JPS59501097A

JPS59501097A - 大きな構造遺伝子の製造および発現

Info

Publication number: JPS59501097A
Application number: JP58501977A
Authority: JP
Inventors: アルトン・ノアマン・ケイ; ピ−タ−ス・メアリ−・エイ; スタビンスキイ・イツア−ク; スニトマン・デイヴイツド・エル
Original assignee: アムジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1982-05-06
Filing date: 1983-04-25
Publication date: 1984-06-28
Anticipated expiration: 2010-07-05
Also published as: US5541293A; DE3382742D1; EP0423845B1; JP2662520B2; CA1200515A; EP0108128B1; US4695623A; DE3382755D1; EP0422697B1; DE19975043I1; US6936694B1; IT1221076B; JPH08289795A; EP0422697A1; EP0424990B1; LV10973A; US5661009A; HK60097A; DE3382771T2; CA1341561C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】大きな構造遺伝子の製造および発現これは、１９８が１５月６日出願の同時継続合衆国特許出願番号３７５．４９４の一部継続出願である。遺伝物質は概括的に、細胞およびウィルスの組成分の製造をプログラムし誘導し且つ細胞およびウィルスの反応を？１ｉｌＩ１３Ｉ＋する化学物質として定義することができる。デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）として知られる長鎖重合体物質は、リポ核酸（ＲＮ＾）によってプログラムされるある種のウィルスを除いて、あらゆる生細胞およびウィルスの遺伝物質を構成する。ＤＮＡポリマーの反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、それらは各々燐酸塩群がくっついたデオキシリポース糖類に結合したプリン（アデニンあるいはグアニン）あるいはピリミジン（チミンあるいはシトシン）から成る。直線状ポリマー内のヌクレオチドの接合は、１つのヌクレオチドの５゛−燐酸の別のヌクレオチドの３′ヒドロキシル基への融合による。機能ＤＮＡはヌクレオチドの一本鎖（デオキシオリゴヌクレオチドとして知られる）の安定した二本鎖会合の形で生じ１この会合はプリン塩基およびプリミジン塩基の間の水素結合によって生しる〔即ち、アデニン（八）とチミン（Ｔ）との間あるいはグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間に存在する「相補的Ｊ対合〕。慣習により、ヌクレオチドはそれらを形成するプリン塩基あるいはピリミジン塩基の名前で呼ばれ、二本鎖ＤＮＡの相補的対合（即ち、　Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ）は「塩基対」と呼ばれる。リポ核酸は１ポリヌクレオチドであり、アデニン、グアニン、シトシン、および、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）から成り、これらはリポースおよび燐酸群に結合している。最も簡潔に云うと、ＤＮへのプログラム機能は＝般に、特定のＤＮＡヌクレオチド白＆ｌ　（３！ｉ伝子）が比較的に不安定なメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮへ）ポリマーに「転写」されるプロセスによって達成される。ｍＲＮＡは、一方、アミノ酸から構造、調整および触媒蛋白質を生成する鋳型として役立つ。この翻訳プロセスには、小さなＲＮＡ鎖（ｔＲＮＡ）の働ぎが関連し。ｔＲＮＡは個々のアミノ酸を送り込んでｍＲＮ八に沿って児ツリさせて、適切なアミノ酸伍ツリのポリペプチドの生成を可能にする。ＤＮＡから得られ、　ｔＲＮＡの供給と２０のアミノ酸の定位の基礎を定めてポリペプチドの「発現」をもたらすｍＲＮへの「メツセージ」は、トリブレット「コドンｊの形態−３つのヌクレオチド塩基の配ダ釣なグループ化をとる。ある意味では、蛋白質の形成は、遺伝子のヌクレオチド配列によってもたらされるプログラムされた遺伝メツセージの「発現」の究極的な姿である。ＤＮＡポリマー内で普通遺伝子の「先に来る」あるＤＮＡ配列は、　ｍＲＮ八への転写の開始部位をもたらす。これらは「プロモーターＪ配列と呼ばれる。ＤＮＡポリマー内で通富遺伝子の「上流Ｊ　（叩ち、先行）にあるその他のＤＮＡ配列は、転写開始の頻度（あるいは速度）を決定する蛋白質を結合する。これらその他の配列は「レギュレーター」配列と呼ばれる。このように１機能ＤＮＡポリマーのなかで選択された遺伝子１つ（あるいは複数の遺伝子の酉ツリ）に先立ち、且つ遺伝子の転写（およびその後の発現）が起きるか否かを決定する配列は、「プロモーター／レギュレーター」あるいは’市１１ｆｆｆｎノＤＮＡ配列とＷ＋：される。ＤＮへポリマー内で遺伝子にｒ続き１月つｍＲ猟への転写の終了の信号をもたらすＤＮＡ配列はｒターミ不イクー」配列と呼ばれる。過去用年近くの間、微生物学的プロセスの焦点は１望ましい生成物に関づる迅伝コート情報をもともとＤＮＡに持たない生物を用いて産業に、そして製薬に有用な物質を鮎することに向けられてきた。簡単に云うと、生成物の構造を定める遺伝子は、「供１４．生物から分離されるか１あるいは、化学的に合成され、そして、安定的Ｑこ別の生物に導入され。前述の別の生物は自己複製単線１１ｆｆ、＆生物であることが望ましい。これが達成されれば、　「この技術分野には１選択された宿主生物のトランスフォーメイションに使用する遺伝物質の分離１合成、精製、および増面のための「組み侶えＤＮＡ　Ｊ方メツ：論（こ関する故多くの′１１許および文献がある。例えば、　Ｃｏｌ＋ｅｎ等の特許番号４　、２３７　、２２４は　１ｉｊｌＪＮされた外刺生のＤ＼・八ｉ＆ｌＪを含む「ハイフ刃ソド」ウィルスＤＮＡあるいは環状プラスｉ　ｉ’ＤＮＡを用いた原核単細胞宿主生物のトランスフメーメイションに関連する。Ｃｏｌ＋ｅｎ等Ｃ１“［等電１手順は６まず酵素的にウィルスＤＮＡあるし号ｊ屋状プラスミドＤＮへを切断してｉｈ線ｊノ、ｉ閏年を形成することによるトランスフメーメイション・ベクターの製造に関する。選択びれた外旧生ＤＮＡ鎖は、同様な酵素の使用、することによって直線状に調製される。直線状のウィルスＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡは、外来性ＤＮＡと共に結合酵素の存在のもとでインキ、ヘートさ扼前述の酵素はイ顔夏プロセスを行う能力があり１　「ハイブリット」ベクターが形成され、前述のベクターはウィルスＤＮＡあるいは環状ＤＮ八へプラスミドに［スプライスされた」外来性ＤＮＡ断片を含む。和合性のある単細胞宿主生物のハイブリッド・ベクターによるトランスフォーメイションは、宿主細胞ポピユレーション内に外来１生ＤＮＡの多数のコピーを生しる。場合によっては、目的は単に外来性ＤＮＡの増面であり、収穫される「生成物」はＤＮＡである。もっと多くの場合に、トランスフォーメイションの目標は、外来性のＤＮＡの宿主細胞による発現であり、外来性ＤＮＡによってコードが示された商業的に有用な蛋白質あるいはポリペプチド断片を分離可能なほどの量だけ嬬処こ合成する形をとる。例えば１合衆国特許番号４，２６９．７３１　（Ｓｈｉｎｅ　）　、４，２７３，８７５　（Ｍａｎｉｓ　）および４，２９３．６５２　（Ｃｏｈｅｎ　）を参照のこと。Ｃｏｔ＋ｅｎ等の特許に記載されたような手順の成功は、主にｒｉｔｉｌＪｌ！ｉ！エンドヌクレアーゼ」酵素が容易に入手できることによるものであり、前述の酵素はハイブリット化されないＤＮＡベクター、および重要な外来性配列を含乙真核生物のＤＮＡ鎖等のｌｌも定の部位の切断を促進する。二本鎖直線状ＤＮＡ鎖に一本鎖柚市性「末端Ｊを形成する切断の仕方は、　「結合」酵素の処理を受けたときの外来性ＤＮ＾のベクター−、の機能０雪且み込ゐの蓋然性を非常に高める。このような多数の制限エンドヌクレアーゼ酵素が現在商業的に入手可能である〔例えば、ヘエセッダ　リサーチ・ラボラトリーズ、　Ｉｎｃ、、ガイザーズハーグ、ノアリラント州のｒ１９８＋／１９８２カタログ」に載ったｒＲｌｌｌ、制限エンドヌクレアーゼ参照表１を参照のこと。〕ハイブプリンの形成のｆｉｌｔｈ＋よ、クロマトグラフの手法によって容易なものとなり、前述の手法は１例えば１分子量に基づいて非ハイブリット・プラスミドとハイフ刃ノド・プラスミドとを別けることができる。その他の有用な手法番誌朋引牛ＤＮＡハイブリッド形成に関連するものである。原核細胞のトランスフォーメイションの成功に大いに寄与した別のｌｋ乍「道具」は、選択可能な「標識」遺伝子配列の使用である。簡〃に言うと、望ましい外握生ＤＮＡに加えて、トランスフオームされた宿主細胞をトランスフオームされない宿主細胞から区別することの出来る形質ＩＭ’ｌを発現するコートをもつ１つあるいはそれ臥ｌ二のＤＮＡ配列を含むハイブリット・ベクターが使用される。典型的な標識遺伝了賃汐１］は、ｌ・ランスフメームされた原核細胞が、トランスフオームされない宿主細胞を殺すがあるいはその増殖を甚だしく阻止する金属１抗生物質、および同様のものを含む培地の中で生存し増殖することを可能とするものである。トランスフオームされた宿主微生物内において外来性遺伝子が首尾よく発現するか否かは主に１前述の遺伝子を、前述の遺伝子のｍＲＮＡへの転写を確実に行う適切なプロモーター／レギュレーター領域がありｍＲＮＡのメツセージの蛋白質への翻訳を籠にするその他の信号（例えば、リボヅーム結合謂頒がある状態で、トランスフォーメイション・ヘクターに組み込めるか否かによって決まる。遺伝子のｒ元のＪプロモーター／レギｊ、レークー領域が新しい宿主において高レヘルの発現を許すことは珍しい。従って，挿入しようとする遺伝子には，挿入に先立って新しい宿主に合わゼた転写および翻訳ＭＫｆｆ＋Ｄｈａ配列をくっつけるか，あるいは，前述の遺伝子はヘクターＤＮ＾の中で現存の転写および翻訳信号に８１ｉＩＪｉ卸される部位に挿入する必要がある。外来性遺伝子の例えば環状ＤＮＡプラスミト・ヘクターへの挿入は，しばしば，現存する転写および翻訳信号の直後の部位において，あるいは宿主内で発現の程度が高い比較的に大きな蛋白質のコードを持つ現存プラスミド遺伝子内でおこなわれる。後者の場合は，このようにして形成された『融合遺伝子Ｊの宿主における発現は，望みの蛋白質配列（例えば，大きな蛋白質の化学的な切断によって分離出来る中間断序として）を含む『融合蛋白質ｊの高レヘルの生成となる。前述の手順は単に望みの調節と外来性遺伝子生成物の高レヘルの発現を確実にするにとどまらず，望みの蛋白質生成物を宿主に内在するプロテアーゼの攻撃からある程度防御する。さらに，宿主生物によって異なるが．前述の手順は，望みの蛋白質の宿主細！勧１ら細胞培地への一種の『ピギーハノク』輸送を可能として，望みロセスはどちらかというと単純な，容易に実施でｍつ簡単に検証できるもののように見えるかも知れないが，実際には，必要なＤＮ八配列の操作のｌｉｌｌ＋よ非富に骨折りな困Ｒ’ｔなもので，望みの生成物の収率は殆ど１列外なく非常に低いことを特徴とする。一例を挙げると，宿主微生物のトランスフォーメイションに使用されるヘククーに挿入するための遺伝子の最初のｒｍｕ，は非常に難しいプロセスである場合があるが．発現さセようとする遺伝子がヒｌ・のような高等な生物に内在性のものである場合は特にそうである。この技術において行われる１つの手間の掛かる− ｆＪＩＩ＆よ，　『供与」細胞の全ＤＮＡゲノムの組み替えプラスミドへの体系的なクローニングであり，前述のクローニングは，ランダムなＤＮＡ配列断片を持つトランスフォームされた細胞の膨大な『ライブラリー』を生み出ＮＡに『複写Ｊされ，それからポリメラーゼによって二本鎖に転写され，そしてクローニングされる。この手順も，トランスフォームされた細胞のライブラリーを生み出すが，このライブラリーは全ゲノム・ライブラリーよりも幾分力ＶＪＸさく，望みの遺伝子のコピーを含み且つ宿主微生物による発現に大きく干渉する］・ランスフォームされないｒイン１・ロン」を持たない可能性がある。上記の時間のかかる遺伝子分離手順ｉ刻畔簑こ幾つかの蛋白質を微生物に発現させるのに公表された組み替えＤＮＡ手順で使用されたものであり，前述の蛋白質はラット・プロインシュリン印１１ｒｉｃｈ等，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　，　却』，　ｐｐ．　１３１３−１３１８　（１９７７）〕，ヒト繊維芽細胞インターフェロン（Ｇｏｅｄｅｌ　Ｉ等，　均旦シｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｇａｒｃｈ．　８　＋　ｐｐ．　４０８７−４０９４　（１９８０）　）　，マウスβ−エンドルフィン（Ｓｈｉｎｅ等，　Ｎａｔｕｒｑ，　２８５　，　Ｉｌｌ１．　４５６−４６１　（１９８０）　）　．およびヒト白血球インターフェロン［Ｇｏｅｄｅｌ　１等１岡垣ｒｅ，　２８７　＋　ｐｐ．　４１１−４１６　（１９８０）　；およびＧｏｅｄｅｌ　Ｉ等，　Ｎａｔｕｒｅ．　２９０　，　ｐｐ．　２０−２６　（１．９８１）　〕を含む。可能な場合は必ず，ヌクレオチ１′塩基を用いての望みの遺伝子の部分的なあるいは全部の製造は，組替えＤＮＡ方法で使用する遺伝子の調製のもっと望ましい手順を持つ。そのような製造に必要なものは，当然のことながら，望みのポリペブチじの正確なアミノ酎晒ｅｌリの知識である。この情報があれば，蛋白質を生み出ずＤＮＡ　ｉ！１コード■ち，適切に酎汐リされた塩基トリプレソト・フトン）を酎画することが可能となり，対応する合成二本鎖ＤＮＡ配列を作ることができる。゜製造方法とｃＤＮＡ合成方法との組合せがヒト成長ホルモン用の遺伝子を作り出すのに使用されたと報告されている。特に，製造された７２ヌクレオチド塩基対の直線状二本鎖ＤＮＡ　ｉＥ’ＪＩＪ　（望みの１９１アミノ酸ポリペプチドの最初の２１アミノ酸を決めるコドンを持つもの）が，アミノ酸番号２５−１９１用のコードを持つｃＤＮＡ誘導二本鎖に結合されて，変性ｐＢＲ３２２プラスミトのｉヱ２・プロモーター／レギュレーター配列力廖脚する遺伝子座に挿入された（Ｇｏｅｄｅｌｌ等，’　Ｎａｔｕｒｅ．　？８１　，　ｐｐ．　５４４−５４８　（１９８］）　）。比較的にｒ短い』生物学的に機能するポリペプチド，例えば１　ヒト・ソマトスタチン（１４アミノ（自）およびヒト・インノユリン（２１アミノ酸および３０アミノ酸の２ポリペプチド鎖）用のコードを持つ遺伝子の製造には完全な合成手順が使用されている。ソマトスタヂン遺伝子！手順［１　ｔａｋｕｒａ等，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　，　１９８　，　ｐｐ．　１０５６−１０６３　（１９７７）〕においては，５寓基対遺伝子力酢られ，この遺伝子では，４列話基対が必要な１４アミノ酸を定めるコドンであり，そして，ｉ＠基対が追加されて，構造遺伝子を微生物トランスフォーメイション・ヘクターに結合するのに用いられる『付着末端』一本鎖終末領域の形成を可能としている。特に，この遺伝子はβガラクトシダーゼ酵素遺伝子の末端近くに挿入され，その結果生しる融合遺伝子は融合蛋白質として発現さ五，この蛋白質から臭化シアン切断によってソマトスクチンが分離された。ヒト・インシュリン遺伝子の製造は，先に述べたように，２】アミノ酸鎖と３０アミノ酸鎖のコードを持つ遺伝子の調製を伴った。１８デオキシオリゴヌクレオチド断片を結合して長い方の鎖用の遺伝子が作られ，１１断片を結合して短い方の鎖の遺伝子が作られた。各遺伝子はβガラクトシダーゼ遺伝子とともに融合遺伝子を形成するのに使用され，個々に発現したポリペプチド鎖は酵素的に分離され結合されて完全なインシュリン分子を形成した。　（Ｇｏｅｄｅｌ１等＋　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．ジし７６．　ｐｐ．　１０６−１１０　（１９７９）。〕上記の各手順において，デオキシオリゴヌクレオチド断片は調製され，そして，下記の一般手順に従って順匁吉合された。　〔例えば，　Ａｇａｒｗａｌ等，迫切些，ηＬ，ρｐ．　１−７　（１９』　（自）ち，５’− ３″旧ワデオキシオリゴヌクレオチド断片は，酵素的に第２のｒ頭ｊ断片に結合された。これら２つのｒ頭』鎮のＰＩＪは，第１頭鎖の半分と第２頭鎖の平分とに相補性を持つ塩基配列を持つ『尾』　（即ち，３゜から５゜柳ワ鎖を使用することで可能になった。結合した後で，頭鎖の補（１４結合の塩基は，形成された二重部分から『突き出すｊ０第２の底鎖力伽えられるが．この鎖は，突き出した頭鎖の５乃至６塩基補体を含み２　さらに追加の５乃至６塩基が加わるが，これは尾一本鎖部分として突き出る。そし・で，２つの尾鎖は一緒になる。このような逐次的な付加は完全な遺伝了仮ソリが形成されるまで続けられ全手順は非常に時間が掛かり且づ非常に不能率である。全遺伝子合成の前述の方法の時間力寸卦かるーという特徴は，先に言及した２つの『短い』インシュリン遺伝子の糾み立てを行うのに少なくとも４人の研究者による３カ月に渡る作業が必要であったとい分晧に良＜｛４ｉされている。さらに．ヘククーの挿入に成功するには比較的に少量の製造された遺伝子が必要なだけであるが，上記の合成手順は総収率が非常に低く　（１結合当たり２０％のオーダー），処方に細心の注意を払って従っても選択された短い遺伝子のごく少量の分離さえも保証されるものではない。合成可能な最大長の遺伝子は，ｌｌｌｉｌ々の短い断片を接合する効率によって明らかに限度がある。そのような結合反応が旦ほとｄ要であり．前述の各反応の収率が■であるとすると，得られる正しく合成された遺伝物質の量はｙｎに比例する。この関係は指数関数的であるので，１結合反応当たりの収率の僅かな増加でも，合成できる最大遺伝子の長さは大幅に増加することになる。上記の方法の不能率さは，主に望ましくない中間生成物の形成によるものである。→１を挙げると．尾の『鋳型Ｊ鎖を伴うアニールされた頭鎖を形成する最初の反応においては望ましい反応は５？あろうが．実際に得られる生成物はａ　＼　ａ　，あるいは，　■一一』■■一，Ｘ■〜一±一−あるいは同様のものであるかも知れない。さらに，｛固々のデオキシオリゴヌクレオチドカ《長くなればなるほど，それら力勃力学的に安定した自己会合，例えば２　ｒヘアピンｊあるいは集団を形成する可能性が高まる。合成効率を高めるための提案はこれまですぐに出てくる状態ではなく，最近に『現在得られる方法によっては．約３０ユニノ１・のアミノ酸よりも長いペプチドを合成することは経済的に不可能であり，多くの臨床的に重要な蛋白質はもっと長いものである』ど報告された。　〔＾ｈａｒｏｎｏｗｉ　ｔｚ等。５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍ−ｅけｃａｎ　，　２４’ｙ　，　Ｎｏ．　３．　ｐｐ．　１４０−１５２．　ｐ．］５１　（１９８１）。〕大きな遺伝子の合成にかかわる『経済的実行可Ｍｉｄ生」の例が，ヒト白血球インターフェロンの全合成の努力の『成功Ｊの最近の発表にのることができる。　（Ｅｄ（Ｈｅ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９２　．　ｐｐ．　７５６−７８２　（１９８１）。〕簡ｌｙに要約すると，約１５塩基を含む６７の異なるデオキシオリゴヌクレオチドが合成され，上記の種類のｒ５０％重なりＪ手順によって接合されてＩ１の短い二重型を形成した。次ぎに，これらは４つのもっと長い二重型に糺み立てられ前述の二重型は最後乙こ接合されて，１６６アミノ酸蛋白質のコードを持っ５１４塩基対遺伝了をもたらした。この手順は，著昔等がｒ迅ｉＬと特徴付けたものであるが，５人の研究者の約１カ年に渡る努力を要したものと確実に推定さね７組み立て８１画の効率は明らかに非常に低い。雪列として，出発点となった６７のデオキシオリゴヌクレオチドはそれぞ相Ｏｐモルが用意され，１１の中間サイズの二重型を形成するのに使用されたが，４つの大きな二重型の組み立てが達成された頃には．全遺伝子を最終的に組み立てるのに使用できる長い二重型の収量は僅かに糸鈴．Ｏｌ　ｐモルだけであったことを指摘することができよう。産業におよび製薬に重要な蛋白質の微生物による発現のための組み替えＤＮＡ技術の実施の別の一面は，　『コドンの優先性Ｊの現象である。遺伝的にトランスフォームされた宿主細胞内の遺伝子の発現の現存する機構が『働いて』望みの生成物を作り上げることは既に述べたが，微生物内で達成される発現のレヘルは太き《異なる可能性があり，部分的には挿入された外来性遺伝子内に存在するアミノ酸仕様遺伝コードの特定の代替形によって変わる。４つの可能なヌクレオチド塩基の『トリプレノトＪ　・コドンは，６４の異なる形をとりうる。これらの形が僅か２０の異なるアミノ酸（さらに転写の開始および終了）のメノセージをもたらすということは，゜アミノ酸Ｇ三よっては２つ以上のコドンによってコードを決めることが出来ることを意味ケる。実際のところ．アミノ酸によっては６つもの『冗長なノ代替コドンを持つものもあり，１つの必要なコドンし力寸寺たないものもある。いまだ完全には理解されていない理由によって，代替コドンは異なる種類の細胞の内在性ＤＮＡ内にいささかも均一に存在しておらず，ある種の細胞内のある種のコトンには異なる自然の階ｍ　即ち，ｒ耽生」カ寺在するように思われる。雪列として，アミノ酸ロイシンは，　ＣＴＡ，　ＣＴＣ，　ＣＴＧ，　ＣＴＴ，　ＴＴＡおよひ゛ＴＴＧ　（それぞれ疏Ｎ八コド７，　ＣＵＡ，　ＣＩＪＣ，　ＣＩＩＧ，　（；１１０，　ｕｌｌＡおよびｔｌｌｌＧに対応する）を含む６０ＮＡ：ｌトンの何れによっても仕様が決まる。微生物のゲノム・コドン頻度の徹底的な解析によって．』．替Ｕ細菌の内在性ＤＮ＾はＣＴＧロイシン仕様コドンを最も普通に含むことが判明し，酵母および変形菌類のＤＮＡはＴＴ＾ロイシン仕様コドンを最も普通に含むことが判明した。この階層性にかんがみて，』，剋宿主によってロイシンに冨んだポリペプチドの高レヘルの発現を得る可能性は，ある程度までコドンの使用の頻度Ｇこよって決まると→畳こ考えられている。例えば，　ＴＴＡコドンの豊富な遺伝子は，まず藺違いな＜　Ｅ．　ｃｏｌｉにおいては発現が少ないが，　ＣＴＧの豊冨な遺伝子はポリペプチドをおそらく多《発現するであろう。同様に，酵母細胞がロイシンの豊富なポリペプチドの発現のためのトランスフォーメイション宿主細胞である場合は，挿入されたＤＮ八で使用するのが望ましいコドンはＴＴＡであろう。例えば，　Ｇｒａｎ．ｔｈａｍ等，　’Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ＲｅｓｅａｒｃＴｏ　８　＋　ｐｐ．　ｒ４９−ｒ６２　（１９８０）　；　Ｇｒａｎｔｈａｍ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　８　，　ｐｐ．　１８９３−１９１２　（１９８０）　；及びＧｒａｎｔｈａｍ等，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　’Ｒｅｓｅａｒ６，　Ｌ．　ｐｐ．　ｒ４３−ｒ７４　Ｑ９８Ｄを参照のこと。別み替えＤＮ八手法にコドンの優先性現象が恵味するものは明白であり、そして，この現象は首尾よくトランスフォームされた宿主生物において外来性遺伝子の高い発現を達成するのに失敗した過去の多くの例を説明するのに役立つ可能性がある。即ち，ｒａｍ生』の低いコドンが挿入された遺伝子に繰り返し存在して，発現のための宿主細胞のｔｓｔｈ劾率的に働かないのではないか。この現象は，予定の宿主細胞が優先するコドンを含むように設計された完全に製造された遺伝子は組み替えＤＮＡ手法を実施するだめの外来性遺｛ｄ勿質の望ましい形態をもたらすとい５１％ｇ命に導《。このような関係において，コドンの選択を可能とする迅速且つ能率的な全遺伝子製造手順が存在しないことは，この技術における進歩のより深刻な障害を成しているように思われる。本発明の背景にすくなからず関係するのは，生物学的に活性のある物質の眺　インターフェロン（ＩＦＮ　）の調製および使用に関する技術である。インターフェロンは分泌さわる蛋白質であり，かなりよく確定された抗ウイルス性，抗腫瘍性，および免疫調節性を持つ。例えば，　Ｇｒａｙ等，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９５　，　ｐｐ．　５０３−５０８　（１９Ｂ２）およびＥｄｇｅ等，前掲，およびそれに示された参照文献を参照のこと。抗原性および生物学的および化学的性質に基づいて，ヒ１・・インターフェロンは３つの大きなクラス，即ち，　ＩＦＮ−α（白血球）　，　ＩＦＮ−β（至）蒲速細ｌＩ（イ）およびＩＦＮ−γ（蝮に分類されている。ウイルＸＢｈ！ｉｌｌ！−安定性インターフェロン（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）の構造および性質についてはかなりの情報が蓄積されている。これらは均質になるまで純化され，少なくともＷＢ分的なアミノ酸配列が確認されている。ＩＦＮ−βｌおよびＩＦＮ−α複遺伝子ファミリーのクローニングされたｃＤＮＡおよび遺伝子配列の解析によって１多くのインターフェロンの完全なアミノ酸賃７１Ｊを演鐸することが可能となった。さらに，」．延におけるＩＦＮ−β１および幾つかのＩＦＮ −αの，そして酵母におけるＩＦＮ−αｌの効率の高い合成が．これらの蛋白質を大量に生物学的に活性のある形態で精製することを可能とした。種々の分製促進襲識を受けたリンパ球の培養内で一般に生成されるインターフェロンであるＩＦＮ−γの構造および性質に関する情報はもっと少ない。ＩＦＮ− 　ｒ　Ｌ！Ｊｌｌに不安定で．　ＩＦＮ−αあるいはＩＦＮ−βに対して調製された抗血清とは交差反応しない。ＩＦＮ−γは広範な生物学的作用があるものと考えられそれらにはＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス作用の増強も含まｆｙ　ＩＰＮ−ｒはウイルスおよび細胞の特異性および誘導される抗ウイルス性機序の点でＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βとは異なっている。粗調製したものを用いての試験管内の研究は．　ＩＦＮ一丁の主な機能は免疫調節因子としての機能であることを示唆している。トランスフォームされた細胞に対するＩＦＮ−γの抗増殖効果は，　ＩＦＮ一αあるいはＩＦＮ−βの１餌音から１００倍で，あると報告されており，新形成の治療に用いる可能性があることを示している。不ズミ■ＦＮ−ｒ製寿１は，マウス肉腫に対して優れた抗腫瘍作用を持つことが示されている。ヒ｝　ＴＦＮ−γのコードを持つｃＤＮＡ配列を含む組み替えプラスミトが分離され特性力髄認されたと最近報告された（Ｇｒａｙ等，飼リ。』．幀および培養モンキー細胞内のこの配列の発現は，本当のヒトのＩＦＮ−γの性質を持つポリペプチドを生したと報告されている。発表によると，　ｃＤＮＡ配列および『成熟』ポリペプチドの推論された１４６アミノ酎酒己列は，推定されるリーダー配列を除いて，下記の通りである。以前に発表された配列では，グルタミンではなくアルギニンカ呪列の位匠１４０に示された。　（従って，別に示さない限り，『ヒ１一免疫インターフェロン」あるいは簡単にｒｌＦＮ−γ」は〔＾ｒｇ　１４０　］および（Ｇｉｎ　１４０　）の両形態を包含するものとする。）上述した種々のインターフェロンの広範な生物学的作用の故に，インターフェロンの合成ポリペプチド類似体を作り出すことは，このクラスの化合物のｌ版上の可能性の完全な具現化に非富に大きな意義がある。組み替えＤＮＡ手法によって今日までにもたらされた大量のインターフェロンの分離の利点にもかかわらず，この分野の専門家はインターフェロンの合成ポリペプチド類似体の調製にこれという成果を収めていない。言い替えると，　Ｇｒａｙ等，前掲のＩＦＮ−　ｒのコードを持つ遺伝子の分離の研究，およびＥｄｇｅ等，前掲の完全に製造された■ＦＮ−αｌ遺伝子をもたらすための多大な努力は，単一の非県に精密に定められたポリペプチド翫ツリの発現のための遺伝物質のみをもたらした。『正真の』ポリペプチドとたとえ１つのアミノ酸の種類あるいは位置でも異なるヒトＩＦＭ−　ｒ類似体の大量の微生物による発現を可能にする手順（特定の部位の突然変異生成の手段は別として）は全く存在しない。同様に．　Ｅｄｇｅ等，前掲によって調製されたポリペプチドとアミノ酸が１つ異なるＩＦＮ−αｌ　ｍ．似体の調製では，１つのトリプレフトーコトンが異なる全く新しい遺伝子を作り出すのに更に１年の期間が必要になると思われる。対象遺伝子の断片を切出して変種のポリペプチド配列のコーディング情報を含む断片で置き換えるためのあつらえの手段は存在しない。さらに．報告されたｃＤＮＡ７Ｉ１−嗣將され製造されたＤＮＡ配列を変えてフトンの用法を変えることは，選択可能な『オプションＪではない。カ乳組み替えＤＮＡ手法による変種インターフェロン・ポリペプチド類のｇＴｉｉ製の報告は，　ＩＦＮ−αｊおよびＩＦＮ−α２のためのヒト遺伝子の『ハイブリンドＪの調製および発現に関連するもののみである（Ｗｅｃｋ等，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　９　，　ｐｐ．　６１５３−６］６８　（１９８１）およびＳｔｒｅｕｌｉ等＋　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．八ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ｌＪ．ｓ＾，＋　７８　，　ｐｐ．　２８４Ｂ−２８５２　（１９８１）　）．得られたハイフ刃ノドは，８つのヒト（ｃＤＮＡ誘導）遺伝子の２つが偶然に翫７＋１のなかに１度だけ含まれていることを知って作られた遺伝子断片の４つの可能な組合せから成り，塩基配列は細菌エンドヌクレアーゼの制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｐｖｕ　ＩＴおよびＢｇｌｌＴに幻応する。従って，本技術分野において１ヌクレオチド塩基からインターフェロン等の大きなポリペプチト−のコートを持つ製造されたＤＮＡ　ｉｉＪｌの完全な合成のもっと効率のよい手順が切望されている。さらに，自然に生しる形態のものから１つあるいはもっと多くの選択されたアミノ酸の種類および／あるいは位置が異なる合成ポリペプチドの微生物的発現を可能とするような，変種形態の合１ｉ３ｉＭＥＪ１の迅速な作成のた′めの合成方法が必要である。要約本発明は，長さ力甲柁ｏｏヌクレオチド塩基対を超える直線状二本鎖ＤＮＡ　［！ＩＪの完全な合成のだめの新規な，迅速な且つ効率の高い手順を提供するものであり，前述の１５１１は望みのポリペプチドの広範な異種の合成を司る構造遺伝子で全て出来ている場合がある。本発明によると、長さ力傍謔ＯＯ塩基対を超え３且つ、アミノ酸の事前に錘された連続配列の発現をこの配かｊを含む選択された０随ベクターによってトランスフオームされた選択された宿主微生物の中でおこなわせるためのコードを持つ直線状二本鎖１１ＮＡ配列は、下記から成る方法によって合成される：（ａ）　長さ力％ｔｌＯＯ塩基対あるいはそれ以上の２つ以上の異なるサブユニット直線状二本鎖ＤＮＡ配列を９選択されたアッセンブリー・ベクターの内部で組み立てるために調製し。調製された各々の異なるサブユニットＤＮＡ翫ツリは２発現されるべき前述の事前に定められたアミノ簡改すの異なる連続部分のコードを持つ一連のヌクレオチド塩基コドンから成り。前述のサブユニ７Ｆの第１のものの１つの終末領域は、塩基配列の一部分から成り、それは第１の制限エンドヌクレアーゼによる切断の認識部位をもたらし、前述の識ＭＶＡ広ま前述の選択されたアッセンブリー・ベクターにサブユニットが挿入されたのちにこのベクターのなかに１度あるかあるいは全く無いかどちらかであり、前述のサブユニットの第２のものの１つの終末領域は、塩基翫７＋１の一部分から成り、それば前述の第１のエンドヌクレアーゼ以外の第２の制限エンドヌクレアーゼによる切断の認識組粒をもたらし、このｍＷ聞立ば前述の選択されたアッセンブリー・ベクターにサブユニット力１重人されたのちにこのベクターのなかに１度あるかあるいは全く無いかどちらかであり。サブユニットの残りの終末領域全部の少なくとも半分は、前述の第１および第２のエンドヌクレアーゼ以外の制限エンドヌクレアーゼによる切断の認識部位部分（望ましく番おぐリントロームの６塩基対認識ｆｍのを成し、この認識謂凱オ市述の選択されたアッセンブリ−・ベクターにすべてのサブユニットが挿入されたのちにこのベクターのなかに１度そしてただ１度だけ存在し；且つ（ｂ）　ステップ（ａ）で調製された前述の各サブユニットＤＮＡ配列を順次に選択されたアッセンブリー・ベクターに挿入し、各挿入に続いてアッセンブリー・ベクター翫ツリの生物学的ｌ除行い、それによって、事前に定められた連続アミノ［ｌＪのコードを持つ望みのＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクターを形成し、そして１組み立てられる望みのＤＮ＾配列は、その中間位置に、制限エンドヌクレアーゼによる切断のための少なくとも１つのユニークな、望ましくはパリンドロームの６塩基のｍ立を含む。上記の一般的な方法は、望ましくは２　さらに望みのＤＮＡ　Ｋｌｌ＋Ｊをアッセンブリ−・ベクターから分離するステップを含み、望ましくは、新規に製造されたＩＩＮＡ配列のクラスの１つをもたらすもので、前述の新規の配列はその中間位置に制限エンドヌクレアーゼによる切断のための少なくとも１つのユニークなパリンドロームの６塩基認識分を持つ。このようにして分離された翫ツリは２次ぎに別の「発現」ベクターに挿入さね、ア・ノセンブリー・ベクターが増福されたものと同し或いは異なる微生物によって望みのポリペプチドが直接に発現される。この方法のその他の望ましい実朧列においては、少なくとも３つの異なるサブユニットＤＮＡ発現がステップ（ａ）によって調製され順次に前述の選択きれたアッセンブリー・ベクターにステップ（ｂ）によって挿入さねそして得られた望みの製造されたＤＮＡ　ＦＥＪＩＪは、その中間位置に制限エンドヌタレアーゼによる切断のための少なくとも２つのユニークなバリッドロームの６塩基認識部位を含九合成されたＩＩＮＡ配列は、生物学的に活性のポリペプチドのコートを持つ前述の構造遺伝子から成り５そして、製造されたＤＮ八へ列においては、ヌクレオチド塩基の西０１１は、前述の選択された宿主微生物におけるコドンの優先的発現特性に基づいて同しアミノ酸を指定ずち代替コドンのなかから選択された１つあるいはその以上のコドンを含む。本発明の新規な生成物は、長さ力傍！ｆ２００塩基り１を超える製造された直線状二本鎖開＾配列で、この配列を含む選択されたＤＮＡベクターによってトランスフオームされた選択された宿主微生物による事前に定められた連続アミノ崗１ｆｆｌＪの発現のためのコードを持つもので、その中間位置に匍諏エンドヌクレアーゼによる切断のための少なくとも１つのユニークなパリンドロームの６塩基認識部位を持つことを特徴とするものを含む。前述の製造された配列の生物による発現のポリペプチド生成物も含まれる。実例として１本発明により、ヒト免疫インターフェロン（ＩＦＮ−γ）およびヒト免疫インターフェロンとは１つあるいはそわ以上のアミノ酸の種類および／あるいは位置が異なる新規の生物学的機能類似体ポリペプチドを合成するためのコードを持つ新規の製造された遺伝子がもたらされる。Ｆサブタイプ（’ＬｅＪＦＮ−Ｆ　ＪあるいはｒＩＦＮ−αＦＪ）のヒト白血球インターフェロンおよびその類似体、および共働ヒト白血球インターフェロンの合成のためのコードを持つ製造された遺伝子ももたらされる。本発明の方法の実施に使用するＤＮＡサブユニット翫ｊすは、望ましくはヌクレオチド塩基から、共同所存の同時出願された合衆国特許出願番号３７５．４９３にＹｉ　ｔｚｈａｋ　５ｔａｂｉｎｓｋｙに開示され「構造遺伝子の製造および発現」　（代理人の整理番号鵠５０）と名前をつけた方法に従って合成される。ｂａ′Ｊに要約すると一般的な方法は下記のステップから成る。（１）２つあるいはもっと多くの異なる直線状の二重型ＤＮＡ鎖を調製し、各二重型鎖は１２あるいはもっと多くの選択された十所紹す畠基対の二本鎖領域を含み、さらに鎖のｉ培に３つから７つの選択された塩基の頭一本鎖終未配列および／あるいは鎖のもう１つの端Ｇこ３つから７つの選択された塩基の尾一本鎖終才酒＆ｌＪを含み、各二重型ＤＮＡ　Ｌｔ４の各一本幀終未配列は、調製されたその他の二重型ｒｌＮＡ鎖の何れかの多くて１つの一本鎖終未配列ｇ１基相補体からなるものであり、そして（２）ステップ（１）で調製された各二重型ＤＮＡ鎖を、ステップ＋＋１で調製さ相開ｉ性一本鎖終未配列を持つ１つあるいは２つのことなる二配酉彫こアニーリングし、それによって１つの連続した二本１１ＩＤＮＡ　１ｉＪｌを形成し、この二本鎖ＤＮＡ配列は少な（とも２７の選択された塩基対の二重型領域を持ち、前述の塩基対はステップ（１）で調製された二重型ＤＮＡ鎖の−Ｍ−’ｆ４に未配列のＨＪ？Ｊ＋生会合によって形成された少なくとも３つの塩基対を含み、さらζこ前述の一二謁抽ＮＡ配列は３つから７つの塩基の一本鎖頭あるいは尾終末領域をＯから２つ持つ。サブユニ、トの製造の望ましい一般プロセスにおいては、少なくとも３つの異なる二小型ＤＮＡ鎖がステップ（１１によって柵製さ札そのようにしてＨＥＭされた鎖は全て１つのアニーリング反応混合物のなかで同時にアニールされて単一の連続二重型鎖ＤＮＡ配列を形成し。、この配列は少なくとも４２のｊ用尺された塩基対の二重型領域を持ち１前述の選択された塩基対はステップ（１）で調製された二重型鎖の一本鎖終オ酒Ｊりの相補性会合によノツ形成された３つあるいはもっと多くの塩基対の少なくとも２つの近接しないセットを含む。望ましいサブユニット製造プロセスの二重型ＤＮＡＮ開鎖間テップｆ１．ｌは、望ましくは下記のステップから成る。（ａ）　選択された直線状配列内に１５以上の塩基を持つ第１および第２の直線状デ第４−ソオリゴヌクレオチド断片を作り、第２の断片の塩基の直線掘ヒ１１は第１１４Ｉｉ片の塩基の配列の金相補体から成るが、但し、第２の断片の少なくとも→陽よ、第１の断片を完全ζこ榴山するものに続いて３つから７つの選択された塩基の追加直線Ｊｆｌ＆ｌＪを含むか、あるシ）Ｇま第１の断片の終末配列Ｇ斜…ｇりな３つから７つの塩基の直線状の配列を欠くかのいずれかであるが、しかしながら、第２の断片は追加の塩基配列を持つことも、その両端に塩基配列を欠くこともあってはならず；そして（ｂ）　第１および第２の断片を断片間の相補的会合を促進するような条件におＬ）−ζ組み合わモて１つの直Ｘ店に二重型開へ鎖を形成する。形成されたニオ鎖ＤＮＡサブユニット配列内の塩基の配列は、望ましくは予定された宿主微生物１例えば、酵母細胞あるいは細菌２特に」、ｑ司ユ細菌内でのコドンの（侶四勺発現特性に基づき同しアミノ酸を指定する代替コドンのなかから選択された１つあるいはもつと多くのトリブレット・コドンを含む。本発明によって、」、印り宿主細胞内での選択された外来性遺伝子の発現のレヘルを」二げるための方法およ固設４の改善ももたらされる。端的に述べると１発現ヘクターは、ポリペプチド・コーディング領域の」二重の選択されたＤ〜Ａ配列を含むように構成され　この選択された配列は、高く発現された内在性ポリペプチドに伴うゲノムのｌ　ｃｏｌｉ　１１弘に存在するりボソーム結舖附の複製である。現在望ましい選択された配列は、アラクー・メンプレイン蛋白Ｆ　（’ ＯＭＰ−Ｆ　Ｊ　）の」、（Ｑし発現乙こ伴うリポソーム結合部位配列の複製である７本発明のその他の怜牧および長所は、下記の本発明の詳細な説明を考察すれば明らかになろう。 …印■莫明本明細書で用いる場合は、　ＤＮＡ酎７耐１あるいは遺伝子に使われる「製造されたＪの用語は、ヌクレオチド塩基の組み立てにより完全に化学的に合成される生成物か１あるいはそのように化’Ｆｆｔ’Ｊに合成された生成物の生物学的反復複製から得られる生成物を意味する。そのようなものであるので、この用語は生物学的起票の開始材料を用いるＣＤＮＡ方法あるいはゲノムのクローニング方法論によって「合成Ｊされた生成物を除外する。下記の第１表は、不明？１１書においてアミノ酸を示すのに使用される略称を示し、几ＰＡＣの推奨する１文字呼称を含む。第１表アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄグルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅフェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆグリシン　ｃｒｙ　Ｇヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈメチオニン　Ｍｅｔ　Ｍアスパラギン　ＡＳｎＮプロリン　Ｐｒｏ　Ｐグルタミン　Ｇｉｎ　Ｑトリプトファン　Ｔｒｐ　讐チロシン　Ｔｙｒ　Ｙ下記の嗜斜まヌクレオチド塩基に用いるものとする：Ａ−アデニン、Ｇ−グアニン；Ｔ−チミン：Ｕ−ウラシル；そしてＣ−シトシン６本発明の理解を容易にするために、下記の第■表および第■表は、　ＤＮＡの６４のトリプレット・ヌクレオチド塩基コドンと２０のアミノ酸との相関関係表、およびそこに指定される転写終了（「停止」）機能を示す、ＩＩＮＡの対応する相関を決定するには、これらの表のＴをＵに置き換える。第非表第１位置　第２位置　第３位置Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＴＴ　Ｉ’ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＣＬｅｕ　Ｓｅｒ、　５ｔｏｐ　５ｔｏｐ　Ａ１、ｅｕ　Ｓｅｒ　、５ｔｏｐ　Ｔｒｐ　ＧＬｅｕＰｒｏＨｉｓ、ＡｒｇＴＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　ＡｒｇＣＬｅｕＰｒｏ’、ＧｌｎＡｒｇＡＬｅｕ　Ｐｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇ１１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　’Ｔ八八ｌｅＴｈｒＡｓｎＳｅｒＣ１１ｅ　Ｔｂｒ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＡＭｅｔＴｈｒＬｙｓＡｒｇＧ νａｌＡｌａＡｓｐＧｌｙＴＧＶａｌ八１ａへｓｐＧｌｙＣ νａ１　＾１ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＡＶａｌ　＾Ｉａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ第旦表アえス酸　指定ユｌ−’７（Ａ）　アラニン　ＧＣＴ、　ＧＣＣ，ＧＣ八、　ＧＣＧ（Ｃ）　システィン　ＴＧＴ、　ＴＧＣ（Ｄ）　アスパラギン酸　島Ｔ、　ＧＡＣ（Ｅ）　グルタミン酸　ＧＡ八、　ＧＡＣ（Ｆ）　フェニルアラニン　ＴＴＴ、　ＴＴＣ（Ｇ）　グリシン　ＧＧＴ、　ＧＧＣ，ＧＧＡ、　ＧＧＧ（Ｈ）　ヒスチジン　ＣＡＴ、　ＣＡＣ（１）　イソロイシン　八ＴＴ、＾ＴＣ，ＡＴ八（Ｋ）　リジン　へへへ、　ＡＡＧ（Ｌ）　ロイシン　ＴＴＡ、　ＴＴＧ、　ＣＴＴ、　ＣＴＣ，ＣＴ八、　ＣＴＧ（Ｍ）　メチオニン　八ＴＧ（Ｎ）　アスパラギン　八ＴＧ（Ｐ）　プロリン　ＣＣＴ、　ＣＣＣ，ＣＣ八、　ＣＣＧ（Ｑ）　グルクミン　Ｃ４八、　ＣＡＧ（Ｒ）　アルギニン　ＣＧＴ、　ＣＧＣ，ＣＧＡ、　ＣＧＧ、　ＡＧＡ、　ＡＧＧ（Ｓ）セリンＴＣＴ、ＴＣＣ，ＴＣへ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、八ＧＣ（Ｔ）　トレオニン　ＡＣＴ、　ＡＣＣ，ＡＧＡ、　ＡＣＧ（■）　バリン　ＧＴＴ、ＧＴＣＧＴ八、　ＧＴＧ（Ｗ）　トリプレット〉ＴＧＧ（Ｙ）　チロシン　ＴＡＣ，ＴＡＴＳＴＯＰＴ八八、ＴＡＧ、へへ八二本鎖ＤＮへの’ＩＩＩＩＷａエンドヌクレアーゼ切断の「パリンドロームのＪ　遮す図ｑは１頭と尾の塩基相補体との間に左から右および右から左への文冴剃生を示すもの、即ち、５゛から３′末端までの回復冊立の相補性塩基配列のｒ読み」が司−であるものである。制限エンドヌクレアーゼによる切断のためのパリンドロームの６塩ＴＡ＆１ＥＪｌ立の例としては、　Ｈ４ｎｄＩ［Ｉによる切断の部位があるが、その頭および連鎖の５゛から３゛はＡＡＧＣＴＴである。非パリンドロームの６塩基利尿部位の例としては、　ＥｃｏＰ１５による切断部位があり、この頭鎖はＣＡＧＣＡＧと繰り返しを示す。連鎖塩基相補体の５゛から３゛はＣＴＧＣＴＧである。定義によって本質的に、奇数（例えば５．７）の塩基からなる制ｍＷｉ１ｍｔま非パリンドロームである。エンドヌクレアーゼによっては１つの部位のいくつ力１の変形部位で切断するものもあり、この部位はパリンドロームの場合もあればそうでない場合もある。１例を挙げると、　Ｘｈｏ　Ｈは（いずれかのプリン）　ＧＡＴＣ（いずれかのピリミジン）を読み、これにはパリンドロームの配列ＡＧＡＴＣＴおよび非パリンドロームの配列ＧＧＡＴＣＴも含まれる。先に述べたｒＢＲＬ制限エンドヌクレアーゼの一覧表」を参照すると、エンドヌクレアーゼを認識する６塩基配列のパリンドローム的部位は、　Ｂｂｒｌ、　Ｃｈｕｍ、　Ｈ４ｎ１７３．　Ｅｉｎ９１Ｒ，旧ｎｂｌｌｌ、　ｌ１ｉｎｂｌｌｌ、　Ｈ４ｎｄ’ｌｌｌ、　Ｈ４ｎｆＨ，Ｈｓｕｌ、Ｂｇｌｌｌ、５ｔｕｌ、ＲｒｕＬ　Ｃ１ａｌ、　八ｖａＩＩＩ、　Ｐｖｕｌｌ、ＳｍａＬ　Ｘｍａｌ、Ｅｃｃｌ、　５ａｃＩＩ、５ｂｏｌ、５ｂｒｌ、５ｈｙＬＳｓｔＩＩ、ＴｇＩＩ＋Ａｗｌｌ、ＰｖｕｌｌＲｓｈｌ、Ｒｓｐｌ、Ｘｎ１ｌ、ＸｏｒＩｌ、Ｘｍａｌｌｌ、Ｂｌｕｌ、Ｍｓｉｌ、５ｃｕｌ＋５ｅｘｌ、　Ｓｇｏｌ、　５ｌａｌ、　５ｌｕｌ、　５ｐａｌ、　Ｘｈｏｌ、　Ｘｐａｌ、　Ｂｃｃ１７０．　Ｂｓｕ１２４７．　Ｐｓｔｌ、５ａｌＰＩ、　ＸｍａＩｌ。Ｘｏｒｌ、　ＥｃｏＲ］、　Ｒｓｈ６３（Ｈ，５ａｃｌ、　５ｓｔＴ、　５ｐｈｌ、　ＢａｍＨＬ　ＢａｍＫ１．　ＢａｍＮＬ　ＢａｍＦｌ、　Ｂｓｔｌ、　Ｋｐｎｌ。５ａｉ１．　χａｍｌ、Ｈｐａｌ、Ｘｂａｌ、ＡｔｕＣＩ、Ｂｅ１ｌ、Ｃｐｅｌ、５ｓｔｌＶ、Ａｏｓｌ、Ｍｓｔｌ、Ｂａ１ｌ、　八ｓｕＩ＋、およびＭｌａ＋に限られる。非パリンドロームの６塩基翫７＋Ｊのみを認識するエンドヌクレアーゼは、　Ｔｔｈｌｌｌｌｌ、　ＥｃｏＰ１５．　Ａｖａｌ、およびＡｖｒ■に限られる。パリンドロームと非パリンドロームの６塩基配列の両方を認識するエンドヌクレアーゼには、　Ｈａｅｌ、　Ｈ（ＨｉＡＴ、　Ａｃｙｌ、　Ａｏｓｌｌ、　八５ｕｌＴＩ、　Ａｃｃｌ、ＣｈｕＩＩ、　Ｈ４ｎ１７３．　Ｈｉｎｄｌｌ、　ＭｎｎＴ、χｈｏＩｌ＋　ＨａｅＵ、　１ＩｉｎＨ１，Ｎｇｏｌ＋およびＥｃｏＲＩ’がある。こね坊・ら生成する望みのポリペプチドの構造が決まると３本発明の娼餠よ下記を必要とする。長さが１００塩基対以上の２つあるいはもっと多くの異なる特定の連続二本鎖ＤＮＡサブユニット配列で適切な構成の末端部分をもつものを調製すること。選択された宿主生物のなかでハイブリッド・ヘククーの中［里耐帛を行いながら選択されたアッセンブリ−・ヘククーにサブユニットを順次挿入すること；アッセンブリー・ヘクター（あるいはサプコ。ニットから製造されたＤＮＡ　ＭＥ！＋ｌＪを含む別の選択された「発現」ヘクター）を用いて適切な選択された宿主をトランスフオームすること。および、宿主生物に発現されたポリペプチド発現を分離することである。その最も効率の良い形態においては１本発明の月餠よ、Ｎ造された酊ツリのアッセンブリーとポリペプチドの大量発現とに同じヘクターを用いる。同様に２発現に利用する宿主微生物は通常は、サブユニ・７ト・アッセンブリ−、プロセス÷実施される増福に用いられるものと同しである。域を備えることが可能であり，あるいはベクター内に存在するブロモークー／レギュレーター翫ソリによる発現の制御が可能となるような仕方でベクターに取り込まれることが可能である。本発明の製造されたＤＮＡ配列は，プラスミド内に存在する遺伝子（例えばβガラク１・シダーゼ）に適切に取り込まれて製造されたＤＮＡ配列によってコートが定まる望みのアノセンフ刃一翫７１Ｊを含む融合ポリペプチド生成物のコードを持つ融合遺伝子を形成することができる。本発明の望ましい実施形態においては，製造されたポリペプチドのサイズは２約６あるいは７５アミノ酸から糸勧００あるりはそわ以上のアミノ酸の範囲である。選択されたトランスフォームされた宿主生物による望みのポリペプヂトの高レヘルの発現は８宿主によって優先的に発現される１つあるいはもっと多くの代替コドンを含むＤＮＡ配列の製造によって促進される。長さが１００から２００塩基対の二本鎖サブコーニノｌ・ＤＮＡ配列の製造は１先に言及した先行技術アノセンブリ一方法に従って進めることも出来るが，望ましくは上述したＳｔａｂｉｎｓｋｙによる合衆国特許出願番号３７５，４９３に開示され且つ本発明の実施の下記の例の幾つかに使用された迅速な能率的な手順によって達成される。端的に云うと，これらの１順は３デオ的に短い一本鎖領域とともに含む。二本鎖領域は，望みのポリベプチトの前述のアミノ酸翫ツリの始めの，終末の，あるいは中間部分のアノセンブリーを指定するのに必要なフトンを含む。可能な場合は，予定される宿主（例えば，　Ｅ．ｃｏｌｉ）によって優先的に発現される代替コドンが使用される。最終的に組み立てられるラブユニットＤＮＡ配列において占めるべき相対的位置によって異なるが，二重型鎖の一本鎖領域は塩基配列を含め．これは２他の二重型鎖の塩基によって相補されると．望みのポリペプチド西Ｊｌ内のアミノ酸を指定ずるコドンをもたらず。この手順に従って形成された二重型鎖は．次に相補性の短い一本鎖領域を持つ１つあるいは２つの異なる二重型鎖に酵素的にアニールされて，望みのポリペプチド断片のコード鎖の１つのアニーリング反応を実施することによって強化されるが，前述の二重型鎖の短い一本鎖領域は，その他の二重型鎖のせいぜい１つの他の一本鎖領域の塩基の相補体となる。その他の二重型の一本鎖領域１つだけを特定的に相補する短い一本鎖領域を形成された全ての二重型鎖を用意することは，遺伝コードの冗長性の範囲内で，そして望ましくは．予定される宿主生物のコドンの優先性を考慮して代替コドンを選択ずることにＪって達成される。イ反巴のポリペプチドのコードを操屑反巳の長いＤＮＡ翫ツリの製造のＴ記の説明は，本発明の実施を，取分けサブユニットＤＮＡ　翫ｊｌの適切な終末配列の形成に関連して写実的に説明する役にたつと思われる。望みの生物学的に活性のあるポリペブチトを分離し，そのアミノ酸を順番に配列して，連続する配列の１００のアミノ酸残基の構成を明らかにする。ポリベプチトの微生物学的発現のための製造された遺伝子の形成は，選択された宿主生物のトランスフォーメイソヨンに使用される選択されたウ・イルスあるし鴎訂■太プラスミドＤＮＡへクターへ挿入するための少なくとも３００塩基対のアノセンブリーを必要とする。製造された遺伝子を構成する前に，予定される微生物宿主の種類を考劇一る必要があるが，それは，宿主力洗に分かっていれば宿主種のコドンの酬生を考慮してコドンを選択できるからである。この記郎こおいてはＥ．　ｃｏｌｉ細菌宿主を選択するものと仮定する。製造された遺伝子の構成において考慮すべき第２の点は，アフセンブリー・プロセスで用いられる予定のＤＮ八ヘクターの種類である。適切なヘクターの選択は，制限エンドヌクレアーゼ酵素によるヘクターの切断部位に関する現在の雉纏こ基づく。もっと具体的には，アノセンブリー・ヘククーは２サブユニットの容易な挿入を許すエンドヌクレアーゼ切断澗立をもたらずＤＮＡ翫ｊリを含むかどうかに基づいて選択される。この点に関しては，選択されたアッセンブリー　ヘククーは，望ましくは少なくとも２つの制限部位を持ち，前述の制限ｓｌＱＬまサブユニノ１・挿入プロセスの実施の前にはヘクター内で１度しか叩ち，−ＧＡＡＴＴＣ− 『ユニーク』である）起きない。この説明においては，１つのＥｃｏＲＩ制限部位，　−ＣＴＴＡＡＧ−−ＣＡＧＣＴＧ− ，および１つのＰｖｕ　Ｉｔ制限制立，−ＧＴＣＧＡＣ−を持っ仮想環状ＤＮΔ ブラフ４ドを仮定する。次に３アミノ酸の代替コドンカ碍られるかどうかを考慮するために望みのポリペプチドのアミノｍりを解析する（望ましくは１予定される』．如り．宿主のコドンのＰ生を考慮する）。この情報を得てから，２つのサフ゛ユニソ｝ＤＮＡ　９リを設計するが，望ましくは前述の西Ｊル縣５１５０対のオーダーの長さを持つものとし，　Ｎ９１Ｊはそれぞれ望みのポリペ？チトの全アミノ酸銖ｊｌ１の約半分のコートを持つ。この説明においては１製造された２つのサブユニットは’ ＡＪおよび’ＢＪで呼ふ。本発明の方法は．前述の２つのサブユニットに適用されると，一般に下記を必要とする。即ち，ザブユニットの１つをアンセンブリー・ヘククーに挿入すること。形成されたノ＼イブリノド・ヘクターの増福。および第２のザブユニットを挿入して適切な配列に組み立てられたザブユニットを含む第２のハイブリノドを形成することである。この方法は，２つのサブユニ，トを接合−て接合された末端が連続した事前に選択された塩ａ改ＩＪをもたらして連続的な事前に選択されたアミノ酸配列のコードを持つようにすることを要するので，もう一方のサブユニット．に接合される製造されたサブユニットの終末領域を構成する塩基の種類および配列に関する必要事項が幾つかある。この方法はサブユニットをアノセンブリー・ヘククーに接合ずることを要するので．アノセンブリー・ヘククーに接合される製造されたラブユニットの終末領域を構成する塩基の１１１および配列に関するその他の必要事項がある。サブコーニノＩ−は，同時的にではなく，順次にアノセンブリー・ヘクターに挿入されるので咀つ．サブユニットを組み立てられた形想幼）ら選択的に切り出してその中の製造された塩基ＭｉＷＩＪに変更を加えることができれば本方法は最も有利に実施できるので），製造されたサブユニットの終末領域の塩基の種類に関する，ｆｆｌＪｌＮがさらにある。分かり易いように，下記の終末領域の性格に関する検劃においては，サブユニ７　１■ＡおよびＢの両端の柊末領域はそれぞれＡ−１と八−２，およびＢ−］とＢ−２と呼ぶ。　即ら１サブユニノ１・八をｐＢＲ３０００に最初に挿入し，終末領域へ −１をＥｃｏＲＩ　ｉ那顕ｂ位でヘクク−に結合ずるア／センブリーの計画を想定する。最も簡車な場合は，終；ＬイｉＬｒ，ｌは単にＥｃｏＲｌ『イ」着末端』，即ち，４塩基の一本鎖（−ＡＡＴＴ−あるいは−ＴＴＡＡ−）を備え，それがρＢ招０００のＥｃｏＲＩ分解で形成される一本５有配列を相禎ずる。これによってリガ−セ酵素翅里をずれば終末領域Ａ−１をヘクターに結合ずるごとが出来る。終末領域Ａ−１の末端の−利削こ適切５’　−Ｇ− な塩基対（例えば，　３’−ＣＴＴＡＡ−　）が先行していないと，完全な認識部位はへククーへの結合によって再構成されない。結合によってＥｃｏＲＩ認識謂劾早ｆｔｌａされるか否かはりち１サブユニノ｝Ａをヘククーに挿入した後に残ったＥｃｏＲｉ認臨冊勤＜０か１つかは）．計画を考案するものの裁量にゆだねられる。別法としては，サブユニットΔの終末領域祠を，　｛良四狗に’ＸＸＸ　Ｊと呼ふなにか他のエンドヌクレアーゼのだめのＬ♂ｉ＆ｉｌＭ立をもたらす塩基の完全な一揃いを含むように構成し１そして上述したようにＥｃｏＲＩ認識部位の部分を付加してＥｃｏＲＩ　’リンカー』を備えてもよい。組め立てられた配列からサブユニットＡを切り出すのに実際に用いることができるためには＋　’ＸＸＸ　Ｊ　謂ｕＪま挿入によって形成されたハイフ刃ノト　ブラスミドの中の他のどこにもあってはならない。終末領域Ａ−１の構成の必要事項は，従って，それ力′４１Ｉ附エント゛ヌクレアーゼによる切断のため列？Ｊｈ冊ケをもたらす塩基配列の部分く即ち，全部あるいは一部）を成すことであり，前述の８忍基部位がサブユニットの挿入後にアノセンブリー　ヘクターの巾に１度起きるか全く起きないかのいずれかであることである。サブユニットＢの終末Ｖ４域Ｂ−２もアノセンブリー　ヘクターに接合ずる必要があると想定しよう（例えば．ρＲＲ３０００に存在ずるＰｖｕ　ＩＴ切断の甲 −の認識謂ケにおいて）。終末領域Ｂ−２の構成の必要事項は＾−１の構成のものと同しであるが，但し，Ｂ−２を構成する際に参照する第２のエントヌクレアーゼ酵素は八−１を構成する際に参照されるものとは異なっていな番』ればならない。もし認識部位が同しであれば，完全に組め立てられた配列から断Ｊ４−ＡおよびＢを別々に切り出すことは出来ない。上記の想定から５終末領域Ａ−２は最終のｐＢＲ３０００ハイブリノｌ−において終末領域１１−１に結合する必要がある。終末領域八一２あるいは終末領域Ｂ −１のいずれかは，仮想の第３のエンＩヌクレアーゼ’ＹＹＹ　Ｊによる；ｔｉｌｌ限エンｌヌクレアーゼ切折の認臨圃立の部分（望ましく｛ＪバリンＩロ一ムの６塩基）を持つように桿賊さね。前述の認ｉ鉛ＨＩｌ倍よ，全てのサブユニットを発現ヘクターに挿入した後に発現ヘククーの中にただ１つだけ．即ち，サブユニノＩ一のアノセンブリ一の中間位置に．存在することになる。この結果を得るための計画は幾つかある。１つの選択可能な訓画においては．ｒＹＹＹＪの全Ｌａ監Ｈ立は終末領域Ａ−２に含まれ，この領域はｆｌｌｌｉＮＱのためにザブユニット八のアノセンブリー　へクターへの挿入を完了し（２）その後のザブユニット八のシブユニノ１・Ｂへの接合を可能にするのＣこ必要なエントヌクレアーゼ切断のためのその他の言、告八部位の１つあるし別２つも持つ。この場合は，終末領域１１−１の末端にはそれを終末領域八−２に繋くのに必要な塩基があるだｉＪである。別の代替唱Ｊ画においては，全’ＹＹＹＪＬａ腹間仏咥名未領域Ｂ−］に含まれ，Ｂ−１はさらにそのオ出に，サフ゛ユニット八をサフ゛コ〜ニソトＢに接合するのに１吏立つエントヌクレアーゼ切ＩｆｉのＬα低部位の部分を持つ。別の代替計画として，終末領域Ｂ−１はその，ＩＩ彫こ’ＹＹＹ　Ｊ認識謂立を含んでもよい。終未領域＾−２はそうすると全’ＹＹＹ　Ｊ　ＬＰ２ｈ部位を含み、ざらにその勅彫こ、サブユニ、トの増福の前にアッセンブリー・ヘククーに八−２を接合する適切な「リンカ−」を含むことになる（例えば、Ｐｖｕ　Ｔｌ　”付着末端」）。サブユニノｌ−Ａを含むバイブリア）の増福の後に、ハイフ刃ソドは’ＹＹＹ　、＋によって切断され（Ａ−２の末端にｒＹＹＹ　Ｊ認識部位の付着末端部分力１出し）、ザブユニｙ１４を挿入することが可能となり、その終末領域Ｂ−１は終末領域Ａ−２の末端と接合して全’ＹＹＹ　Ｊ　Ｈ為朧立を再構成する。全ての断片（Ａ−１およびＢ−２を除く）の終末領域の構成に関して必要なことは、１つあるいはもう一方あるいは両方（即ち、「少なくとも半分」）が第３のエンドヌクレアーゼ切断の認識部位の部分を持つことであり、このｔ？ｌ’Ｊ６ｆ冊ケは全てのサブユニットカ揃述のアッセンブリー　ヘククーに挿入されたのち）こ前述のヘクターにただ１つたり存在する（即ち、「ユニークなＪ）。本発明の新規なりＮＡ配列のクラスのものを生み出すには、第３のエンドヌクレアーゼの認識部位は６塩基のバリン１０−ムな認識部位でなければならない。」二に述べたザブユニノ＋−ｒ：ｐａＭｉｚＪは、サブユニット末端がらザブユニットにそってその中心にまで延びるとも考えられるが、実際の問題として、先に述べた構成は通常は最後の１０あるいは加塩基で行われる。同様に、２つのサブユニット・アッセンブリー内のユニークな「中間Ｊ認識部位は製造された配列の一方の末端へ他方の末端へよりも３倍はど近づいてもよいが、この認識部位は通當ｉ頗冴ＩＪの中央近くにおかれる。上記の説明において、接合する３つのサブユニットを調製する必要がある合１Ａ＋画が立てられた場合は、製造された遺伝子は中間位置に２つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断■粒を含むことになり、そのうちの少なくとも１つは本発明の新規のＤＮＡ配列のクラスのパリンドロームな６塩央蕊括Ｈ立を持つ。上記のブＩコセスの素晴らしい長所は明白である。製造された遺伝子がその長さの中間位置に１つ以上のコーニークなｉ！１ｌｌ１６エンドヌクレアーゼ切断制立を含む゛ので、切断部位で接合される２つのサブユニットのコドン６びりの変更は、容易に、そして製造された遺伝子全部を再合成することなしに行うことが出来る。能力のある製造された遺伝子の形成における本発明の実施の実例ガある。これらの例から、本発明の遺伝子製造方法論は、非常に柔軟性のある枠組みのなかで２００塩基対を超え、。長さの遺伝子の本当に迅速月、つ効率的な合成および発現のための総合的な合成君１両をもたらすものであり５組み替えＤＮＡ手法を用いる研究者たちがこれまで実現しえなかった生成物の構造の変種の発現を可能とするものであることは明白である。第１例ヒ）　ＩＦＮγの発現のための合成遺伝子を構成する手順において、最初に行った選択は。望みのポリペプチドの発現の微生物宿主とし７てＥ、ｃｏｌｉを選択したことであった。したがって、コドンの選択手順は、　’Ｇｒａｎ　ｔｈａｍの論文、前掲で列挙されたＥ、ｃｏｌｉの示すコドンに対する（伐生を考慮してなされた。第２の選択は、　ｐＢＲ３２２を発現−、フタ−として、そして、重要なことには、ザブユニット発現の１ｍ福に用いるアッセンブリー・ヘクターとして選択したことである。後者の要素についてはプラスミドが選択されたが１それはプラスミドが単一のＢａｍ１ｌｌ、　Ｈｉｎｄ　Ｉ［ｌ、および５ａｉｌ制限部位を含むことが分かっている力）らである。これらの制限割９立とヒト免疫インターフェロン内の既知のアミノ酸配列を考えながら、３ツノｒ人」サブニー’−ノドＤＮＡ配列（ＩＦ−３，ＩＦ−２，およびＩＰ−１）および１−’：）（７）ｒ小」サブユニノ）ＤＮＡ　ｆｉｔ！ＪＩＪ　（ＩＰ−４）を形成する計画が策定された。この計画は下記の第Ｎ光に示される。第Ｎ光第■表■続逢トａｍ　Ｈｌ第Ｎ光」続ぎ［Ｈｉｎｄ　ｍ第凹屹舊旨γ 「小Ｊ西冴り（ＩＦ−４）は４番から１番の（５’−ＴＧＴ　ＴＡＣＴＧＣＣＡＧ）アミノ酸のためのコドンおよび開始メチオニン［Ｍｅｔ　’　）を含んでいるのめ扮かる。この構成においては、ｒ小Ｊ翫ツリは追加の塩基を含んでおり、後に説明するｐＢＲ３２２からの発現ベクター・アッセンブリーに関連するＩＪｌａＴ）７−の部分をもたらす。（Ａｒｇ　１４０　）　ＩＦＮ　ｒのための製造された遺伝子の合成に使用するサブユニットＩＦＮ−］の代替形態は、第１４０番のアミノ酸を指定するコドンＷＡｎ＆こ５′−ＣＡＧ　（（Ｇｉｎ　１４０　）のためのもの）の代わりにコドン５’　−ＣＧＴを含んだ、合成されたポリペプヂド指定部分全ＤＮへ発現の頭鎖用のコドン配夕１ＪｔＴ＋画は下記の通りであった。５“−ＴＧＴ−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−ＣＣＧ−ＴＡＣ−ＧＴＴ−ＡＡＧ−Ｇ八八−ＧＣ八−ＧＡＡ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−Ａ八八−Ａ八八−ｒＡｃｒｒｒｃ−Ａｎｃ−ｃＣ八−ＧＧＣ−ＣＡＣ−ＴＣＣ−ＧＡＣ−ＧＴＡ−ＧＣＴ−ＧＡＴ−へへＣ−ＧＧＣ−へＣＣ−ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−へＴＣ−ＣＴへ−ＡΔへ−へへＣ−ＴＧＧ−へへへ−ＧＡＧ−Ｇへへ−ＴＣＣ−ＧＡＣ−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＡＴＣ−へＴＧ−ＣＡＧ−ＴＣＴ−ＣへΔ−ＡＴＴ−ＧＴＡ−へＧＣ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−へへＡ−ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＡＡＧ−へＡＣ−ＴＴＣ−へＡＡ−ＧＡＣ−ＧＡＴ−Ｃ八八−ＴＣＣ−八ＴＣ−ＣＡＧ−ＡＡＧ−ＡＧＣ−ＧＴＡ−ＧＡＡ−ＡＣＴ−八ＴＴ−ＡＡＧ−ＧＡＧ−ＧＡＣ−ＡＴＣ−４八Ｃ−ＧＴ＾−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−へへＣ−ＡＧＣ−ＡＡＣ−へ＾Ｇ−＾へＧ−Ａ＾八−ＣＧＣ−ＧＡＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＡＧ−ＡＡＡ−ＣＴＧ−ＡＣＴ−ＡＡＣ−ＴＡＣ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−八ＣＡ−ＧＡＴ−ＣＴＧ−ＡＡＣ−ＧＴＧ−ＣＡＧ−ＣＧＴ−へＡＡ−ＧＣＴ−ＡＴＴ−ＣＡＣ−ＧＡへ−ＣＴＧ−へＴＣ−Ｃ＾へ−ＧＴＴ−ＡＴＧ−ＧＣＴ−Ｇ八八−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＣＣＴ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＡＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＣ−ＡＡ八−ＣＣＣ−八ＡＧ−ＣＧＴ−ＡＧＣ−ＣＡＧ−＾ＴＧ−ＣＴＧ−ＴＴＴ−ＣＡＧ−（ｏｒ　ＣＧＴ）　−ＣＧＴ −ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＧＣＴ−ＴＣＴ−ＣＡＧ。上記の翫ｊすにおいては、能面り牙’ｈ基および始めのメチオニン指定コドンは図示されておらず、終末ＦＥ＋＋１あるいは終末５ａｌｌ制限部位をもたらす配列も図示されていない。縦線が各サブユニット酎ツリに帰する頭鎖部分を分けている。下記の例は本発明のＤＮＡ配列の製造に使用するためのデオキシオリゴヌクレオチドの調製のだめの望ましい一般手順を示すものである。第１併ｌオリゴヌクレオチド断片は、４段階手順と途中での何度かの洗いを用いて合成された。半融ガラス漏斗に入れられたポリマー結合ジメトキントリチルに保護されたヌクレオシドは、最初にジクロロメタンの中で３％三塩化酢酸を用いて１Ｖ２分の間５゛−−保護除去された。ポリマーはそれからメタノール、テトラヒドロフランおよびアセトニトリルを用いて洗われた。洗われたポリマーはそれから乾燥アセトニトリルで洗われ、アルゴンの中に置かれ、それから、下記のような凝縮処理を受けた。アセトニトリルに１０　ｍｇのテトラゾールを溶かした溶液０．５− がポリマーを入れた反応容器に加えられた。それからアセトニトリルに溶かした３０　ｍＨの保護されたヌクレオシド０．５　ｍ　１１Ｊ’ｌＤｉられた。この反応液は攪拌され反応時間は２分であった。反応体は吸引によって除去されポリマーはアセトニトリルで洗われた。この後に酸化段階が続き、２−６−ルチジン／Ｈ２０／ＴＨＦ、　１　：　２　：　２に０．１モルＩ２を含む心夜１ｍβが２分間のあいだポリマーに結合したオリゴヌクレオチド鎖と反応させられた。ＴＩＩＦによってすすいだ後に、ジメチルアミノピリジン（１００ｍ　ｌのＴＨＦ中に６．５　ｇ　）および無水酢酸の４対１溶液の中で２分間に渡ってキャッピングが行われた。その後に、メタノールによる洗い、およびＴＨＦによる洗い力領いた。それからＣＩｌ□Ｃ１２中の三塩（１３＠による処理で再びサイク）１．ＩＡ台まった。このサイクルは望みのオリゴヌクレオチ順びり力得られるまで繰り返された。最終的なオリゴヌクレオチド鎖は、室温で４粉間に渡ってチオフェノール、ジオキサン、トリエチルアミン１：２：２によって処理された。ジオキサン、メタノールおよびジエチルエーテルでｌ先った後に１オリゴヌクレオチドはポリマーから７１＃化アンモニウムを用いて室温で切り出された。ｌ容７夜をポリマーからデカントした後に、濃縮７持狡化アンモニウム溶液はシールしに８蓼倹冴の中で６０℃で１６時間に渡って加熱された。それから、１−ブタノールを用いてオリゴヌクレオチド溶液が４度抽出された。溶液は２０％ポリアクリルアミドＩＦ尿素電気泳動ゲルに充填され、泳動を行った後に、適切なりＮへハンドが分離された。そして、サブユニットＩＰ−１の組み立ての一般手順に従ってデオキシオリゴヌクレオチドからサブユニットが組み立てられた。望みの１４ＤＮＡ　％Ｖｉ＋Ｊの分離の後に、サブコ、二ノ１−ＩＰ−１は下記の仕方で構成された。１．５′接着末端を含む断片１３および断片２を除く、各ＤＮＡ断片１ナノ七肋り５′燐酸化された。２、ＤＮＡ　ノ＋１Ｒｉｔｉｔ！ＩＮ、断片＋３ト１４．１１．４：１２．９　ト１０．７　ト８．５．４：　６．３　ト４．　オヨヒｌと２が組み合わされ、９０℃まで力膿されたのちに、　２５’ｃまで徐冷された。３、　ＷｒられたアニーリングされたＤＮＡ対は順次組み合わセられ１３７°Ｃまで力［１熱されたのちに、２５℃まで徐冷された。４、断片１から断片１４までをすべて含む最終の試験管内のＡＴＰおよびＤＴＴの濃度はそれぞれ１５０　／Ｊ’Ｍおよび１８＠Ｍに調製された。この溶液に２０ユニツトのＴ−４ＤＮＡリガーゼが加えられ１反応物質は４°Ｃで１８時間に渡ってインキュベートされた。５、得られた粗生成物は９０゛Ｃまで２分間に渡って力醪央され、　１０　ｍＭ　）リエチル重炭酸アンモニウムを溶離剤として用いてセファデックスＧ５０／４０の上でゲル濾過された。６、望みの生成物は、５′瞭化の後に、８％ポリアクリルアミｌ’−ＴＰ、Ｅゲルを用いて楕円された。ザブユニノ）ＩＦ−２，ＩＦ−３およびＩＦ−４は同様な仕方で構成された。下記の例は次の物に関連する。即ち、サブユニ７　）ＩＦ−］、　ＩＦ−２，ＩＦ−３，およびＩＰ−４からのヒト免疫インターフェロンの組み立て。および、適切な栄養状態におｉＪるトランスフオームされた」、竺旦細胞の培養、　８１１１１’Ｍ）らのヒト免疫インターフェロンの分離、およびそうして分離されたインターフェロンの生物学的胤生の試験の各手順。第１例完全なヒトｌＦＮγを仕様する遺伝子をサブユニソ）ＩＰ−１，ＩＦ−２およびＩＰ−３から組み立てる）勺手順の主要なステップが第１図に示されている。１３６塩基対サブユニ、１−ＩＦ−１はゲルから電気溶出され、エタノールで沈澱さセたのちに再び水に０．０５＠モル／μｐの濃度で懸濁された。プラスミドｐＢＲ３２２（２，０ｐモル）は、　ＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌによって消化され、ホスファターゼで処理され、フェノールで抽出され。エタノールで沈澱され、再び水に０．１ｐモル／μｐで懸濁された。結合は０．１ｐモルのプラスミドと０．２　ｐモルのサブユニットＩＰ−１とを用いて、　Ｔ−４ＤＮＮグリガーゼよっｚ＋ｈンれハイブリッド・プラスミドｐｌＮＴ１が形成された。」、９旦がトランスフオームされそれから多数のρｌＮＴｌのコピーが分離された。上記の手順は５１５３塩基対サブユニノ目Ｆ−２を挿入してｐｌＮＦ２を形成するために繰り返されたが、但しプラスミドはＥｃｏＲｌおよびＢｇＩｎで消化された。】５３塩基対ＩＦ−３サブユニツトは、　ｐｌＮＴ３の製造の際に暉碧こｐｌＮＴ２に挿入されたが、但しプラスミドの消化にはＥｃｏＲｌおよびＢｉｎｄｌｌ＋が使用された。ＩＰ−４ザブユニツトは最終の発現ベクターの構成の際に下記のように使用された。まずプラスミドＰＶｖｌはカリフォルニア州、パロ　アルドのスクンフノーード大学から購入され、Ｐνｕ　ＩＩで消化された。標準プロセスを用いて、　ＥｃｏＲＩ　ｉαに−ＩＭ立がプラスミドのＰｖｕ　Ｈ部位に挿入された。このハイブリッドのコピーはＥｃｏＲｌおよびＨｐａ　ｌによって消化され、　ｔｒｐプロモーター／オペレーター領域の部分を含む２４５塩基対酋ｊすをもたらした。標準プロセスを用いて、免疫インターフェロンの始めの４アミノ酸（Ｃｙ３ −Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ　）用のコドンをもたらず全ｔｒｐ翻訳開始信号および塩基の残りの３７塩基対を取り込むためにＩＦ−４がｌ１ｐａ　Ｉ部位に付加された。得られたアッセンブリーは１ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１ｌｌによって消化されたｐｌＮＴ３に挿入されて、　ｐｌＮＴγ−ＴＲＰＩ７と呼ばれるプラスミドを生み出した。ｐｌＮＴ　ｒ−ＴＲＰＩ７を含むＥ、　ｃｏｌｊ細胞は、　Ｏ，Ｄ、６００　ｏｆ　１までトリプトファンが存在しない状態でに培地で培養された。インドールアクリル■が２０μｇ　７ｍ　Ａの濃度で加えられ、細胞はさらに２時間に渡って３７℃で培養された。細胞は遠＋＋、５）離によって収穫され、細胞のペレットは）ＩＥＰＥＳ緩衝ウシ新生児血清（ｐ）１８．０）中に再懸濁された。細胞は１０，０ＯＯｐｓ＋でフレンチ・プレスに１度掛けて溶解された。細胞熔解産物は遠心分離によってデブリスを除かわう上澄液はＣＰＥ検定によって抗ウイルス性を調べられた〔「インターフェロン・システムＪ　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａ（Ｈ編、−’Ｎ、Ｙ、、　Ｎ、Ｙ、（１９８１）　）　、分離された発現生成物は７−］と呼ばれた。この例は、プラスミドｐｌＮＴγ−Ｌｒｐ１１のＤＮＡ配列の変更に関するもので、この変更は例えばＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αＦの類似体のコードを持つ構造遺伝子のｔｒｐプロモーター制御発現におりるヘクターの使用を容易にした。第土例すでに述べたように、断片ＩＦ−４は、始めのメチオニンのコードの塩基およびＩＦＮ−γの最初の４アミノ酸および訂塩基対（Ｈｐａｌ平湯末端を持つその５゛末端から始まる）を含むように構成され、前述の３７塩基対はｔｒｐプロモーター／オペレーター発現の３゛末端で完了し、ンヤイン・デルガルノ・リボゾーム結合ｍｉ！ｌ’Ｊを含む。ＩＦＮ−γ剖以体およびＩＦＮ−γ以外のポリペプチドのコードを持つ配列に関連する蘭竹よ、全ｔｒｐプロモーター／オペレーター領域に１ｌｉｌ＋限部位３′が設けられたら容易になることは明らかであった。例を挙げると、その他の遺伝挙用のＩＦ−４に対応する配列は、　ｔｒｐプロモーター／オペレーターをＭＪＭするのに必要な全３７塩基対を再び組み立てずとも１組み立てることができ１完全なプロモーター／オペレーターを持つ適切なリーディング・フレームのなかへの挿入を容易にするような塩基を５゛末端に必要とするだけである。この目的にかなうように、酎ｉすＩＰ−４は、　ｔｒｐブロモ−クー／オペレーターを完成する塩基対にＸｂａＩ制限部位３”を組み込んで再組み立てされた。　この構成は下の第Ｖ表に示されている。第ｙ表断片ＩＦ−４のこの変種はｐｌＮＴ　ｒ　−ｔｒｐＩ７　（ｌｌｐａｌおよびＢａｍ１ｌＩで消化されたもの）に挿入されプラスミドｐｌＮＴ　ｒ−ＴＸｂ４が生み出され、このプラスミドのＩＦＮ−γを仕様する遺伝子はＸｂａｌおよび５ａｉｌで消化することが可能であり、そして全ｔｒｐプロモーター／オペレーターは大きな断片に留まる。下記の例はＩＦＮ−γの構造剰以体の組み立てに関するもので、そのポリペプチド構造は１つ以上のアミノ酸の種類あるいは位置がＩＦＮ−ｒとは異なる。第五例ＩＦＮ−γの類似体の第１のクラスが形成されたが、それは位置８１にアスパラギンの代わりにリジン残基を含んだ。この類似体を生み出すのに必要な単一の塩厚轟ツリの変更は、第■表のサブユニットＩＰ−２の断片３５および３６であった。アスパラギンを定めるコドンＡＡＣは。リジンを定めるコドンＡＡＧによって置き換えられた。前述の変更されたＤＮＡ配列（Ｌｙｓ　８１］　ＩＦＮ−γの発現生成物は分離されてγ−１０と名付けられた。ＩＦＮ　γ類似体の別のクラスは、アミノ酸発現に存在する１つ以上の潜在的なグリコシレージョン部位力悄１１除されたポリペプチドから成る。より具体的に云うと、それらは（Ａｒｇ１４０　）　ＩＦＮｒあるいはＣＧｉｎ　１４０　）　ＩＦＮ　γから成り、これらにおいてはポリペプチド配列は１つ以上の自然に生しる配列（’　（ＡｓｎあるいはＧｉｎ）　（なんでもよい）　−（Ｓｅｔある位をもたらすことが分かっている。前述のＩｌｌの１つは、ＩＦＮｒにおいて１位置器から位置３０を占め（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　）　、別のもめは位置１０１から１０３を占める（八５ｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　）。位１８〜３０の変更を伴う本発明による類似体の調製においては、４つの全てのＩＦＮ−ｒサブユニットを含むプラスミドをＢａｍ１１１およびＨ４ｎｄｎｌによって切断してサブユニットＩＦ−３を除去し、続いてサブユニットＩＦ−３の変種を挿入するが、この変種においてはアスパラギンのＡｌＩＣコドンはグルタミンのコドンＣＡＧによって置き換えられる。　（前述の置換は１デオキシオリゴヌクレオチド断片３７を変更してＡＭＣではな（ＣＡＧを含むようにし、さらに断片３８を変更してＴＴＧではな（ＧＴＣを含むようにすることによって達成される。第■表を参照のこと。）前述の変更されたＤＮＡ配列（Ｇｉｎ　２８）　ＩＦＮ−γの発現生成物は分離されてＴ−１２と名付られた。このタイプのポリペプチド類似体は、酵母細胞で発現されてもグリコシレートされないように思われる。このようにして生成されたポリペプチド類似体は、自然に生じるＴＦＮ　ｒとは、自然の形態の抗体との反応性において、あるいは抗増殖あるいは免疫調節薬理学的効果において、あきらかな違いがあるとは考えられないが、ある形であるいは幾つかの形で優れた薬勇Ｊを示す可能性がある。ＩＦＮｒのその他のクラスは、［Ｔｒｐ　３９］残基が［Ｐｈｅ　３９］に置き換えられ、および／あるいはアミノ酸位置４Ｂ、　８０．１２０および１３７でメチオニン力考１［えばロイシンによって置き換えられ、および／あるいは、アミノ酸位置１および３でシステインカＡ列えばセリンによって置き換えられるか或いは完全に除去されたポリペプチドから成る。これらの最後に述べた類似体は１分子間のジスルフィド・ブリッジ形成能力がないので微生物によって発現するともっと容易に分離出来る可能性がある。位置３９のトリプトファンのフェニルアラニンによる置換は、サブユニノ目Ｆ− ３のＴＧＧコドンをＴＴＣ（ＴＴＴも使用できた）で置き換えることを必要とし、これはデオキシオリコスクレオチド断片３３の変更（ＴＧ［；からＴＴＣへ）およびＩＰ−３を型造するのに（併された重複断゛片３６の変更（ＴＧＡからＴＡＣ）によって成された。　ＣＦ’ｈｅ　３９．　Ｌｙｓ　８１）　ＩＦＮ−ｒは、ｉｌ」述の変更されたＤＮＡ配列（上記の位置８１のアスパラギンをリジンに置き換えることをも含む）の発現生成物を分離したものであるが、ｒ−５と名付られた。同様に３位置４８．８０．１２０．および】３７のそれぞれでの１つ以上のメチオニンの置換は。ザブユニ、　１−ＩＦ、、３　（デオキシオリゴヌクレオチｌ−３］、　３２および３３の再構成と共に）。ザブユニットＩＦ−２（デオキシオリゴヌクレオチ１−断片２１および２２の再構成と共に）、そしてザブユニットＩＦ−１，（デオキシオリゴヌクレオチド断片７と１０および／あるいは３と４と共に）の変換に関係する。位置４日でトレオニンがメチオニンに代わったＩＦＮ−γの類似体は、サブユニットＩＦ−３内の断片３１を変換してメチオニン仕様コドンＡＴＧを抹消しＡＣＴコドンで置換することによって得られた。この変化を起こすためには、断片３４の変換（ＴＡＣからＴＧＡ　）も必要であった。　（Ｔｈｒ　４Ｂ、　Ｌｙｓ　８１１１１ＦＮ−ｒは、前述の変換されたＤＮＡ配列（位置８１にリジン仕様コドンをも含む）の発現生成物を分離したものであるが、Ｔ−６と名付けられた。位置１および３のシスティンの置換あるいは肖ＩＪ除は、サブユニットＩＦ−４の変換のみに関係する。第１の例として、ザブユニットＩＰ−４の構成を変換して位置１および３の両システィン仕様コドン（それぞれＴＧＴおよびＴＧＣ）をセリン仕様コドンＴＣＴで置き換えるには。２つの断片の再構成を必要とするだけであった蔀■表のｅとｆ）。　（Ｓｅｒ　Ｌ　Ｓｅｒ　３、Ｌｙｓ　８１３１ＦＮ−γは、前述のように変換された［Ｌｙｓ　８］］　ＩＦＮ−ｒ　ＤＮＡ翫ツリの発現の生成物から分離されたものであるが、γ−２と名付られた。別の例として、（Ｌｙｓ　Ｌ　Ｌｙｓ　２．　Ｇｌｎ　３．　Ｌｙｓ　８１　）　ＩＦＮ−γはγ−３と名付けられたが、サブユニノ目Ｆ−４の変換構成の発現生成物として１等られたが、そこではコドンへへへ、Ａ＾へおよびＣへ＾がそれぞれＴＴＧ、　ＴＡＣおよびＴＧＣに代わった。最後に、（ｄｅｓ−Ｃｙｓ　］、　ｄｅｓ−Ｔｙｒ　２．　ｄｅｓ−Ｃｙｓ　３．　Ｌｙｓ　８］　）　ＩＦＮ−７はｒ−４と名付けら５”−ＡＴＣＣＡＧ−３’ れたが、アミノ酸仕様領域のサブユニノ目Ｆ−４断片を３’　−ＴＡＣＧＴＣ− ５’に変換することによって得られた。遺伝子の始めのアミノ酸コーディング領域の上述した変換は第４例のｐｌＮＴγ−ＴＸｂ４の構成によって多いに促進されたが、それはアミノ・ターミナル蛋白質コープインク酒びりを完成して遺伝子を完全なｔｒｐプロモーターに結合するのに、　ＢｂａｌおよびＢａｍＨＩ付着末端を持つ短い翫５１Ｊを作るだけで済んだからである。本発明によってもたらされるＩＦＮ−γ顛す体ポリペプチドのその他のクラスには、以前からポリペプチドの第２および第３の立（本配置に関連すると見なされてきたアミノ酸、ｉ＜ＩＦＮ−Ｔと異なるものが含まれる。−仔すを挙げると、ＩＦＮ−ｒポリペプチド内の中間位置にシスティン残基をもたらすと　ＩＦＮ− αに見られるようなアミノ　ターミナル残基と中間のシスティン残基との間に分子間ジスルフィド・ブリッジの形成を（足進する構造を持つポリペプチドの種類を生み出す。さらに２本発明に従うポリペプチドにプロリンを挿入するかあるいは欠失さゼると、直線状の曲がった立体配置に変化か生して生物学的活性にも影響があると考えられる。　（Ｌｙｓ　８１．、　Ｃｙｓ　９５］　ＩＦＮ−１は３　Ｔ−９と名付けられたが、ザブユニ、目Ｆ−２５’　−ＴＴＣ−３’　５’ 　−ＴＣＧ　３の断片１７および１８の３’−ＡＡＧ−５”に代わる３’−ＡＧＣ−５’で変形したＤＩＩＡ配列の発現から分離された。　（Ｃｙｓ　９５：ｌ　ＩＦＮ−γ　（γ−１１と名イ」られる）剣士様するＤＮＡ発現が司し一般的手順によって現在作られている最中である。同様に、（Ｃｙｓ　９５．　Ｐｒｏ　１０４　）　ＩＦＮ−７のコードを持つ遺伝子も、トレオニン仕様コドンＡＣへ　（ＩＦ−２の断片１５）をプロリン仕様コドンＣＣへに変えることによって作られている最中である。ＣＧｌｕ　５　）　ＩＦＮ−γは＋’　ｙ−１３と名付られるが、サブユニットＩＰ−３の断片４３を変換して。アスパラギン酸仕様コドンＧＡＴではなくグルタミン酸塩仕様コドンＧＡへを含むようにすることによって得られるであろう。前述の変更は、その遺伝子座にＢａｍＨＩ認識部位を存在することを許さないと考えられるので、サブユニットＩＰ−３４閤頃合サブユニットとしてサプユニソ）ＩＰ−４のアミノ酸仕様部分を含むものとして作られる必要があり１組み立てられた遺伝子のχｈａｌとＨｉｎｄｌＩｌの間には制限部位は無くなる。このＩＦＮ−ｒ類似体は自然に生しる形態のものよりも酸に対して安定にていると考えられる。上述したトリプトファンおよび／あるいはメチオニンおよび／あるいはシスティン置換を持つ上記の類似体は、自然に生しる１ＦＮ−γど比較して、自然形態のものに対する抗体との反応度あるいは抗増殖薬効あるいは免疫調節作用の点において異なるとは考えられないが、薬理学的効果はより長いものと期待されている。さらに別の類似体のクラスには、「ハイブリッド」あるいは「融合したｊタイプのポリペプチドがあり、これらは定められた６すの末端に１つ以上の追加のアミノ酸を含む。これらは、　ＩＦＮ　γのコードを持つ全配列に、別の製造されたＤＮ＾配列８例えば、後に述べるＬｅｌＦＮ−Ｃｏｎに特有のポリペプチドの配列のコードを持つサブユニットの１つを追加することによって形成される遺伝子によって発現されるであろう。発現されるポリペプチドは。自然に生しるＩＦＮ　ｒの抗体反応を幾分か残し、そして、　ＬｅｌＦＮの抗体反応を幾分か示すと考えられる。その薬理学的な作用は１作用の薬効および持続期間の２つの点において自然に生しるＩＦＮ−ｒに優るものと考えられている。下の第■表は５本発明に従って調製されたＩＦＮ−γの抗ウィルス作用と試験された靴以体の幾つかのものの抗ウィルス作用の研究の結果をまとめたものである。相対的な抗ウィルス作用は、　Ｍ＋ｉｓ筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）に感染したヒト・ヒーラ細胞において検定されたが、イミュノアブソーバントアソセイにおいて決定されたＩＦＮ−γに対するモノクローンの抗体に結合する単位当たりのものである。第可表下記の例は、これまでの例のＤＮＡ配列内のポリペプチド・コーディング領域内の変換に関するもので、前述の変換は望みの生成物の発現を促進するものである。第旦例ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γの類似体のコードを持つ製造されたＤＮＡ　Ｍｉ！ｐｌＪの微生物による発現のポリペプチド生成物に行われた分析の暫定的結果から、２つの主な蛋白質力吠体同じ量だけ製造されたことが明らかになった。１つは完全な１４６アミノ酸ＩＷＩＪに対応する１７に形態のもので、いま１つはアミハターミナルの約５０アミノ酸を失ったインターフェロン断片に対応する１２に形態のものである。製造された遺伝子におけるコドンの使用を検討した結果、短い種類のものは、塩基ｉＥ＋１３　’がシャイン−デルガル口・リポソーム結合配列に類似しているために生したＭｅｔ　４８残基における微生物翻訳開始の結果形成されん可能性が高いことが明らかになった。このように、転写されたｍＲＮＡの約半分は始めのメチオニンに先行する遺伝子座においてのみリポソームと結合したが、残りの半分はＭｅｔ　４８コドンに先立つ遺伝子座で結合されたように思われた。ポリペプチド・コーディング領域内でリポソーム結合が生しる可ｆ！旨を減らすために　−ＩＪブユニットの断片３３および３４は再構成された。もっと具体的にいうと８位置４１にグルタミン酸塩残基を仕様するのに用いられたＧＡＧコドンは別のＧＡΔコドンに変えられ１位置４５にアルギニンを仕様するのに用いられたＣＧＴコドンは別のＣＧＣコドンに変えられた。これらの変更は、ＩＦＮ−ｒのγ−６類似体を仕様する遺伝子を作る際に実施され、適切な長さの単一の優勢な種類のポリペプチドが生じた。下記の第７例および第８例は、ヒト白血球インターフェロンのＦサブタイプ（” ＬｅｕｌＦＮ−ＦＪあるいはｒｌＦＮ−αＦＪ）およびそのポリペプチド類似体を仕様する製造されたＩＦＮ−αを生み出す本発明の手順に関連する。５１例Ｆサブタイプのヒト白血球インターフェロン用のアミノ酸伍啜りは、　ｃＤＮＡクローンの配列を調べて演繍されている。例えば、　（：０６ｄｅｌ１等、　Ｎａｔｕｒｅ、２００　、　ｐｐ、　２０−２６　（１９８１）を参照のこと。先の第１例、第２例および第３例の＝般手順が、ｐＢＲ３２２誘導発現へフタ−を用いてＩＦＮ−αＦをＥ、　ｃｏｕ内で微生物的に発現するために使用する製造されたＤＮＡ配列の設計および組み立てに使用された。３つの「大Ｊサプユニノ）ＤＮＡ　占表１Ｊ　（ＬｅｕｌＦＮ−Ｆ、　ＬｅｕｌＦＮ−ＦｌｌおよびＬｅｕｌＦＮ−ＦＩ［ｌ）および１つの「小」サブユニｙトＤＮ＾配列（ＬｅｕｌＦＮ−Ｆ　Ｎ）を構成するための一般計画が策定されなか、その計画を下の第■表に示す。第■表に吐丑上土はＬＥＵＩＦＮ−Ｆ　ＩＩＬｅｕｌＦＮ−Ｆ　Ｉ第■表に示した遺伝子謹上画の場合と同様に、第■表の計画は、デオキシリボヌクレオチド断片構成に支障のない限り微生物の（（先するコドンの使用と関連する。ラブユニノ、トを用いる発現ベクターの作成は、ＩＦＮ−ｒ仕様遺伝子に関連するものと似通っており、使用される市１肺酵素に僅かな違いがあるだけである。サブユニット１は＋　ＥｃｏＲｌおよび５ａｌｌによって切断されたｐＢＲ３２２に結合される。　（サブユニット終末部分は一本鎖Ｓａｌ＋　’？’Ｊ着末端」を含むが、榴ｉＩｉが行われると、５ａｌｌ認識＝ｌｉ４ま再構成されないことに注意。しかしながら、全Ｒａｍ１ｌ　ｌ認識宮田仏ま残り、その後のサブユニットの切出しを可能としている。）この第１の中間ブラスミＦは増面されサブコーニノ）ＩＩは、再びＥｃｏＲｌおよび５ａｌｌによる切断の後に増面されたプラスミドに挿入される。このようにして形成された第２の中間プラスミドは攬福さ、！′１７　そしてラブユニット■はＥｃｏＲｌおよびＨｉｎｄｌＩｌで切断されたｉＨＢされたプラスミドに挿入される。このようにして形成された第３の中間プラスミドはＬＷ椙さメ・１゜る。サブユニノ１−■は、第４例のｐｌＮＴγ−ＴＸｂ４から分離されたＥｃｏＲｌおよびＸｂａｌ断片Ｇこ結合され、この結合生成物（ＥｃｏＲｌおよびＢｓ　ｔＥ　ＩＩ付着末端を持つ）　ｉ：ｌ：ＥｃｏＲｌおよびＢｓｔＥ［Ｉによって切断さね、たＩＩ！Ｆｌ助れた中間プラスミドに挿入されて、最終の発現ベクターを生め出す。最終発現ベクターに挿入された第■表の製造されたＤＮＡ配列のｔｒｐプロモーター／オペレーターに制御されたＥ、　ｃｏｌｉによる発現から分離された生成物はＩＦＮ−αＦ）と名（＝ｊら才１゜た。第１仲１後に協（すＪ白血球インターフェロンに関して述べるように１位置１４にトレメーニン残基お」、び位置１６にメチオニン残基を持つヒト白血球インターフェロン・サブタイプは、　Ａｌａ　１４．ｂよびｌ１ｅｌθｇを持つサブタイプよりも高い抗ウィルス作用を示すことが良く知られてＬ）る。従って、ヒト白血球インターフェロン・サブタイプＦの珂以体が第７例のＤＮ八へ列の微生物による発現によって製造されたが、前述の配列は残基１４および１６に」−レオニンおよびメチオニンをそれぞれ仕様するように変更された。より具体的に云うと、（Ｔｈｒ　１４．　Ｍｅされたサブユニ７）Ｉｔ　（！４■表のもの）を挿入された第■表のベクターでトランスフオームされた」、並月内で発現された。サブユニ・ノド■の上記の変換は、アラニン仕様コドン応する変更はサブユニｙ　）ＬｅｕｌＦＮ−Ｆ　ＩＩの断片４０内７１すｂれた。下記の第９例および第１弱りは、ヒト白血球インターフェロン・サブタイプＦの類似体と名（＝Ｊけることの出来る協働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチドの微生物による合成における本発明の月餠こ関する。第直例本明細書においては、　「協働ヒト白血球インターフェロンＪ　（’ＩＦＮ−Ｃｏｎ　Ｊ　、’ＬｅｕｌＦＮ−Ｃｏｎ」）は、自然に生しないポリペプチドを意味し、前述のポリペプチドは全ての自然に生じるヒト白血球インターフェロン・サブクイフ配列に共通なアミノ酸残基を優勢的に含み、且つ全てのサブタイプに共通のアミノ酸の存在しない位置にその位置に１９９に生しるアミノ酸を含み、どんな場合にも少なくとも１°つの自然に生しるサブタイプに存在しないアミノ酸残基は含まない。　（ごの定義においては、サブタイプＡは他のサブタイプと位置を￥９すさ札位置４氾こ「欠りている」アミノ酸がある。二とが明らかになる。）このように定義されると　協働ヒト白血球インターフェロンは通富は全てのザブタイプの全ての知られた共通アミノ酸残基を含むことになる。自然に生しるサブタイプ配列とこ関する知識は常に伸展しているごとはお分りであろう。特定の位置の特定の残基の「共通性」を否定する新しいサブタイプが発見されるかも知れない。１つあるいはもっと多くの位置の後に改訂された共通性の決定に基づいて構造が予測されるポリペプチドにもこの定義が適用できると思７）れる。なぜなら、それらは共通のアミノ酸を優勢的に含み、さらに、もはや共通とつは考えられなくなったアミノ酸は該位置の１（勢なアミノ酸であると考えられるからである。何れかの位置において共通のあるいは曖勢なアミノ酸を含まないポリペプチドでも、その（９−置の残Ｗが少なくとも１つのサブタイプで生しれば定義に当てはまる。協ｌｉｔヒト白面ｆ本インターフェロンの１つ９十の内部のあるいｌ末の残基を欠くか、あるいは、いずれのザブタイプにも仲間のない内部のあるいも将２末の残基を持つポリペプチドは、ヒト協働白血球インターフェロンの類似体と見なされるであろう。８つのｃＤＮＩＩ秀導ヒト白血球インターフェロン・サブタイプの発表された予１則アミノ耐酒己列シま、１６６残基の配列内のアミノ酸の＋ｉ＋順に関じて解析された。−（Ｉ彫こ、Ｇｏｅｄｅｌｌ等、肺聾、益岨、　ｐｐ、　２０−２６　（１９８１）を参照のこと。前述の論文はＬｅｌＦＮ−ＡからＬｅｌＦＮ−Ｈまでを比較し、７９のアミノ酸だけが８つの全てのインターフェロン形態の同一位置にあり、Ｅサブタイプ（ｃＤＮＡ偽遺伝子から得られたもの）を無視すると９９のアミノ酸が同じ位置にあると指摘した。残りの位置については、それぞれのアミノ酸の相り１的な存在頻度が分析され、１つのアミノｒ＃Ｊ＜８つの形態のうちの少なくとも５つ形態の同し位置にある場合は、そのアミノ酸はその位置の優勢なアミノ酸であるとされた。１６６アミノ酸のｒ協働Ｊポリペプチド肖Ｊすが図示さ札　８つの１固々の配列と比較された。その結果、　ＬｅＩＦＮ−Ｆのその「自然に生しるＪ形態を僅かに変えるだけで協（ｅｋツリに従うことが判明した。製造されたＩＦＮ−Ｃｏｎ　ＤＮＡ　１ｊｊｉＪ１４を作る割画が策定された。この計画は下の第１表にしめさり、でいる。この表においては、　ＬｅｌＦＮ− Ｃｏｎ　１を生み出ずのに、即ち、　ＩＰＮ−αＦの（Ａｒｇ　２２、　Ａｌａ　７６、　Ａｓｐ　７８．　Ｇｌｕ　７９．　Ｔｙ？　９０．　Ｌｅｕ　９６．　Ｔｈｒ　１５６．　Ａｓｎ　１５７．　Ｌｅｕ　１５８　）類似体を生め出すのにＩＦＮ−αＦに加える必要のある変更が星印で示されている。図示された頭鎖配列は、可能な場合は必ず、−ル薊内の優先的発現の対象となるコドンを含む。この西びりは、　ｌ’ｉｌＪの中間の位置にＳａｌ、　１ｌｉｎｄ　ＩＩｌ、およびＢｓ　ＬＥ２の認識部位をもたらす塩基を、そして配列の両えり組こはＸＢａ？およびＢａｍ１ｌＪの認識部位をもたらす塩基をも含む。後者の１ＩＦＮ −αＦおよびその類似体用に作られた配列の場合と同様に，この配列をｐＢＲ３２２ヘクターに組み込む際に使用するために選択された。第１表次の第■表は，ＩＦＮ−Ｃｏｎ　１の製造に使用する４サブユニツトＤ＼へ百ツリの調製のための特定の二本鎖Ｄ＼八へ列を示している。サブユニットＬｅｕＴＦＮ−ＣｏｎＮは．第ＸＩ［表のＬｅｕｌＦＮ−ＦＩＶの複製である。ＩＦＮ− αＦ遺伝子を作るのに用いられたものと異なるサブユニットの断片はｒプライム記号Ｊで示されている（例えば、３７”および３８゛は位置２２シこａいてグリシンではなくアルギニンをもたらす必要のある３７および３８の変形されたものである）。第■表い可セｉ　Ｃｏｎ−叩Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＬｅｕｌＦＮ　Ｃｏｎ　ＩＩＬｅｕｌＦＮ　Ｇｏｎ　ＩＥｃｏＲＩ　１１４　１２０１３０Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｉｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　’Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒｌ、６０　１６６Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ、Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＡｒＢ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｔｐ第■表の４つのサブユニットは、第７例の手順に従って順次に発現ベクターに挿入され、　ｔｒｐプロモーター／オペ（レータ−の制御を受ける第■表のコーディングリポソームを持つベクターを生み出した。このベクターのＥ、　ｃｏｌｉ内における発現の生成物はＩＦＮ−Ｃｏｎ　＋と名付られた。このポリペプチドはＧｏｅｄｅｌ　Ｉ等、前掲に示された全ての共通の残基を含んでおり、さらに、　Ｓｅｒ　８０．　Ｇｌｕ　８３．　Ｖａｌ　１１４およびＬｙｓ　１２１を除外して、参照文献の配列の要約の分析によって示された優勢なアミノ酸も含んでいる。上記の４つの残基はサブユニットの形成と発現ベクター内への組み込みとを容易にするために天然のＩＦＮ−αＦ　１１Ｊから保持された。　（例えば、セリーンは位置℃０に保持されて＋　Ｉ（ｉｎｄ１１１部位の形成を可能とした。）Ｇｏｅｄｅｌｌ等のＩＦＮ−αサブタイプの要約の発表の後に、幾つかの追加のサブタイプが確認された。第２図は、現在知られている１３のザブタイプ（知られている５つのｃＤＮＡ偽遺伝子により明らかになったものは除く）の演鐸された配列を表の形で示しており、別の研究所が同じＩＦＮ−αサブタイプに付けた別の名称は括弧内に示されている（例えば、　ＩＦＮ−α６およびＩＦＮ−αＫ　）　。例えば、　［；ｏ６ｄｅｌ＋等、　削孔Ｓｔｅｂｂｉｎｇ等１組み替工側［生成物ユ乙乞２ユＩン　イン　−フエロンおよび　本少千ン（＾、　Ｂｏｌｌｏｎ園、　Ｃ，ＲＣプレス（１９８３）　。およびＷｅｉｓｓｍａｎ等、　現す一【金胛、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　２５．　ｐｐ、　２９５−３２６　（１９８２）を参照のこと。共通のアミノ酸の無い位置は肉太活字で示されている。ＪＰＮ−αザブタイプは大まかにアミノ酸残基に基づいてグループ分けされている。７つの位置で（１４，１６，７１，７８、７９，８３および１６０）、種々のサブタイプは僅か２つの代替アミノ酸を示し、７つの位置のどれが司しアミノ酸残基に占められているかに基づいてサブタイプを２つのサブグループ（Ｉおよび■）に分類することを可能としている。３つのＩＦＮ−αサブタイプ（Ｈ，ＦおよびＢ）は４位置の区別でグループＩあるいはグループ■に分類することが出来ず、これら具体的に云うと、　ＩＦＮ−Ｃｏｎ　ｌの発現ベクターはＢｓ　ｔＥ　ＩＩおよびＨｉｎｄｕで処理され、サブユニットＬｅｕｌＦＮ　Ｃｏｎ１［ｌを除去された。変更されたサブユニットが挿入されたが、このサブユニットにおいては１位置３９および４０のアラニン仕様コドンＧＣＴがトレオニン仕様コドンＡＣＴで置換され、イソロイシン・コドンＣＴＧはＡＴＧに変えられた。変更された製造された遺伝子の発現の生成物である（Ｔｈｒ　１４．　Ｍｅｔ　１６．　Ａｒｇ　２２．　Ａｌａ　７６、　Ａｓｐ　７８．　Ｇｌｕ　７９．　Ｔｙｒ　８６゜ソトにおいては１位置３９および４０のアラニン仕様コドンＧＣＴがトレオニン仕様コドンＡＣＴで置換され３イソロイシン・コドンＣＴＧはＡＴＧに変えられた。変更された製造された遺伝子の発現の生成物である（Ｔｈｒ　１４．　Ｍｅｔ　１６．　Ａｒｇ　２２．　Ａｌａ　７６、　Ａｓｐ　７Ｂ、　Ｇｌｕ　７９．　Ｔｙｒ　８６゜Ｔｙｒ　９０．　Ｌｅｕ　９６．　Ｔｈｒ　１５６．　Ａａｎ　１５７．　Ｌｅｕ　１５８　）　ＩＦＮ−αＦはＩＦＮ−Ｃｏｎ　２と名付られた。現在１位置１１４および１２１の残基の種類の点でＪＰＮ−Ｃｏｎ　１と異なる協働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチドのための遺伝子が作られている。より具体的に云うと、　ＩＦＮ−αＦサブタイプ残基を複製する力嘔勢なアミノ酸ではないＶａｌ　１１４およびＬｙｓ　１２１残基は、それぞれ優勢なＧｌｕ　１１４およびＡｒｇ　１２１残基に変えられる。コドンをＶａｌ　１１４がら＾ｒｇ１１４に卿ち、　ＧＴＣからＧＡＡに）変更すると、サブユニットＬｅｕｌＰＮ　Ｃｏｎ　Ｉ　＠Ｄ（ａの終末部分に５ａ１１部位が存在できなくなるので、サブユニット■および■は単一のサブユニ。ンをＣＴＧに変えると１位置１２１にアルギニンが存在することが出来る。製造された遺伝子Ｔｙｒ　９０．１．ｅｕ　９６．　Ｔｈｒ　１５６．　Ａｓｎ　１５７．　、Ｌｅｕ　１５Ｂ　）　ＩＦＮ−αＦはＩＰＮ−Ｃａｎ　２と名付られた。現在１位置１１４および１２１の残基の種類の点でＩＦＮ−Ｃｏｎ　１と異なる協働ヒト白血球インターフｌロン・ポリペプチドのための遺伝子が作られている。より具体的に云うと、　ＩＦＮ−αＦサブクイプ残基を複製する力頑勢なアミノ酸ではないＶａｌ　１１４およびＬｙｓ　１２１残基は１それぞれ優勢なＧｌｕ　１１４およびＡｒｇ　１２１残基に変えられる。コドンをＶａｌ　１１４がらＡｒｇ１１４にＵち、　ＧＴＣからＧＡＡに）変更すると、サフ゛ニー’−ｙトＬｅｕｒＦＮ　Ｃｏｎ　Ｉ　Ｑｆ−ｒｘａの終末部分に５ａｌ１部位が存在できなくなるので、サブユニソｌ−１および旧おＵ−のサブユニットとして作られる必要が生しると思われる。断片１１および１２のＡＡＡ、即ち、リジン・コドンをＣＴＧに変えると１位置１２１にアルギニンが存在することが出来る。製造された遺伝子の微生物による発現の生成物である（Ａｒｇ　２２．八ｌａ　７６、八ｓｐ　７８．　Ｇｌｕ　７９．　Ｔｙｒ　８６．　Ｔｙｒ　９０、　Ｌｅｕ　９６．　Ｇｌｕ　１］４．八ｒｇ　１２Ｌ　Ｔｈｒ　１５６．八ｓｎ　１５７．　Ｌｅｕ　１．５８　］　ＩＦＮ−αＦはＩＦＮ−Ｃｏｎ　３と名イ」られた。下記の例は、細菌において、特にＥ、　ｃｏｌｉにおいて外来性遺伝子の発現のレベルを高める手順に関する。第１例上記の６１１の発現ベクターの形成において、　ｔｒｐプロモーター／オペレーターＤＮＡ　６１Ｊが用いられたが、前述のＩＩＪは始めの転写開始（Ｍｅｔ　 −］、　ＡＴＧ　）の直前の位置にリボソー白質コーディング遺伝子の＋　Ｉｎｏｋｕｃｈｉ等、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、　１０．　ｐｐ、　６９５７−６９６８　（１９８２）　、　Ｇｏｌｄ等、八ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍ４ｃｒｏｂｉｏｌ、　３５．　ｐｐ、　３６５−４０３　（１９８１）およびＡｌ　ｔｏｎ等、拗句匹、囮影、　ｐｐ、　８６４−８６９　（１９７９）において報告されたリポソーム結合■載に牙Ｉ肋１剣付され１１２印且蛋白質ｏｈｐ−Ｆ＜アウター・メンプレイン蛋白質）　、　ＣＲＯおよびＣＡＭ　（クロラムフェニコール・トランスアセチラー切に関連するものの部分的な複製の１８１Ｊを用いることが決まった。５’−ＡＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＴ八−３′３’　−ＴＴＧＧＴＡＣＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴ−５’このＳすを１例えばＩＦＮ−Ｃｏｎ　１あるいはＩＦＮ−αＦ、のコードを持つ製造されたＩＦＮ−αの蛋白質コーディング領域の前に組み込むために１発現ヘクターのサブユニ７）ＩＶは削除され（ベクターをＸｂａ！およびＢｓ　ｔＥ　ＩＩで切断することにより）、変更された断片４１Ａおよび４２Ａおよび断片４３および４４を新断片ＲＢＩおよびＲＢ２で置換した変更済みサブユニ７）ＩＶ力代わった。変更された翫牙すの構造は下の第Ｘ表に示す通りである。第Ｘ表Ａ翫ツリを示し、　ｔｒｐプロモーター／オペレーター内のＨｐａ１部位で始まるＧ■表のサブユニットＩＰ−４と比較のこと）。第夏表Ｈｐａｌ　ＸｂａｌＡＡＣＴＡＧ　ＴＡＣＧＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　ｃＧＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＴＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡＴＴＧ　ＩＩＴＣＡＴＧ　ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＡＧ　ＡＴＣＴＴＴ　ＧＧＴｔ−ｉコドンの直前に下記のｉ＆１が生した。全てのＲＢＳ　６すの挿入部は、ンヤインーデルガルノ翫ワリに良く梱以しており、アデニンが豊富で５過密「停止Ｊコドンをもたらすｉ＃＋１を含むことが分かる。ＩＦＮ−Ｃｏｎ　１のＥ、　ｃｏｌｉ発現レベルは、３つのＲＢＳ挿入部浣全なｔｒｐプロモーター／オで定量された。ＯＭＰ−Ｐ　ＲＢＳ複製配列を用いた望みのポリペプチドの発現は５培養１β当たり１５０〜３００　ｍｇであり、全蛋白質の１０〜２０％に当たった。ＣＡＭ　ＲＢＳ複忠腋汐すを組み込んだベクターの発現レベルは、　ＰＮＰ−Ｆ変種の約半分であった。ＣＲＯＲＢＳ複製発現を含んだベクターは、　ＯＭＰ−Ｆ変種の約１／１ｏのレヘルの望みの蛋白質を生み出した。下記の例は、これまで述べた例によりもたらされたヒト白血球インターフェロンおよびポリペプチドの抗ウィルス作用のスクリーニングに関する。第化例下の第ＸＩＩ表は１種々の細胞系におりる自然の（バフィコート）インターフェロンおよび分離され微生物的に発現されポリペプチドを仕様されたＩＦＮ−αＦ　、　、　ＩＦＮ−αＦ　２　、　ＩＦＮ−Ｃｏｎ　＋　＋およびＩＦＮ−Ｃｏｎ２の抗ウィルス作用の試験の結果を示す。使用されたウィルスはｖｓｖ　Ｃ＃Ｆｌ性口内ウィルス）およびＥＭＣＶ　（ｌｉ！１．＼筋炎ウィルス）であった。細胞系は種々の＠槍）らであり、ヒト（ＷＩＳＩ（、ＨｅＬａ）　、ウシ（ＭＤＢＫ）　、　？ウス（ＭＬＶ−６）およびザル（Ｖｅｒｏ）が含まれた。抗ウィルス作用は、　Ｗｅｅｋ等、　’Ｊ、　Ｇｅｎ、、　Ｖｉｒｏｌ、＋　５７＋　ｐｐ、２３３−２３７　（１９８１）およびＣａｍｐｂｅｌ　］等、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２１　ｍ、　１２４７−１２５３　（１９７５）に報告された終点細胞変性効果検定によってへｊｊ定された。ここに示すデータはＷＩＳ１１細胞における抗ウィルス作用に正規化しである。第μＶ表ウィルス　細胞系　ＩＦＮ−αＦ　ＩＦＮ−αＦ　ＩＦＮ−Ｃｏｎ　ＩＦＮ−Ｃｏｎ　ＩＦＮ−ＣｏｎＶＳＶ　ＷＩＳＩ＋　１００　１００　１００　１００　１００ＶＳＶ　）Ｉｅｌａ　４００　１００　ＮＤ＊　２００　１００ＶＳＶ　ＭＤＢＫ　１６００　３３　ＮＤ　２００　３００ＶＳＶ　ＭＬＶ−６２０５ＮＤ　３　２０ＶＳＶ　Ｖｅｒｏ　１０　０．Ｉ　ＮＤ　１０　０．１ＥＭＣＶ　ｌｌｌ５Ｉ＋　１００　１００　１００　１００　１００１００Ｅ　Ｈｅ１ａ　１．００　５　ＮＤ　３３　３３ＥＭＣＶ　Ｖｅｒｏ　１００　２ＯＮＤ　１０００　１０＊ＮＤ−現在データ無し。上述した８幇列から１本発明は、始めて、完全に新規な種類の合成された。生物学的に活性のある蛋白様の生成物をもたらすものであり、前述の生成物は自然に生しる形態のものとは１つ以上のアミノ酸の種類および／あるいは位置の点で、および１つ以上の生物学的（例えば抗体反応（１）および薬理学的（例えば薬効あるいは効果の持続ＸＪ＆’ｌ）な点で異なるものであるが、その他の前述の性質を実質的に保持するものであることは明白である。本発明の生成物は適切なｒ標識を付ける」ことが可能であり１例えば、酵素に接合したｌｊＭＨ生標識（例えば　１１２５を用いて）を付けるか３螢光色素で標識を付けるがして、体液ザンブル内の前述の生成物および／あるいは前述の抗体の存在量を定性的におよび／あるいは定量的に測定するための検定および／あるいは診１弗灸にキットに有用な試薬材料を提供することが出来る。前述の抗体は１つ以上の動物種（例えば、マウス、ラビット、ヤギ、ヒト等）に接種を行うかあるいはモノクローンの抗体源から得ることが出来る。前述の試薬材料は単独で、あるいは適切な基質１例えばガラスあるいはプラスチックのビーズに塗布してイ吏用することが出来る。これまで述べた具体例を考慮すれば本技術に熟達された方々ば本発明の実施の数多くの改善あるいは変更を思いつかれるものと思われる。従って１本発明は１蕗」する請求の範囲に反映される範囲においてのみ限定されるものと見なされるものとする。図１　クローニング計画ＩＦＮ−αｃｏｎＩＣＤＬＰＱＴＨ３ＬＧＮＲＲＡＬＩＬＬへＱＭＲＲＩＳＰＦＳＣＬＫＤＲＩＩＴＩＦＧＦＰＱＥＥＦＤＧＭＱＦＱＫＡ口ＡＩＳＶＬＨＥＭＩＦＮ−αｃｏｎ１１ＱＱＴＦＮＬＦＳＴＸＤＳＳＡＡＷＤＥＳ１．ＬＥＫＦＹ置ＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＥＶＧＶＥＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬＡＶＩＦＮ−α ｃｏｎ　Ｉ　ＫＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＷＲＡＥＩＭＲ３ＦＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ国際調査報告ｌｎｌ＋ｎ＋１ｉｅｎｉｌ　Ａｐｏｌ“ｅ＋ｌｏｎ　Ｎｏ　ＰＣＴ／ＵＳ８３１００６０５第１頁の続き５

Claims

【特許請求の範囲】１．長さ力係％ＯＯ塩基対を超え、且つ、アミノ酸の事前に決定された連続配列の発現をこの配列を含む選択されたＤＮＡベクターによってトランスフオームされた選択された宿主微生物の中でおこなわセるためのコートを持つ直線状二本鏡開＾耐汐すを製造する為の方法で、前述の方法が。（ａ）　長さが約１００塩基対から！ＶＯＯ塩基対までの２つ以上の異なるサブユ；ノド直線状二本鎖１１ＮＡ配列を調製するステップで。各にの異なるサブユニットＤＮＡ　Ｍｙりは１発現されるべき前述の事前に定められたアミノ酸酉ｊｌの異なる連続部分のコートを持つ一連のヌクレオチド塩基コドンから成り。前述のサブユニ７Ｆの第１のものの１つの終末領域は、塩基行ツリの一部分から成り。それは第１の１，１１限エンドヌクレアーゼによる切断の認識部位をもたらし、前述の認識部位は前述の選択されたアノセンフ刃−・ベクターにサブユニット力刊人されたのちにこのベクターのなかに１度あるかあるいは全く無いかどちらかであり。前述のサブユニットの第２のものの１つの終末領域は、塩ａＷＪ＋１の一部分から成り。それは前述の第１のエンドヌクレアーゼ以外の第２の制限エンドヌクレアーゼによる切断の認轟猶立をもたらし、この認識部位は前述の選択されたアッセンブリー・ベクターにサブユニットが挿入されたのちにこのベクターのなかに１度あるかあるいは全く無いかどちらかであり。サブユニットの残りの終末領域全部の少なくとも半分は、前述の第１および第２のエンドヌクレアーゼ以外の制限エンドヌクレアーゼによる切断の認識部位部分 □□□ましくはパリンドロームの６塩基対認識澗のを成し、この認識ｓ１色増述の選択されたアッセンブリー・ベクターにすべてのサブユニットが挿入されたのちにこのベクターのなかに１度そしてただ１度だけ存在するものと。（ｂ）　ステップ（ａ）で調製された前述の各サブユニットＤＮＡ酉ｊすを順次に選択されたアッセンブリーの生物学的増幅を行い、それによって、事前に定められた連続アミノ酸飯牙すのコートを持つ望みのＤＮＡ　ｆｉＥ＋ｌを含むＤＮＡベクターを形成するステップで１組み立てられる望みのＤＮＡ　Ｂすは、その中間位置に、制限エンドヌクレアーゼによる切断のための少なくとも１つのユニークな認識部位を含むものとから成る。２、請求の範囲第１項の方法で、前述の第１および第２のエンドヌクレアーゼ以外の制限エンドヌクレアーゼによるエンドヌクレアーゼ切断の制限部位が、パリンドロームな６塩基認識謂立であり、絹み立てられた望みのＤＮＡ　ｎＦ￥ｉすはその中間位置ＣｊＩＩ附エン［ヌクレアーゼ切断のための少なくとも１つのユニークな６塩唇、硯へ部位を持つもの。３、請求の範囲第１項の方法で、少なくとも３つの異なるサブユニットＤＮＡ配列がステップ（ａ）によって調製され順次に前述の選択されたベクターにステップ（ｂ）によって挿入され　そして得られた望みのＤＮＡ配列はその中間位置に少なくとも２つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むもの。４、請求の範囲第１項の方法で、製造されたＤＮＡ配列が生物学晦ご活性のあるポリペプチドのコードを持つ完全な構造遺伝子を成すもの。５、請求の範囲第１項の方法で、製造されたＤＮＡ配列において、ヌクレオチｌ −塩基の配列が２前述の選択された宿主微生物内におりるコドンの優先的な発現の特性に基づいて同じアミノ酸を仕様する代替コ１′ンのなかから選択された１つ以上のコドンを含むもの。６、長さ力傍４Ｊ２００塩基対を超え、且つ、アミノ酸の事前に決定された連１＆ｌＪの発現をこの配列を含む選択されたＤＮＡベクターによってトランスフズームされた選択された宿主微生物の中でおこなわせるためのコードを持つ製造された直線状二本鎖ＤＮＡ配Ｆ１１で、前述の配列がその中間位置に制限エンドヌクレアーゼ切断のための少なくとも１つのユニークなパリンドロームな６塩基認識部位を持つことを特徴とするもの。７、請求の範囲第６項のＤＮ＾配列で、その中間に２・つ以上や制限エンドヌクレアーゼ切断冊立を持ち５少なくともそれらの１つは６塩基のパリンドロームな認識澗立を持つことを特徴とするもの。８、請求の範囲第６項のＤＮＡ　（Ｈ７ｙ＋Ｊで、生物学的に活性のあるポリペプチドのコードを持つ完全な構造遺伝子を成すもの。９、請求の範囲第８項のＤＮ八へ列で、遺伝子がヒト・ポリペプチドのコードを持つもの。１０、請求の範囲第８項のＤＮＡ配列で、遺伝子がポリペプチドのコードを持つが、前述のポリペプチドが１つ以上のアミノ酸の＋ｍおよび／あるいは位置の点で自然に生しるヒト・ポリペプチドと異なるもの。比請求の範囲第６項のＤＮＡ配列で、ヌクレオチド塩基の翫ｊすが、前述の選択された宿主微生物内におけるコドンの優先的な発現の特性に基づいて同しアミノ酸を仕様する代替コドンのなかから選択された１つ以上のコドンを含むもの。１２、請求の範囲第６項の製造されたＤＮ＾配列の生物による発現のポリペプチド生成物。１３、請求の範囲第６項の製造されたＤＮＡ配列を含む生物学的機能ＤＮへ微生物トランスフＡ−メーシゴン・ヘクター。１４、請求の範囲第１２項のヘククーで、環状ＤＮＡプラスミドであるもの。１５、選択された宿主微生物内においてヒト免疫インターフェロンの合成を司る能力を持つ製造された遺伝子。１６、請求の範囲第す項の製造された遺伝子で、その中間位置に制限エン１′ヌクレアーゼ切°　断のための少なくとも１つのユニークな６塩基認識部位を持つもの。１７、請求の範囲第す項の製造された遺伝子で、塩基配列が、予定の宿主微生物内におけるコドンの（（先約な発現の９制生に基づいて同しアミノ酸を仕様する代替コドンのなかから選）Ｒされた１つ以上のジドンを含むもの。１８、請求の範囲第１７項の製造された遺伝子で、塩展己列が、Ｊ、替旦内におけるコドンの優先的な発現のｍ凱こ基づいて同しアミノ酸を仕様する代替コドンのなかから選択された１つり」二のコドンを含む゛もの。１９、請求の範囲第１５項の製造された遺伝子で、塩基６汐すが１頭鎖の５′お勤・ら始まって。１５ＴＧＴ−ＴＡＣ，−ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−ＣＣＧ−ＴＡＣ−ＧＴＴ−へへＧ −ＧＡＡ−ＧＣへ−ＧＡＡ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−ＡＡＡ−ＡへΔ−ＴＡＣ−ＴＴＣ八八へへ３５７ＴＧＣ−ＡへへＧＡＧ−Ｇｌへへ−ＴＣＣ−ＧＡＣ−ＣＴＧ−へＡＧ−ΔＴＣ− ＾ＴＧ−ＣＡＧ−ＴＣ，Ｔ−Ｃへ＾−ＡＴＴ−ＧＴ八−へＧＣ−ＴＴＣ−ＴＡＣ −ＴＴＣ−９４１１３ＧＡＧ−八ＡＡ−ＣＴＧ−ＡＣＴ−ＡＡＣ−ＴＡＣ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−ＡＣ八− ＧＡＴ−ＣＴＧ−ＡＡＣ−ＧＴＧ−ＣＡＧ−ＣＧＴ−ＡＡＡ−ＧＣＴ−ＡＴＴ− ＣＡＣ−であるもの。２０、請求の範囲第１９項の製造された遺伝子で、アミノ酸４１の塩基コドンカ旬ＡＡであり、アミノ酸４６の塩基コドンが部Ｃであるもの。２１、請求の範囲第１額の製造された遺伝子を含む生物学的聞能ＤＮＡ微生物トランスフＡ−メーション・ヘクター。２２、請求の範囲第２１項のヘククーγ、Ｊ、！１炒ｓ４プラス川！であるもの。２３、ヒト免疫インターフェロンの製造のためのプロセスで、請求の範囲第１５項の製造された遺伝子を含む生物学的機能を持つＤＮＡによってトランスフオームされた微生物を適切な栄養条件の下で増殖することを含むもので、それにより前述の微生物が前述の遺伝子を発現しｊＦ曳のヒト免疫インターフェロンを生み出すもの。２、特許請求の範囲第２３項のプロセスで、増殖される微生物が−１，ｃｏｌｉ −微生物であるもの。２５　選択された宿主微生物内においてポリペプチドの合成を司る能力を持つ製造された遺伝子で、前述のポリペプチドが１つ以上のアミノ酸のｆ！および７／あるいは位置の点てヒト免疫インターフェロンと異なるもの。２、特許請求の範囲第２額の製造された遺伝子で、その中間位置に１ノ１限エンドヌクレアーゼ切断のための少なくともｊフのユニークな６塩基認識９ｆ’ｌＱを持つもの。２７、請求の範囲第２ｙ頁の製造された遺伝子で、塩部酒ｐｌＪが、予定の宿主微生物内におけるコドンの優先的な発現の特性に基づいて同しアミノ酸を仕様する代替コドンのなかから選択された１つり」二のコドンを含むもの。２、特許請求の範囲第２７項の製造された遺伝子で、塩基株ψりが、」、唾内におけるコドンの（（先的な発現の特性に基づいて同しアミノ酸を仕様する代替コドンのなかから選択された１つり一ヒのコドンを含むもの。２９、請求の範囲第２５項の筋立された遺伝子を含む生物学的機能開Δ微生物１ −ランスフォーメーション・ヘクター。３０、請求の範囲第２９項のヘククーで、環状ＤＩＩＡプラスミドであるもの。３１、ヒト免疫インターフェロンの類似体の製造のためのプロセスで、請求の範囲第２５項の製造された遺伝子を含む生物学的機能を持つＤＮＡによってトランスフオームされた微生物を適切な栄養条件の下で増殖することを含むもので、それにより前述の微生物力１１１述の遺伝子を発現し正真のヒト免疫インターフェロンを生み出すもの。３２　請求の範囲第３１項のプロセスで、増殖される微生物が」、９旦微生物であるもの。３３、請求の範囲第２顛のプロセスのポリペプチド生成物。３４、請求の範囲第訂項のプロセスのポリペプチド生成物。３５、請求の範班悄狛４項のポリペプチド生成物で。（Ｌｙｓ　ｅｌ、ｌｌ　ＩＦＮ　ｒ。（Ｓｅｒ　１．　Ｓｅｒ　３．　Ｌｙｓ　８１）　ＩＦＮ　ｒ　。（Ｌｙｓ　１．　Ｌｙｓ　２．　Ｇｉｎ　３．　Ｌｙｓ　８１　）　ＩＦＮ　ｒ。（ｄｅｓ−Ｃｙｓ　Ｌ　ｄｅｓ−Ｔｙｒ　２．’　ｄｅｓ−Ｃｙｓ　３．　Ｌｙｓ　８１　）　ＩＦＮ　７　。（Ｐｈｅ　３９．　Ｌｙｓ　８１）　ＩＦＮ　ｒ　。（Ｔｈｒ　４８．　Ｌｙｓ　８１）　ＩＦＮ　ｒ　。（Ｌｙｓ　８１．　Ｃｙｓ　９５）　ＩＦＮ　ｒ　。ＣＣｙｓ　９５）　ＪＰＮ　ｒ。（Ｃｙｓ　９５．　Ｐｒｏ　１０４　）　ＩＦＮ　ｒ。ＣＧＩｎ２８］　ＩＦＮ　ｒ、　ｈよび（Ｇｌｕ　５　）　ＩＦＮ　ｒから成るグループから選択されたもの。３し　選択された宿主微生物内において協働ヒト白血球インターフェロンの合成を司るｆｉｉ２Ｊを１シ゛つ製造された遺伝子。３７、協働ヒト白血球インターフェロン。３８、請求の範囲第３７項の協働ヒト白血球インターフェロンで。〔八ｒｇ２２．．ＡＩａ７６、Ａｓｐ７Ｂ、Ｇｌｕ７９．Ｔｙｒ８６．Ｔｙｒ９０．Ｌｅｕ９６．Ｔｈｒ１５６．Ａｓｎ１５７゜Ｌｅｕ　１５８　）　ＩＦＮ− αＦ　。〔丁ｈｒＩ４．Ｍｅｔ１６．Ａｒｇ２２．Ａｈａ７６、Ａｓｐ７Ｂ、Ｇｌｕ７９．Ｔｙｒ８６．Ｔｙｒ９０，１．ｅｕ９６．Ｔｈｒ］５６．八ｓｎ　１５７．　Ｌｅｕ　１５８３　ＩＦＮ−αＦ　、および〔＾ｒｚ　２２．　八Ｉａ　７６、Ａｓｐ　７８．Ｇｌｕ　７９．　Ｔｙｒ　８６．Ｔｙｒ　９０，１．ｅｕ　９６．Ｇｌｕ　ＩＭ、Ａｒ５　１２＋。Ｔｈｒ　１５６．　Ａｓｎ　１５７．　Ｌｅｕ　１５８　］　ＩＦＮ−αＦから成るグループから選択されたもの。３９　選択された宿主微生物内においてヒト白血球インターフェロン・サブタイプＦの合成５’４ＧＴ−ＧＡＴ−ＴＴ八−ＣＣＴ−ＣＡＡ−ＡＣＴ−ＣＡＴ−ＴＣＴ−ＣＴＴ−ＧＧＴ−ＡＡＣ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−八ＴＴ−ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＧＣＡ−ＣＡＧ−へＴＧ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−へＴＴ−ＴＴＣ−ＣＣＧ−ＴＴＴ−へＧＣ−ＴＧＣ−ＣＴＧ−Ａへへ−ＧＡＣ−ＣＧＴ−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＣ−ＴＴＴ−ＣＣＧ−ＣＡＡ−ＧＡＡ−ＧＡＧ−ＴＴ（ニーＧＡＴ−ＧＧＣ−ΔハＣ−ＣＡＡ−ＴＴＣ−ＣＡＧ−＾＾＾−ＧＣＴ−ＣＡＧ− ＧＣＡ−八ＴＣ−ＴＣＴ−ＧＴ八−ＣＴＧへＣＡＣ−ＧＡｊｌ−ＡＴＧ−ＡＴＣ −ＣＡＡ−ＣＡＧ−ＡＣＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−ＴＴＴ−ＴＣＣ−ＡＣＴ −ＡＡＡ−ＧＡＣ，ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＧＣＴ−ＡＣＣ−ＴＧＧ−Ｇｉｎ−ＣＡＡ −八ＧＣ−ＴＴＧ−ＣＴＧ−ＧＡＧ−ＡＡＧ−ＴＴＣ−ＴＣＣ−ＡＣＴ−ＧＡＡ −ＣＴＧ−ＡＡＣ−ＣＡＧ−’ＣＡＧ−ＣＴＧ−ＡＡＣ−ＧＡＣ−ΔＴＧ−ＧＡＡ−ＧＣ＾−ＴＧＣ−ＧＴＡ−八ＴＣ−ＣＡＧ−ＧＡＡ−ＧＴＴ−ＧＧＴ−ＧＴ八−ＧへへＧＡＧ−ΔＣＴ−ＣＣＧ−ＣＴＧ−八ＴＧ−八八Ｃ−ＧＴＣへＧＡＣへへＣＴ−ＡＴＴ−ＣＴＧ−ＧＣ八−ＧＴＴ−八ＡＡ−ＡＡＧ−ＴＡＣ−ＴＴＣ −ＣＡＧ−ＣＧＴ−ＡＴＣ−ＡＣＴ−ＣＴＧ−ＴＡＣ−ＣＴＧ−ＡＣＣ−Ｇｉｎ −へＡＧ−へへへ−ＴＡＴ−ＴＣＴ−ＣＣＧ−ＴＧＣ−ＧＣＴ−ＴＧＧ−Ｇｉｎ −ＧＴ八−ＧＴＴ−ＣＧＣ−ＧＣＴ−Ｇｉｎ−＾ＴＴ−八ＴＧへＣＧＴ−ＴＣＴ −ＴＴＣ−ＴＣＴ−ＣＴＧ−へＧＣ−ＡＡＡ−へＴＣ−ＴＴＣ−ＣＡＧ−ＧＡＧ −ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＡＡＡ−ＧＡ八−３゜であるもの。４１、ヒト白血球インターフェロン・サブタイプＦの製造のためのプロセスで、請求の範囲第３９項の製造された遺伝子を含む生牛厨イ１■幾能を持つＤＮＡによってトランスフオームされた微生物を適切な栄養条件の下で増殖することを含むもので、それにより前述の徹仕物力捕ｊ述の遺伝子を発現しヒト白匍球インターフェロン・ザブタイプＦを生め出すもの４２、請求の範囲法１項の）冶セスのポリペブチ１生放物。４３選択された宿主微生物内においてポリペプチドの合成を司る能力を持つ製造された遺伝子で、前述のポリペプチドが１つ以上のアミノ酸のＪｉｉｌＮおよび／あるいは位置の点でヒト白血球インターフェロン・サブタイプＦと異なるもの。４４　じト白血球インターフェロン・ザブタイプＦと１つ以上のアミノ酸の種類および／あるいは位置の点で異なるポリペプチドの製造のためのプロセスで、請求の範囲第招項の屑省された遺伝子を含む生物学的機能を持つＤＮＡによってトランスフオームされた微生物を適（）Ｊな栄災剥牛の下で増殖することを含むもので、それにより前述の１枚生物力’ｒｉｉｉｉ木の遺伝子を発現し前述のポリペプチドを生め出すもの。４５、　請求（’）範囲第４４項のプロセスのポリペプチド生成物。４６、請求の範囲第４５項のポリペプチド生成物で、（ＴＩ＋ｒ　１４．　Ｆ′ ｌｅｔ　＋６）　ＩＦＮ−αＦであるもの４７　請求の範囲第６項の放射性標識を付けた製造されたＤＮＡ配列から成る試薬（羽目。４８、請求の範囲第４７項の試薬材料で、前述の放射性イ然泣く■２５であるもの。４９　請求の範囲第１２項のポリペプチドの標識をイ弔）た抗体から成る試薬＋、１１ｉ４で、プラスチック・ビーズの表面に塗布されたもの。５０、微生物によって合成され生物学的に活性のある蛋白質生成物で、自然に発生する形態のものと１つ以上のアミノ酸の種類および／あるいは位置の点でおよび１つ以」二の生物学的および薬理学的性質の点で異なるが、自然に発生ずる形態のもののその他の前述の性質を実質的に保有するもの。５１．請求の範囲第閣項のポリペプチド生成物で。（Ｌｙｓ　８１）　ＩＦＮ　ｒ　。（Ｓｅｒ　Ｌ　Ｓｅｒ　３．　Ｌｙｓ　８１：ｌ　ＩＦＮ　ｒ。（１，ｙｓ　１．　Ｌｙｓ　２．　Ｇｌｎ　３．　Ｌｙｓ’８１　）　ＩＦＮ　ｒ。（ｄｅｓ−Ｃｙｓ　１．　ｄｅｓ−Ｔｙｒ　２．　ｄｅｓ−Ｃｙｓ　３．　Ｌｙｓ　８１　）　、ＩＰＮ　ｒ　。（Ｐｈｅ　３９．　Ｌｙｓ　８１）　ＩＦＮ　ｒ。（Ｔｈｒ　４Ｂ、　Ｌｙｓ　８］）　ＩＦＮ　ｒ。（１，ｙｓ　８１．　Ｃｙｓ、９５）　ＩＦＮ　ｒ。（Ｃｙｓ　９５）　ＩＦＮ　ｒ。（Ｃｙｓ　９５．　Ｐｒｏ　１０４　］　ＩＦＮ　ｒ　。ＣＧｉｎ　２８）　ＩＦＮ　ｒ。（Ｇｌｕ　５　）　、ＩＦ）ｊ　ｒ　、および（Ｔｈｒ　１４．　Ｍｅｔ　１６）　ＴＦＮ−αＦから成るグループから選択されたもの。５２、Ｅ、　ｃｏｌｉ内において外来性のベクターに運ばれた遺伝子の発現を促進するプロセスで、前述のプロセスが、前述のベクターに、外来性遺伝子蛋白質コーディング発現の上流の位置に、　ＯＭＰ−Ｆ、　ＣＲＯおよびＣＡＭ遺伝子生成物の」、９旦合成に関連するりポソーム結合塩部位塩基対の複写の塩基対から成るＤＮＡ配列を挿入することを含むもの。５３、請求の範囲第５２項のプロセスで、挿入されるＤＮＡ配列力ＪＭ＋’−Ｆ　Ｍ伝子生成物の」　印パ合成に関連する西ｉ１であるもの。５４、請求の範囲第５３項のプロセスで、挿入されるＤＮへ配列がであるもの。５５、請求の範囲第５３項のプロセスで、挿入されるＤＮＡ配列がｔｒｐプロモーター／オペレーター酎汐耐に従うもの。