ由来のパッケージングシグナル、およびＨｒＶ−２由来の第２の鎖合成の起点由来であり得る。レンチウイルスベクター構築物は、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１以上の異種配列、第２のＤＮＡ鎖合成の起点、および３’ＬＴＲを含み得、ここで、このレンチウイルスベクターは、ＲＲＥではない核輸送エレメントを含む。
簡潔には、長い末端反復配列（「ＬＴＲ」）は、Ｕ５、ＲおよびＵ３と命名された３つのエレメントに分けられる。これらのエレメントは、レトロウイルスの生物学的な活性に寄与する種々のシグナルを含み、これには、例えば、Ｕ３内に配置されるプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントが挙げられる。ＬＴＲは、このゲノムのいずれかの末端でのそれらの正確な複製に起因して、プロウイルス（組み込まれたＤＮＡ形態）において容易に同定され得る。本明細書中で使用される場合、５’ＬＴＲは、５’プロモーターエレメントおよび十分なＬＴＲ配列を含み、逆転写およびこのベクターのＤＮＡ形態の組み込みを可能にすることが理解されるべきである。この３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナル、および十分なＬＴＲ配列を含み、逆転写およびこのベクターのＤＮＡ形態の組み込みを可能にすることが理解されるべきである。
ｔＲＮＡ結合部位および第２のＤＮＡ鎖合成の起点はまた、レトロウイルスが生物学的に活性となるのに重要であり、そして当業者によって容易に同定され得る。例えば、レトロウイルスｔＲＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対によってｔＲＮＡ結合部位に結合し、そしてウイルス粒子中にこのレトロウイルスゲノムを運搬する。次いでこのｔＲＮＡは、逆転写酵素によってＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。このｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲからすぐ下流のその位置に基づいて容易に同定され得る。同様に、第２のＤＮＡ鎖合成の起点は、その名前から暗示されるように、レトロウイルスの第２のＤＮＡ鎖合成のために重要である。この領域（この領域は、ポリプリントラクト（ｔｒａｃｔ）とも呼ばれる）は、３’ＬＴＲのすぐ上流に位置する。
５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、および第２のＤＮＡ鎖合成の起点に加えて、組換えレトロウイルスベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、および目的の１つ以上の遺伝子またはコード配列を含み得る。さらに、このレンチウイルスベクターは、核輸送エレメント（好ましい実施形態において、ＲＲＥではない）を有する。適切な核輸送エレメントの代表的な例としては、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｏｇｅｒｔら、Ｊ ＶｉｒｏＬ ７０、３８３４−３８４３、１９９６）、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｌｉｕ ＆ Ｍｅｒｔｚ、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、９、１７６６−１７８９、１９９５）およびシミアンレトロウイルスＩ型のゲノムのエレメント（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６８、７９４４−７９５２、１９９４）が挙げられる。他の潜在的なエレメントとしては、ヒストン遺伝子のエレメント（Ｋｅｄｅｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８、８３７−８７０、１９７０）、α−インターフェロン遺伝子（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ ２８７、４０１−４０８、１９８０）、β−アドレナリン作用性レセプター遺伝子（Ｋｏｉｌｋａら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９、７５−７９、１９８７）、ならびにｃ−Ｊｕｎ遺伝子（Ｈａｔｔｏｒｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、９１４８−９１５２、１９８８）が挙げられる。
組換えレンチウイルスベクター構築物は、代表的に、Ｇａｇポリメラーゼコード配列およびＥｎｖコード配列の両方を欠失している。組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、２０個未満、好ましくは、１５個、より好ましくは、１０個、そして最も好ましくは、８個の連続したヌクレオチド（Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子およびＥｎｖ遺伝子中に見出される）を含む。本発明の１つの利点は、合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（これは，組換えレトロウイルスベクター構築のためにパッケージング細胞株を構築するために使用され得る）が、野生型Ｇａｇポリメラーゼ配列に対してほとんど相同性を有さず、従って、合成配列と野生型配列との間の相同組換えの可能性をかなり減少または排除するということである。
レンチウイルスベクターはまた、目的の１個以上の遺伝子または配列の発現を駆動する組織特異的プロモーターを含み得る。
レンチウイルスベクター構築物は、目的の１個を超える遺伝子が発現されるように生成され得る。これは、ジシストロンカセットまたはオリゴシストロンカセット（例えば、このコード領域は、８０個以下のヌクレオチドによって分離される（一般的に、Ｌｅｖｉｎら、Ｇｅｎｅ １０８：１６７−１７４、１９９１を参照のこと））の使用を介して、または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の使用を介して達成され得る。
上記の組換えレトロウイルスベクター構築物と共に使用するのに適したパッケージング細胞株は、本明細書中で提供される開示から容易に調製され得る。簡潔には、このパッケージング細胞株が由来する親の細胞株は、種々の哺乳動物の細胞株から選択され得、これには、例えば、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、および骨髄腫細胞が挙げられる。
パッケージング細胞株の生成のために適切な宿主細胞の選択後、１個以上の発現カセットが、欠失されているベクター成分をイントランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）補充または供給するために、細胞株中に導入される。
適切な合成ＨＩＶポリヌクレオチド配列の代表的な例は、本発明の発現カセットにおける使用について、本明細書中に記載される。上記のように、ネイティブのコード配列および／または合成のコード配列もまた、これらの発現カセットにおいて利用され得る。
上記の発現カセットを利用することにより、広範な種々のパッケージング細胞株が産生され得る。例えば、一局面において、パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列、および核輸送エレメントを含む発現カセットを含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結される。他の局面において、パッケージング細胞株（プロモーター、およびｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、もしくは他のＨＩＶ抗原、またはそれら由来のエピトープをコードする配列を含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、またはＨＩＶ抗原もしくはエピトープをコードする配列に作動可能に連結される。さらなる実施形態において、このパッケージング細胞株は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒのうちいずれか１個以上をコードする配列を含み得る。例えば、このパッケージング細胞株は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒ単独のみ、ｔａｔ、ｒｅｖとｎｅｆ、ｎｅｆとｖｉｆ、ｎｅｆとｖｐｕ、ｎｅｆとｖｐｒ、ｖｉｆとｖｐｕ、ｖｉｆとｖｐｒ、ｖｐｕとｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｉｆとｖｐｕ、ｎｅｆ、ｖｉｆとｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｐｕとｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕとｖｐｒ、またはｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕとｖｐｒの４つ全てなどを含み得る。
１つの実施形態において、この発現カセットは、安定に集積される。別の実施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、粒子を生成する。さらなる実施形態において、このプロモーターは、誘導性である。本発明の特定の好ましい実施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、複製コンピテントウイルスを含まない粒子を生成する。
改変されたコード配列を含む合成カセットは、選択された細胞株にトランスフェクトされる。（ｉ）代表的に、ＨＩＶコード配列の組み込まれた安定なコピーを保有し、そして（ｉｉ）これらのポリペプチドの受容可能なレベルを発現する、トランスフェクトされた細胞が選択される（発現は、本発明の開示の教示を考慮して、当該分野で公知の方法により評価され得る）。この細胞株がＶＬＰを産生する能力もまた、実証され得る。
目的の配列は、上記のように適切なウイルスベクター中に構築される。次いで、この不完全なウイルスは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。このパッケージング細胞株は、ウイルス様粒子を産生するのに必要なウイルス性機能を提供し、この粒子に目的の配列を含む不完全なウイルスゲノムをパッケージングする。次いで、これらのＶＬＰが単離され、そして例えば、遺伝子送達または遺伝子治療に使用され得る。
さらに、このようなパッケージング細胞株はまた、ＶＬＰのみを産生するために使用され得、このＶＬＰは、例えば、他の抗原と共に投与するためのアジュバンドとして、またはワクチン組成物に使用され得る。また、パッケージング細胞株中の、ポリペプチド（例えば、抗原）をコードする選択された目的の配列の同時発現はまた、結果として、この選択されたポリペプチドのＶＬＰ中への包理および／またはこの選択されたポリペプチドのＶＬＰとの結合を生じ得る。
本発明の異なる実施形態の種々の形態（例えば、合成構築物）が、組み合わせられ得る。
（２．４．０ ＤＮＡ免疫および遺伝子送達）
種々のＨＩＶポリペプチド抗原、特にＨＩＶ抗原は、本発明の粒子中で使用され得る。ＨＩＶ抗原は、ＤＮＡ免疫構築物中に含まれ得、この構築物は、例えば、合成Ｅｎｖ発現カセット、合成Ｇａｇ発現カセット、合成ｐｏｌ誘導ポリペプチド発現カセット、１つ以上の補助的遺伝子もしくは調節遺伝子（例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ）をコードする配列を含む合成発現カセット、および／またはインフレームで、ポリペプチド抗原（合成または野生型）のコード配列に融合される合成Ｇａｇ発現カセットを含み、この構築物の発現により、目的の抗原を提示するＶＬＰが得られる。
本発明の実施に使用される特定の目的のＨＩＶ抗原としては、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒおよび他のＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶなどとしてもまた知られている）抗原またはそれら由来のエピトープ（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０（ネイティブおよび改変体の両方）のような抗原が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｇａｇ；ならびに種々の単離体由来のｐｏｌ（多様なサブタイプ由来のＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、種々のサブタイプ（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）由来の他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ；Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。これらの抗原は、合成（本明細書中で記載されるような）または野生型であり得る。
効力を評価するために、本発明の合成発現カセットを使用したＤＮＡ免疫は、例えば、以下のように実施され得る。マウスは、ｔａｔ／ｒｅｖ／ｎｅｆの合成発現カセットで免疫される。他のマウスは、ｔａｔ／ｒｅｖ／ｎｅｆの野生型発現カセットで免疫される。プラスミドＤＮＡを用いたマウスの免疫は、代表的には、この合成発現カセットがネイティブな発現カセットに対して免疫原性の明瞭な改良を提供することを示す。また、第２のブースト免疫は、例えば、約２週間後に、第２の免疫応答を誘導する。さらに、ＣＴＬアッセイの結果は、代表的には、ＤＮＡ免疫による細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導について、合成発現カセットの増強した効力を示す。
中和抗体の評価およびＨＩＶに対する細胞性免疫応答に指向される例示的な霊長類の研究が、以下に記載される。
本発明は、広範の種々の抗原に対する免疫応答を増強し、そしてこれにより、感染、特にＨＩＶ感染を処置または予防するために使用され得ることが容易に明らかである。
（２．４．１ 本発明の合成発現カセットの送達）
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して、例えば、この遺伝子を発現する細胞からのｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、または遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、標準的な技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲ）を使用して、この遺伝子を含む細胞および組織から直接的に単離され得る。ＤＮＡを得るためおよび単離するために使用される技術の記載について、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローン化ではなく、合成により産生され得る。このヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列について、適切なコドンで設計され得る。一般に、配列が発現される、意図される宿主に対して、好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法によって調製されるオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．、（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９〜５３を参照のこと。
次に、所望の抗原をコードする遺伝子配列は、本発明の合成発現カセットを含むベクターに挿入され得る。１つの実施形態において、選択される抗原をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、第一のベクターにおけるＥｎｖコードポリヌクレオチド、第二のベクターにおけるＧａｇコードポリヌクレオチド、第三のベクターにおけるＰｏｌ誘導化ポリペプチドコードポリヌクレオチド、さらなるベクターにおけるｔａｔコードポリヌクレオチド、ｒｅｖコードポリヌクレオチド、ｎｅｆコードポリヌクレオチド、ｖｉｆコードポリヌクレオチド、ｖｐｕコードポリヌクレオチド、ｖｐｒコードポリヌクレオチド、など）に別個クローン化される。特定の実施形態において、抗原は、合成Ｇａｇコード配列に挿入されるかまたは隣接し、その結果、結合された配列が発現される場合に、Ｇａｇポリペプチドおよび目的の抗原（例えば、Ｅｎｖ（ネイティブまたは改変体）またはＨＩＶ由来の他の抗原（ネイティブまたは改変体））を含むＶＬＰの産物を生じる。挿入は、コード配列内またはコード配列のいずれかの末端（発現されたＧａｇポリペプチドの５’アミノ末端；または発現されたＧａｇポリペプチドの３’カルボキシ末端）で作製され得る（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１２７：１１７−１３７、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００：１６２−１７５、１９９４；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３３８９−３３９８、１９９５；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｔ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００：５２４−５３４、１９９４；Ｃｈａｚａｌ，Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８（１）：１１１−１２２、１９９４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（６）：３１９１−３１９８、１９９３；Ｒｅｉｃｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：６４２−６５０、１９９５）。
ｐ５５Ｇａｇのコード配列の５０％までは、ウイルス様粒子への組み立ておよび発現効率に影響を与えることなく欠失され得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３−９３１７、１９９８；Ｇａｍｉｅｒ，Ｌ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（６）：４６６７−４６７７、１９９８；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（３）：１７８２−１７８９、１９９８；Ｗａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（１０）：７９５０−７９５９、１９９８）。本発明の一実施形態において、合成Ｇａｇ発現カセットを高レベルで発現する免疫原性は、異なる構造または非構造のＨＩＶ抗原、マルチエピトープカセット、またはサイトカイン配列をＧａｇ配列の欠失領域に挿入することによって増加され得る。このような欠失は、本発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された全長配列を使用するのに対する、本アプローチの１つの可能な利点は、発現産物のより高い発現効率／分泌効率であり得る。
配列が、Ｇａｇのアミノ末端に付加される場合、ポリヌクレオチドは、ミリスチン部分のＧａｇ含有ポリペプチドへの付加のためのシグナルをコードする、５’末端のコード配列（例えば、Ｍｅｔ−Ｇｌｙをコードする配列）を含み得る。
Ｇａｇ含有ポリペプチド構築物がＶＬＰを形成する能力は、本明細書の教示に従って実験的に決定され得る。
合成発現カセットはまた、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み得、これは、目的の種においてインビボで遺伝子の発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞発現の代表的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター）、マウス乳腺ガンウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターなどが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）遺伝子）に由来するプロモーター）はまた、哺乳動物発現についての使用を見出す。代表的には、転写終止およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終止コドンの３’側に位置する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に配置する）もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載される、ＳＶ４０由来のもの、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。
エンハンサーエレメントはまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載される）、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）から誘導されるエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載される）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載される）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
さらに、キメラ抗原−コード遺伝子配列を含み、例えば、１つより多くのウイルス単離体に由来する、例えば、目的の複数抗原／エピトープをコードする、プラスミドが構築され得る。
代表的には、抗原コード配列は、合成コード配列に先行するか、または後に続き、キメラ性転写単位は、目的の抗原および合成コード配列の両方をコードする単一のオープンリーディングフレームを有する。あるいは、マルチシストロン性カセット（例えば、二シストロン性カセット）が、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどを使用して単一のｍＲＮＡからの複数の抗原の発現を可能にするように構築され得る（実施例７）。
本発明の１つの実施形態において、核酸免疫組成物は、例えば、以下：Ｇａｇ発現カセットを含む第１の発現ベクター、Ｅｎｖ発現カセットを含む第２の発現ベクター、およびＰｏｌ発現カセットを含む第３の発現ベクター、または１つ以上のＰｏｌのコード領域（例えば、Ｐｒｏｔ、ＲＴ、ＲＮａｓｅ、Ｉｎｔ）を含み得、ここでさらなる抗原コード配列は、Ｐｏｌ発現と関連し得、このような抗原は、例えば、アクセサリー遺伝子（例えば、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ）、調節遺伝子（例えば、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ）、またはＰｏｌ配列の一部（例えば、Ｐｒｏｔ、ＲＴ、ＲＮａｓｅ、Ｉｎｔ）から得られ得る。別の実施形態において、核酸免疫組成物は、例えば、本発明の合成ポリヌクレオチド配列のいずれかを含む発現カセットを含み得る。別の実施形態において、核酸免疫組成物は、例えば、多くのＨＩＶ遺伝子（またはこのような遺伝子に由来する配列）のコード配列を含む発現カセットを含み得、ここでこのコード配列は、インフレームであり、そして単一のプロモーターの制御下にある（例えば、Ｇａｇ−Ｅｎｖ構築物、Ｔａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ構築物、Ｐ２Ｐｏｌ−ｔａｔ−ｒｅｖ−ｎｅｆ構築物など）。本発明の合成コード配列は、コード配列産物（すなわち、ＨＩＶポリペプチド）に依存して任意の数の組み合わせで組み合わされ得、例えば、このコード配列産物に対して免疫応答が惹起されることが所望される。さらに別の実施形態において、複数のＨＩＶ由来のポリペプチドの合成コード配列は、単一のプロモーターの制御下のポリシストロン性メッセージに構築され得、ここでＩＲＥＳは、各コードされたポリペプチドのコード配列の近傍に配置される。
本発明の例示的な合成ポリヌクレオチドおよび／または発現カセットは、例えば、以下を含み得る：Ｔａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）；ｐ２Ｐｏｌ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）；ｐ２Ｐｏｌ（ＴｙｐｅＣ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）；ＧａｇｃｏｍｐｌＰｏｌ Ｔａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、ＧａｇｃｏｍｐｌＰｏｌは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ｐ２ＰｏｌＴａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、ｐ２Ｐｏｌは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ＰｏｌＴａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、Ｐｏｌは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ＰｒｏｔＲＴＴａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、ＰｒｏｔＲＴは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ＰｒｏｔＴａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、Ｐｒｏｔは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ならびにＧａｇＴａｔ（ＴｙｐｅＢ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＢ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｔａｔ（ＴｙｐｅＣ）Ｒｅｖ（ＴｙｐｅＣ）Ｎｅｆ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、Ｇａｇは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）。
さらに、本発明の合成ポリヌクレオチドおよび／または発現カセットは、例えば、以下を含み得る：Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）；ｐ２Ｐｏｌ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）；ｐ２Ｐｏｌ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）；ＧａｇｃｏｍｐｌＰｏｌＶｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、ＧａｇｃｏｍｐｌＰｏｌは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ｐ２ＰｏｌＶｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、ｐ２Ｐｏｌは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ＰｏｌＶｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、Ｐｏｌは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ＰｒｏｔＲＴＶｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、ＰｒｏｔＲＴは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ＰｒｏｔＶｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、Ｐｒｏｔは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）；ならびにＧａｇＶｉｆ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＢ）Ｖｉｆ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｒ（ＴｙｐｅＣ）Ｖｐｕ（ＴｙｐｅＣ）（ここで、Ｇａｇは、例えば、任意のサブタイプ由来であり得るか、あるいは種々のサブタイプ由来のコンセンサス配列に基づき得る）。
１つの一般的な実施形態において、本発明の合成ポリヌクレオチドおよび発現カセットは、例えば、以下を含み得る：Ｉｎｔのタンデム反復（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）；Ｔａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）；Ｔａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆコード配列のタンデム反復（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）；Ｖｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕ（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）；Ｖｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕコード配列のタンデム反復（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）；およびＴａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ−Ｖｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕ（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）；ならびにＴａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ−Ｖｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕコード配列のタンデム反復（ここで、遺伝子産物コード配列の少なくとも２つは、異なったＨＩＶ型（例えば、Ａ−Ｇ、Ｏ）由来である）。
このような合成ポリヌクレオチドコード配列（例えば、本明細書中で上述されるような）は、機能的遺伝子産物をコードし得るか、または（野生型と比較して）減少、減弱、不活性化、除去、または合成ポリヌクレオチドにコードされる遺伝子産物に非機能的な活性を与えるように変異され得る。合成ポリヌクレオチド内のコード配列の順序は、変動され得る。最適な順序は、例えば、標的細胞型における産物の所望の発現レベルを得ることに基づいて実験的に決定され得る。
一旦完成すると、この構築物は、標準の遺伝子送達プロトコルを使用して核酸免疫のために使用される。遺伝子送達方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、あるいは被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得、そしてこの細胞は、被験体に再移植される。
多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子送達のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な基盤を提供する。選択された配列は、ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の技術を使用して、レトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され得、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が、記載されてきた（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。
多くのアデノウイルスベクターがまた、記載されてきた。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは違い、アデノウイルスは、染色体外に存在し、それ故、挿入突然変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日に公開された）およびＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日に公開された）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
本発明のポリヌクレオチドを送達するために有用な別のベクター系は、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７６，９５０号）によって記載される、腸内投与される組換えポックスウイルスワクチンである。
目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための用途が見出されるさらなるウイルスベクターとしては、ポックスファミリーのウイルス（ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む）に由来する抗原が挙げられる。例として、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換体は、以下のように構築され得る。特定の合成ＨＩＶポリペプチドコード配列をコードするＤＮＡは、適切なベクターにまず挿入され、その結果、このＤＮＡは、ワクシニアプロモーターの近傍に存在し、そしてワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接する。このベクターは、次いで、ワクシニアで同時に感染される細胞をトランスフェクトするために使用される。相同組換えは、ワクシニアプロモーターおよび目的のコード配列をコードする遺伝子をウイルスゲノムに挿入するように作用する。得られたＴＫ組換体は、細胞を５−ブロモデオキシウリジンの存在下で培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークを選び取ることによって選択され得る。
あるいは、アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）は、遺伝子を送達するためにもまた使用され得る。組換えアビポックスウイルス（哺乳動物病原由来の免疫原を発現する）は、非鳥類種に投与される場合、保護免疫を付与することが公知である。アビポックスベクターの使用は、特に、ヒトおよび他の哺乳動物種において望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ、生産的に複製し得、従って、哺乳動物細胞では感染性ではない。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記されるような遺伝的組換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２号；ＷＯ８９／０３４２９号；およびＷＯ９２／０３５４５号を参照のこと。
分子結合体ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載される、アデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用され得る。
アルファウイルス属のメンバー（例えば、シンドビウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳髄膜炎ウイルス由来のベクターであるが、これらに限定されない）はまた、本発明のポリヌクレオチドを（例えば、合成Ｇａｇ−ポリペプチドコード発現カセット）送達するためのウイルスベクターとしての用途を見出す。本発明の方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来ベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開第ＷＯ９５／０７９９５号およびＷＯ９６／１７０７２号；ならびにＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．ら、米国特許第５，８４３，７２３号（１９９８年１２月１日に発行された）、およびＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．，同第５，７８９，２４５号（１９９８年８月４日に発行された）を参照のこと。好ましい発現系としては、真核生物階層（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始系（例えば、米国特許第６，０１５，６８６号、同第５，８１４，４８２号、同第６，０１５，６９４号、同第５，７８９，２４５号、ＥＰ１０２９０６８Ａ２号、ＷＯ９９１８２２６Ａ２／Ａ３号、ＥＰ００９０７７４６Ａ２号、ＷＯ９７３８０８７Ａ２号）が挙げられるがこれらに限定されない。
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系は、宿主細胞中で目的のコード配列の誘導性の一過性の発現を提供するために便利に使用され得る。この系において、細胞は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換体を用いてインビトロでまず感染される。このポリメラーゼは、これがＴ７プロモーターを保持するテンプレートだけを転写するという点で優れた特異性を示す。感染後、細胞は、目的のポリヌクレオチドで感染され、このポリヌクレオチドは、Ｔ７プロモーターによって駆動される。ワクシニアウイルス組換体から、細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは、次いで、宿主翻訳機構によってタンパク質へと翻訳される。この方法は、多量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルな一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
ワクシニアウイルス組換体またはアビポックスウイルス組換体での感染あるいは他のウイルスベクターを使用する遺伝子の送達に対する、代替的アプローチとして、宿主細胞への導入後に高レベルの発現を誘導する増幅系が、使用され得る。具体的には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについてのコード領域に先行するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、遺伝子操作され得る。このテンプレート由来のＲＮＡの翻訳によって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが産生され、このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが、次いで、テンプレートをより転写する。同時に、Ｔ７プロモーターの制御下で発現されるｃＤＮＡが存在する。従って、増幅テンプレートＲＮＡの翻訳から産生されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいくらかは、所望の遺伝子の転写を導く。いくらかのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが、増幅を開始するために必要とされるので、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレートと共に細胞中に導入され、転写反応を開始し得る。このポリメラーゼは、タンパク質として、またはＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入され得る。Ｔ７系および細胞を形質転換するためのこれらの用途のさらなる考察については、例えば、国際公開第ＷＯ９４／２６９１１号；ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５−２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１−１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７−２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４−２１２０；ならびに米国特許第５，１３５，８５５号を参照のこと。
本発明の発現カセットの送達はまた、ＣＭＶ由来のエレメントを含む真核生物発現ベクターを使用して達成され得、このようなベクターとしては、以下：ｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋ ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ、およびｐＣＭＶ６ａ（全て上記される）が挙げられるがこれらに限定されない。
目的の合成発現カセットはまた、ウイルスベクターなしに送達され得る。例えば、合成発現カセットは、被験体または被験体由来の細胞へと送達される前に、リポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に、リポソームを使用して達成され得、このリポソームは、核酸を安定に結合または閉じ込め、そして保持し得る。濃縮ＤＮＡの脂質調製物に対する比は、変化し得るが、一般的に、約１：１（ｍｇ ＤＮＡ：μモル脂質）であるか、または脂質がより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），第１０１巻，５１２頁〜５２７頁を参照のこと。
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物、および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および機能的形態の精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは、容易に入手できる。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標名で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと)。他の市販の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号を参照のこと。
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な材料を使用して容易に調製され得る。このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、ＤＯＴＭＡ出発材料およびＤＯＴＡＰ出発材料と適切な比で混合され得る。これらの材料を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
リポソームは、多層小胞（ＭＬＶ）、小さな単層小胞（ＳＵＶ）、または大きな単層小胞（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），第１０１巻，５１２頁〜５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
ＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載されるものに類似する渦巻型脂質組成物で送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号もまた参照のこと。
目的の合成発現カセットはまた、粒子状キャリアに被包され得るか、それに吸着され得るか、またはそれと結合され得る。このようなキャリアは、複数コピーの選択された抗原を免疫系に示し、局所的なリンパ節中で、抗原の捕捉および保持を促進する。粒子は、マクロファージによって食作用され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を強化し得る。粒子状キャリアの例としては、ポリメタクリル酸メチルポリマーに由来するキャリアならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。適切な微粒子はまた、荷電界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在下で製造され、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有する微粒子を得ることができる。例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を用いて製造された巨大粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子））は、例えばＤＮＡのような負に荷電した巨大粒子を吸着する。（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと）。
さらに、他の粒子状系およびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボでの送達のために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、およびこれらの分子の結合体）は、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、他の不溶性無機酸塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウム（ベントナイトおよびカオリンを含む）、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどを使用する沈殿）は、本方法に関する用途を見出す。遺伝子移入に有用な送達系の概説については、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。ペプトイド（１９９８年１１月３日に発行された、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、米国特許第５，８３１，００５号）もまた、本発明の構築物の送達のために使用され得る。
さらに、粒子状キャリア（例えば、金およびタングステン）を使用する遺伝子銃を使用する（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達系は、本発明の合成発現カセットを送達するために特に有用である。粒子は、送達されるべき合成発現カセットでコーティングされ、「遺伝子銃」からのガンパワー放電を使用して、一般的に還元雰囲気下で高速度まで加速される。従って、このような技術の記載および有用な装置については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。また、針無し注射系も使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
本発明の合成発現カセットを保有する組換えベクターは、脊椎動物被験体への送達のための組成物中に処方される。これらの組成物は、予防的（感染を予防するため）または治療的（感染後に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。この組成物は、「治療有効量」の目的の遺伝子を含み、それによって、ある量の抗原がインビボで産生され、その結果、免疫応答は抗原が投与される個体中で惹起される。正確な必要量は、他の因子の中でも、処置される被験体；処置される被験体の年齢および一般的状態；抗体を合成する被験体の能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択された特定の抗原およびその投与様式、に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的な試行によって決定され得る、比較的広い範囲に入る。
組成物は、一般的に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理的食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。核酸の取り込みおよび／または発現の特定の促進剤（例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースが挙げられるがこれらに限定されない）はまた、組成物中に含まれ得るかまたは同時投与され得る。
一旦処方されると、本発明の処方物は、（例えば、上記されるように）被験体に直接投与され得るか、あるいは、例えば、上記される方法を使用して、被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達および形質転換された細胞を被験体に再移植するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこれには、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン媒介性トランスフェクションおよびＬＴ−１媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（対応する抗原を含むかまたは含まない）のリポソーム中での被包化、ならびにＤＮＡの核への直接的微量注入が挙げられ得る。
合成発現カセット組成物のインビボでの直接の送達は、一般的に、上記されるように、ウイルスベクターを使用してかまたは使用せずに、従来のシリンジまたは遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達系（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））のいずれかを使用する注入によって達成される。この構築物は、皮下的、表皮的、皮内的、粘膜内的（例えば、鼻内的、直腸的および膣的）、腹腔内的、静脈内的、経口的または筋内的のいずれかで注射され得る。ＤＮＡの表皮細胞への送達が、特に好ましい。なぜならこの投与様式は、皮膚関連リンパ細胞への接近を提供し、そしてレシピエントにおけるＤＮＡの一過性の存在を提供するからである。投与の他の様式としては、経口投与および肺投与、坐剤、針無し注射、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。核酸の投与は、ペプチドまたは他の物質の投与ともまた組み合わされ得る。
例示的な免疫原性研究は、実施例４、５、６、９、１０、１１、および１２において示される。
（２．４．２ 本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達）
１つの実施形態において、Ｔ細胞および関連する細胞型（抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、リンパ球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびこれらの前駆細胞を含むがこれらに限定されない）は、本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達に使用され得る。Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手順によって、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、ＰＢＬの集団からアクセサリー細胞およびＢ細胞を除去することによって「富化」され得る。特に、Ｔ細胞富化は、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を使用する非Ｔ細胞の除去によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定の集団を枯渇させるために使用され得る。例えば、抗Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯渇させるために使用され得、そして抗ＭａｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇させるために使用され得る。
Ｔ細胞は、当業者に公知の技術によって多くの異なる部分集団にさらに分画され得る。２つの主要な部分集団は、これらの細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の差示的な発現に基づいて、単離され得る。例えば、上記のようなＴ細胞の富化の後、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体を使用して富化され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら（上述）を参照のこと）。抗体は、磁気ビーズのような固体支持体と結合され得る。逆に、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体（ＣＤ４＋細胞を除去するため）の使用によって濃縮され得るか、または固体支持体に結合されたＣＤ８抗体の使用によって単離され得る。ＨＩＶ−１感染患者由来のＣＤ４リンパ球は、Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８によって記載される形質導入の前または後に、エキソビボで増殖され得る。
Ｔ細胞の精製の後、当業者に公知の種々の遺伝的改変の方法は、本明細書中に記載されるように構築された、非ウイルスベースの遺伝子移送ベクターまたはウイルスベースの遺伝子移入ベクターを使用して実施され得る。例えば、１つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞に由来する培養物のベクター含有上清を用いて精製されたＴ細胞の導入を包含する。第２のアプローチは、精製されたＴ細胞との、照射された単層のベクター産生細胞の同時培養を包含する。第３のアプローチは、類似する同時培養アプローチを含むが、精製されたＴ細胞は、種々のサイトカインで前刺激され、そして照射されたベクター産生細胞との同時培養の前に４８時間培養される。このような導入の前の前刺激は、効率的な遺伝子移入を増大させる（Ｎｏｌｔａら、（１９９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。増殖のためのこれらの培養物の刺激はまた、患者への再注入のための細胞集団の増加を提供する。同時培養の後、Ｔ細胞は、ベクター産生細胞単層から回収され、増殖され、そして液体窒素で凍結される。
遺伝子移入ベクター（本発明の１つ以上の合成発現カセット（単離されたＴ細胞への送達のための適切な制御エレメントを伴う）を含む）は、公知の方法を使用して、そして本明細書の指針に従って、構築され得る。
選択マーカーはまた、遺伝子移入ベクターの構築において使用され得る。例えば、遺伝子移入ベクターで形質導入された哺乳動物細胞に、細胞傷害性剤に対する耐性を与えるマーカーが、使用され得る。細胞傷害性剤は、ネオマイシン、アミノ配糖体、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシンＡ、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得るが、これらに限定されない。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシンアナログであるゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）に対する耐性を付与する。
Ｔ細胞はまた、少なくとも１種類の増殖因子を含有する培地において維持され得、その後選択される。種々の増殖因子は、当該分野で公知であり、これらは特定の細胞型の増殖を維持する。このような増殖因子の例は、サイトカインマイトジェン（例えば、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５）であり、これらは、リンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の細胞型は、ホルモン（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンを含む）のような他の増殖因子によって刺激される。特定の細胞集団に対する適切な増殖因子の選択は、当業者によって容易に達成される。
例えば、白血球（例えば、分化した前駆細胞および幹細胞）は、種々の増殖因子によって刺激される。より具体的には、活性化ＴＨおよび活性化マクロファージによって産生される、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、骨髄性幹細胞を刺激し、この骨髄性幹細胞は、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆細胞、好酸球前駆細胞、好塩基球前駆細胞、骨髄巨核球、および赤血球前駆細胞に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびＥＰＯのような増殖因子によって調節される。
多能性幹細胞は、次いで、リンパ球幹細胞、骨髄間質細胞、Ｔ細胞前駆細胞、Ｂ細胞前駆細胞、胸腺細胞、ＴＨ細胞、ＴＣ細胞、およびＢ細胞に分化する。この分化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−５のような増殖因子によって調節される。
顆粒球−単球前駆細胞は、単球、マクロファージ、および好中球に分化する。このような分化は、増殖因子であるＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８によって調節される。好酸球前駆細胞は、好酸球に分化する。このプロセスは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５によって調節される。
好塩基球前駆細胞の肥満細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＩＬ−９によって調節される。骨髄巨核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、およびＩＬ−６に応答して、血小板を産生する。赤血球前駆細胞は、ＥＰＯに応答して赤血球に分化する。
従って、ＣＤ−３結合因子による活性化の間、Ｔ細胞はまた、マイトジェン（例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン）と接触され得る。特に好ましい実施形態において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でＴ細胞の集団に添加される。ＣＤ−３結合因子を用いる活性化を、２〜４日間実施し得る。
いったん適切に活性化されると、Ｔ細胞へのベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で、Ｔ細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって、Ｔ細胞は遺伝的に改変される。Ｔ細胞集団の細胞密度が約０．１×１０６と５×１０６との間、好ましくは約０．５×１０６と２×１０６との間である場合、遺伝的改変が実施される。多くの適切なウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入ベクターが、本明細書中で使用について記載されている。
形質導入後に公知の技術を用いて、形質導入細胞を、非形質導入細胞から選択する。例えば、形質導入に用いられる遺伝子移入ベクターが細胞傷害性剤に対する耐性を付与する選択マーカーを含む場合、細胞は適切な細胞傷害性剤に接触され得、これにより非形質導入細胞は、形質導入細胞からネガティブに選択され得る。選択マーカーが細胞表面マーカーである場合、細胞は特定の細胞表面マーカーに特異的な結合因子と接触され得、これにより、形質導入された細胞は、この集団からポジティブに選択され得る。この選択工程はまた、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）技術を包含し得（例えば、ＦＡＣＳを使用して、特定の細胞表面マーカーを含む集団から細胞を選択する場合）、またはこの選択工程は、標的細胞捕捉および／またはバックグラウンド除去のための回収可能な支持体としての、磁気的に応答性の粒子の使用を包含し得る。
より好ましくは、形質導入細胞のポジティブ選択を、ＦＡＣＳセルソーター（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施して、選択可能な細胞表面マーカーを発現する形質導入された細胞を分類および回収し得る。形質導入に続いて、細胞を、特定の細胞表面マーカーに対する蛍光標識抗体分子で染色する。それぞれの細胞に結合した抗体の量は、細胞を含有する液滴をセルソーターに通すことによって測定され得る。染色した細胞を含む液滴に電磁気的電荷を与えることによって、形質導入細胞を他の細胞から分離し得る。次いで、ポジティブに選択された細胞を、滅菌回収容器内に回収する。これらの細胞分類手順は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（節３−１１〜３−２８および１０−１〜１０−１７を特に参照する）に詳細に記載されている。
形質導入細胞のポジティブ選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁気的分離を用いて実施され得る。このような分離技術において、ポジティブに選択される細胞は、まず特異的結合因子（例えば、細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬）と接触される。次いで、細胞は、回収可能な粒子（例えば、磁気的に応答性の粒子）と接触される。この粒子は、（陽性細胞に結合した）特異的結合因子と結合する試薬と結合されている。次いで、細胞結合因子−粒子複合体を、非標識細胞から物理的に分離し得る（例えば、磁場を用いて）。磁気的に応答性の粒子を用いる場合、標識細胞は、磁場を用いて容器内に保持され得る一方、ネガティブ細胞は除去される。これらおよび類似の分離手順は、当業者に公知である。
選択された形質導入細胞におけるベクターの発現を、当業者に公知の多くのアッセイによって評価し得る。例えば、ウエスタンブロット分析またはノーザン分析を、目的の挿入ヌクレオチド配列の特性に依存して使用し得る。一旦発現が確立され、そして形質導入されたＴ細胞が選択された合成発現カセットの存在について試験されると、末梢血流を介した患者への注入の準備ができる。
本発明は、初代哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝的改変のためのキットを含む。このキットは代表的に、１以上の容器に含まれる少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの合成発現カセットをコードする遺伝子移入ベクター、付属の試薬またはハードウェア、ならびにキットの使用についての取扱説明書を含む。
（２．４．３．さらなる送達レジメン）
本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）またはポリペプチド（上記のいずれかの方法によって送達される）はまた、他のＤＮＡ送達系および／またはタンパク質送達系と組み合わせて使用され得る。非限定的な例としては、これらの分子の同時投与（例えば、１以上の分子が「プライム」工程で送達され、その後１以上の分子が「ブースト」工程によって送達される、プライム−ブースト法）が挙げられる。特定の実施形態において、１以上の核酸含有組成物の送達の後に、１以上の核酸含有組成物および／または１以上のポリペプチド含有組成物（例えば、ＨＩＶ抗原を含むポリペプチド）が送達される。他の実施形態において、（同じかまたは異なる核酸分子の）複数の核酸「プライマー」の後に、（同じかまたは異なるポリペプチドの）複数のポリペプチド「ブースト」が送達され得る。他の例としては、複数の核酸投与および複数のポリペプチド投与が挙げられる。
同時投与を含む任意の方法において、種々の組成物は、任意の順序で送達され得る。従って、複数の異なる組成物または分子の送達を含む実施形態において、これらの核酸は、ポリペプチドよりも前に全てが送達される必要はない。例えば、プライミング工程は、１つ以上のポリペプチドの送達を含み得、そしてブースト工程は、１つ以上の核酸および／または１つ以上のポリペプチドの送達を含む。複数のポリペプチドが投与され、その後、複数の核酸が投与され得るか、またはポリペプチドおよび核酸の投与が任意の順序で実施され得る。本明細書中に記載される任意の実施形態において、核酸分子は、ポリペプチドの全てまたはいくつかをコードし得るか、あるいは全くコードしなくてもよい。従って、本明細書中に記載される１つ以上の核酸分子（例えば、発現カセット）および／または本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドは、任意の順序で、かつ任意の投与経路で同時投与され得る。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの任意の組み合わせが、免疫反応を誘発するために使用され得る。
（３．０ 改善されたＨＩＶ−１ Ｇａｇ発現カセットおよびＰｏｌ発現カセット）
いずれの特定のモデルにも理論にも仮説にも拘束されることを望まないが、以下の情報は、本発明のより完全な理解を提供するために示される。
世界保健機構（ＷＨＯ）は、ＨＩＶ−１に感染した世界中の人の数が、３６１０万人を超えると概算した。従って、安全かつ有効なＨＩＶワクチンの開発が、現時点で不可欠である。最近の研究により、感染患者においてＨＩＶ−１複製を制御することにおけるＣＴＬの重要性が実証された。さらに、複数のＨＩＶ抗原とのＣＴＬ反応性は、ウイルス複製の有効な制御に必要である。本発明を支持して実施された実験は、中和抗体の誘導のためのＥｎｖに加えて、ＨＩＶ−１ ＧａｇおよびＰｏｌをワクチンに含めることが有用であることを示唆する。
ＨＩＶ−１ワクチン候補の効力を増大させるため、Ｇａｇ単独またはＧａｇ＋Ｐｏｌのいずれかについて、コドン改変されたＧａｇ発現カセットおよびＰｏｌ発現カセットを設計した。発現および効力における潜在的な差異を評価するために、これらの構築物の発現を分析し、そして免疫原性研究をマウスにおいて実施した。
ＧａｇおよびＰｏｌをコードするいくつかの発現カセットを設計した。これらのカセットとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｇａｇプロテアーゼ、フレームシフトしたＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼ（ｇａｇＦＳｐｏｌ）およびインフレームのＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼ（ｇａｇｐｏｌ）。減弱（Ａｔｔ）または非機能的プロテアーゼ（Ｉｎａ）を有する、インフレームのＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼのバージョンもまた設計した。これらの核酸配列を、高度に発現されるヒト遺伝子のコドン用法に対応するようにコドン改変した。マウスを滴定したＤＮＡ用量で免疫し、そして体液性免疫応答および細胞性免疫応答をＥＬＩＳＡおよび細胞内サイトカイン染色によって評価した（実施例１０）。
マウスにおける免疫応答は、インビトロでの相対的発現レベルと相関することが観察されている。アカゲザルにおけるワクチン研究は、インビボでの免疫応答および発現レベルをさらに扱う。
（４．０ ＨＩＶに対する強力な中和抗体および細胞性免疫応答の誘導のための増強されたワクチン技術）
いずれの特定のモデルにも理論にも仮説にも拘束されることを望まないが、以下の情報は、本発明のより完全な理解を提供するために示される。
ＨＩＶ感染に対する保護は、おそらく、ウイルスチャレンジに曝露された、ワクチン接種された個体中に予め存在する、強力かつ広く反応性の中和抗体を必要とする。細胞性免疫応答は、感染した個体におけるウイルス血症を制御するために所望されるが、感染に対する保護は、これらの応答の誘導に排他的に依存するワクチンアプローチについては実証されていない。この理由のために、本発明を支持して実施された実験は、初代ＨＩＶ単離体（例えば、Ｒ５サブタイプＢ（ＨＩＶ−１ＳＦ１６２）株およびサブタイプＣ（ＨＩＶ−１ＴＶＩ）株）由来の新規Ｖ欠失エンベロープ抗原を使用する、プライム−ブーストアプローチを使用する。これらの抗原を、増強されたＤＮＡ［ポリアクチド（ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅ）ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）微粒子処方物もしくはエレクトロポレーション］またはアルファウイルスレプリコン粒子ベースのワクチンアプローチ、その後のＭＦ５９アジュバント中のＥｎｖタンパク質でのブースター免疫によって送達した。電気的透過化による、プラスミドにコードされた遺伝子のインビボの効果的な発現が記載されている（例えば、Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１５９８−１１６０７；Ｂａｎｇａら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４０８−４１２；Ｈｅｌｌｅｒら（１９９６）Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．３８９：２２５−２２８；Ｍａｔｈｉｅｓｅｎら、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：５０８−５１４；Ｍｉｒら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：４２６２−４２６７；Ｎｉｓｈｉら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１０５０−１０５５を参照のこと）。ＳＦ１６２株由来のネイティブおよびＶ欠失の両方のモノマー性形態（ｇｐ１２０）およびオリゴマー性形態（ｏ−ｇｐ１４０）のタンパク質を、ブースターとして試験した。全てのタンパク質調製物を高度に精製し、そして生物物理学的方法論および免疫化学的方法論によって広範に特徴付けた。ウサギおよび霊長類の免疫原性研究の結果は、中和抗体応答は、親の非Ｖ２欠失ＳＦ１６２ウイルスに対して構成的に誘導され得るが、異種ＨＩＶ株に対する応答の誘導は、この免疫原のＶ２ループの欠失によって改善されたことを示した。さらに、これらのプライム−ブーストワクチンレジメンを使用して、強力なＨＩＶ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答もまた実証した。
これらの発見に基づいて、Ｖ２欠失エンベロープＤＮＡおよびタンパク質ワクチンは、臨床的評価に対する進歩について選択された。免疫のための類似のアプローチは、例えば、本発明の合成ＨＩＶポリヌクレオチドを、対応するＨＩＶ誘導ポリペプチドブーストまたは異種ＨＩＶ誘導ポリペプチドブーストと共に使用することによって使用され得る。
本発明のこの局面の１実施形態を、以下に一般的に記載し得る。抗原を、ワクチン組成物のために選択する。Ｅｎｖポリペプチドを、代表的に、免疫応答を誘導するために使用される第一の抗原性組成物において使用する。さらに、Ｇａｇポリペプチドを、代表的に、免疫応答を誘導するために使用される第二の抗原性組成物において使用する。この第二の抗原性組成物は、ＨＩＶ由来のポリペプチド配列（Ｐｏｌ配列、Ｔａｔ配列、Ｒｅｖ配列、Ｎｅｆ配列、Ｖｉｆ配列、Ｖｐｒ配列および／またはＶｐｕ配列を含むが、これらに限定されない）をさらに含み得る。ＤＮＡプライムワクチン接種を、代表的に、第一および第二の抗原性組成物を用いて実施する。１以上の抗原性組成物を用いるさらなるＤＮＡワクチン接種もまた、選択された時間間隔で含まれ得る。このプライムの後に、代表的に、少なくとも１回のブーストが行われる。このブーストとしては、例えば、アジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔ）したＨＩＶ由来のポリペプチド（例えば、ＤＮＡワクチン接種のために使用されるポリペプチドに対応する）、ウイルスベクターによってコードされる、ＨＩＶ由来ポリペプチド（例えば、ＤＮＡワクチン接種のために使用されるポリペプチドに対応する）のコード配列、さらなるＤＮＡワクチン接種および／または上記の組み合わせが挙げられ得る。１実施形態において、ＤＮＡプライムは、第一の抗原性組成物（例えば、エンベロープポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物）および第二の抗原性組成物（例えば、Ｇａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、ＮｅｆポリペプチドおよびＲｅｖポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物）と共に投与される。プライムにおいて使用するためのＤＮＡ構築物は、例えば、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターを含み得る。このＤＮＡプライムの後に、ブースト（例えば、アジュバント化したエンベロープポリペプチドブーストおよびウイルスベクターブースト（ここで、このウイルスベクターは、例えば、Ｇａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、ＮｅｆポリペプチドおよびＲｅｖポリペプチドをコードする））が行われる。あるいは（またはさらに）、このブーストは、アジュバント化したＧａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、ＮｅｆポリペプチドおよびＲｅｖポリペプチドのブースト、ならびにウイルスベクターブースト（ここで、ウイルスベクターは、例えば、エンベロープポリペプチドをコードする）であり得る。このブーストは、ＤＮＡプライムにコードされた全てのポリペプチド抗原を含み得るが；これは必須でない。さらに、異なるポリペプチド抗原を、最初のワクチン接種に対してブーストにおいて使用し得るが、逆もまた行われ得る。さらに、最初のワクチン接種は、ＤＮＡ構築物ではなくウイルスベクターであり得る。
ＨＩＶエンベロープワクチン設計において考慮され得るいくつかの因子は、以下のとおりである。エンベロープベースのワクチンは、非ヒト霊長類モデルにおいて、感染に対する保護を実証している。受動的抗体研究は、ウイルスチャレンジストックに対して、中和抗体の存在下でＨＩＶ感染に対する保護を実証している。Ｅｎｖを排除するワクチンは、一般に、より低い保護効力を付与する。本発明を支持して実施された実験は、ＳＦ２ ｌａｂ株由来のモノマー性ｇｐ１２０タンパク質が、ＨＩＶ−１ ｌａｂ株の中和および霊長類モデルにおけるウイルスチャレンジに対する保護を提供したことを実証している。Ｔｈａｉ Ｅフィールド株由来の初代ｇｐ１２０タンパク質は、サブタイプ交差的な（ｃｒｏｓｓ−ｓｕｂｔｙｐｅ）ｌａｂ株の中和を提供した。初代サブタイプＢオリゴマー性ｏ−ｇｐ１４０タンパク質は、サブタイプＢ初代（フィールド）単離体の部分的中和を提供した。初代サブタイプＢのｏ−ｇｐ１４０ΔＶ２ ＤＮＡプライム＋タンパク質ブーストは、多様なサブタイプＢ初代単離体の強力な中和、および霊長類モデルにおけるウイルスチャレンジに対する保護を提供した。初代サブタイプＣのｏ−ｇｐ１４０およびｏ−ｇｐ１４０ΔＶ２は、おそらく、サブタイプＢについて記載された結果と類似の結果を提供する。
強力で広範に反応性である中和抗体の誘導のためのワクチンストラテジーは、保存された中和エピトープを露出するエンベロープポリペプチド構造（例えば、可変領域の欠失および脱グリコシル化、エンベロープタンパク質−レセプター複合体、結晶構造に基づく合理的設計（例えば、β−シート欠失）ならびにｇｐ−４１融合ドメインベースの免疫原）の構築によって補助され得る。
エンベロープタンパク質産生のための安定なＣＨＯ細胞株が、最適化したエンベロープポリペプチドコード配列（ｇｐ１２０、ｏ−ｇｐ１４０、ｇｐ１２０ΔＶ２、ｏ−ｇｐ１４０ΔＶ２、ｇｐ１２０ΔＶ１Ｖ２、ｏ−ｇｐ１４０ΔＶ１Ｖ２が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して開発されている。
さらに、以下のプライム−ブーストレジメン（例えば、上記のレジメン）は、感染した被験体におけるウイルス負荷を低減すること、そしておそらくＨＩＶ関連疾患の進行を（未処置の被験体と比較して）遅延または予防することを助けるために有利なようである。
例示的な抗原性組成物および免疫原性研究を、実施例９、１０、１１および１２に示す。
（実験）
本発明を実施するための特定の実施形態の例を以下に示す。これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確証するための努力が成されているが、ある程度の実験的誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。
（実施例１）
（合成発現カセットの作製）
（Ａ．合成ポリヌクレオチドの作製）
本発明のポリヌクレオチド配列を、その遺伝子産物の発現を最大化するために操作した。以下の工程の順序は、変化し得る。
第１に、ＨＩＶ−１のコドン用法パターンを、得られる核酸コード配列が高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法に適合するように改変した。ＨＩＶコドン用法は、高含有量のヌクレオチドＡまたはＴのコドントリプレットを反映する。ＨＩＶ−１コドン用法の効果は、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含有量であり、これにより、ＲＮＡのＡＵ含有量が高くなり、ｍＲＮＡの翻訳能力が減少し、不安定になる。対照的に、高度に発現するヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。野生型配列を、高度に発現するヒト遺伝子において見出されるコドン用法に適合するように改変した。
第二に、いくつかの遺伝子についての非機能的改変体を作製した。以下の表（表Ｂ）において、いくつかのＨＩＶ遺伝子の活性に影響を与える変異を開示する。
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 これらの変異のいくつかを含む構築物が、本明細書中に記載される。Ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕの合成構築物が記載される。関連する遺伝子産物の機能を低減または排除することは、本明細書の教示を考慮して、上記の表に示される教示を使用して達成され得る。
本発明の１実施形態において、Ｇａｇポリメラーゼ配列の全長コード領域は、合成の最適化されたＧａｇ発現カセットによって発現されるウイルス様粒子についてのエピトープの数を増加させるために、合成Ｇａｇ配列に含まれる。合成ＨＩＶ−１ Ｇａｇポリメラーゼは、（構造タンパク質およびプロテアーゼに加えて）潜在的に欠失した機能的酵素である逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）を発現するので、ＲＴ機能およびＩＮＴ機能を不活化することが重要である。ＲＴおよびＩＮＴのリーディングフレームにおけるいくつかのインフレーム欠失は、ＲＴ活性およびＩＮＴ活性に関して、触媒的に非機能的な酵素を達成するために作製され得る。
Figure 0004302513
 さらに選択されたＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープが、ＲＴコード配列またはＩＮＴコード配列の欠失の内側のＧａｇ−ポリメラーゼ構造に付加され、ＲＴおよびＩＮＴの機能的改変により欠失される任意のエピトープと置き換えられ、そして増強され得る。代替的に、選択された、ＲＴおよびＩＮＴ由来のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープを含む）は、上記で記載した合成Ｇａｇカセットまたは合成ＧａｇＰｒｏｔカセットの発現により形成される最小のＶＬＰ中に含まれ得る（既知のＨＩＶ Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープについての記載については、ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ ＣＴＬ Ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ，１９８７〜１９９７；Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｄｄｒｅｓｓ：ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．を参照のこと）。
別の局面において、本発明はＥｎｖコード配列を含み、このＥｎｖコード配列は以下のＨＩＶ−コードポリペプチド：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、およびｇｐ１２０（例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２（「ＳＦ２」）Ｅｎｖポリペプチドの記載については米国特許第５，７９２，４５９号を参照のこと）をコードするポリヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。これらのポリペプチド間の関連を、図３（図中で：ポリペプチドは線で表わし、アミノ末端およびカルボキシ末端はｇｐ１６０ライン上に示され；白丸はオリゴマー形成ドメインを表わし；白四角は膜貫通型架橋ドメイン（ＴＭ）を表わし；そして「ｃ」は切断部位の位置を表わし、ｇｐ１４０．ｍｕｔにおいて、「Ｘ」は、切断部位がすでに切断部位として機能しないように改変されていることを示す）に概略的に示す。このポリペプチドｇｐ１６０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のコード配列含む。このポリペプチドｇｐ４１は、オリゴマー形成ドメイン（ＯＤ）および膜貫通型架橋ドメイン（ＴＭ）を含む、いくつかのドメインから構成される。天然のエンベロープにおいて、オリゴマー形成ドメインは、ｇｐ４１トリマー（およびそれ自体）との共有的な相互作用を介して、３つのｇｐ４１ポリペプチドがトリマー構造を形成するための非共有結合に必要とされ、ｇｐ１２０ポリペプチドはまた、トリマー構造内で組織化される。１つの切断部位は、およそｇｐ１２０のポリペプチド配列とｇｐ４１に対応する配列ポリペプチド配列との間に存在する。この切断部位は、改変されて、その部位での切断を妨害し得る。生じたｇｐ１４０配列ポリペプチドは、ｇｐ４１の膜貫通型架橋ドメインが欠失している、ｇｐ１６０の短縮形態に一致する。このｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１部分内のオリゴマー形成ドメインの存在の利点により、単量体およびオリゴマー（例えば、トリマー）の両形態で存在し得る。切断部位が改変されて切断を防止し、そしてｇｐ４１の膜貫通部分が欠失している状況において、生じたポリペプチド生成物は、所望の「変異」ｇｐ１４０（たとえば、ｇｐ１４０．ｍｕｔ）である。当業者に明らかであるように、切断部位は、様々な方法で改変され得る。（ＷＯ ００／３９３０２も参照のこと）。
野生型ＨＩＶコード配列（例えば、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆなど）は、既知のあらゆるＨＩＶ単離物から選択され得、そしてこれらの配列を操作して、本発明の教示に従うそれらの遺伝子産物の発現を最大にする。野生型コード領域は、おそらく以下の一つ以上の方法で改変される。１つの実施形態において、Ｅｎｖ、特にＶ１および／またはＶ２の超可変領域をコードする配列が欠失された。他の実施形態において、改変は、例えば、Ｅｎｖ内の切断部位をコードする配列中に誘導され、オリゴマーｇｐ１４０が酵素的に切断されてｇｐ１２０モノマーとなるのを抑制する（例えば、Ｅａｒｌら、（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６４８〜６５２；Ｅａｒｌら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３１〜４１を参照のこと）。さらに他の実施形態において、超可変領域が欠失され、Ｎ−グリコシル化部位は除去され、そして／または切断部位が改変された。上記で考察したように、異なる改変が、異なる遺伝子のコード配列内に誘導され得る（例えば、表Ｂを参照のこと）。例えば、Ｔａｔコード配列は、本明細書の教示に従って改変され、例えば、遺伝子産物のトランス活性化ドメイン（例えば、２２位のグリシン残基とシステイン残基との置き換え、Ｃａｐｕｔｏら、（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２３５）に影響を及ぼした。
本発明の合成コード配列を作製するために、遺伝子カセットは目的の全コード配列を含むように設計される。合成遺伝子カセットは、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅によって構築され、遺伝子フラグメントを生成する。プライマーは、サブクローニングに便利な制限部位を提供するように選択される。次いで、生じたフラグメントをライゲーションし、次いで、適切なベクターにクローニングされる所望の全配列を作製する。最終的な合成配列は、（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ消化および分析によってスクリーニングされ、（ｉｉ）所望の配列が得られることを確かめるためにＤＮＡ配列決定に供され、そして（ｉｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、発現タンパク質の同定および整合性を確認した。合成コード配列は、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）でか、またはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）により構築される。
本発明の合成配列に対する同一％は、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索アルゴリズム（Ｔｉｍｅ Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃｌｉｎｅ Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＶ）を用いて、以下の例示的なパラメータ：重量マトリックス＝ｎｕｃ４×４ｈｂ；ギャップオープニングペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ギャップエクステンションペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、報告義務のある閾値（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１；アライメント閾値（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝２０で決定され得る。
本発明の異なる実施形態（例えば、構成）の、様々な形態が合わせられ得る。
本発明の合成ポリヌクレオチドの例示的な実施形態は、表Ｃに表される配列を含むが、これらに限定されない。
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 （Ｂ． 本発明の合成ポリヌクレオチドを含む発現カセットの作製）
本発明の合成ＤＮＡフラグメントは、以下の発現ベクターにクローニングされる：一時的な発現アッセイおよびＤＮＡ免疫研究のためのｐＣＭＶＫｍ２（ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６）から誘導され、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡ、次いで、下記に記載される合成配列のための挿入部位、次いで、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋを生成するためにポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されたという点においてのみ、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターとは異なる）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（ｐＣＭＶＩＩＩとしても公知である）；およびバキュロウイルス発現系において用いるためのｐＡｃＣ１３シャトルベクター（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７〜５９８２、１９９０に記載されるｐＡｃＣ１２由来であった）。これらのベクターの説明については、共有に係るＷＯ ００／３９３０２、ＷＯ ００／３９３０３、ＷＯ ｓ００／３９３０４、ＷＯ ０２／０４４９３も参照のこと。
簡単に、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（ｐＣＭＶＩＩＩ）の構築を下記に示した。ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ））リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に挿入し、ｐＥＴ−ＥＭＣＶを得た。ｄｈｆｒ遺伝子を、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからＰＣＲ増幅し、翻訳終止コドンに代わってＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を得、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨ１フラグメントとして挿入され、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを得た。次に、弱められたｎｅｏ遺伝子を、ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの独自のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）を得た。次いで、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺伝子の下流に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔを得た。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔの切断により調製した。ＣＭＶエンハンサー／プロモーター＋イントロンＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントとして、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９１）１９：３９７９〜３９８６）からｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に移した。Ｎｄｅ１部位からＳａｐ１部位までを、ｐＵＣ１９のベクター骨格から欠失させた。上記に記載したＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳがＣＭＶプロモーターの次に来て最終構築体を作製するように、この構築物に加えた。このベクターはまた、ａｍｐｒ遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
本発明の発現ベクターは、本明細書中に開示される（例えば、図で示される）一つ以上の合成コード配列を含む。発現カセットが１つより多くのコード配列を含む場合、コード配列はすべてインフレームであって、１つのポリタンパク質を生成し得るか；あるいは、１つより多いポリペプチドコード配列は、ポリシストロンのメッセージを含み得、ここで例えば、ＩＲＥＳは、それぞれのポリペプチドコード配列に対して、５’に位置する。
（実施例２）
（合成コード配列についての発現アッセイ）
野生型配列は、合成ＨＩＶ由来の配列がクローニングされたベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローニングされる。
野生型（任意の公知の単離体）および対応する合成配列を有する様々なベクターについての発現効率を、以下のように評価する。いくつかの哺乳動物細胞株（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ；全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９から入手される）由来の細胞を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（ＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、５４５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中の２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトする。これらの細胞を、縮小（ｒｅｄｕｃｅｄ）血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で５時間インキューベートする。次いで、培地を以下のように標準培地と入れ換える；２９３細胞（ＩＭＤＭ １０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））；ＲＤ細胞およびＣＯＳ−７細胞（Ｄ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））；ならびにＣＨＯ細胞、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。これらの細胞を、４８時間か６０時間のいずれかの時間にわたりインキューベートする。上清を収集して、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、そして必要に応じて−２０℃で保存する。
上清を、ＨＩＶ抗原に対する適切なモノクローナル抗体（例えば、ＨＩＶコア抗原に対するマウスモノクローナル）でコーティングした９６ウェルプレートを用いたＣｏｕｌｔｅｒ ｐ２４−アッセイ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳ）を用いて評価する。最適なＨＩＶ抗原は、コーティングされたウェルに結合し、ＨＩＶに対するビオチン化抗体は、この結合した抗原を認識する。結合体化ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−セイヨウワサビペルオキシダーゼはビオチンと反応する。ペルオキシダーゼとＴＭＢ基質との反応により、発色する。反応を、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させる。色の強度は、サンプル中のＨＩＶ抗原の量に、直接的に比例する。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をまた、製造業者の指導書に従って、Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ポリアミントランスフェクション試薬（Ｐａｎ Ｖｅｒａ）を用いて、本明細書中に記載される合成ＨＩＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒまたはｐＣＭＶＩＩＩベクター骨格）でトランスフェクトし、そして９６時間インキューベートする。９６時間後、培地を選択培地（２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む特別なＦ１２）に換え、細胞を１：５に分け、さらに４８時間インキューベートする。コロニーの形成が開始するまで培地を５〜７日ごとに入れ換え、コロニーが形成されるときにコロニーを拾い、９６ウェルにプレートにプレーティングし、そしてＣａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。ポジティブクローンを２４ウェルプレートに広げ、上に記載のように、Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡによってＨＩＶタンパク質産生について数回スクリーニングする。２４ウェルプレート内がコンフルーエンシーに達した後、ポジティブクローンをＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に広げる。コンフルーエンシー後、これらを数回スクリーニングし、ポジティブクローンをＴ７５フラスコに広げる。
ポジティブＴ７５クローンをＬＮ２中で凍結し、最も発現の高いクローンを、様々な濃度の０〜５μＭメトトレキセート（ＭＴＸ）で増幅させ、１００ｍｍ培養皿中にプレートする。プレートをコロニー形成についてスクリーニングし、そして全てのポジティブクローズド（ｃｌｏｓｅｄ）を、上記に記載のように再び広げる。クローンを広げ、捕捉ＥＬＩＳＡによって各工程で増幅およびスクリーニングする。ポジティブクローンを、各メトトレキセートレベルで凍結する。最も多く生成されるクローンを、より大きなバイオリアクターにスケールアップするように低血清懸濁培地条件に広げ、そして適応させるように、灌流バイオリアクター（３Ｌ、１００Ｌ）中で増殖させる。
本発明を支持して実施された実施例からのデータは、多様な細胞株において発現する場合、合成ＨＩＶ発現カセットが、ネイティブの（野生型）配列に対して、それらのタンパク質産物の生成の劇的な増加を提供し、そして、所望のＨＩＶポリペプチドを発現する、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株が生成され得ることを示す。ＣＨＯ細胞を用いたＨＩＶポリペプチドの生成は、（ｉ）正しいグリコシル化形パターンおよびタンパク質高次構造（ＭＡｂのパネルへの結合により決定される場合）；（ｉｉ）ＣＤ４レセプター分子への正しい結合；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞混入の非存在（例えば、昆虫ウイルスおよび／または昆虫細胞）；および（ｉｖ）容易な精製を提供する。
（実施例３）
（発現のウエスタンブロット分析）
本明細書中に記載されるＨＩＶ発現カセットをトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析を、共有に係るＷＯ ００／３９３０２に記載されるように本質的に実施する。簡単に言えば、ヒト２９３細胞を、実施例２に記載されるように、ネイティブまたは合成のＨＩＶ発現カセットを含む、ｐＣＭＶ６ａのベースのベクターでトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクション後、６０時間培養する。上清を記載したように調製する。細胞溶解物を、以下のように調製する。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で１回洗浄し、界面活性剤［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の１％ ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）］で溶解し、そして溶解物を新しいチューブに移す。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（前もって調製した（ｐｒｅ−ｃａｓｔ）８〜１６％；Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に、２０μｌの上清または１２．５μｌの細胞溶解液を充填する。タンパク質スタンダードもまた、充填する（５μｌ、広いサイズ範囲のスタンダード；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。電気泳動を行い、ＢｉｏＲａｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって推奨される転写緩衝液を用いて、１００ボルトで９０分間、転写を実施し、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写させる。この膜を、ＨＩＶ−１−ポジティブヒト患者血清にさらし、そしてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫染色する。
イムノブロッティング分析の結果を用いて、合成ＨＩＶ発現カセットを含む細胞が、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、１細胞当り高い濃度で、期待されるＨＩＶ−ポリペプチドを生成することを示す。
（実施例４）
合成ＨＩＶ発現カセットのインビボ免疫原性
Ａ．免疫
合成ＨＩＶ発現カセットの免疫原性を評価するために、マウス研究を実施し得る。プラスミドＤＮＡ（例えば、本発明の合成配列を含む発現カセットを有するｐＣＭＶＫＭ２）を、１００μｌの総注射容量において以下の最終濃度まで希釈する：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇおよび０．０２μｇ。希釈ＤＮＡの起こり得るネガティブな希釈効果を克服するために、各サンプル中の総ＤＮＡ濃度を、ベクター（ｐＣＭＶＫＭ２）単独を使用して、２０μｇまで上昇させる。コントロールとして、ネイティブな対応するポリペプチドをコードする発現カセットを含むプラスミドＤＮＡを、同様に扱う。４匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の１２群に、種々の投薬量を使用して筋肉内免疫する（５０μｌ／肢、前脛骨筋中に筋肉内注射）。
Ｂ．体液性免疫応答
体液性免疫応答を、マウス血清の適切な抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いて、免疫後０および４週目（群５〜１２）、そしてさらにそれぞれ免疫後６および８週目、２回目の免疫後２および４週目（群１〜４）に検査する。
血清の抗体価を抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡにより決定する。簡潔には、免疫マウス由来の血清を、適切なＨＩＶタンパク質（例えば、ＧａｇについてはＨＩＶ ｐ５５）に対する抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１ウェルあたり０．２μｇのＨＩＶタンパク質で一晩コートし、４回洗浄する；続いて、ブロッキングを、ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）で２時間行う。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希釈マウス血清を加える。血清を１／２５希釈で試験し、その後３倍系列希釈で試験する。マイクロタイタープレートを４回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキューベートする。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そして１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を１ウェルあたりに加えた。各ウェルの光学密度を１５分後に測定する。報告した力価は、最大半値光学密度（Ｏ．Ｄ．）を与えた血清の希釈率の逆数である。
プラスミド−ＤＮＡでのマウス免疫の結果を使用して、合成発現カセットが、ネイティブな発現カセットと比較して、免疫原性の向上を提供することを示す。また、２回目のブースト免疫は、２週間後に二次免疫応答を誘導する（群１〜３）。
Ｃ．細胞性免疫応答
特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度を、ペプチドをパルスしたＢａｌｂ／ｃマウスＣＤ４細胞の標準的なクロム放出アッセイにより評価する。ＨＩＶタンパク質発現ワクシニアウイルスに感染したＣＤ−８細胞を、ポジティブコントロールとして使用する（ｖｖ−タンパク質）。簡潔には、脾臓細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を、（上記のように免疫した）ＢＡＬＢ／ｃマウスから得る。細胞を培養し、再刺激し、そして例えば（Ｄｏｅ，Ｂ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ＡＩＤＳ １０（７）：７９３−７９４，１９９６に）記載されたＧａｇペプチドでパルスした標的細胞に対するＣＴＬ活性についてアッセイする。細胞傷害活性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定する。標的（Ｔ）細胞をエフェクター（Ｅ）細胞とともに種々のＥ：Ｔ比で４時間培養し、そして二連のウェルからの平均ｃｐｍを使用して特異的５１Ｃｒ放出（％）を算出する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を、本明細書中で記載したＨＩＶ ＤＮＡ構築物で免疫したマウスから回収した脾細胞において測定する。ＤＮＡ免疫動物由来のエフェクター細胞は、ＣＴＬ応答を示す、ＨＩＶペプチドでパルスしたＳＶ−ＢＡＬＢ（ＭＨＣが一致した）標的細胞の特異的溶解を示す。ペプチドでパルスされ、そしてＭＨＣが一致しないマウス系統（ＭＣ５７）に由来する標的細胞は、溶解されない。ＣＴＬアッセイの結果を使用して、ＤＮＡ免疫による、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導についての合成ＨＩＶ発現カセットの増加した効力を示す。
（実施例５）
（合成ＨＩＶ発現カセットのインビボ免疫原性）
（Ａ．一般的免疫化方法）
合成ＨＩＶ発現カセットの免疫原性を評価するために、モルモット、ウサギ、マウス、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）およびヒヒを用いる研究が実施される。これらの研究は、代表的には以下のように構成される：ＤＮＡ免疫化単独（単回または複数回）；タンパク質免疫化（追加免疫）をともなうＤＮＡ免疫化；シンドビス粒子免疫化をともなうＤＮＡ免疫化；シンドビス粒子単独による免疫化。
（Ｂ．モルモット）
実験は、モルモットにおいて以下のように実施され得る。各々が６匹のモルモットを含む群は、０、４、および１２週に、本明細書に記載される１つ以上の配列を含む発現カセットをコードするプラスミドＤＮＡで、筋肉内または粘膜により免疫化する。次いで、動物は、約１８週に、プラスミドブーストの配列（単数または複数）によりコードされるＨＩＶタンパク質および／またはその他のＨＩＶタンパク質の単回投与量（筋肉内、皮内または粘膜による）で追加免疫される。抗体力価（幾何平均力価）を、第３のＤＮＡ免疫化の２週間後および上記タンパク質追加免疫２週間後に測定する。これらの結果を用いて、免疫応答を生成する合成構築物の有用性、およびＤＮＡ免疫化後の免疫応答を増大するタンパク質追加免疫を提供する利点を証明する。
（Ｃ．ウサギ）
実験は、ウサギにおいて以下のように実施され得る。ウサギを、本明細書に記載のＨＩＶタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで、筋肉内、粘膜により、または皮内で免疫化する（Ｂｉｏｊｅｃｔニードルレスシリンジを用いる）。この核酸免疫化は、初期免疫化の後、タンパク質追加免疫をともなう。代表的には、本発明の合成ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む構築物は、高度に免疫原性であり、そしてウサギにおいてわずか２回の免疫化後に実質的な抗原結合抗体応答を生成する。
（Ｄ．体液性免疫応答）
任意の免疫化動物モデルにおいて、体液性免疫応答は、免疫化後の種々の時点で、抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）で、免疫化動物からの血清標本中でチェックされる。血清の抗体力価は、上記のように抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡにより決定される。要約すれば、免疫化動物からの血清は、動物を免疫化するために用いられた、上記ＤＮＡによりコードされたＨＩＶポリペプチド／タンパク質（単数または複数）、および／またはポリペプチドに対して惹起された抗体についてスクリーニングされる。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェルは、選択されたＨＩＶポリペプチド／タンパク質で一晩コートされ、そして４回洗浄される；次いで、ブロッキングが、ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）で２時間行われる。ブロッキング溶液を除去した後、１００μｌの希釈されたマウス血清を添加する。その後、血清を、１／２５希釈で、かつ系列３倍希釈によって試験する。マイクロタイタープレートを、４回洗浄し、そして二次の、ペルオキシダーゼ連結抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とインキューベートする。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そしてウェルあたり１００μｌの３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。各ウェルの吸光度を１５分後に測定する。力価は、代表的には、最大の半分の吸光度（Ｏ．Ｄ．）を与えた血清の希釈の逆数として報告される。
細胞性免疫応答もまた評価され得る。
（実施例６）
（本発明の合成ＨＩＶポリヌクレオチドを含む発現カセットを用いる、ヒヒおよびアカゲザルのＤＮＡ免疫化）
（Ａ．ヒヒ）
４匹のヒヒを、３回（０、４および８週）、本明細書に記載の遺伝子送達ヒビクルを用い、両側で大腿四頭筋肉中に筋肉内に、または粘膜により免疫化する。各免疫化の後２週間で動物から採血し、そしてＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡを、単離された血漿を用いて実施する。このＥＬＩＳＡは、二次抗体複合体が、１：５００の希釈で用いた、抗ヒトＩｇＧ、ｇ鎖特異的ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＤ６３１７８）であることを除いて、本質的に上記のように実施する。５０μｇ／ｍｌの酵母抽出物を、血漿サンプルと抗体複合体の希釈物に添加しても良く、ヒヒ中にある既存の酵母抗体に起因する非特異的バックグラウンドを低減する。リンパ球増殖応答は、第４の免疫化後２週（１４週目）にヒヒで観察され、そしてＨＩＶポリペプチドでの追加免疫（４４週および７６週）後に実質的に高められる。このような増殖結果は、Ｔヘルパー細胞機能の誘導の指標である。
（Ｂ．アカゲザル）
本発明のポリヌクレオチドをコードする、合成のコドン改変ＨＩＶポリペプチドの改良された能力は、発現プラスミド中に構築されるとき、アカゲザルで確認され得る。代表的には、アカゲザルは、改変ＨＩＶポリヌクレオチドの２または３の１ｍｇ投与量の後、検出可能なＨＩＶ特異的ＣＴＬを有する。要するに、これらの結果は、合成ＨＩＶ ＤＮＡは、非ヒト霊長類で免疫原性であることを証明する。中和抗体もまた検出され得る。
（実施例７）
（単一シストロン構築物および複数シストロン構築物の同時トランスフェクション）
本発明は、複数シストロン、単一シストロン発現カセットでの同時トランスフェクション、および１つ以上の複数シストロン発現カセットでの同時トランスフェクション、またはそれらの組合せを含む。
このような構築物は、種々の組合せで、一過性トランスフェクション研究のために２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされ得る。
例えば、２シストロン構築物が構築され得、ここで、異なるＨＩＶポリペプチドのコード配列が、単一ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、そして、この２つのコード配列の間に、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ）；Ｋｏｚａｋ、Ｍ．、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７（４５）：３８５〜４０２、１９９２；Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１４：６６０〜６６３、１９９５）配列が、第１のＨＩＶコード配列の後、かつ第２のＨＩＶコード配列の前に導入される。
細胞培養物から回収された上清液が、ＨＩＶタンパク質の存在について試験され、そしてトランスフェクトされた細胞中で適切なタンパク質が発現されていることを示す（例えば、Ｅｎｖコード配列が存在すれば、対応するＥｎｖタンパク質が検出される；Ｇａｇコード配列が存在すれば、対応するＧａｇタンパク質が検出される、など）。
これらの細胞株によるキメラＶＬＰの産生は、電子顕微鏡分析を用いて測定され得る（例えば、同時所有されるＷＯ ００／３９３０２を参照のこと）。
（実施例８）
（ＨＩＶ−１ワクチンのアクセサリー遺伝子成分：変異したＴａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆ型Ｃ抗原の機能分析）
ＨＩＶ調節遺伝子およびアクセサリー遺伝子は、それらのウイルス病原性における役割、高度に保存されたＣＴＬエピトープの高い割合、およびウイルス生活環におけるそれらの初期発現に起因して、ＨＩＶワクチンの成分として増加した注目を受けている。これら遺伝子の種々の所望されない性質のため、ワクチン成分としてそれらの安全性および適切性に関する疑問がもたれた。本発明を支持するために実施された実験は、候補ＨＩＶ−１サブタイプＣ ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ変異体を、効率的発現および潜在的に有害な機能の不活性化について分析した。他のＨＩＶサブタイプアクセサリー遺伝子は、同様に評価され得る。
Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ＨＩＶ−１サブタイプＣのコンセンサスＴａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆタンパク質をコードする、配列改変された変異体ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ遺伝子は、重複合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲを基礎にした部位特異的変異誘発を用いて構築された。個々のコンセンサス配列に緊密に似る単離物の野生型遺伝子の構築物もまた、ＰＣＲにより作製された。これら構築物のインビトロ発現は、ウェスタンブロッティングにより分析した。Ｔａｔ変異体のトランス活性化活性およびＲｅｖ変異体の核ＲＮＡ搬出活性は、種々の細胞株のトランスフェクションの後、レポーター−遺伝子を基礎にする機能性アッセイを用いて調査した。
すべての構築物のインビトロ発現は、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、またはＮｅｆ発現プラスミドでのマウスのＤＮＡワクチン接種により生成される抗原特異的マウス血清を用いるウェスタンブロッティングにより証明した。これら配列改変遺伝子の発現レベルは、野生型遺伝子より有意に高かった。
サブタイプＢおよびＣ Ｔａｔ ｃＤＮＡは変異されて、ＴａｔＣ２２、ＴａｔＣ３７、およびＴａｔＣ２２／３７を得た。Ｔａｔ活性は、３つの細胞株（ＲＤ、ＨｅＬａおよび２９３）においてアッセイする。サブタイプＣコンセンサスＴａｔのバックグラウンドにおいて、Ｃ２２における単一変異は、ＬＴＲ依存性ＣＡＴ発現を不活性化するには不十分であった。対照的に、この活性は、単一変異Ｃ３７、または二重変異Ｃ２２Ｃ３７を用いるＲＤ、２９３およびＨｅＬａ細胞中で有意に損傷された（表Ｂを参照のこと）。対応する結果が、サブタイプＢ株由来のＴａｔ変異体について得られた。
例示の結果が、２９３細胞中のＬＴＲ−ＣＡＴプラスミドに関するＴａｔ変異体のトランス活性化活性について図４中に提示されている。３つの独立のアッセイを、各構築物について実施した（図４、説明文（１）、（２）、（３））。
サブタイプＣ構築物であるＴａｔＣ２２ＰｒｏｔＲＴＴａｔＲｅｖＮｅｆおよびＰｒｏｔＲＴＴａｔＣ２２ＲｅｖＮｅｆは、ＴａｔＣ２２単独と比較したとき、減少したＴａｔ活性を示し、これは、多分、融合タンパク質により引き起こされた構造的変化に起因する。
Ｒｅｖ構築物には、機能の損失を試験するために、ネイティブまたは変異したＲｅｖを含むレポータープラスミドを用いるＣＡＴアッセイを用いた。図５に示されるように、野生型Ｒｅｖと比較して、二重変異をもつサブタイプＣ Ｒｅｖ、Ｍ５Ｍ１０（表Ｂを参照のこと）のｍＲＮＡ搬出機能は、有意により低かった。バックグラウンドレベルは、「偽」データ、およびＲｅｖなしのｐＤＭ１２８レポータープラスミドデータに示されている。２つの独立したアッセイを、各構築物について実施した（図５、説明文（１）、（２））。
Ｎｅｆ特異的機能を測定するためのアッセイもまた実施され得る（Ｎｅｆ変異は、表Ｂ中に記載されている）。例えば、ＦＡＣＳ分析を用いて、細胞表面上のＭＨＣ１およびＣＤ４の存在を捜す。細胞を、Ｎｅｆ発現の存在下および不在下（コントロール）、ならびにネイティブｎｅｆタンパク質および変異ｎｅｆタンパク質をコードする本発明の合成ポリヌクレオチドを用いアッセイする。ＭＨＣ１およびＣＤ４発現のダウンレギュレーションは、ｎｅｆ遺伝子産物が機能的でないこと、すなわち、ｎｅｆが非機能的であれば、ダウンレギュレーションはないことを示す。
これらのデータは、複数成分ＨＩＶ−１サブタイプＣワクチンの一部を形成し得るｔａｔおよびｒｅｖＤＮＡ免疫原の損傷した機能を示す。他グループによって先に公開されたデータとは対照的に、このＣ２２変異は、Ｔａｔのトランス活性化機能を十分に不活性化しなかった。Ｃ３７変異は、サブタイプＣおよびサブタイプＢ Ｔａｔタンパク質の不活性化に必要であるようであった。
（実施例９）
（種々のＨＩＶポリペプチドをコードするプラスミドの免疫原性の評価）
上記のように、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドまたは発現カセットの免疫原性は、容易に評価される。以下の表（表Ｄ）は、ウサギにおけるエレクトロポレーションを用いる、個々のサブタイプのワクチンおよび混合されたサブタイプのワクチンの両方の、サブタイプＢおよびＣエンベローププラスミドの免疫原性の比較を含む例示の手順である。このような方法は、任意の他のＨＩＶポリペプチドに等しく適用可能であることが明らかである。
Figure 0004302513
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 ＭＦ５９Ｃアジュバントは、４℃で１０ｍＬアリコート中に貯蔵された、１０ｍＭクエン酸ｐＨ６中に、５％スクアレン、０．５％ｔｗｅｅｎ８０、０．５％スパン８５を含む微小流動化されたエマルジョンである。
免疫原は、種々の群中の動物への投与のために、以下の表（表Ｅ）に記載のように調製される。濃度は、この表中に記載される濃度から、例えば、用いられている配列および／またはタンパク質に依存して変動され得る。
Figure 0004302513
 免疫化（表Ｆ）および採血（表Ｇ）スケジュールは以下のようである：
Figure 0004302513
 （実施例１０）
（ＧａｇおよびＰｏｌ構築物を用いるマウス免疫化研究）
細胞性免疫応答および体液性免疫応答を、以下の構築物について（本質的に実施例４に記載のように）評価した：Ｇａｇ、ＧａｇＰｒｏｔｅａｓｅ（＋ＦＳ）（ＧＰ１、最適化されたプロテアーゼコドンおよびＩＮＳの不活性化；ＧＰ２、プロテアーゼＩＮＳの不活性化のみ）、フレームシフトをもつＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼ（ｇａｇＦＳｐｏｌ）、およびＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼインフレーム（ＧａｇＰｏｌ）（図９１を参照のこと）。ＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼインフレームの複数のバージョンもまた、弱力化（ＧａｇＰｏｌＡｔｔ）または非機能的プロテアーゼ（ＧａｇＰｏｌＩｎａ）とともに設計した。
インビトロ発現データは、Ｇａｇ単独、ＧａｇＰｒｏｔｅａｓｅ（＋ＦＳ）、ＧａｇＦＳｐｏｌおよびＧａｇＰｏｌＩｎａを用いてｐ５５Ｇａｇおよびｐ６６ＲＴの匹敵する発現を示した。完全に機能的または弱力化したプロテアーゼ（ＧａｇＰｏｌまたはＧａｇＰｏｌＡｔｔ）をもつ構築物は、おそらくは、プロテアーゼの細胞傷害性効果に起因してｐ５５Ｇａｇおよびｐ６６ＲＴの発現においてより効率的でなかった。
ｐＣＭＶベクター中のＧａｇ対ＧＰ１およびＧａｇ対ＧＰ２を用いるマウスのＤＮＡ免疫化は、前脛骨筋中の筋肉内で実施した。マウスを研究の開始時（０週）および４週間後に免疫化した。採血を０、４、および６週で実施した。ＤＮＡ投与量は以下のようであった：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、および０．０２μｇ。
ｐＣＭＶベクター中のＧａｇ対ｇａｇＦＳｐｏｌを用いるマウスのＤＮＡ免疫化は、前脛骨筋中の筋肉内で実施した。マウスを、研究の開始時（０週）に免疫化し、そして４週間後にＧａｇ（ｒＶＶｇａｇ）をコードする組換えワクシニアウイルスで抗原投与した。採血を０および４週で実施した。ＤＮＡ投与量は以下のようであった：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、および０．０２μｇ。
ｐＣＭＶベクター中のＧａｇ対ｇａｇＦＳｐｏｌおよびＧａｇ対ｇａｇｐｏｌを用いるマウスのＤＮＡ免疫化は、前脛骨筋中の筋肉内で実施した。マウスを、研究の開始時（０週）に免疫化し、そして抗原投与４週間後にＧａｇ（ｒＶＶｇａｇ）をコードする組換えワクシニアウイルスで抗原投与した。採血を０および４週で実施した。ＤＮＡ投与量は以下のようであった：２μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇおよび０．００２μｇ。
Ｇａｇに対する細胞性免疫応答は、すべての試験された改変体、例えば、Ｇａｇ、ＧａｇＰｒｏｔｅａｓｅ、ｇａｇＦＳｐｏｌおよびＧａｇＰｏｌＩｎａについて比較し、すべてが同等の能力を有していた。
Ｇａｇに対する体液性免疫応答もまた、ＧＰ２および特にＧＰ１を除いて同等であった。体液性免疫応答は、機能的または弱力化プロテアーゼを含む構築物でより弱く、これは、過剰活性プロテアーゼによって引き起こされるｐ５５Ｇａｇのより効率的でない分泌に起因し得る。
本発明を支持するために実施されたインビトロおよびインビボ実験は、Ｇａｇの発現および免疫原性は、すべての構築物で同等であったことを示唆する。例外は、完全に機能的であるか、または弱力化プロテアーゼをもつＧａｇＰｏｌインフレームであった。これはプロテアーゼの細胞傷害性効果の結果であり得る。マウスにおける免疫応答は、インビトロの発現の相対的レベルと相関した。
（実施例１１）
（Ｃ型誘導エンベロープポリペプチドを使用しての中和抗体のタンパク質発現、免疫原性および産生）
サブタイプＣの主要な単離物ＴＶ１、（これは南アフリカの個体から回収された）由来のエンベロープ（Ｅｎｖ）ワクチンを、以下のようにウサギで試験した。遺伝子カセットを設計し、ｇｐ１２０（表面抗原）、ｇｐ１４０（表面抗原および膜貫通タンパク質ｇｐ４１の外側ドメイン）、および可変ループ領域（Ｖ２およびＶ１Ｖ２）の欠失を有するか、有さないＨＩＶ−１エンベロープポリタンパク質の全長（ｇｐ１２０およびｇｐ４１）のｇｐ１６０形態を発現する。全ての遺伝子を、Ｒｅｖ非依存様式で、コード化糖タンパク質の発現を増強するように配列改変し、次いで、これらを、上記のようにＤＮＡワクチンおよびタンパク質生産適用のためのｐＣＭＶベースのプラスミドへとクローン化した。これらの配列を本明細書中に記載されるようにコドン最適化した。簡潔に述べると、全ての改変されたエンベロープ遺伝子を、カイロンｐＣＭＶ連結ベクター、好ましくはＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位へとクローン化した。
（Ａ．タンパク質発現）
ＴＶ１ Ｅｎｖ抗原の全長（ｇｐ１６０）、短縮型ｇｐ１４０（Ｅｎｖ外側ドメインのみ）およびｇｐ１２０のネイティブバージョンを、本明細書中に記載の発現カセットから生産した。ｇｐ１４０コード配列を、２９３Ｔ細胞へと一過性にトランスフェクトした。遺伝子産物の発現レベルを、組織内抗原捕獲ＥＬＩＳＡによって評価した。ＴＶ００１ｃ８．２、ＴＶ００１ｃ８．５およびＴＶ００２ｃ１２．１のネイティブ配列から構築されたエンベロープ遺伝子は、インビトロで正しいタンパク質を発現し、ｇｐｌ４０ＴＶ００１ｃ８．２は、最も高い発現レベルを示した。さらに、ＴＶ１由来クローン８．２から発現したＥｎｖタンパク質は、ＣＤ４レセプタータンパク質を結合することを見出した（これは、発現タンパク質のこの特性が、機能的コンホメーションにおいて維持されることを示す）。発現したＴＶ１ ｇｐ１６０タンパク質結果のレセプター結合特性／機能をまた、細胞融合アッセイによって確認した。
合計発現は、ネイティブｇｐ１４０遺伝子カセットと比較して、合成ｇｐ１４０構築物では約１０倍増加した。改変したｇｐ１２０改変体およびｇｐ１４０改変体の両方は、上清中に高い量のタンパク質を分泌した。さらに、ｇｐ１４０のＶ２欠失形態およびＶ１Ｖ２は、インタクトなｇｐ１４０よりも約２倍のより多いタンパク質を発現した。全体で、合成ｇｐ１４０遺伝子改変体の発現レベルは、ネイティブな配列を有するｇｐ１４０遺伝子と比較して１０〜２６倍に増加した。
つまり、試験された各合成構築物は、ネイティブなコード配列を使用する構築物に対し、１０倍以上増加した発現のレベルを示した。さらに、全ての発現タンパク質は、予測された分子量であり、そしてＣＤ４に結合することが示された。安定なＣＨＯ細胞株を誘導し、そして小スケールのタンパク質精製方法を使用して、ワクチン研究のために、少量のこれらのタンパク質の欠失していない形態およびＶ欠失オリゴマー形態（ｏ−ｇｐ１４０）の各々を生成した。
（Ｂ．ＴＶ１００ウイルス単離物およびＴＶ００２ウイルス単離物の中和特性）
一過性発現実験は、ＴＶ１００ウイルス単離物およびＴＶ００２ウイルス単離物由来のエンベロープ遺伝子が、所望のタンパク質産物を発現することを示した。１８人の感染した南アフリカ個体（サブタイプＢおよびＣ）由来の血清を使用して、これらの２つのウイルス株の相対的中和感受性は、以下の通りであった。ＴＶ２株は、１：１０の血清希釈で、１８／１８の血清によって中和され、１：５０希釈では１６／１８；１：２５０希釈では１５／１８で中和された。比較すると、ＴＶ１単離物は、１：１０希釈で１５／１８：１：５０希釈で６／１８のみ中和され；そして１：２５０希釈で検体のひとつも中和されなかった。さらに、ＴＶ００１患者の血清は、試験された全ての希釈物でＴＶ００２単離物に対して中和活性を示した。対照的に、ＴＶ００２は、１：１０の血清希釈でのみＴＶ００１の中和を示した。これらの結果は、ＴＶ００１単離物が、ＴＶ００２よりもその感染した宿主において、より広範でかつ強力は中和抗体応答を誘導し得ることを示唆する。
（Ｃ．ウサギ研究における改変ＴＶ１ Ｅｎｖ ＤＮＡおよびタンパク質抗原の免疫原性）
ＴＶ１ Ｅｎｖ ＤＮＡ（合成発現カセットを含む）およびタンパク質ワクチンを、以下の表Ｈに示されるように投与した。
Figure 0004302513
 １群あたり４匹のウサギの７つの群を、指定されたプラスミドＤＮＡおよびオリゴマーのＥｎｖタンパク質抗原を用いて免疫した。ＤＮＡの３回用量（１回の免疫あたり１匹の動物に１ｍｇのＤＮＡ）を、ニードル注射によって筋内に投与し、次いで０週目、４週目および２０週目にエレクトロポレーションした。ＭＦ５９アジュバント中の１００μｇのＥｎｖタンパク質の単回用量をまた、２０週で筋内の別の部位に与えた。
ＤＮＡ免疫は、サブタイプＣの配列改変遺伝子（ＴＶ１）（ｇｐｌ６０、ｇｐｌ６０ｄＶ２、ｇｐｌ６０ｄＶｌＶ２、ｇｐｌ４０、ｇｐｌ４０ｄＶ２およびｇｐｌ４０ｄＶｌＶ２）ならびにサブタイプＢ ＳＦ１６２の配列改変ｇｐｌ４０ｄＶ２を使用した。ＤＮＡ免疫は、ニードル注射によって筋内経路を介して、筋細胞および常在性抗原提示抗原細胞のトランスフェクションを促進するためのエレクトロポレーションを使用して、０週、４週および２０週で行った。
単回のＥｎｖタンパク質追加免疫（ＭＦ５９アジュバント中）を、別の部位で筋内注射によって２０週目に与えた。抗体力価を、各々の後免疫に次いで、ＥＬＩＳＡによって評価した。血清検体を、０週目、４週目、６週目、８週目、１２週目、２２週目、および２４週目に回収した。血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡで測定した。９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌの濃度のタンパク質でコートした。血清サンプルを、系列的に３倍希釈した。ヤギの抗ウサギペルオキシダーゼ結合体（１：２０，０００）を検出のために使用した。ＴＭＢを基体として使用し、そして抗体力価を、４５０ｎｍで０．６ＯＤで読み取った。
ＰＢＭＣ増殖Ｒ５ ＨＩＶ−１株に対する中和抗体応答を、２つの異なる研究所における２つの異なるアッセイ（Ｃｈｉｒｏｎにおける５．２５レポーター細胞株ベースのアッセイおよびＤｕｋｅ大学におけるＤａｖｉｄ ＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉのＰＢＭＣベースのアッセイ）を使用して、免疫したウサギから収集した血清においてモニターした。結果を、図９４、図９５、および図９６に示す。このＣｈｉｒｏｎアッセイを、基本的に以下のように実施した。ＰＢＭＣ増殖ＣサブタイプＴＶ００１株およびＰＢＭＣ増殖ＣサブタイプＴＶ００２株に対する中和抗体応答を、５．２５細胞株を用いる組織内レポーター細胞株アッセイを使用して測定した。この細胞は、その細胞膜上にＣＤ４レセプター／コレセプター、ＣＣＲ５レセプター／コレセプター、ＣＸＣＲ４レセプター／コレセプターおよびＢＯＮＺＯレセプター／コレセプターを有する。親のＣＥＭ細胞株は、急性リンパ芽球性白血病に罹患した４歳の白人の（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）女性に由来した。この細胞をヒトＢ細胞株７２１．１７４と融合して、ＣＥＭｘ１７４を作製した。ＣＣＲ５遺伝子（約１．１ｋｂ）を、ｐＢＡＢＥ ｐｕｒｏレトロウイルスベクターのＢａｍＨ−Ｉ（５’）およびＳａｌ−Ｉ（３’）にクローニングし、続いてＣＥＭｘ１７４に導入した後、ＬＴＲ−ＧＦＰをこの細胞にトランスフェクトした。この細胞の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ）によって検出した。ウイルス中和アッセイのために、力価決定した５０ｕｌのウイルスおよび５０ｕｌの希釈免疫血清または免疫前血清を、室温で１時間インキューベートした。２４ウェルプレートにプレートした、１０４細胞／ｍｌ細胞を有するウェルに、この混合物を添加し、そして３７℃で５〜７日間インキューベートした。次いで、この細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、２％ホルムアルデヒドで固定した。Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを使用して、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎにて各サンプルについて１５，０００事象（細胞）を収集した。示したデータは、３連のウェルの平均であった。以下の式：ウイルス阻害％＝（ウイルスコントロール−実験）／（ウイルスコントロール−細胞コントロール）×１００、を使用して、ウイルスコントロールと比較した中和％を算出した。採血前に観察されたすべてのウイルス阻害を、各個々の動物について差し引いている。＞５０％の値を陽性と見なし、グレーで強調する。
図９５において、「＃」は、動物が、採血前血清において高いレベルのウイルス阻害（＞２０％ウイルス阻害）（これは、観察した阻害の大きさ、およびいくつかの場合、有意な中和抗体活性（＜５０％阻害）の存在について、その血清を陽性または陰性としてスコア付けする本発明者らの能力に影響した）を有したことを示す。
図９６に示すデータについて、単回のタンパク質追加免疫の後（３回目の後（ｐｏｓｔ−ｔｈｉｒｄ））収集した血清サンプルを、ウイルスで１：８希釈（細胞添加後１：２４）において３連でスクリーニングした。示した値は、対応する採血前コントロールサンプルにおけるｐ２４合成に対する、ｐ２４合成の減少％である。０値は、陰性の値が測定されたか、または値が測定されなかったことを示す。ＮＶ（有効でない（ｎｏｔ ｖａｌｉｄ））は、免疫前血清におけるウイルス阻害に起因する。ｐ２４が、少なくとも８０％低減された場合、中和を陽性と見なした；これらのサンプルを、ダークグレーで強調する。より明るいグレーの陰影を付けたサンプルは、ｐ２４の合成において少なくとも５０％の減少を示した。
図９２は、プレートをモノマーのｇｐ１２０．ＴＶ１タンパク質でコートした際のＥＬＩＳＡデータを示す。このタンパク質は、免疫に使用したＣサブタイプ遺伝子に相同である。全ての免疫群が、２回目のＤＮＡ免疫の後、高い抗体価を生じた。ｇｐ１４０形態のＤＮＡで免疫した群は、１回目のＤＮＡ免疫および２回目のＤＮＡ免疫の両方の後、ｇｐ１６０形態を使用した群と比べて相対的に高い幾何平均抗体価を有する。ｇｐ１４０．ＴＶ１遺伝子およびｇｐ１４０ｄＶ１Ｖ２．ＴＶ１遺伝子の両方は、２回目のＤＮＡ免疫の２週間後において高い抗体価（約１０４）を生じた；ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１プラスミドは、この時点および他のすべての時点で最高の抗体力価（＞１０４）を生じた。ｇｐ１２０．ＴＶ１タンパク質に対する結合抗体価は、約１０３の力価を示す異種ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２遺伝子で免疫した群よりも、同種ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１遺伝子で免疫した群について高かった。２回目のＤＮＡ免疫の後、全ての群が、８週目までに抗体価におけるいくらかの下落を示した。２０週目でのＤＮＡ＋タンパク質追加免疫の後、全ての群が、２回目のＤＮＡ免疫の後に以前に観察した力価より高い力価に到達した（０．５〜１．０対数増加を観察した）。タンパク質追加免疫の後、ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１ ＤＮＡまたはｇｐ１６０ｄＶ２．ＴＶ１ ＤＮＡによって初回抗原刺激されたかに関わらず、ｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１タンパク質を受けた全ての動物は、最高の抗体価を示した。
結合抗体価をまた、オリゴマーＣサブタイプｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１タンパク質またはＢサブタイプｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２タンパク質のいずれかでコートしたＥＬＩＳＡプレートを使用して測定した（図９３）。全てのＴＶ１ Ｅｎｖ免疫群について、オリゴマータンパク質であるｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１を使用して測定した抗体価は、モノマー（非Ｖ２欠失）タンパク質であるｇｐ１２０．ＴＶ１を使用して測定した抗体価より高かった。実際、これらの群について、異種のＢサブタイプｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２タンパク質を用いて観察した力価は、ＣサブタイプＴＶ１ｇｐ１２０を用いて測定された力価と同等であるか、またはそれよりも高かった。それにもかかわらず、Ｃサブタイプ抗原で免疫した全ての群は、Ｂサブタイプｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２に結合する力価よりも高い、Ｃサブタイプｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１タンパク質に結合する力価を示した。逆に、ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２免疫原で免疫した群は、オリゴマーＢサブタイプタンパク質を用いると、そのＣサブタイプ対応物より高い抗体価を示した。概して、３つのアッセイはすべて、高い抗体交差反応性抗体が、ＣサブタイプＴＶ１ベースのＤＮＡ免疫原およびタンパク質免疫原によって産生されることを示した。
これらの結果は、ＣサブタイプＴＶ１由来のＥｎｖ ＤＮＡ抗原およびタンパク質抗原が、免疫原性であり、免疫されたウサギにおいて高い力価の抗体を誘導すること、ならびにＢサブタイプＲ５ウイルス株およびＣサブタイプＲ５ウイルス株の両方に対する中和抗体の実質的な証拠であることを示す。特に、ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１抗原は、ＢサブタイプＳＦ１６２ＥｎｖＤＶ２株およびＣサブタイプＴＶ２株に対する一貫した中和反応を誘導している。従って、ＴＶ１ベースのＥｎｖ ＤＮＡ抗原およびタンパク質ベースの抗原は、免疫原性であり、そしてＣサブタイプＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原およびＢサブタイプＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原の両方に反応性である高力価抗体応答を誘導する。２回のみのＤＮＡ免疫後、いくつかの群で中和感受性ＢサブタイプＲ５ ＨＩＶ−１ＳＦ１６２ＤＶ２に対する中和抗体応答を観察した。Ｅｎｖタンパク質での単回の追加免疫の後、ＴＶ１ ＥｎｖのＶ２欠失形態を受けた群のウサギの大多数が、密接に関連するＣサブタイプＴＶ２初代株に対する中和活性を示した。
（実施例１２）
（Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓにおける免疫学的応答）
表Ｉに示すように構成された免疫研究において、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を、３群のｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ（各群は、４匹の動物で構成された）において評価した。免疫組成物についての投与経路は、いずれの場合においてもエレクトロポレーションであった。抗体価を、２回目の免疫の２週間後について表Ｉに示す。
Figure 0004302513
Figure 0004302513
 ＊ｐＣＭＶｇａｇ＝ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ Ｔｙｐｅ Ｃ Ｂｏｔｓｗａｎａ
ｐＣＭＶｅｎｖ＝ｐＣＭＶＬｉｎｋ．ｇｐ１４０ｅｎｖ．ｄＶ２．ＴＶ１（Ｔｙｐｅ Ｃ）
ｐＣＭＶｐｏｌ＝ｐＣＭＶＫｍ２．ｐ２Ｐｏｌ．ｍｕｔ。Ｉｎａ Ｔｙｐｅ Ｃ Ｂｏｔｓｗａｎａ
ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌ＝ｐＣＭＶＫｍ２．ｇａｇＣｐｏｌ．ｍｕｔ，Ｉｎａ Ｔｙｐｅ Ｃ Ｂｏｔｓｗａｎａ。
１回目の免疫の前０週において、免疫前血清を得た。０週目において、１回目の免疫を実施した。４週目において２回目の免疫を実施した。１回目の採血を、２回目の免疫の２週後（すなわち、６週目）に実施した。３回目の免疫を８週目に、そして４回目の免疫を、１６週目に実施した。動物２Ａ、動物３Ａ、動物３Ｂおよび動物３Ｄは、以前（おおよそ４年以上前）に、ｇａｇプラスミドＤＮＡまたはｇａｇＶＬＰ（サブタイプＢ）でワクチン接種されている。
バルクＣＴＬ、５１Ｃｒ放出アッセイ、およびフロー細胞サイトメトリー法を使用して、表Ｊおよび表Ｋ中のデータを得た。ｇａｇ特異的Ｔ細胞およびｐｏｌ特異的Ｔ細胞を検出するために使用した試薬は、以下であった：（ｉ）「ｇａｇＣｐｏｌ」抗原（ｎ＝３７７）に広がる合成重複ペプチド（代表的には、このペプチドは、１１マーまでの重複を有する１５マーのプールであり、このプールは、以下：プール１、ｎ＝１〜８２、プール２、ｎ＝８３〜１６４、プール３、ｎ＝１６５〜２７１、プール４、ｎ＝２７２〜３７７であり、従ってプール１およびプール２は、「ｇａｇ」特異的であり、そしてプール３およびプール４は、「ｐｏｌ」特異的である）、ならびに（ｉｉ）組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）（例えば、ｒＶＶｇａｇ９６５、ｒＶＶｐ２Ｐｏｌ９７５（ｐ２ｐ７ｇａｇ９７５を含む）、およびＶＶｗｒ親ウイルス）。
２回目の免疫の後に、血液中のＧａｇ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｇａｇ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｐｏｌ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＰｏｌ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、上の表Ｉに記載の各動物について決定した。結果を、表Ｊおよび表Ｋに示した。表Ｋに示すｐｏｌ特異的活性のうちいくらかは、ｐ２ｐ７ｇａｇに対して惹起された可能性がある。
Figure 0004302513
 ？＝ｖＶＶｐ２Ｐｏｌに対して陽性であり得る。
Figure 0004302513
 これらの結果は、本発明の構築物が、選択されたＨＩＶポリペプチド抗原に対する特異的細胞応答および体液性応答を生成可能であることを支持する。
本発明の好ましい実施形態はいくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、明らかな改変がなされ得ることが、理解される。
図１Ａ〜図１Ｄは、Ｃ型ＨＩＶ ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（配列番号１；本明細書中でＴＶ１と称される）のヌクレオチド配列を示す。種々の領域を表Ａに示す。 図２Ａ〜図２Ｃは、種々のＨＩＶ単離物（ＳＦ１６２、配列番号２；ＴＶ１．８＿２、配列番号３；ＴＶ１．８＿５，配列番号４；ＴＶ２．１２−５／１、配列番号５；コンセンサス配列、配列番号６）由来のＥｎｖポリペプチドのアライメントを示す。これらの矢印の間の領域は、削除および／または短縮され得る、βシート領域および／または架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）シート領域における（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローン、両方ともＣ型ＨＩＶの単離体の）領域を示す。この「＊」は、（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）Ｎ連結グリコシル化部位、改変（例えば、欠失および／または変異）され得る１つ以上の部位を記載する。 図２Ａのつづき。 図２Ｂのつづき。 図３は、ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドの以下：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の形態間の関係を示す概念図を示す。 図４は、２９３細胞におけるＬＴＲ−ＣＡＴプラスミドの発現に対するＴａｔ変異体の転写活性に関する例示的データを示す。 図５は、ＣＡＴ発現によってモニタリングされるＲｅｖ変異体の輸送（ｅｘｐｏｒｔ）活性に関する例示的データを示す。 図６（シート１およびシート２）は、構築物ｇａｇＣｐｏｌＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号９）を示す。 図６（シート１およびシート２）は、構築物ｇａｇＣｐｏｌＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号９）を示す。 図７（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号１０）を示す。 図７（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号１０）を示す。 図８は、構築物ＧａｇＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号１１）を示す。 図９（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１２）を示す。 図９（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１２）を示す。 図１０（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１３）を示す。 図１０（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１３）を示す。 図１１（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１４）を示す。 図１１（シート１およびシート２）は、構築物ＧａｇＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１４）を示す。 図１２は、構築物ＧａｇＴａｔＲｅｖＮｅｆ＿Ｃの配列（配列番号１５）を示す。 図１３は、構築物ｉｎｔ．ｏｐｔ．ｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１６）を示す。 図１４は、構築物ｉｎｔ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１７）を示す。 図１５は、構築物ｉｎｔ．ｏｐｔ．ｍｕｔ＿Ｃの配列（配列番号１８）を示す。 図１６は、構築物ｉｎｔ．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号１９）を示す。 図１７は、構築物ｎｅｆ．Ｄ１２５Ｇ．−ｍｙｒ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２０）を示す。 図１８は、構築物ｎｅｆ．Ｄ１０７Ｇ．−ｍｙｒ１８．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２１）を示す。 図１９は、構築物ｎｅｆ．ｏｐｔ．Ｄ１２５Ｇ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２２）を示す。 図２０は、構築物ｎｅｆ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２３）を示す。 図２１は、構築物Ｎｅｆ＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号２４）を示す。 図２２は、構築物Ｎｅｆ＿ＴＶ２＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号２５）を示す。 図２３は、構築物ＮｅｆＤ１２４Ｇ＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号２６）を示す。 図２４は、構築物ＮｅｆＤ１２４Ｇ＿ＴＶ２＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号２７）を示す。 図２５は、構築物ＮｅｆＤ１２４Ｇ＿Ｍｙｒ−ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号２８）を示す。 図２６は、構築物ｎｅｆ．Ｄ１０６Ｇ．−ｍｙｒ１９．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号２９）を示す。 図２７は、構築物ｐ１５ＲｎａｓｅＨ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３０）を表す。 図２８は、構築物ｐ１５ＲｎａｓｅＨ．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号３１）を表す。 図２９は、構築物２ｐＰｏｌ．ｏｐｔ．ＹＭＷＭ．ＳＦ２の配列（配列番号３２）を表す。 図３０は、構築物ｐ２ＰｏｌＩｎａｏｐｔ．ＹＭ．ＳＦ２の配列（配列番号３３）を表す。 図３１は、構築物ｐ２Ｐｏｌｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３４）を表す。 図３２は、構築物ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ｎａｔｉｖｅ＿Ｂの配列（配列番号３５）を表す。 図３３のシート１およびシート２は、構築物ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号３６）を表す。 図３３のシート１およびシート２は、構築物ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号３６）を表す。 図３４は、構築物ｐ２Ｐｏｌ．ｏｐｔ．ＹＭＷＭ＿Ｃの配列（配列番号３７）を表す。 図３５は、構築物ｐ２Ｐｏｌｏｐｔ．ＹＭ＿Ｃの配列（配列番号３８）を表す。 図３６は、構築物ｐ２Ｐｏｌｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号３９）を表す。 図３７は、構築物ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ ｏｐｔ Ｃの配列（配列番号４０）を表す。 図３８は、構築物ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ｎａｔｉｖｅ＿Ｃの配列（配列番号４１）を表す。 図３９は、構築物ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号４２）を表す。 図４０は、構築物ｐｏｌ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４３）を表す。 図４１は、構築物Ｐｏｌ＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号４４）を表す。 図４２は、構築物Ｐｏｌ＿ＴＶ２＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号４５）を表す。 図４３は、構築物ｐｒｏｔ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４６）を表す。 図４４は、構築物ｐｒｏｔＩｎａ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４７）を表す。 図４５は、構築物ｐｒｏｔＩｎａＲＴ．ＹＭ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４８）を表す。 図４６は、構築物ｐｒｏｔＩｎａＲＴ．ＹＭＷＭ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４９）を表す。 図４７は、構築物ＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号５０）を表す。 図４８は、構築物ｐｒｏｔＲＴ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号５１）を表す。 図４９は、構築物ＰｒｏｔＲＴ．ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号５２）を表す。 図５０は、構築物ＰｒｏｔＲＴＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号５３）を表す。 図５１は、構築物ｐｒｏｔＩｎａＲＴ．ＹＭ．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号５４）を表す。 図５２は、構築物ｐｒｏｔＩｎａＲＴ．ＹＭＷＭ．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号５５）を表す。 図５３は、構築物ＰｒｏｔＲＴ．ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号５６）を表す。 図５４は、構築物ｒｅｖ．ｅｘｏｎ１＿２．Ｍ５−１０．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号５７）を表す。 図５５は、構築物ｒｅｖ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号５８）を表す。 図５６は、構築物ｒｅｖ．ｅｘｏｎ１＿２．Ｍ５−１０ｏｐｔ＿Ｃの配列（配列番号５９）を表す。 図５７は、構築物ｒｅｖｅｘｏｎ１＿２．ＴＶ１ Ｃ ＺＡｏｐｔの配列（配列番号６０）を表す。 図５８は、構築物ＲＴ．ｏｐｔ．ＳＦ２（変異体）の配列（配列番号６１）を表す。 図５９は、構築物ＲＴ．ｏｐｔ．ＳＦ２（ネイティブ）の配列（配列番号６２）を表す。 図６０は、構築物ＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号６３）を表す。 図６１は、構築物ｔａｔ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．Ｃ２２−３７．ＳＦ２の配列（配列番号６４）を表す。 図６２は、構築物ｔａｔ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．Ｃ３７．ＳＦ２の配列（配列番号６５）を表す。 図６３は、構築物ｔａｔ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．Ｃ２２−３７＿Ｃの配列（配列番号６６）を表す。 図６４は、構築物ｔａｔ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．Ｃ３７＿Ｃの配列（配列番号６７）を表す。 図６５は、構築物ＴＡＴ＿ＣＹＳ２２＿ＳＦ１６２＿ＯＰＴの配列（配列番号６８）を表す。 図６６は、構築物ｔａｔ＿ｓｆ１６２＿ｏｐｔの配列（配列番号６９）を表す。 図６７は、構築物ＴａｔＣ２２Ｅｘｏｎ１＿２＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号７０）を表す。 図６８は、構築物ＴａｔＥｘｏｎ１＿２＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号７１）を表す。 図６９は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ｎａｔｉｖｅ．ＳＦ１６２の配列（配列番号７２）を表す。 図７０は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号７３）を表す。 図７１は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇ Ｂの配列（配列番号７４）を表す。 図７２のシート１および２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆｇａｇＣｐｏｌＩｎａ Ｂの配列（配列番号７５）を表す。 図７２のシート１および２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆｇａｇＣｐｏｌＩｎａ Ｂの配列（配列番号７５）を表す。 図７３のシート１および２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ Ｂの配列（配列番号７６）を表す。 図７３のシート１および２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ Ｂの配列（配列番号７６）を表す。 図７４は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆｐ２Ｐｏｌ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号７７）を表す。 図７５は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆｐｒｏｔＲＴｏｐｔ Ｂの配列（配列番号７８）を表す。 図７６は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ｎａｔｉｖｅ＿ＺＡの配列（配列番号７９）を表す。 図７７は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿ＺＡの配列（配列番号８０）を表す。 図７８は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇ Ｃの配列（配列番号８１）を表す。 図７９のシート１およびシート２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆｇａｇＣｐｏｌＩｎａ Ｃの配列（配列番号８２）を表す。 図７９のシート１およびシート２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆｇａｇＣｐｏｌＩｎａ Ｃの配列（配列番号８２）を表す。 図８０のシート１およびシート２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ Ｃの配列（配列番号８３）を表す。 図８０のシート１およびシート２は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ Ｃの配列（配列番号８３）を表す。 図８１は、構築物ＴａｔＲｅｖＮｅｆＰｒｏｔＲＴ ｏｐｔ Ｃの配列（配列番号８４）を表す。 図８２は、構築物ｖｉｆ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号８５）を表す。 図８３は、構築物ｖｐｒ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号８６）を表す。 図８４は、構築物ｖｐｕ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号８７）を表す。 図８５は、構築物Ｖｉｆ＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号８８）を表す。 図８６は、構築物Ｖｉｆ＿ＴＶ２＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号８９）を表す。 図８７は、構築物Ｖｐｒ＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号９０）を表す。 図８８は、構築物Ｖｐｒ＿ＴＶ２＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号９１）を表す。 図８９は、構築物Ｖｐｕ＿ＴＶ１＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号９２）を表す。 図９０は、構築物Ｖｐｕ＿ＴＶ２＿Ｃ＿ＺＡｏｐｔの配列（配列番号９３）を表す。 図９１は、ＨＩＶ−１のゲノム構成および有用なサブゲノムフラグメントの概要を表す。 図９２は、ＨＩＶエンベロープＤＮＡ構築物およびタンパク質での免疫後の、免疫したウサギからの抗体力価データを表す。 図９３は、三回のＤＮＡ免疫および一回のタンパク質ブーストの後に収集されたウサギ血清におけるサブタイプＢエンベロープタンパク質およびサブタイプＣエンベロープタンパク質に対するＥＬＩＳＡ力価の比較を表す。 図９４は、ＤＮＡプライムタンパク質ブーストレジメンにおいて、サブタイプＣ ＴＶ１ Ｅｎｖで免疫したウサギにおけるサブタイプＢ ＳＦ１６２ ＥｎｖｄＶ２株に対する抗体応答の中和のデータを表す。 図９５は、一回のタンパク質ブースト後の、５．２５レポーター細胞アッセイにおける、サブタイプＣ初代株、ＴＶ１およびＴＶ２に対する抗体応答の中和のデータを表す。 図９６は、一回のタンパク質ブースト後の、サブタイプＣ、ＴＶ１およびＤｕ１７４、ならびにサブタイプＢ、ＳＦ１６２に対する抗体応答の中和のデータ（Ｄｕｋｅ ＰＢＭＣアッセイにより測定される）を表す。

Claims (53)

  1. ２つ以上の免疫原性ＨＩＶ−１ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドの少なくとも２つは、異なるＨＩＶ−１サブタイプ由来であり、ここで、該合成ポリヌクレオチドは、配列番号９〜配列番号９３のうちの一つに記載のポリヌクレオチド配列を含む、合成ポリヌクレオチド。
  2. 前記ＨＩＶ−１サブタイプがサブタイプＢおよびサブタイプＣである、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  3. 前記ＨＩＶポリペプチドが、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  4. 前記ポリヌクレオチドがＴａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆをコードする、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  5. 前記ポリヌクレオチドがＶｉｆ、ＶｐｒおよびＶｐｕをコードする、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  6. 前記ＨＩＶ−１ポリペプチドの１つ以上が１つ以上の突然変異を含む、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  7. 前記ＨＩＶ−１ポリペプチドがｖｉｆ、ｖｐｒまたはｖｐｕを含む、請求項６に記載の合成ポリヌクレオチド。
  8. さらなる抗原性ポリペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  9. 請求項１〜８のいずれかの合成ポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
  10. 選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系であって、該組換え発現系は、請求項９に記載の発現カセットを含み、ここで前記ポリヌクレオチド配列は、該選択された宿主細胞における発現に適合する制御エレメントに作動可能に連結される、組換え発現系。
  11. 請求項１０に記載の組換え発現系であって、前記制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からなる群から選択される、組換え発現系。
  12. 前記転写プロモーターが、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒ、およびメタロチオネインからなる群から選択される、請求項１１に記載の組換え発現系。
  13. 前記ポリヌクレオチド配列が、前記選択された細胞における発現に適合する制御エレメントと作動可能に連結される、請求項９に記載の発現カセットを含む細胞。
  14. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  15. 前記細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の細胞。
  16. 前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
  17. 前記細胞が昆虫細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  18. 前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎ５）昆虫細胞またはＳｆ９昆虫細胞のいずれかである、請求項１７に記載の細胞。
  19. 前記細胞が細菌細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  20. 前記細胞が酵母細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  21. 前記細胞が植物細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  22. 前記細胞が抗原提示細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  23. 前記抗原提示細胞が、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、これらの細胞の前駆体細胞からなる群から選択される、リンパ系細胞である、請求項２２に記載の細胞。
  24. 前記細胞が始原細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  25. 前記細胞が不死化細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  26. 前記細胞が腫瘍由来細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  27. 異なるサブタイプ由来の２つ以上のＨＩＶ−１ポリペプチドを含むポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が、該ポリペプチドを産生するための条件下で、請求項１３に記載の細胞をインキューベートする工程を包含する、方法。
  28. 哺乳動物被験体における使用のための遺伝子送達ベクターであって、該ベクターは、該被験体における使用に適切な遺伝子送達ベクターを含み、ここで、該ベクターは、請求項９に記載の発現カセットを含み、ここで、該ポリヌクレオチドの配列が該被験体での発現に適合する制御エレメントに作動可能に連結される、遺伝子送達ベクター。
  29. 被験体のＤＮＡ免疫に適した組成物であって、該組成物は、請求項２８に記載の遺伝子送達ベクターを含み、ここで、該遺伝子送達ベクターを含む組成物は、該被験体における前記発現カセットの発現に適合する条件下での導入に適している、組成物。
  30. 前記遺伝子送達ベクターが非ウイルスベクターである、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ベクターを含む組成物が、特定のキャリアを用いた送達に適している、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記ベクターを含む組成物が、金粒子またはタングステン粒子上にコーティングされ、該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用した送達に適している、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化される、請求項２９に記載の組成物。
  34. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２９に記載の組成物。
  35. 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記被験体が哺乳動物である、請求項２９に記載の組成物。
  38. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３７に記載の組成物。
  39. 被験体における免疫応答を生成する組成物であって、該組成物は請求項２８に記載の遺伝子送達ベクターを含み、ここで、該遺伝子送達ベクターを含む該組成物は、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で細胞をトランスフェクトするのに適しており、それによって該ポリペプチドに対する免疫応答を誘発する、組成物。
  40. 前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ベクターを含む組成物が、粒子状キャリアを使用する送達に適している、請求項３９に記載の組成物。
  42. 前記ベクターを含む組成物が、金粒子またはタングステン粒子上にコーティングされ、該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用する送達に適している、請求項３９に記載の組成物。
  43. 前記ベクターが、リポソーム調製物中にカプセル化される、請求項３９に記載の組成物。
  44. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３９に記載の組成物。
  45. 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４４に記載の組成物。
  47. 前記被験体が哺乳動物である、請求項３９に記載の組成物。
  48. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３９に記載の組成物。
  49. 前記組成物は、エキソビボでトランスフェクトするのに適しており、前記トランスフェクトされた細胞が前記被験体に再導入されることを意図される、請求項３９に記載の組成物。
  50. 前記組成物は、前記被験体においてインビボでトランスフェクトするのに適している、請求項３９に記載の組成物。
  51. 前記免疫応答が体液性免疫応答である、請求項３９に記載の組成物。
  52. 前記免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項３９に記載の組成物。
  53. 前記遺伝子送達ベクターが、筋内投与、粘膜内投与、鼻内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、膣内投与、直腸内投与、口内投与または静脈内投与に適している、請求項３９に記載の組成物。
JP2003510815A 2001-07-05 2002-07-05 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用 Expired - Fee Related JP4302513B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30319201P 2001-07-05 2001-07-05
US31686001P 2001-08-31 2001-08-31
US34979302P 2002-01-16 2002-01-16
US34987102P 2002-01-16 2002-01-16
US34972802P 2002-01-16 2002-01-16
PCT/US2002/021421 WO2003004657A1 (en) 2001-07-05 2002-07-05 Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008297353A Division JP2009082136A (ja) 2001-07-05 2008-11-20 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2004537303A JP2004537303A (ja) 2004-12-16
JP4302513B2 true JP4302513B2 (ja) 2009-07-29

Family

ID=27540889

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003510815A Expired - Fee Related JP4302513B2 (ja) 2001-07-05 2002-07-05 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用
JP2008297353A Withdrawn JP2009082136A (ja) 2001-07-05 2008-11-20 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008297353A Withdrawn JP2009082136A (ja) 2001-07-05 2008-11-20 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20030198621A1 (ja)
EP (3) EP1409694A4 (ja)
JP (2) JP4302513B2 (ja)
CA (1) CA2452119C (ja)
WO (1) WO2003004657A1 (ja)
ZA (1) ZA200400802B (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
EP1418940A4 (en) 2000-03-02 2006-09-20 Univ Emory DNA expression vectors and methods of use
WO2002072754A2 (en) 2001-03-08 2002-09-19 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mva expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
CA2452119C (en) * 2001-07-05 2013-10-15 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
CN1606625A (zh) 2001-10-31 2005-04-13 南非医学研究会 Hiv－1亚型分离株调节/附加基因及其修饰物和衍生物
US20060110736A1 (en) * 2002-10-07 2006-05-25 John Donnelly Hiv vaccine formulations
US20060205070A1 (en) * 2004-01-13 2006-09-14 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services HIV TEV compositions and methods of use
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
US20100015211A1 (en) 2004-11-01 2010-01-21 Barnett Susan W Combination Approaches For Generating Immune Responses
AU2007345682B2 (en) * 2006-07-27 2013-07-18 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric virus-like particles
US9439959B2 (en) 2006-07-27 2016-09-13 Takeda Vaccines, Inc. Chimeric influenza virus-like particles
GB0802224D0 (en) * 2008-02-06 2008-03-12 Inst Superiore Di Sanito Process for the production of vaccine components
EP2496609A4 (en) 2009-11-03 2013-05-08 Ligocyte Pharmaceuticals Inc CHIMERIC RSV-F POLYPEPTIDE AND VLPS ON LENTIVIREN OR ALPHA RETROVIRUS GAG BASE
CA2928908C (en) 2013-11-01 2021-01-12 Pfizer Inc. Vectors for expression of prostate-associated antigens
AP2017009846A0 (en) 2014-09-26 2017-03-31 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection
MD3390430T2 (ro) * 2015-12-15 2019-12-31 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antigenele virusului imunodeficienței umane, vectori, compoziții și metode de utilizare ale acestora
MA45381A (fr) 2016-06-16 2021-04-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Formulation de vaccin contre le vih
JP7272965B2 (ja) 2017-06-15 2023-05-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｈｉｖ抗原をコードするポックスウイルスベクターおよびその使用方法
SG11202012253WA (en) * 2018-07-26 2021-01-28 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Nef-containing t cells and methods of producing thereof

Family Cites Families (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1984A (en) 1841-02-18 Machinery for trimming straw braid
US5326859A (en) 1979-10-30 1994-07-05 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
US4405712A (en) 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5364773A (en) * 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
DE3377363D1 (en) 1982-03-31 1988-08-18 Ajinomoto Kk Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells
US4853332A (en) 1982-10-19 1989-08-01 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4966843A (en) 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5843638A (en) * 1983-12-05 1998-12-01 Institut Pasteur And Centre National De La Recherche Scientifique Nucleic acids and pepties of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1).
US4892743A (en) 1983-12-21 1990-01-09 Schering Corporation Novel hybrid interferon species
EP0165942A1 (en) 1983-12-23 1986-01-02 Monash University PRODUCTION OF HUMAN INTERFERON-$g(a)
AU594014B2 (en) 1984-03-21 1990-03-01 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant DNA molecules
US7815916B1 (en) * 1984-08-22 2010-10-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Cloning and expression of HTLV-III DNA
US5032510A (en) * 1984-09-26 1991-07-16 Eli Lilly And Company Method for expression and secretion in bacillus
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4847201A (en) 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
DE3650699T2 (de) 1985-03-15 1999-04-15 Antivirals Inc Immunotestmittel für Polynukleotid und Verfahren
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4663161A (en) 1985-04-22 1987-05-05 Mannino Raphael J Liposome methods and compositions
US4871488A (en) 1985-04-22 1989-10-03 Albany Medical College Of Union University Reconstituting viral glycoproteins into large phospholipid vesicles
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
JPS63500636A (ja) 1985-08-23 1988-03-10 麒麟麦酒株式会社 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5017691A (en) 1986-07-03 1991-05-21 Schering Corporation Mammalian interleukin-4
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4879227A (en) 1986-05-06 1989-11-07 Genetics Institute, Inc. Production of a recombinant human colony stimulating factor
US5034511A (en) * 1987-04-13 1991-07-23 Institut Pasteur Variant of LAV viruses
US5135855A (en) 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5256767A (en) * 1987-06-10 1993-10-26 The Immune Response Corporation Retroviral antigens
US5637677A (en) * 1987-07-16 1997-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biologically active compounds and methods of constructing and using the same
US5128319A (en) * 1987-08-28 1992-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Prophylaxis and therapy of acquired immunodeficiency syndrome
DE10399031I1 (de) 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
JP3015383B2 (ja) 1987-09-11 2000-03-06 ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ 形質導入した線維芽およびそれらの使用
US5879907A (en) * 1987-09-14 1999-03-09 Skandigen Ab Artificial gene coding for authentic human serum albumin, use thereof and method
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US5683864A (en) * 1987-11-18 1997-11-04 Chiron Corporation Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US5714596A (en) 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
US5712088A (en) 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
WO1989005349A1 (en) 1987-12-09 1989-06-15 The Australian National University Method of combating viral infections
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
CN1038306A (zh) 1988-03-21 1989-12-27 维吉恩公司 重组反转录病毒
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
EP0432216A1 (en) 1988-09-01 1991-06-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
WO1990002568A1 (en) 1988-09-13 1990-03-22 Chiron Corporation Hiv-1 envelope muteins lacking hypervariable domains
US5750373A (en) * 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
EP0446283A4 (en) 1988-12-01 1992-01-08 Univ North Carolina Synthetic interleukin-6
WO1990007936A1 (en) 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US5665577A (en) * 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US6214804B1 (en) * 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ES2116269T3 (es) 1989-03-21 1998-07-16 Vical Inc Expresion de secuencias exogenas de polinucleotidos en un vertebrado.
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
EP0487587A1 (en) 1989-08-18 1992-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
ES2072346T3 (es) * 1989-10-23 1995-07-16 Hoffmann La Roche Peptidos sinteticos de la cubierta del htlv-i.
FR2658432B1 (fr) 1990-02-22 1994-07-01 Medgenix Group Sa Microspheres pour la liberation controlee des substances hydrosolubles et procede de preparation.
ATE183235T1 (de) 1990-03-21 1999-08-15 Wolf Hans Joachim Prof Dr Für abgeänderte retrovirale gag-polypeptide kodierende dna-sequenzen und diese enthaltende impfstoffe oder aggregate davon
AU8200191A (en) 1990-07-09 1992-02-04 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
WO1992001800A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5840313A (en) * 1990-09-27 1998-11-24 Syntello Vaccine Development Kb Peptides for use in vaccination and induction of neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
PT100090A (pt) * 1991-02-04 1993-07-30 Univ Saskatchewan Metodo de preparacao de uma composicao capz de libertar um agente biologicamente activo para um alvo, e de encapsulacao do referido agente em esferas da proteina vp6
AU1643692A (en) * 1991-03-07 1992-10-06 Seragen, Inc. Use of cell surface receptor targeted molecules for the treatment of viral diseases
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5558865A (en) * 1991-08-22 1996-09-24 Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha HIV immunotherapeutics
CA2116764C (en) 1991-09-13 1999-12-07 Amy J. Weiner Immunoreactive hepatitis c virus polypeptide compositions
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
IT1253009B (it) 1991-12-31 1995-07-10 Sclavo Ricerca S R L Mutanti immunogenici detossificati della tossina colerica e della tossina lt, loro preparazione ed uso per la preparazione di vaccini
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
EP0572737B1 (en) * 1992-06-04 2001-02-28 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University HIV Gag-env fusion antigen
JPH07507689A (ja) 1992-06-08 1995-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定組織のターゲティング方法及び組成物
JPH09507741A (ja) 1992-06-10 1997-08-12 アメリカ合衆国 ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子
CA2141188A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Manlio G. Abele High field magnets for medical applications
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5665720A (en) * 1992-08-07 1997-09-09 Merck & Co., Inc. Benzoxazinones as inhibitors of HIV reverse transcriptase
DE4228458A1 (de) * 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
FR2695563B1 (fr) * 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
US6004763A (en) * 1992-09-11 1999-12-21 Institut Pasteur Antigen-carrying microparticles and their use in the induction of humoral or cellular responses
CA2105629A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-15 Robert S. Becker Potentiation of immunogenic response
US5686078A (en) * 1992-09-14 1997-11-11 Connaught Laboratories, Inc. Primary and secondary immunization with different physio-chemical forms of antigen
US5831005A (en) 1992-09-24 1998-11-03 Chiron Corporation Synthesis of N-substituted oligomers
US5304472A (en) * 1992-11-20 1994-04-19 Genentech, Inc. Method of controlling polypeptide production in bacterial cells
JP3720353B2 (ja) * 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
DE59402827D1 (de) * 1993-01-16 1997-06-26 Manfred Dr Schawaller Verfahren zur gewinnung nativer, oligomerer, glykosylierter ektodomänen viraler membranproteine, deren verwendung, insbesondere als impfstoff gegen hiv
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5591601A (en) 1993-05-14 1997-01-07 Ohio University Edison Animal Biotechnology Institute DNA polymerase gene expression system utilizing an RNA polymerase co-delivered with the gene expression vector system
US5419900A (en) * 1993-05-19 1995-05-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Of Health And Human Services Immunologic enhancement with intermittent interleukin-2 therapy
AU700371B2 (en) * 1993-06-07 1999-01-07 Genentech Inc. Hiv envelope polypeptides
CN1111540C (zh) 1993-06-09 2003-06-18 康诺特实验室有限公司 串联的合成hiv－1肽类
US5614413A (en) * 1993-07-01 1997-03-25 The Uab Research Foundation Encapsidated recombinant poliovirus nucleic acid and methods of making and using same
US5834441A (en) 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5955342A (en) * 1994-08-15 1999-09-21 Connaught Laboratories Limited Non-infectious, replication-defective, self-assembling HIV-1 viral particles containing antigenic markers in the gag coding region
US6291157B1 (en) * 1998-02-23 2001-09-18 Connaught Laboratories Limited Antigenically-marked non-infectious retrovirus-like particles
US6080408A (en) * 1994-08-22 2000-06-27 Connaught Laboratories Limited Human immunodeficiency virus type 1 nucleic acids devoid of long terminal repeats capable of encoding for non-infectious, immunogenic, retrovirus-like particles
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5550280A (en) * 1994-11-30 1996-08-27 Uniroyal Chemical Ltd./ Uniroyal Chemical Ltee Hindered aromatic ester compounds useful as anti-viral agents
DK0800579T3 (da) 1994-12-30 2002-09-09 Chiron Corp Kombinations-gen-leveringsvehikler
US5962428A (en) * 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
WO1996030523A2 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Hans Wolf Antigen presentation system based on retrovirus-like particles
CU22559A1 (es) * 1996-01-17 1999-05-03 Ct Ingenieria Genetica Biotech Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión
US5741492A (en) 1996-01-23 1998-04-21 St. Jude Children's Research Hospital Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
US6087486A (en) * 1996-01-29 2000-07-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleotide sequences encoding vpr receptor protein
US6060587A (en) * 1996-01-29 2000-05-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cellular receptor for HIV-1 VPR essential for G2/M phase transition of the cell cycle
WO1997038087A2 (en) 1996-04-05 1997-10-16 Chiron Corporation Alphaviral vector with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
US5951975A (en) * 1996-06-28 1999-09-14 University Of Pittsburgh Induction of CTLs specific for natural antigens by cross priming immunization
WO1998010069A2 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 The Regents Of The University Of California E25a PROTEIN, METHODS FOR PRODUCTION AND USE THEREOF
US6114148C1 (en) * 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
US6139833A (en) * 1997-08-08 2000-10-31 Lexicon Genetics Incorporated Targeted gene discovery
AU743616B2 (en) 1997-02-07 2002-01-31 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
US5858675A (en) * 1997-05-13 1999-01-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded RNA-binding protein
US6099847A (en) * 1997-05-15 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric Gag pseudovirions
US6846905B2 (en) * 1997-08-15 2005-01-25 Abbott Laboratories Antigen constructs useful in the detection and differentiation of antibodies to HIV
US5932442A (en) * 1997-09-23 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human regulatory molecules
US5932445A (en) * 1997-11-07 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Signal peptide-containing proteins
AU3745599A (en) * 1998-04-14 1999-11-01 Chiron Corporation Noncloning technique for expressing a gene of interest
US6210663B1 (en) * 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2206785A1 (en) * 1998-12-31 2010-07-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Improved expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles
JP2003523721A (ja) * 1998-12-31 2003-08-12 カイロン コーポレイション 抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用
ES2299276T3 (es) * 1998-12-31 2008-05-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polipeptidos env del vih modificados.
CA2389633A1 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Chiron Corporation Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof
US6733993B2 (en) * 2000-09-15 2004-05-11 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications
CA2452119C (en) * 2001-07-05 2013-10-15 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2008086329A2 (en) 2007-01-08 2008-07-17 Continental Automotive Systems Us, Inc. Dc/dc converter
EP2179791B1 (en) 2007-07-06 2017-08-30 M Technique Co., Ltd. Method for production of metal-supporting carbon, method for production of crystal composed of fullerene molecule and fullerene nanowhisker/nanofiber nanotube, and apparatus for production of fullerene molecule and fullerene nanowhisker/nanofiber nanotube
EP2510962A1 (en) 2011-04-12 2012-10-17 F. Hoffmann-La Roche AG Infusion pump device with re-filling scheme for cylinder-piston dosing unit

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200400802B (en) 2005-07-27
CA2452119A1 (en) 2003-01-16
US20030198621A1 (en) 2003-10-23
EP2280074A3 (en) 2011-06-22
EP2280074A2 (en) 2011-02-02
WO2003004657A1 (en) 2003-01-16
EP2292772A1 (en) 2011-03-09
EP1409694A1 (en) 2004-04-21
JP2009082136A (ja) 2009-04-23
JP2004537303A (ja) 2004-12-16
CA2452119C (en) 2013-10-15
EP1409694A4 (en) 2006-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5033303B2 (ja) 抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
CA2414374C (en) Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US8263394B2 (en) Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides, and uses thereof
JP2009082136A (ja) 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用
US20080095833A1 (en) Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides, and uses thereof
EP1535995A1 (en) Polynucleotides encoding the antigenic HIV type C env polypeptide and uses thereof
ZA200400793B (en) Polynucleotides encodin antigenic HIV type C polypeptides and uses thereof.

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20061013

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070112

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070220

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070515

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070522

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070619

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070626

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070720

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20080724

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081120

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090205

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20090309

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20090401

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20090422

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120501

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130501

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees