CZ300540B6 - Farmaceutický prostredek obsahující ribavirin v kombinaci s interferonem alfa pro lécbu pacientu s chronickou infekcí hepatitidy C genotypu 1 - Google Patents

Abstract

Použití ribavirinu a interferonu alfa pro prípravu samostatných nebo kombinovaných farmaceutických prípravku urcených pro pacienty s chronickou infekcí hepatitidy C genotypu 1, kterí dosud nebyli podrobeni žádné antivirové lécbe, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA, zahrnující kombinovanou terapii s použitím úcinného množství ribavirinu a úcinného množství interferonu alfa po dobu 40 až 50 týdnu.

Description

(57) Anotace:

Použití ribavirínu a interferonu alfa pro přípravu samostatných nebo kombinovaných farmaceutických přípravků určených pro pacienty s chronickou infekcí hepatitidy C genotypu 1, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA, zahrnující kombinovanou terapii s použitím účinného množství ribavirínu aúčinného množství interferonu alfo po dobu 40 až 50 týdnů.

Farmaceutický prostředek obsahující ribavirin v kombinaci s interferonem alfa pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidy C genotypu 1

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití ribavirinu a interferonu alfa pro přípravu farmaceutických přípravků určených pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA zahrnující kombinovanou terapii s použitím terapeuticky efektivního množství ribavirinu a terapeuticky efektivního množství interferonu alfa po dobu 20 až 50 týdnů.

Dosavadní stav techniky

Chronická infekce virem hepatitidy C je zákeřná a pomalu postupující choroba, která má značný vliv na kvalitu života. Výsledkem může být cirhóza jater, dekompenzační choroba jater a/nebo hepatocelulární karcinom.

K léčbě chronické infekce hepatitidou C se obvykle používá monoterapie interferonem alfa. Tato léčba však není vždy efektivní a někdy má za následek nesnesitelné vedlejší účinky spojené s dávkováním a délkou trvání terapie. Pro monoterapeutickou léčbu chronické infekce hepatitidou C byl navržen ribavirin (Thomas et al., AASLD Abstracts, Hepatology, Sv, 20/4, pt 2,440, 1994). Tato monoterapeutická léčba se však ukázala jako neúčinná. Byla navržena kombinovaná terapie interferonem alfa a ribavirinem (Lai et al., Symposium to the 9th Biennial Scientific Meeting Asian Pacific Association for the Study of the Liver, 1994), kombinovaná terapie interferonem alfa-2b a ribavirinem chronické hepatitidy C u pacientů, u kterých se nedosáhlo trvalé odezvy na samotný interferon (Swedish experience, J. Hepatology, 1995, 232, Suppl. 2, 17-21, Brouwer J. T., Nevens F., Michielsen P. et al., Co zbývá, když hepatitida C nereaguje na interferon? (What options are left when hepatitis C does not respond to interferon?). Test opakované léčby s kontrolním placebem v multicentru Beneluxu, monoterapie ribavirinem versus kombinace s interferonem. (Placebo-controlled Benelux multicente retreatment trial on ribavirin monotherapy versus combination with interferon), J, Hepatok 1994, 212, Suppl. 1, Sl7. Abstrakt WP2/08. Chemello 1., Cavalleto L., Bemardinello E et ak, Odezva na ribavirin, na interferon a na kombinaci obou u pacientů s chronickou hepatitidou C a její vztah k HCV genotypům (Response to ribavirin, to interferon and to combination of both in patiens with chronic hepatitis CX and its relation to HCV genotypes), J. Hepatok, 1994, 212, Suppl. 1, S12. Abstrakt GS5/29 a Účinek kombinované terapie s interferonem alfa a ribavirinem u pacientů s chronickou hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné léčbě (The effect of interferon alpha and ribavirin combinatioon therapy in naivě patients with chronic hepatitis C), J. Hepatok, 1995, 23, Suppl. 2, 8-12. Reichard et ak, LANCET 1998, 351, 83-87 zveřejnil, že výskyt trvalé virologické odezvy u pacientů s chronickou hepatitidou C je při 24-týdenní kombinaci interferonu a1fa-2b a ribavirinu vyšší než při samotném interferonu alfa-2b. Reichard et ak, také zveřejnil, že samotný interferon alfa-2b je dostatečný k dosažení trvalé odezvy u pacientů, jejichž hodnoty HCV-RNA v séru jsou vyšší než 3 miliony kopií v mk Nikdo však nepopsal způsoby použití interferonu alfa a ribavirinu, které likvidují HCV-RNA jakýmkoli dlouhodobým a účinným způsobem u pacientů s infekcí specifického HCV genotypu, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě.

Rozhodně je tedy zapotřebí způsobu léčby pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, kombinací interferonu alfa a ribavirinu, která likviduje HCV-RNA jakýmkoli dlouhodobým a účinným způsobem.

- 1 CZ 300540 B6

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití ribavirinu pro přípravu farmaceutického přípravku k likvidaci detekované RNA při antivirové léčbě pacienta, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, majícího chronickou infekci hepatitidy C genotypu 1 a virovou zátěž větší než 2 miliony kopit/ml séra měřeno HCV-RNA kvantitativním PCR, kde farmaceutický prostředek je určen pro kombinované podání s účinným množstvím interferonu alfa po dobu 40 až 50 týdnů.

Dále se týká použití interferonu alfa pro přípravu farmaceutického přípravku k likvidaci detekované RNA při antivirové léčbě pacienta, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, majícího chronickou infekci hepatitidy C genotypu 1 a virovou zátěž větší než 2 miliony kopií/ml séra měřeno HCV-RNA kvantitativním PCR, kde farmaceutický prostředek je určen pro kombinované podání s účinným množstvím ribavirinu po dobu 40 až 50 týdnů.

Dále se týká použití jak ribavirinu tak interferonu alfa pro přípravu farmaceutického přípravku k likvidaci detekované RNA při antivirové léčbě pacienta, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, majícího chronickou infekci hepatitidy C genotypu 1 a virovou zátěž větší než 2 miliony kopií/ml séra měřeno HCV-RNA kvantitativním PCR, kde farmaceutický prostředek je určen pro kombinované podání po dobu 40 až 50 týdnů.

V předkládaném vynálezu se zjistilo, že pokud má pacient, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, infekci HCV genotypu 1, nebo pokud má pacient, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, infekci HIV genotypu 1 a PCR kvantitativně stanovenou virovou zátěž vyšší než 2 milióny kopií/ml HCV-RNA, pak je účinné podávat kombinovanou terapii po dobu 40 až 50 týdnů, výhodně 48 týdnů.

Předkládaný vynález se týká použití jak ribavirinu, tak interferonu alfa pro přípravu farmaceutických přípravků pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA způsobem zahrnujícím podávání terapeuticky efektivního množství ribavirinu ve spojení s terapeuticky efektivním množstvím interferonu alfa po dobu 20 až 50 týdnů; pokud má pacient, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, infekci HCV genotypu 1, je účinné podávat ribavirin ve spojení s interferonem alfa po dobu 40 až 50 týdnů, výhodně 48 týdnů.

Předkládaný vynález se týká použití ribavirinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C genotypu 1, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA způsobem zahrnujícím podávání efektivního množství ribavirinu ve spojení s efektivním množstvím interferonu alfa po dobu 40 až 50 týdnů, výhodně 48 týdnů.

Předkládaný vynález se také týká použití interferonu alfa pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidu C genotypu 1, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA způsobem zahrnujícím podávání efektivního množství interferonu alfa ve spojeni s efektivním množstvím ribavirinu po dobu 40 až 50 týdnů, výhodně 48 týdnů.

Ve výhodném aspektu se předkládaný vynález dále týká použití jak ribavirinu, tak interferonu alfa pro přípravu farmaceutických přípravků pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C genotypu 1, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCV-RNA způsobem zahrnujícím podávání efektivního množství ribavirinu ve spojení s efektivním množstvím interferonu alfa po dobu 40 až 50 týdnů, výhodně 48 týdnů.

V jiném výhodném aspektu se předkládaný vynález dále týká použití jak ribavirinu, tak interferonu alfa pro přípravu farmaceutických přípravků pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C genotypu 1 a HCV-RNA PCR kvantitativně stanovenou virovou zátěží vyšší než

-2 CZ 300540 B6 milióny kopií HCV-RNA/ml, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k likvidaci detekovatelné HCVRNA způsobem zahrnujícím podávání efektivního množství ribavirinu ve spojení s efektivním množstvím interferonu alfa po dobu 40 až 50 týdnů, výhodně 48 týdnů.

Podávaný interferon alfa se výhodně vybírá z interferonu alfa-2a, interferonu a1fa-2b, konvenčního interferonu, čištěného vyrobeného interferonu alfa nebo pegylovaného interferonu alfa-2a nebo pegylovaného interferonu alfa—2b. Výhodněji se interferon alfa vybírá z interferonu alfa—2a, interferonu alfa-2b, nebo čištěného vyrobeného interferonu alfa a podávané množství interferonu alfa je 2 až 10 miliónů IU za týden na týdenní, TIW, (třikrát týdně) QOD (každý druhý den) nebo denní bázi. Ve výhodném provedení je podávaným interferonem alfa interferon alfa-2b a interferon alfa se podává v množství 3 miliony UJ TIW.

Nebo je podávaným interferonem alfa konvenční interferon a interferon alfa se podává v množství 1 až 20 mikroorganismů za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi. V jiném provedení je podávaným interferonem alfa pegylovaný interferon alfa-2b a podávané množství pegylovaného interferonu alfa-2b je 0,5 až 2,0 pg/kg za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi. Neboje podávaným interferonem alfa pegylovaný interferon alfa-2a a podávané množství pegylovaného interferonu alfa-2a je 20 až 250 pg/kg za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi.

Výhodně se používá interferon alfa-2a nebo pegylovaný interferon alfa-2a nebo interferon alfa2b nebo pegylovaný interferon alfa-2b.

Během 4é až 50 týdnů je podávané množství ribavirinu 800 až 1200 mg na den, výhodně 800, 1000 nebo 1200 mg na den a podávané množství interferonu a1fa-2a nebo interferonu alfa-2b je 2 až 10 milionů IU za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi, výhodně 3 miliony IU TIW. Detailní popis.

V případě pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C a HCV genotypu 1, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, a pacientů s HCV genotypem 1 a kvantitativní PCR („PCR“) stanovenou virovou zátěží vyšší než 2 milióny kopií HCV-RNA/ml se překvapivě ukázalo, že kombinovaná terapie s terapeuticky efektivním množstvím ribavirinu a terapeuticky efektivním množstvím interferonu alfa po dobu nejméně 20 až 30 týdnů vede, při srovnání s monoterapií interferonem alfa, k desetkrát většímu počtu pacientů, kteří nemají v séru detekovatelnou HCVRNA nejméně 24 týdnů po ukončení terapie. Pokud se kombinovaná terapie prodlouží na dobu 40 až 50 týdnů, nemá nejméně 24 týdnů po ukončení kombinované terapie ve svém séru detekovatelnou HCV-RNA 2 až 3 krát více pacientů než při kombinované terapii trvající 24 týdnů a při srovnání s 48-týdenní monoterapií interferonem alfa, nemá 8 až 9 krát více pacientů ve svém séru detekovatelnou HCV-RNA nejméně 24 týdnů po ukončení kombinované terapie. Viz Tabulka 6, 14, 16 a 17, míra trvalé virologické odezvy nalezené po použití kombinované terapie podle předkládaného vynálezu závisí na HCV genotypu a na base línové virové zátěži měřené HCV-RNA/qPCR, stejně jako na době léčení kombinovanou terapií pro HCV genotyp 1. Viz Tabulka 13 a 15. Doba léčení kombinovanou terapií pacientů s infekčními chronickými HCV genotypy 4, 5 a 6, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, je stejná jako u pacientů s chronickým HCV genotypem 1, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě. Doba léčení kombinovanou terapií pacientů s HCV genotypy 2 a/nebo 3, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, je kratší, a to 20 až 30 týdnů, výhodně 24 týdnů. Viz Tabulky 7, 13 a 15.

Termín „interferon alfa“ zde znamená rodinu vysoce homologních druhově specifických proteinů, které inhibují virovou replikaci a buněčnou proliferaci a modulují imunitní odezvu. Typické vhodné interferony alfa zahrnují, ale nejsou omezeny na rekombinantní interferon alfa-2b, jako je interferon Intron-A dostupný od Schering Corporation, Kenilworth, N.J., rekombinantní interferon alfa-2a, jako je interferon Roferon dostupný od Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J., rekombinantní interferon alfa-2c, jako je interferon Berofor alfa 2 dostupný od Boehringer Ingelheim

-3CZ 300540 B6

Pharmaceutieal, lne., Ridgefield, CT., interferon alfa-nl, čištěná směs přirozených interferonů alfa, jako je Sumiferon dostupný od Sumimoto, Japonsko, ne boj ako je Wellferon interferon alfaln (INS) dostupný od Glaxo-Wellcome Ltd., Londýn, Velká Británie, nebo konvenční interferon alfa, jako jsou ty popisované v US patentech 4 897 471 a 4 695 623 (zejména v jejich Příkladech 7, 8 nebo 9) a specifický výrobek dostupný od Amgen, lne., Newbury Park, CA, nebo interferon alfa-n3 směs přirozených interferonů alfa, vyráběná Interferon Sciences a dostupná od Purdue Frederick Co., Norwalk, CT, pod obchodní značkou Alferon. Výhodně se používá interferon alfa-2a nebo alfa-2b. Nej výhodnější je interferon alfa-2b, protože má ve světě ze všech interferonů nej širší souhlas k použití k léčbě chronické infekce hepatitidou C. Výroba interferonů alfa-2b se popisuje v US patentu 4 530 901.

Podávaný interferon alfa se vybírá z interferonů alfa—2a, interferonů alfa-2b, konvenčního interferonů, čištěného vyrobeného interferonů alfa-2a, interferonů alfa-2b, konvenčního interferonů, čištěného vyrobeného interferonů alfa nebo pegylovaného interferonů alfa-2a nebo pegylovaného interferonů alfa-2b.

Terapeuticky efektivní množství interferonů alfa-2a, interferonů alfa-2b nebo čištěného interferonů alfa podávaného ve spojení s ribavirinem je 2 až 10 milionů IU za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi.

Terapeuticky efektivní množství podávaného interferonů alfa-2b je 3 miliony IU TIW.

Pokud interferonem alfa podávaným ve spojení s ribavirinem je konvenční interferon, je terapeuticky efektivní množství podávaného interferonů alfa 1 až 20 pg za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi.

Termín „pegylovaný interferon alfa“ zde znamená polyethylenglykolem modifikované konjugáty interferonů alfa, výhodně interferonů alfa-2a a interferonů alfa-2b. Výhodným konjugátem polyethylen gly kol-interferon alfa-2b je PEGi₂₀₀₀-interferon alfa-2b. Fráze „interferon alfa konjugovaný s polyethylenglykolem o molekulové hmotnosti 12 000“ a „PEG_]2ooo-IFN alfa“ zde znamená konjugáty, jako jsou ty připravené podle způsobů mezinárodní přihlášky WO 95/13090 a obsahující urethanové vazby mezi aminoskupinami interferonů alfa-2a nebo —2b a polyethylenglykolem o průměrné molekulové hmotnosti 12 000. Pegylovaný interferon alfa, PEG_]2ooIFN-alfa-2b je dostupný od Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ.

Výhodný PEG|₂oo-interferon alfa-2b se připravuje připojením polymeru PEG k epsilon amínoskupině lysinového zbytku molekuly interferonů alfa-2b. Jednotlivá molekula PEG1200 se konjuguje s volnými aminoskupinami molekuly interferonů alfa-2b prostřednictvím urethanové vazby. Tento konjugát je charakteristický molekulovou hmotností připojeného PEG 1200. Konjugát PEG ]₂oo-IFN-alfa-2b se formuluje jako lyofilizovaný prášek pro injekce. Cílem konjugace interferonů alfa s PEG je zlepšení dodávání proteinu tím, že se znatelně prodlouží jeho poločas v plasmě, a tak se poskytne prodloužené působení interferonů alfa.

Další konjugáty interferonů alfa se připravují navázáním interferonů alfa na ve vodě rozpustný polymer. Nelimitující seznam takových polymerů zahrnuje další polyalkylenoxidhomopolymery jako jsou polypropylenglykoly, polyoxyethylpolyoly, jejích kopolymery a blokové kopolymery. Jako alternativa k polymerům na bázi polyalkylenoxidu se efektivně používají neantigenní látky jako je dextran, polyvinylpyrrolidony, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polymery na bázi uhlohydrátů a tak podobně. Takové polymerní konjugáty interferonů alfa se popisují v US patentu 4 766 106, US patentu 4 917 888, Evropské patentové přihlášce 0 236 987, Evropských patentových přihláškách 0 510 356, 0 593 868 a 0 809 996 (pegylovaný interferon alfa-2a) a mezinárodní přihlášce WO 95/13090.

Farmaceutické přípravky pegylovaného interferonů alfa vhodné pro parenterální podávání se formulují s vhodným pufrem, např. Tris-HCl, acetátovým, fosfátovým, jako je pufr dihydrogen-4 CZ 300540 B6 fosforečnan sodný/hydrogenfosforečnan sodný, a farmaceuticky přijatelnými vehikuly (např. sacharóza), nosiči (např. albumin lidské plasmy), činidly toxicity (např. NaCl), konzervačními látkami (např. thimerosol, kresol nebo benzylalkohol) a surfaktanty (např. tween nebo polysorbáty) ve sterilní vodě pro injekce. Pegy lovaný interferon alfa se uchovává jako lyofilizovaný prášek při ochlazení na 2 až 8 °C. Rekonstituované vodné roztoky jsou stálé při uchovávání při teplotě 2 až 8 °C a použitelné do 24 hodin po rekonstituci. Viz např. US patent 4 492 537, 5 762 923 a 5 766 582. Rekonstituované vodné roztoky se také uchovávají v předplněných mu 1tidávkových injekčních stříkačkách jako jsou ty užitečné pro dodávání léčiv jako je insulin. Typické vhodné injekční stříkačky zahrnují systémy obsahující předplněnou vialku připojenou na io injekční stříkačku peřového typu jako je NOVOLET Novo Pen dostupná od Novo Nordisk, stejně jako předplněné injekční stříkačky peřového typu umožňující jednoduchou injekci samotným uživatelem. Další injekční systémy zahrnují injekční stříkačku peřového typu obsahující skleněnou patronu obsahující rozpouštědlo a lyofilizovaný prášek pegylovaného ínterferonu alfa v oddělených prostorách.

Pokud je interferonem alfa podávaným ve spojení s ribavirinem pegy lovaný interferon alfa-2b, podává se interferon alfa v množství 0,5 až 2,0 gg/kg za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi.

Pokud je interferonem alfa podávaným ve spojení s ribavirinem pegy lovaný interferon alfa-2a, podává se interferon alfa v množství 20 až 250 gg/kg za týden na týdenní, TIW, QOD nebo denní bázi.

Ribavirin, l-J3-D-ribofuranosyl-lH-l,2,4-triazol-3-karboxamid, dostupný od ICN Pharma25 ceuticals, lne., Costa Mesa, Califomia, se popisuje v Merck Index, 11, vydání, sloučenina č, 8199. Jeho výroba a formulace se popisuje v US patentu 4 211 771.

Osoba trpící chronickou infekcí hepatitidou C vykazuje jeden nebo více následujících znaků nebo symptomů.

a) zvýšené ALT,

b) pozitivní test na protilátky anti-HCV,

c) přítomnost HCV dokázaná pozitivním testem na HCV-RNA,

d) klinická stigmata nebo chronická choroba jater,

e) hepatocelulámí poškození.

Při provádění vynálezu se kombinovaná terapie interferonem alfa a ribavirinem podává pacientu vykazujícímu jeden nebo více výše uvedených znaků nebo symptomů v množství postačujícím k eliminaci nebo alespoň zmírnění jednoho nebo více znaků nebo symptomů. Formulace s interferonem alfa, včetně formulací s pegylovaným interferonem alfa nejsou účinné při orálním podávání, proto je výhodným způsobem podávání formulací s interferonem alfa nebo pegylovaným interferonem alfa podávání parenterální, výhodně podkožní, IV nebo IM injekcí. Ribavirin se pacientu podává ve spojení s interferonem alfa, to znamená, že dávka ínterferonu alfa se podává během stejné doby, kdy pacient dostává dávky ribavirinu. Ribavirin se podává orálně v kapsli, tabletě nebo tekuté formě ve spojení s parenterálním podáváním pegylovaného Ínterferonu alfa.

Samozřejmě se uvažují i jiné způsoby podávání obou léčiv, jak se stanou dostupnými, jako je nasálně sprejem, transdermálně, čípkem, dávkovači formou s trvalým uvolňováním a pulmonámí inhalací. Jakákoliv forma podávání bude účinná, pokud se dodají správné dávky bez poškození aktivní přísady.

Termín „pacienti, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě“, v kontextu předkládaného vynálezu znamená pacienty, kteří dosud nebyli léčeni ribavirinem nebo jakýmkoliv interferonem včetně, ale bez omezení na, interferon alfa.

-5CZ 300540 B6

Termín „žádná detekovatelná HCV-RNA“ v kontextu předkládaného vynálezu znamená, že v séru pacienta je méně než 100 kopií HCV-RNA, při měření kvantitativní metodologii PCR mu lt icy klové reverzní transkriptázy. HCV-RNA se v předkládaném vynálezu výhodně měří dále popsanou metodologií. Tato metodologie se zde označuje jako HCV-RNA/qPCR.

RNA se extrahuje z pacientova séra s použitím guaninidiurnthiokyanát-fenol-chloroformového misteru a následné precipitace v ethanolu a octanu amonném. Přec i pito váná RNA se centrifuguje a výsledná peleta se suší v pultovém Centrivap (Labconco, Kansas City, Mo). Suchá peleta se resuspenduje v 30 μΐ Rnasinu (Promega Corp., Madison, WI), dithiothritolu a diethylpyrokarbonátové vodné směsi. Vzorky se uchovávají při teplotě nižší než -20 °C (výhodně nižší než 70 °C), do reverzní transkripce (RT) RNA a PCR.

Pro převedení celé sekvence RNA do cDNA při RT reakci se jako primery pro syntézu prvního vlákna cDNA používají randomní hexadeoxyribonukleotidy (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Dva 3μ1 alikvoty resuspendovaného vzorku se přidají k 3 μΐ lOOng/μΙ randomních příměrů a denaturují při 70 °C, poté se 1 hodinu při 40 °C reverzně transkribují s použitím M-MLV reverzní transkriptáty (USB, Cleveland, OH) ve standardním pufru obsahujícím 5 mM MgCI₂. Konečný objem RT reakce je 26 μΐ. Ihned po reverzní transkripci následuje start PCR.

Při modifikované verzi metody PCR se ampl i fikuje cDNA provádí s použitím tepelně stabilní Taq polymerázy, 75 μΐ PCR směsi se přidá k celému reakčnímu RT objemu (26 μΐ) na konečnou koncentraci MgCl₂ l,5mM v celkovém objemu 101 μΐ. Každý ΙΟΙμΙ vzorek se poté rozdělí na 50,5 μΐ a pro zabránění vypařování se na povrch dá vrstva minerálního oleje.

Cyklus PCR se skládá z 90s anelace, 90s extenze a 90s denaturace, při 55, 74, respektive 94 °C. Termocyklováné vzorky se podrobí konečné extenzi 10 minut při 74 °C. Používají se čtyři rozdílné cyklové sady. Vnášením vzorku duplikátně a dělením těchto vzorků ihned po RT se z jednoho vzorku získají čtyři zkumavky. Každá z těchto čtyř zkumavek dostane jiné číslo cyklu, a tak se zlepšuje citlivost a přesnost kvantifikačního procesu. Termocyklická účinnost se stanoví uspokojivou amplifikací známého počtu kopií RNA standardů obsažených v každé sadě 60 zkumavek. Pro amplifíkaci se používají dvě příměrové sady, obě z 5'netranslatované oblasti HCV genomu. Obě tyto primerové sady jsou vysoce konzervativní a detekují všechny známé subtypy HCV. Primerová sada 1: proti směru 5'-GTG GTC TGC GGA ACC GGT GAG T-3', po směru 5-TGC ACG GTC TAC GAG ACC TC-3', která poskytuje 190 bp produkt. Primerová sada 2: proti směru 5'-CTG TGA GGA ACT ACT GTC TTC-3', po směru 5'<CC TATCAG GCA GTA CCA CAA-3', která poskytuje 256 bp produkt.

Poté následuje elektroforéza ampl ifi kované cDNA v 3% agarózovém gelu a přenesení na nylonovou membránu. Cílová DNA se detekuje Southern blotingem a i mun obarvením s použitím ne radioaktivní digoxigeninem značené DNA sondy. Tyto postupy se provádějí s použitím automatizovaných přístrojů pro PCR termocyklizaci, elektroforézu na agarózovém gelu, vakuově přenášený Southern bloting, hybridizaci a imunobarvení. Každá membrána obsahuje známý počet kopií sériově ředěných standardů, které se používají pro sestrojení standardních křivek pro kvantitativní měření pásů vzorků. Originální standardní křivky se dělají podle pečlivě ředěné HCVRNA z transkribovaných klonů. Ke stanovení předpokládané délky transkriptů se s nimi provádějí radioaktivní inkorporační studie, gelová elektroforéza a OD 260. Po produkci kvantitativních klonových standardů RNA transkriptů se generují „rezervní“ standardy, které lépe reprezentují heterogenní povahu HCV, která se vyskytuje u přirozené infekce. Tyto rezervy se vytvářejí kombinováním velkého množství séra nebo plasmy známých infikovaných jedinců. Rezervy séra/plasmy se kalibrují pomocí PCR proti transkriptům klonů a poté se ředí ve známých PCRnegativních tekutinách. Nakonec se vzorky s vyšším počtem kopií z rezerv kontrolují proti cDNA na detekčním systému nukleových kyselin Quantiplex od Chiron Inc. (Emeryville, CA). Tyto „dvojitě kvantifikované“ rezervy se dělí na alikvoty a uchovávají při -70 °C. V každém pokusu se používají ředění 5 000 000, 1 000 000, 500 000, 100 000, 10 000 a 1000 kopií/ml.

-6CZ 300540 B6

Každá membrána ze Southern blotingu se skenuje pomocí počítače s použitím automatického skeneru/densitometru v intervalech během vyvíjení, aby se určilo kdy je standardní křivka nejblíže linearitě. Z výsledných elektronických obrazů se poté měřením určuje plocha pásu a střední hustota pásu. Všechny odečty jsou standardizovány pro integraci hustoty pásu a pro získání numerické hodnoty počtu virových kopií pro každý pás na základě porovnání se standardní křivkou.

Termín „trvalá virologická odezva“ v kontextu předkládaného vynálezu znamená, že v séru pacientů léčených podle předkládaného vynálezu není nejméně 24 týdnů po ukončení léčení kombinovanou terapií přítomna detekovatelná HCV-RNA. Výhodně je doba trvání trvalé virologické odezvy nejméně 1 rok nebo déle po ukončení léčby.

Prováděly se následující klinické protokoly

Příklady provedení vynálezu

Studie 1

Celkový návrh a plán studie

Jednalo se o perspektivní, multicentrální, randomizovanou, paralelní skupinu s dvojitou slepou kontrolou. Studie porovnávala léčbu pacientů pomocí INTRONu® A a ribavirínu s léčbou pomocí INTRONu® A a placeba po dobu 24 nebo 48 týdnů. Jednalo se o pacienty, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, trpící kompenzovanou chronickou hepatitidou C, kteří se dosud nepodrobili terapii interferonem včetně a bez omezení na interferon alfa (INTRON® A, Roferon®-A, konvenční interferon nebo Welferon®) a také se dosud nepodrobili léčbě ribavirinem. Z této studie byli vyloučeni také pacienti, kteří se s hepatitidou léčili pomocí jiného antivirového nebo imunomodulačního léku během předchozích 2 let. V úvahu přicházeli pacienti s chronickou hepatitidou C potvrzenou pozitivním HCV-RNA sérem, biopsií jater a laboratorními testy.

Pacienti se pro léčbu pomocí bud’ INTRONu® A a ribavirinu, nebo pomocí INTRONu® A a placeba randomizovali. Dávka INTRONu® A byla 3 miliony IU SC TIW; dávka ribavirinu byla 1000 nebo 1200 mg PO denně (v závislosti na hmotnosti) ve dvou dělených dávkách. Zařazení do léčené skupiny provádělo ve shodných poměrech Centrální randomizační centrum (Central Randomization Center). Randomizační proces byl navržen tak, aby se pokusil vyvážit léčené skupiny v rámci i napříč skupinami s ohledem na přítomnost nebo absenci cirhózy v jatemí biopsií před léčbou, hladinu HCV-RNA/qPCR v séru a HCV genotyp.

Studovaná léčba se podávala 24 nebo 48 týdnů. Pro stanovení dlouhodobého účinku léčby byla celková doba trvání studie 48 nebo 72 týdnů. Doba trvání se stanovila v době randomizace.

Během léčby a poléčebném následném pozorování se ke stanovení povahy a trvání odezvy na studovanou léčbu používalo biochemické (ALT), virologické (HCV-RNA) a histologické (jatemí biopsie) testování. Proměnná primární účinnosti byla celkovou odezvou definovanou jako ztráta HCV—RNA/qPCR v séru (< 100 kopií/ml) měřená 24 týdny následně po ukončení léčby. Jako sekundární konečný výsledek se navíc hodnotil pokles hepatického zánětu, zlepšení jatemí biopsie po léčbě měřené Knodellovým Indexem histologické aktivity (HAI) a normalizace ALT. Bezpečnost studované léčby se stanovila monitorováním vybraných laboratorních parametrů a také zaznamenáváním a vyhodnocováním výskytu jakýchkoli nepříznivých případů

-7 CZ 300540 B6

Léčebný režim

Studovaly se čtyři léčebné režimy.

1. INTRON® A, 3 miliony IU SC TIW, a ribavirin, 1000 nebo 1200 mg/den PO ve dvou dělených dávkách po dobu 24 týdnů

2. INTRON® A, 3 miliony IU SC TIW, a placebo odpovídající ribavirinu PO ve dvou dělených dávkách po dobu 24 týdnů

3. INTRON® A, 3 miliony IL SC TIW, a ribavirin, 1000 nebo 1200 mg/den PO ve dvou dělených dávkách po dobu 48 týdnů

4. INTRON® A, 3 miliony IU SC TIW, a placebo odpovídající ribavirinu PO ve dvou dělených dávkách po dobu 48 týdnů

Studované léčby 1 a 2 se podávaly 24 týdnů, studované léčby 3 a 4 se podávaly 48 týdnů. Standardní režim pro hepatitidu C, INTRON® A (interferon alfa-2b, rekombinantní) se podával jako fixní dávka 3 miliony IU TIW. Každý pacient obdržel instrukce týkající se přípravku a podkožního podávání INTRONu® A. Ribavirin se podával dvakrát denně, ráno a večer. Dávka se stanovila podle pacientovi tělesné váhy při Vstupní prohlídce. Pacienti s tělesnou vahou < 75 kg dostávali 1000 mg denně jako dvě 200mg kapsle ráno a tři 200mg kapsle večer. Pacienti vážící > 75 kg dostávali 1200 mg denně jako tri 200mg kapsle ráno i večer.

Randomizační proces byl navržen tak, aby vyvážil skupiny co se týče následujících charakteristik basel iny • jatemí histologie před léčbou (cirhóza ano či ne) • statut HCV-RNA/qPCR v séru (HV-RNA/qPCR < 2 000 000 nebo HCV-RNA/qPCR > 2 000 000 kopií/ml) • HCV genotyp (1 nebo jiný). Pacienti se smíšenými genotypy (které zahrnovaly typ 1) se klasifikovali pro účely vyváženosti jako typ 1.

Účinnost

Předmětem primární účinnosti bylo porovnání léčených skupin 1 a 2 a 3 a 4 s ohledem na míru trvalé virologické odezvy definované jako pokles (detekovatelný) HCV-RNA/qPCR v séru měřený 24 týdny následující po ukončení léčby na nedetekovatelnou úroveň nebo na úroveň < 100 kopií/ml. Také se hodnotily následující konečné výsledky sekundární účinnosti.

Konečné výsledky sekundární účinnosti:

• podíl pacientů, u kterých se po 24 týdnů pozorování normalizovalo ALT • podíl pacientů, u kterých se zlepšila biopsie (kombinované skóre kategorie 1 + II + III) • změny oproti baselině ve skóre biopsie (kombinované skóre kategorie 1 + II + 111) • míra odezvy při Ukončení léčby založená na HCV-RNA/qPCR • podíl pacientů, u kterých se při Ukončení léčby normalizovalo ALT • míra odezvy po 24 týdnů Následné pozorování založená na HCV-RNA/qPCR

Virologie: Vstupní statut a Změna oproti vstupu

Testování HCV-RNA/qPCR v séru se provádělo v centrální laboratoři. Při baselině se vyžadoval pozitivní výsledek testu na HCV-RNA/qPCR v séru; studie se účastnili pouze pacienti s pozitivní HCV-RNA. Opakované testy byly rozvrženy na týden 4, 12, 24, a pokud byl pacient zařazen do skupiny s 48týdenní terapií, na týden 36 a 48. Při následném pozorování byly opakované testy všech pacientů rozvrženy na týden 12 a 24,

- 8 CZ 300540 Β6

Odezva se stanovila následovně:

Pacient s odezvou: Pacient se klasifikoval jako Pacient s odezvou v daném okamžiku, pokud byla v daném okamžiku HCV-RNA/qPCR negativní (< 100 kopií/ml).

Pacient s trvalou odezvou: Pacient se klasifikoval jako Pacient s trvalou odezvou, pokud po 24 týdnů následného pozorování byl Pacientem s odezvou.

Pacienti, kteří nevyhovovali těmto kritériím, včetně pacientů, kteří studii přerušili před získáním požadovaného vyhodnocení HCV-RNA/qPCR, bylí klasifikováno jako Pacienti bez odezvy. Pacient s totální odezvou: Na základě HCV-RNA/qPCR v séru a změn v jatemí biopsií hodnocené Knodellovým HAI skórem zánětu (Inflamation Score) byl pacient klasifikován jako Pacient s totální odezvou, pokud on/ona byl Pacient s trvalou odezvou a jeho/její Knodellovo HAI skórem zánětu (součet kategorií I + II + III) se zlepšilo o 2 nebo více jednotek oproti skóre před léčbou.

Jatemí histologie

U všech pacientů se během šesti měsíců před pacientovým zaregistrováním a ve 24. Týdnu následného pozorování požadovala jatemí histologie. Vyhodnocení biopsií prováděl jeden patolog s použitím Knodellova Histologického aktivního skóre (Knodell Histology Activity Score). Centrální patolog pracoval se zakrytou identifikací pacienta, léčené skupiny a doby odběru vzorku pro biopsií vzhledem k léčbě (před nebo po léčbě). Účinnost studovaného léčení se stanovila pomocí porovnání stupně zánětlivé aktivity pozorované při baselině a pozorované ve 24. Týdnu Následného pozorování.

Výsledky

V 42 US centrech se zaregistrovalo devět set dvanáct pacientů, kteří byli randomizačně rozděleni pro léčbu buď INTRONem® A a ribavirinem (N - 228), nebo INTRONem® A a placebem (N = 231) po dobu 24 týdnů, nebo pro léčbu buď INTRONem® A a ríbavtrinem („I + R ‘, N = 228), nebo INTRONem® A a placebem („I + P“, N = 225) po dobu 48 týdnů.

Léčbu a 24 týdny následného pozorování ukončilo celkově 81 % (734/912) pacientů. Ve skupině I + R, 24 týdnů, se jednalo o 89 % (203/228) pacientů, ve skupině I + P, 24 týdnů, to bylo 90 % (207/231) pacientů, ve skupině I + R, 48 týdnů, to bylo 70 % (159/228) pacientů a ve skupině I + P, 48 týdnů, studii dokončilo 73 % (165/225) pacientů.

Léčbu přerušilo 20 % (178/912) pacientů: ve skupině I + R, 24 týdnů, se jednalo o 11 % (25/228) pacientů, ve skupině I + P, 24 týdnů, to bylo 10 % (24/231) pacientů, ve skupině I + R, 48 týdnů, to bylo 30 % (69/228) pacientů a ve skupině I + P, 48 týdnů, to bylo 27 % (60/225) pacientů. Nejčastějším důvodem přerušení léčby ve všech skupinách byl nepříznivý případ, ve skupině I + R, 24 týdnů, se jednalo o 8 % (19/228) pacientů, ve skupině I + P, 24 týdnů, to bylo 9 % (20/231) pacientů, ve skupině I + R, 48 týdnů, to bylo 20 % (45/228) pacientů a ve skupině I + P, 48 týdnů, to bylo 14 % (32/225) pacientů.

Studii dokončilo nejméně 96 % pacientů, kteří dokončili léčbu a nastoupili do následného pozorování. Během následného pozorování studii přerušili pouze 2 pacienti ve skupině I + R, 24 týdnů, 8 pacientů ve skupině I + P, 24 týdnů, 7 pacientů ve skupině I + R, 48 týdnů a 4 pacienti ve skupině I + P, 48 týdnů.

V níže uvedené Tabulce 1 je zaznamenána tělesná váha a výchozí charakteristiky choroby všech pacientů (HCV genotyp a počáteční virologické zatížení) ze Studie 1. Genotypy HCV se určily ze vzorků séra pacientů podle testování pomocí HCV-RNA/qPCR.

-9CZ 300540 B6

Tabulka 1

Tělesná váha a výchozí charakteristiky choroby pacientů ze Studie 1

	I + R' ~	I + P2	I + R1	I + P2
	24 týdny	24 týdny	48 týdnů	48 týdnů
	(N = 228)	(N = 231)	(N = 228)	(N = 225)
Hmotnost > 75 kg	148(65 %)	157(68 %)	133 (58 %)	153 (68 %)
Hmotnost < 75 kg	80 (35 %)	74 (32 %)	95 (42 %)	72 (32 %)
HCV genotyp3
I	164(72%)	167 (72%)	166 (73 %)	162(72 %)
2	29(13%)	38(17%)	37(16%)	43(19%)
3	28(12%)	24(10%)	23(10%)	19 (8 %)
4	6 (3 %)	2 (0,9 %)	1 (0,4 %)	1 (0,4 %)
5	0	0	1 (0,4 %)	0
6	1 (0,4 %)	0	0	0
HCV-RNA/qPCR (kopie/ml)
geometrický průměr	3 070 019	2 767 469	2 922 925	2 819 324
< 2 000 000 kopií/ml	62 (27 %)	74 (32 %)	76 (33 %)	63 (28 %)
> 2 000 000 kopií/ml	166(73 %)	157 (68 %)	152 (67%)	162 (72 %)

Poznámky k Tabulce 1 ¹ I + R znamená Intron A a ribavírin ² I + R znamená Intron A a placebo ³ Subgenotypy se klasifikují podle svého příslušného genotypu

Všechny diskuse o účinnosti a bezpečnosti v této zprávě se zakládají na údajích pro všechny léčené skupiny.

Účinnost

Předmětem této studie bylo porovnání 24- a 48-týdenní léčby INTRONem® A a ribavirinem s léčbou INTRONem® A a placebem co se týče míry totální odezvy a míry vírologické odezvy (založené na HCV-RNA/qPCR) po dobu 24 a 48 týdnů. Primární sledovanou proměnnou účinností v této studii je míra totální odezvy.

Závěry z takto pojaté účinnosti jsou následující:

Kombinovaná terapie INTRONem A a ribavirinem podávaná po dobu 48 týdnů převýšila při léčení pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě 2 až 3 krát účinnost monoterapie INTRONem A. Kombinovaná terapie INTRONem A a ribavirinem podávaná po dobu 48 týdnů zvýšila míru odezvy při Ukončení léčby a snížila hodnotu recidivy, což mělo za následek lepší míru trvalé vírologické odezvy než při podávání INTRONu A a placeba po dobu 48 týdnů. Toto zlepšení účinnosti zahrnuje všechny aspekty choroby a výsledkem je:

-10CZ 300540 B6 • Trvalé odstranění detekovatelné HCV-RNA • Zlepšení zánětu jater • Normalizace ALT • Zlepšení Knodellova HAI skóre zánětu

Trvalá ztráta HCV-RNA v séru odpovídala zlepšení nebo rozptýlení hepatického zánětu. Výsledky ukazovaly korelaci mezi trvalou virologickou odezvou, zlepšením hepatického zánětu, normalizací ALT a zlepšením HQL.

Míra totální odezvy při ukončení Následného pozorování se skládá ze ztráty HCV-RNA (qPCR) v séru a změny v jatemí histologii na konci následného pozorování (24 týdny následující po ukončení léčby). Pacient byl klasifikován jako Pacient s totální odezvou, pokud HCV-RNA (PCR) byla negativní ve 24. Týdnu hodnocení po ukončení léčby a Knodellovo HAI skóre zánětu (součet kategorií I + II + III) se zlepšilo, když hodnota po ukončení léčby poklesla o dvě nebo více jednotek oproti skóre před nastoupením léčby. Tabulky 2, 3, 4 a 5 uvádějí procenta Pacientů s trvalou virologickou odezvou v době k první negativní HCV-RNA, míru virologické odezvy při ukončení Následného pozorování, míru histologícké odezvy a totální odezvy.

Trvalá virologická odezva na HCV-RNA při ukončení Následného pozorování: Trvalá ztráta HCV-RNA 24 týdny následující po ukončení léčby.

Poměr pacientů s vymizelou HCV-RNA v séru 24 týdny následující po ukončení léčby byl ve skupině pacientů léčených kombinací INTRONu® A a ribavirinu ve srovnání se skupinou dostávající INTRON® A a placebo 2x až 3x vyšší (41 % versus 16 %).

Prodloužená délka kombinované terapie měla největší vliv na míru recidivy. 24 Týdny následující po ukončení léčby byla míra recidivy pro 48-týdenní kombinovanou terapii a 48—týdenní léčbu Intronem A a placebem shodná (12 %). Delší léčení kombinovanou terapií (48 týdnů) a pokles míiy recidivy vedl k nejvyšší míře trvalé virologické odezvy. Míra trvalé virologické odezvy byla také u 48-týdenní kombinované terapie ve srovnání s 24-týdenní kombinovanou terapií výrazně vyšší (38 % versus 31 %, hodnota p = 0,053).

Prodloužení kombinované terapie z 24 na 48 týdnů podstatně zvýšilo trvalé virologické odezvy u pacientů, kteří se stali HCV-RNA negativními prvně v týdnech 12 a 24. Většina pacientů, kteří se stali Pacienty s trvalou virologickou odezvou, byla HCV-RNA negativní v týdnu 4. Podle Tabulky 2 je zřejmé, že trvalá virologická odezva se pozorovala u 81 % (35/44) pacientů léčených 24-týdenní kombinovanou terapií (I + R) v Týdnu 4 z 24—týdenní léčby, a u 81 % (36/45) pacientů léčených 48-týdenní kombinovanou terapií v Týdnu 4 z 48-týdenní léčby. Za povšimnutí stojí, že podstatná část těchto pacientů léčených 24— a 48-týdenní kombinovanou terapií, kteří vykázali odezvu prvně v Týdnu 12, se stala Pacienty s trvalou virologickou odezvou. U 42 % těchto pacientů ze skupiny podrobené 24-týdenní kombinované terapii a u 63 % těchto pacientů ze skupiny podrobené 48—týdenní kombinované terapii byly tyto odezvy trvalé. Navíc 44 % pacientů ze skupiny podrobené 48-týdenní kombinované terapii, kteří se stali HCV-RNA negativními prvně v Týdnu 24, získalo trvalou virologickou odezvu. Žádná z odezev, která se vyskytla po Týdnu 24 nevedla v žádné léčené skupině k Pacientu s trvalou odezvou.

Počet pacientů s odezvami prvně v Týdnech 12 a 24, kteří se stali pacienty s trvalou virologickou odezvou 24 týdnů po ukončení léčby byl největší u pacientů, kterým se kombinovaná terapie podávala 48 týdnů. (Viz Tabulka 2).

- 11 CZ 300540 B6

Tabulka 2

Procenta pacientů s trvalou virologickou odezvou vzhledem k době prvně nedetekovatelné hladiny HCV-RNA ze Studie 1

Doba prvně nedetekovatelné HCV-RNA (týdny)	Intron A a ribavirin	Intron A a placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
4	81% (35/43)	80% (36/45)	48% (10/21)	70% (14/20)
12	42% (30/72)	63% (40/63)	9% (3/32)	35% (11/31)
24	46% (5/11)	44% (11/25)	0% (0/22)	22% (4/18)

Tabulka 3 je souhrnem odezvy pacientů indikované podle HCV-RNA v séru při ukončení Následného pozorování.

Tabulka 3

HCV-RNA v séru při ukončení Následného pozorování: Poměr pacientů s vymizelou HCV15 RNA 24 týdny následující po ukončení léčby (End of Treatment, EOT)

Odezva pacientů Statut všichni léčeni 95% interval spolehlivosti	FNTRON A + ribavirin	NTRON A + placebo	Hodnota p1
	A	B	C	D	BvsD
Při EOT	24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
Negativní	121 (53%)	115(50%)	66 (24%)	54 (24%)	<0,001
Pozitivní	107 (47%)	113 (50%)	165 (71%)	171 (76%)
Ukončení následného pozorování
Trvalá odezva	70 (31%)	87 (38%)	13 (6%)	29(13%)	<0,001
Recidiva	54 (24%)	28(12%)	53 (23%)	26(12%)
Bez odezvy	104 (46%)	113(50%)	165 (71%)	170 (76%)

Fisherův přesný test při ukončení léčby: p hodnota A vs B je 0,639; p hodnota A vs C < 0,001; p hodnota A vs D < 0,001.

² Logaritmická regrese pro srovnání při ukončení Následného pozorování: p hodnota A vs B je

0,053; p hodnota A vs C < 0,001; p hodnota A vs D < 0,001.

Kombinovaná terapie ve srovnání s monoterapií INT RON em A podstatně zvýšila virologickou odezvu při ukončení léčby. Viz Tabulka 3. Hodnoty p pro srovnání 48-týdenní kombinované terapie s 48-týdenní monoterapií INT RON em A a srovnání 24-týdenní kombinované terapie s 24-týdenní a 48-týdenní monoterapií INTRONem A jsou každá < 0,001. Při prodloužení kom- 12CZ 300540 B6 binované terapie z 24 na 48 týdnů poklesla hodnota recidivy o 50 % (24 % k 12 %), a tak je 48týdenní kombinovaná terapie účinnější než 24-týdenní kombinované terapie (p “ 0,053).

Biopsie před léčením a po léčení byly dostupné pro 79 % (179/228) a 69 % (157/228) pacientů léčených INTRONem® A a ribavirinem po dobu 24, respektive 48 týdnů, a pro 76 % (176/231) a 70 % (158/225) pacientů, kteří dostávali INTRON® A a placebo po dobu 24, respektive 48 týdnů. Tabulka 4 podává souhrn účinku léčení hepatitického zánětu u pacientů, u nichž byly k dispozici výsledky jaterní biopsie před léčením a po léčení. Jako v případě trvalé ztráty HCV-RNA replikace, byl poměr pacientů se zlepšením zánětu jater značně vyšší (p < 0,001) u pacientů dostávají10 cích kombinovanou terapii ve srovnání s pacienty léčenými monoterapií INTRONem® A po dobu 48 týdnů.

Vymizení detekovatelné HCV-RNA vysoce korelovalo s normalizací ALT v séru. Při srovnání kombinované terapie s monoterapií INTRONem® A bylo při ukončení Následného pozorování dva až třikrát víc pacientů s normálním ALT. Mezi pacienty s trvalou normalizací ALT byla větší část pacientů podrobených 48-týdenní kombinované terapii pacienty s trvalou vírologíckou odezvou ve srovnání s pacienty podrobenými 24—týdenní kombinované terapii a 24-týdenní nebo 48-týdenní monoterapií INTRONem® A.

Tabulka 4

Jaterní histologie při ukončení Následného pozorování; Zlepšení jaterní histologie 24 týdny následující po ukončení léčby na základě skóre Knodellova HAI (I + II + III)

	Počet pacientů15 (%)
Statut pacienta	INTRON A + ribavirin	fNTRON A + placebo	Hodnota pc
A 24 týdny (N = 179)a	B 48 týdnů (N= 157)a	C 24 týdny (N= 176)a	D 48 týdnů (N= 158/
Zlepšená biopsie^	102 (57 %)	96 (61 %)	77 (44 %)	65 (41 %)	<0,001

^a N = počet pacientů s spárovanými vzorky biopsie ^b Pacienti s biopsií před i po léčbě ^c Fisherův přesný test ^d Změna ve skóre Knodellova histologického indexu (HAI, součet I + II + III) před a po léčbě kategorizovaná jako pokles o dvě nebo více jednotek oproti stavu před léčbou.

Totální odezva

Při navrhování studie se uznalo, že jaterní biopsie jakožto invazivní procedura, se nebude po ukončení léčby provádět u všech pacientů. Proto plánovaný protokol a statistická analýza specifikovaly, že analýza totální odezvy bude založena na údajích o všech léčených pacientech a u pacientů, jejichž totální odezva se nebude moci stanovit, tzn. pacientů s negativní HCV-RNA a chybějícím vyhodnocením (poléčebné) biopsie, se stanoví metodou maximální podobnosti (Maximum likehood method, MLM). Protokol také specifikoval, že se dodatečná analýza provede u pacientů s výsledky biopsie jak před léčbou, tak po léčbě (tzn. pacientů s kompletními údaji). Totální odezva se skládá z trvalé ztráty detekovatelné HCV-RNA a zlepšení jaterní his- 13 CZ 300540 B6 tologie při ukončení Následného pozorování. Totální odezva, kteráje shrnuta v Tabulce 5, je založena na následujících analýzách:

• Stanovení maximální podobnosti (Maximum likehood estimate, MLE) • Pacienti s úplnými údaji (výsledky biopsií před i po léčbě) • Výsledky u pacientů s neúplnými údaji (chybí údaje buď HCV, nebo biopsie, nebo oba), které se považují za nezdar

Tabulka 5

Míra totální odezvy

Analyzované údaje	IŇTRONA ± ribavirin	INTRON A + placebo	Hodnota pb
A	B	C	D	B vs D
	24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
Stanovení maximální podobnostia	26%	35%	5%	9%	<0,001
Pacienti s úplnými údaj ic	29% (52/179)	41 % (64/157)	5% (8/170)	11 % (18/158)	<0,001
Neúplné údaje považované za nezdard	23% (52/228)	28% (64/228)	28% (64/228)	8% (18/225)	<0,001

^a MLE založené na logaritmické regresi. Logaritmická regresní analýza pacientů s úplnými údaji o biopsii. p Hodnota pro A vs D < 0,001 a pro A vs B je 0,096.

^b Fisherův přesný test ^c Úplný údaje, výsledky biopsií před léčbou i po léčbě, (logaritmická regresní analýza) ^d Pacienti, jejichž virologické údaje nebo údaje z biopsie chyběly, se považovali za pacienty bez odezvy

Jak se předvídalo a podle jednotlivých výsledků splnilo, účinek léčby na vymizení HCV-RNA při ukončení následného pozorování a zlepšení hepatického zánětu, míra totální odezvy ve skupině léčené INTRONem® A a ribavirinem po dobu 48 týdnů byl výrazně nižší (< 0,001) než se pozorovala ve skupině léčené INTRONem® A a placebem po dobu 48 týdnů. Měřeno MLE a úplnou biopsií bylo u léčby kombinovanou terapií po dobu 48 týdnů ve srovnání s 48-týdenní monoterapií INTRONem A statisticky významné zlepšení totální odezvy. Hodnoty trvalé odezvy u 24-týdenní, respektive 48-týdenní léčby kombinovanou terapií byly významně vyšší než u 24týdenní, respektive 48-týdenní monoterapie INTRONem A.

Logaritmická regresní analýza se prováděla u všech basel i nových demografických proměnných a charakteristik choroby. Jedinými baselinovými statisticky významnými pacienti a charakteristikami choroby prediktivními pro trvalou odezvu při ukončení následného pozorování byl genotyp jiný než genoty p 1 a virová zátěž < 2 miliony.

Co se týče počtu virových kopií (< 2 miliony, > 2 miliony), statisticky významný rozdíl byl ve prospěch vyšších hodnot odezvy u pacientů s < 2 miliony kopiemi, (Viz Tabulka 6).

- 14CZ 300540 B6

V případě kombinace genotypu s baselinovou virovou zátěží, se v odezvě pozorovala hierarchie. Pacienti s genotypem jiným než 1 a baselinovou virovou zátěží < 2 miliony kopií, kterým se 24 a 48 týdnů podávala kombinovaná terapie, měli pří ukončení Následného pozorování nej lepší odezvu; trvalá víro logická odezva byla u pacientů s genotypem 1 a > 2 miliony kopií, kteří se léčili

48 týdnů kombinovanou terapií INTRONem A a ribavirinem, dvakrát lepší než u pacientů, kteří se léčili kombinovanou terapií pouze 24 týdnů. (Viz Tabulka 6).

Tabulka 6

Charakteristiky choroby vs trvalá odezva: všichni léčení pacienti

	Počet pacientů (%)
Charakteristiky choroby®	INTRON A + ribavirin INTRON A + placebo
	24 týdny 48 týdnů 24 týdny 48 týdnů
HCV-RNA virová zátěž
< 2 miliony kopií/ml	42% (26/62) 43% (33/76) 9% (7/74) 29% (18/63)
> 2 miliony kopií/ml	27% (44/166) 36% (54/152) 4% (6/157) 7% (11/162)
HCV genotyp

Genotyp 1	16% (26/164)	28% (46/166)	2% (3/167)	7% (11/162)
Jiné genotypy	69% (44/64)	66% (41/62)	16% (10/64)	29% (18/63)
Genotyp / baselinová HCV-RNA
Jiné genotypy / < 2 miliony kopií/ml	88% (14/16)	71% (15/21)	25% (5/20)	50% (10/20)
Jiné genotypy / > 2 miliony kopií/ml	63% (30/48)	63% (26/41)	11% (5/44)	19% (8/43)
Genotyp 1 / £ 2 miliony kopií/ml	26% (12/46)	33% (18/55)	4% (2/54)	19% (8/43)
Genotyp 1 / > 2 miliony kopíí/ml	12% (14/118)	25% (28/111)	1% (1(113)	3% (3/119)

^a Při vstupu se pacienti rozvrstvili podle počtu HCV virových kopií (< 2 miliony, > 2 miliony), genotypu (1, nebo jiný) a cirhózy (přítomnost, nebo nepřítomnost), měřeno HCV-RNA/PCR.

-15CZ 300540 B6

Tabulka 7

Míra trvalé vtrologické odezvy (%) podle HCV genotypu

	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
Genotyp
1	16% (27/165)	28% (46/166)	21% (4/168) 7% (11/162)
2	83% (25/30)	68% (25/37)	18% (7/38)	35% (15/43)
3	57% (16/28)	65% (15/23)	8% (2/24)	16% (3/19)
4-6	40% (2/5)	50% (1/2)	0	0

----Tabulka 7 ukazuje, že míra trvalé virologické odezvy byla u pacientů všech genotypů léčených 48-týdenní kombinovanou terapií ve srovnání s pacienty léčenými po dobu 24 nebo 48 týdnů Intronem A a placebem vyšší. S výjimkou pacientů s genotypem 2, rostl s prodloužením trvání io kombinované terapie poměr pacientů s trvalými virologickými odezvami. Kombinované virologické odezvy ze Studie 1 a 2 se uvádějí Tabulce 15. Logaritmická regresní analýza trvalé virologické odezvy ukázala, že kromě léčené skupiny byl významným prediktorem trvalé virologické odezvy (hodnota p < 0,001) HCV genotyp jiný než genotyp 1 a < 2 miliony kopií víru baselinové

HCV/ml. Pozoruhodné bylo, že léčení 48-týdenní kombinovanou terapií zlepšilo míru trvalé 15 virologické odezvy u pacientů, u kterých se očekávala nejnižší míra odezvy, zejména u pacientů s HCV genotypem 1 a více než 2 miliony kopií viru HCV/ml. U těchto pacientů byla míra trvalé virologické odezvy dvakrát větší než u pacientů podrobených 24-týdenní léčbě kombinovanou terapií. V podstatě byla trvalá virologická odezva u pacientů s HCV genotypem 1 léčených 48týdenní kombinovanou terapií 1,75 krát větší než u pacientů podrobených 24—týdenní léčbě kom20 binovanou terapií.

Studie 2

V zásadě na stejné metodologii popsané výše u Studie 1 se prováděla Studie 2 na 25 43 mezinárodních místech (832 pacientů) s použitím následujících tří léčebných režimů.

Výsledky jsou shrnuty níže.

1. INTRON® A, 3 miliony IU SC TIW, a ribavirin, 1000 nebo 12000 mg/den PO ve dvou dělených dávkách po dobu 24 týdnů

2. INTRON® A, 3 miliony IU SC TIW, a ribavirin, 1000 nebo 12000 mg/den PO ve dvou děle30 ných dávkách po dobu 48 týdnů

3. INTRON® A, 3 miliony IU SC TIW, a placebo odpovídající ribavirinu PO ve dvou dělených dávkách po dobu 48 týdnů

Účinnost

Předmětem primární účinnosti je trvalá virologická odezva definovaná jako ztráta detekovatelné HCV-RNA (qPCR) v séru měřená při ukončení Následného pozorování (24 týdny následující po ukončení léčby). Pacient se klasifikoval jako Pacient s totální odezvou, pokud byl při hodnocení ve 24. týdnu po ukončení léčby HCV-RNA(PCR) negativní a Knodellovo HA1 skóre zánětu (součet kategorií I + II + III) se zlepšilo (pokleslo) o 2 nebo více jednotek oproti skóre před léčbou.

-16CZ 300540 B6

Tabulky 9, 10, 11 a 12 udávají v souhrnu procenta Pacientů s trvalou virologickou odezvou v čase prvně negativní HCV-RNA, míru virologické odezvy při ukončení Následného pozorování, míru histologické odezvy a totální odezvy.

V níže uvedené Tabulce 8 je zaznamenána tělesná váha a base li nové charakteristiky choroby všech pacientů (HCV genotyp a počáteční virové zatížení) ze Studie 2.

Tabulka 8

Tělesná váha a base li nové charakteristiky choroby pacientů ze Studie 2

	INTRON A a ribavirin	INTRON A a placebo
	24 týdny	48 týdnů	48 týdnů
Tělesná váha
>75 kg	116(42%)	129 (47 %)	122 (44 %)
<75 kg	161 (58%)	148 (53 %)	156 (56%)
HCV genotyp
1	161 (58%)	159 (57 %)	168 (60%)
2	27(10%)	23 (8 %)	21 (8 %)
3	73 (26 %)	74 (27 %)	79 (28 %)
4	12 (4 %)	16(6%)	9 (3 %)
5	1 (0,4 %)	5 (2 %)	1 (0,4 %)
6	3 (1 %)	0	0
HCV-RNA/PCR (kopie/ml)
geometrický průměr	2 229 797	2 064 959	2 351 824
<: 2 miliony kopií/ml	108 (39%)	115(42%)	95 (34 %)
> 2 miliony kopií/ml	169 (61%)	162 (59 %)	183 (66%)

Tabulka 9

Procenta pacientů s trvalou virologickou odezvou vzhledem k léčbě prvně nedetekovatelné hladiny HCV-RNA ve Studii 2

-17 CZ 300540 B6

Doba prvně nedetekovatelné HCV-RNA (týdny)	Intron A a ribavirin	Intron A a placebo
	24 týdny	48 týdnů	48 týdnů
4	84 % (57/68)	83 % (58/70)	72 % (33/46)
12	47 % (36/77)	69 % (51/74)	34% (18/53)
24	12 % (3/26)	45 % (9/20)	10% (2/21)

Podle Tabulky 9 je zřejmé, že většina pacientů, kteří se stali Pacienty s trvalou virologickou odezvou, byli HCV-RNA negativní v týdnu 4 léčení. Podstatná část těchto pacientů léčených 24- a

48-týdenní kombinovanou terapií, kteří byli HCV-RNA pozitivní v Týdnu 4, vykázala však odezvu prvně v Týdnu 12; 47 % pacientů ze skupiny léčení 24 týdnů a 69 % ze skupiny léčené 48 týdnů se stalo Pacienty s trvalou virologickou odezvou. Důležité je, že 45 % (9/20) pacientů ze skupiny podrobené 48-týdenní kombinované terapii, kteří se stali HCV-RNA negativní prvně v Týdnu 24, se stalo Pacienty s trvalou virologickou odezvou. Žádná z odezev, která se vyskytla io po Týdnu 24 se nestala v žádné léčené skupině odezvou trvalou.

HCV-RNA odezva při ukončení Následného pozorování: trvalá ztráta HCV-RNA 24 týdny následující po ukončení léčby

Poměr pacientů s vymizelou HCV-RNA v séru 24 týdnů následujících po ukončení léčby kombinovanou terapií byl podstatně vyšší u pacientů léčených kombinovanou terapií INTRON em® A a ribavirinem ve srovnání s pacienty léčenými monoterapii INTRONem® A. Tabulka 10 podává souhrn odezvy u pacientů při ukončení následného pozorování indikované podle HCV-RNA v séru.

Tabulka 10

HCV-RNA v séru při ukončení Následného pozorování: Poměr pacientů s vymizelou HCV25 RNA 24 týdny následující po ukončení léčby (End of Treatment, EOT) a při ukončení Následného pozorování (End of Follow-Up, EOFU)

	Počet pacientů (%)
	INTRON A + ribavirin	INTRON A a placebo	Hodnota p B vs C1
	24 týdny	48 týdnů	48 týdnů
EOT2
Negativní	57% (157)	52% (145)	33 % (93)	<0,001
Pozitivní	42% (120)	42% (132)	65% (185)
EÓFU3
Trvalá odezva	35 % (96)	43% (118)	19% (53)	<0,001
Recidiva	23 % (23)	10% (27)	15% (41)
Bez odezvy	42 % (42)	48% (132)	66% (184)

- 18CZ 300540 B6 ¹ Fisherův přesný test pro EOT srovnání; logaritmická regrese pro EOFU ² EOT Ukončení léčení, p Hodnota A vs C < 0,001; p hodnota A vs B je 0,348 ³ EOFU Ukončení Následného pozorování, p Hodnota A vs C < 0,001; p hodnota A vs B je 0,055.

Tabulka 10 ukazuje, že 1) 24- a 48-týdenní kombinované terapie podstatně zvýšily trvalou virologickou odezvu při ukončení léčení ve srovnání s monoterapií Intronem A (obě hodnoty p < 0,001) a 2) prodloužená doba kombinované terapie z 24 na 48 týdnů měla největší účinek na míru recedivy (10 % při 48-týdenní léčbě ve 23 % při 24-týdenní léčbě, hodnota pje 0,055).

io

Jatemí histologie při ukončení Následného pozorování: Zlepšení jatemí histologie 24 týdnů následujících po ukončení léčby na základě skóre Knodellova histologického aktivitního indexu (HAI, I + II + III)

Biopsie před léčením a po léčení byly dostupné pro 74 % (204/277) a 60 % (167/277) pacientů léčených INTRONem® A a ribavirinem po dobu 24, respektive 48 týdnů, a pro 69 % (191/278) pacientů, kteří dostávali INT RON® A a placebo. Tabulka 11 podává souhrn účinku léčení hepatitického zánětu u pacientů, u nichž byly k dispozici výsledky jatemí biopsie před léčením a po léčení. Jako v případě trvalé ztráty HCV-RNA replikace, byl poměr pacientů se zlepšením zánětu jater značně vyšší (p < 0,001) u pacientů dostávajících kombinovanou terapii po dobu 48 týdnů ve srovnání s pacienty léčenými monoterapií INTRONem® A po dobu 48 týdnů. Prodloužení kombinované terapie z 24 na 48 týdnů také podstatně zvýšilo poměr pacientů, kteří vykázali zlepšení jatemího zánětu (hodnota p = 0,046).

Jatemí histologie při ukončení Následného pozorování: Zlepšení jatemí histologie 24 týdnů následujících po ukončení léčby na základě skóre Knodellova HAI (I + II + III)

Tabulka 11

	Počet pacientů** (%)
Statut pacienta	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo	Hodnota pc B vs C
24 týdny (N = 204)8	48 týdnů (N= 167)a	48 týdnů (N = 191)
Zlepšená biopsied	53% (107)	63 % (105)	39 % (74)	<0,001

^a Počet pacientů s spárovanými vzorky biopsie ^b Pacienti s biopsií před i po léčbě ^c Fisherův přesný test. Hodnota p pro A vs C = 0,007 a pro A vs B je 0,046 35 ^d Změna ve skóre Knodellova histologického indexu (HAI, součet I + 11 + III) před a po léčbě kategorizovaná jako pokles o dvě nebo více jednotek oproti stavu před léčbou.

Totální odezva

Totální odezva, která je shrnuta v Tabulce 12, je založena na následujících analýzách:

• Stanovení maximální podobnosti (Maximum likehood estimate, MLE) • Pacienti s úplnými údaji (výsledky biopsií před i po léčbě)

- 19CZ 300540 B6 • Výsledky pacientů s neúplnými údaji (chybí údaje buď HCV, nebo biopsie, nebo oba), které se považují za nezdar

Tabulka 12

Míra totální odezvy

Analyzované údaje	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
	A 24 týdny	B 48 týdnů	C 48 týdnů
Stanovení MLa	28%	37%	17%
Pacienti s úplnými údaji	30%	41 %	17%
biopsiec	(62/204)	(68/167)	(32/191)
Neúplné údaje	22%	24%	12%
považované za nezdard	(62/277)	(68/277)	(32/278)

^a MLE založené na logaritmické regresi, p Hodnota pro B vs C < 0,001 a pro A vs C < 0,002 a pro A vs B je 0,043.

^b Fisherův přesný test ^c Úplné údaje, výsledky biopsií před léčbou i po léčbě, p Hodnota pro B vs C < 0,001 a pro A vs C < 0,005 a pro A vs B je 0,032.

^d Výsledky pacientů, jejichž virologické údaje nebo údaje z biopsie, nebo údaje z obou vyšetření chyběly, se považovaly za nezdar.

Jak se předvídalo a podle jednotlivých výsledků splnilo, účinek léčby na vymizení HCV-RNA při ukončení následného pozorování a zlepšení hepatického zánětu, míra totální odezvy ve skupině léčené INTRONem® A a ribavirinem je při všech způsobech hodnocení výrazně vyšší s dvounásobným zlepšením oproti pozorování ve skupině léčené INTRONem® A a placebem.

Logaritmická regresní analýza se prováděla u všech baselinových demografických proměnných a charakteristik choroby. Jedinou statisticky významnou baselinovou charakteristickou predikací pro trvalou odezvu při ukončení Následného pozorování byl genotyp jiný než genotyp 1.

Tabulka 13

Míra trvalé virologické odezvy podle HCV genotypu pacientů ze Studie 2

-20CZ 300540 B6

	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny 48 týdnů	48 týdnů
Genotyp
1	18% (29/161)	30% (48/159)	11 % (19/168)
2	59% (16/27)	74% (17/23)	35 % (8/23)
3	66 % (48/73)	61 % (45/74)	32 % (25/79)
4-6	19% (3/16)	38% (8/21)	12% (1/8)

Kombinovaná terapie poskytla ve srovnání s Intronem A a placebem vyšší míru trvalé víro logické odezvy u všech genotypů. S prodloužením trvání kombinované terapie na 48 týdnů rostl poměr pacientů s trvalou virolog ickou odezvou, s výjimkou typu 3. (Viz Tabulka 13 a Tabulka 15 Kombinované vírologické odezvy ze Studie 1 a 2).

Co se týče počtu virových kopií (< 2 miliony, > 2 miliony) byl zjištěn početní rozdíl ve prospěch vyšší míry odezvy u pacientů s <2 miliony kopiemi. (Viz Tabulka 14). V případě kombinace io genotypu s baselinovou virovou zátěží, se v odezvě pozorovala hierarchie. Při ukončení Následného pozorování měli nejlepší odezvu pacienti s genotypem jiným než 1 a baselinovou virovou zátěží < 2 miliony kopií; pacienti s genotypem 1 a > 2 miliony kopií, kteří se léčilo delší 48týdenní kombinovanou terapií, vykázali ze všech skupin nej podstatnější zlepšení trvalé víro logické odezvy.

-21 CZ 300540 B6

Tabulka 14

Charakteristiky choroby vs trvalá virologická odezva: všichni léčení pacienti ze Studie 2

	Počet pacientů (%)
Charakteristiky choroby	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	48 týdnů
HCV-RNA virová zátěž
< 2 miliony kopií/ml	44% (48/108)	47% (54/115)	31 % (15/49)
> 2 miliony kopií/ml	28 % (48/109)	40 % (64/102)	13% (24/183)
HCV genotyp
Genotyp 1	18% (29/161)	30% (48/159)	11 % (19/168)
Jiný genotyp	58% (67/116)	59% (70/118)	31 % (34/110)
Genotyp / baselinová HCV-RNA
Jiný genotyp / <2 miliony kopií/ml	53 % (28/53)	62 % (34/55)	31 % (15/49)
Jiný genotyp / > 2 miliony kopií/ml	62 % (39/63)	57 % (36/63)	31 % (19/61)
Genotyp 1 / < 2 miliony kopií/ml	36 % (20/55)	33 % (20/60)	30% (14/46)
Genotyp 1 / > 2 miliony kopií/ml	8 % (9/106)	28 % (28/99)	4% (5/122)

Tabulka 14 ukazuje, že prodloužení kombinované terapie na 48 týdnů obecně zlepšilo míru trvalé virologické odezvy. Nejvyšší míra trvalé virologické odezvy se pozorovala u pacientů, kteří dostávali 48-týdenní kombinovanou terapii s genotypy jinými než genotyp 1 a počátečními HCV io hladinami <2 miliony kopií/ml. Důležité je to, že u pacientů s genotypem 1 a HCV hladinami > 2 miliony byla míra trvalé virologické odezvy při 48-týdenní kombinované terapii víc než 3 krát vyšší než míra při 24-týdenní kombinované terapii.

Závěry o účinnosti vzhledem ke kombinovaným výsledkům všech pacientů ve Studii 1 a 2.

Kombinovaná terapie byla při počáteční léčbě chronické hepatitidy C podstatně účinnější než monoterapie INTRONem® A. Míra trvalé virologické odezvy u těchto pacientů, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, byla téměř třikrát vyšší při 48-týdenní kombinované terapii než při 48-týdenní monoterapii Intronem A a podstatně vyšší u 48-týdenní kombinované terapie než u 24-týdenní kombinované terapie. Na zlepšení míry trvalé odezvy se usuzuje ze dvou účinků léčení: vyšší míra odezvy při ukončení léčby a nižší míra recidivy. Souhrnným výsledkem obou těchto účinků byla nejvyšší míra trvalé odezvy u 48-týdenní kombinované terapie ve srovnání s 48-týdenní monoterapii nebo kratším režimem kombinované terapie. Toto zlepšení

-22CZ 300540 B6 účinnosti u 48-týdenní kombinované terapie také zahrnovalo měření dalších odezev jako jsou biochemické (ALT) a histologické konečné výsledky.

Ve skutečnosti bylo trvalé vymizení HCV-RNA v séru vysoce korelované s dalšími klinickými konečnými výsledky - normalizací ALT a zlepšením nebo rozptýlením hepatického zánětu. Vymizení detekovatelné HCV-RNA při ukončení následného pozorování bylo spojeno s normalizací ALT ve všech léčených skupinách, u kombinované terapie však bylo lehce zvýšené. Většina pacientů léčených kombinovanou terapií, kteří měli ALT normální, byla také HCVRNA negativní (83 až 87 %).

Prodloužená délka terapie měla největší vliv na míru recidivy. Při ukončení Následného pozorování byla míra recidivy jak ve skupině 48-týdenní kombinované terapie, tak ve skupině monoterapie nižší než hodnota recidivy ve skupině 24-týdenní kombinované terapie. Kombinace vysoké konečné odezvy na léčení dosažené u 24- a 48—týdenní kombinované terapie ve srovnání s 4815 týdenní monoterapií Intronem A a snížená míra recidivy vedla k nejvyšší míře trvalé odezvy. Míra trvalé odezvy byla u 48-týdenní kombinované terapie ve srovnání s 48-týdenní monoterapií Intronem A více než dvakrát vyšší (p < 0,001). Také ve srovnání s 24-týdenní kombinovanou terapií byla míra trvalé odezvy u 48-týdenní kombinované terapie vyšší (p = 0,008).

U pacientů s recidivou užitek z kombinované terapie zůstal bez ohledu na standardní prediktory odezvy na monoterapií INTRONem® A a 24-týdenní kombinovanou terapii. Při nástupu do těchto testů se pacienti rozdělili podle následujících charakteristik choroby: HCV-genotyp (typ 1 nebo jiné genotypy); úroveň hladiny viru HCV (počet kopií viru v séru < 2 miliony kopií/ml, nebo > 2 miliony kopií/ml) a cirhóza (přítomnost nebo nepřítomnost). Logaritmická regresní analýza trvalé virologické odezvy ukázala, že kromě léčené skupiny, byl významným prediktorem trvalé virologické odezvy pouze HCV genotyp. Schopnost předem ne léčených pacientů dosáhnout trvalé virologické odezvy na kombinovanou terapii nebyla ovlivněna ani hladinou HCV viru před léčbou, ani přítomností cirhózy.

U 48-týdenní kombinované terapie byla míra trvalé odezvy důsledně vyšší než u 48-týdenní monoterapie Intronem A bez ohledu na genotyp a byla obecně vyšší než u 24-týdenní kombinované terapie. Jako skupina se pacienti infikovaní genotypem t ukázali být méně ovlivnitelní monoterapií INTRONem® A než pacienti infikovaní jinými genotypy. Navzdory tomu byla míra trvalé virologické odezvy u genotypu 1 3krát vyšší u 48—týdenní kombinované terapie ve srovná35 ní s 48-týdenní monoterapií INTRONem® A a dvakrát vyšší u 48-týdenní ve srovnání s 24týdenní kombinovanou terapií. Při kombinované terapii byla míra trvalé virologické odezvy důsledně vyšší u pacientů infikovaných jinými genotypy. Míra odezvy jak při 24-týdenní, tak při 48-týdenní kombinované terapii byla vyšší než při 48-týdenní monoterapií INT RON em® A, a u všech genotypů s výjimkou 2 & 3, které měly stejnou míru odezvy (tzn. 64 % po 24 týdnech stejně jako po 48 týdnech kombinované terapie), s prodloužením trvání kombinované terapie na 48 týdnů vzrostl poměr pacientů s trvalými virologickými odezvami (Viz Tabulka 15).

Kombinovaná terapie byla také mnohem účinnější než 48-týdenní monoterapie INT RON em® A v produkci stálých virologických odezev bez ohledu na base línovou hladinu viru. 48-Týdenní kombinovaná terapie důsledně vedla k vyšší míře trvalé virologické odezvy u všech hladin virové infekce než 48-týdenní monoterapie INTRONem® A. Míra trvalé odezvy byla podobná u všech hladin viru ve skupinách jak 24-týdenní, tak 48—týdenní kombinované terapie, s výjimkou nejvyšších hladin viru (5-<6 a < 6 x 10⁶ kopií/ml), kde byla míra trvalé odezvy u skupin 48-týdenní kombinované terapie dvakrát vyšší než u skupin 24-týdenní kombinované terapie.

Jak se uvádí výše, pacienti s genotypy jinými než genotyp 1 měli vyšší míru trvalé virologické odezvy než pacienti s typem 1, a s hladinou viru < 2 miliony/ml byla spojena lepší míra odezvy než s hladinou viru > 2 miliony/ml. Pozoruhodné bylo, že prodloužení kombinované terapie na 48 týdnů zlepšilo míru trvalé odezvy u pacientů, u kterých se předpokládala nejnižší míra odezvy,

-23 CZ 300540 B6 zejména u pacientů s genotypem 1 a > 2 miliony kopií HCV-RNA/ml. Prodloužení kombinované terapie na 48 týdnů u této skupiny pacientů vedlo k míře trvalé virologické odezvy čtyřikrát vyšší než u pacientů podrobených 24-týdenní kombinované terapií.

Další demografické/chorobopisné charakteristiky měly na výsledek kombinované terapie malý vliv. Oproti tomu se podstatně nižší míra trvalé odezvy zaznamenala při monoterapii Intronem A u pacientů starších 55 let, o hmotnosti > 75 kg nebo u pacientů infikovaných prostřednictvím transfuze. Všichni měli míru trvalé odezvy v rozmezí 10-12 %.

io Dostupnost spárovaných biopsií byla vysoká ve srovnání se podobnými typy studií u pacientů s chronickou hepatitidou C. Jak se předjímalo, u části pacientů byla z různých důvodů jatemí biopsie před a/nebo po léčbě nedostupná. Spárovaná biopsie byla však získána u 71 % pacientů. Zlepšení se zaznamenalo u podstatně vyšší části pacientů podrobených 48-týdenní kombinované terapii ve srovnání s pacienty podrobenými 48-týdenní monoterapii Intronem A při ukončení

Následného pozorování (p < 0,001). Ve zlepšení hepatického zánětu byla 24-týdenní kombinovaná terapie také podstatně účinnější než 48-týdenní monoterapie Intronem A. Jak se uvádí výše, korelace virologické odezvy se udržela, pokud biopsie stanovila zlepšení nebo střední změnu od baselíny v nekrozánětovém skóre; 64-69 % pacientů mělo zlepšený hepatický zánět se střední změnou od baseliny -3,8 až -5,0. Nej podstatnější střední změna byla u pacientů podrobených

48-týdenní monoterapii Intronem A.

Jak se předjímalo, pacienti s trvalou virologickou odezvou ve všech léčených skupinách vykázali větší zlepšení ve skóre biopsie jatemího zánětu než pacienti, kteří zůstali HCV-RNA pozitivní, a ačkoliv rozsah zlepšení byl podobný ve všech skupinách, poměr pacientů s virologickou odezvou a histologickým zlepšením byl nejméně dvakrát tak vysoký u 24- i 48-týdenní kombinované terapie než u 48-týdenní monoterapie Intronem A. Prodloužení kombinované terapie vedlo k vyššímu střednímu zlepšení u hepatického zánětu. Je také poznamenán thodné, že pacienti, kteří měli recidivu při 48-týdenní kombinované terapii, měli významné střední zlepšení u zánětu. V Tabulkách 15 až 20 se podává souhrn kombinovaných výsledků,

Tabulka 15

Kombinovaná virologická odezva pro Studie 1 a 2

Účinnost: Ztráta detekovatelné HCV-RNA při ukončení léčby (EOT) a trvalá virologická odezva při ukončení Následného pozorování (EOFU) a procenta pacientů s odezvou

-24CZ 300540 B6

	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
Počet pacientů’	N = 505 A	N = 505 B	N = 231 C	N = 503 D
EOť	53%	50%	29%	24%
EOFU3	33%±4	41%±5	6%	16%
HCV genotyp	Počet pacientů	Počet pacientů
Genotyp 1	17%±4 (56/326)	29%±5 (94/325)	2%	9%
Genotyp 2	73%±124 (41/57)	70 %± 124 (42/60)	18%	35%
Genotyp 3	63%±94 (64/101)	62%±104 (60/97)	8%	29%
Genotypy 4/5/6	24 %± 10 (5/21)	39% ±20 (9/23)	0%	11 %

¹ Charakteristiky pacientů: a) 66 % muži; 34 % ženy; b) střední věk: 42,7 roků; c) střední hladiny HCV-RNA před léčbou < 2 miliony kopií/ml: 34 %, > 2 miliony kopií/ml; 66 %; Super Quant, NGl; d) HCV genotyp 1: 66 %; genotyp 2: 13 %, ne 1-3: 3 %.

² EOT-ukončení léčby: p hodnota B vs D <0,001; p hodnota A vs D < 0,001. EOFU-ukončení

Následného pozorování - 24 týdny po ukončení léčby; p hodnota AvsB = 0,257;p hodnota B vs D < 0,001; p hodnota A vs D < 0,001.

Trvalá virologická odezva při ukončení Následného pozorování; p hodnota A vs B = 0,008.

⁴ Trvalá virologická odezva pro HCV genotypy 2 a 3 po uplynutí 24 týdnů byla 64,5 % a po io uplynutí 48 týdnů byla 65 %.

Tabulka 16

Procenta trvalé virologické odezvy pro všechny pacienty s genotypem 1

Pacient	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
HCV genotyp 1 / < 2 miliony kopií/ml	32%	33%	4%	25%
HCV genotyp 1 / > 2 miliony kopií/ml	10%	27%	1 %	33%
Všechny HCV genotypy 1	17%	29%	2%	9%

-25 CZ 300540 B6

Trvalá virologická odezva u všech pacientů s HCV genotypem 1 léčených 24- a 48-týdenní kombinovanou terapií byla statisticky vyšší než ta pozorovaná u všech pacientů s HCV genotypem 1 léčených 24- a 48-týdenní terapií INTRONem A a placebem. Trvalá virologická odezva u pacientů s HCV genotypem 1 a baselinovou virovou zátěží vyšší než 2 miliony kopií/ml byla statisticky vyšší při 24- a 48-týdenní kombinované terapii ve srovnání s 24- a 48-týdenní terapií FNTRONem A a placebem.

io Tabulka 17

Trvalá virologická odezva podle HCV genotypu a baselinových hladin HCV-RNA u Studií 1 & 2

Pacienti	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
HCV genotyp 1 / baselinové hladiny HCV-RNA < 2 miliony kopií/ml	32%	33%	4%	25%
HCV genotyp 1 / baseíinové hladiny HCV-RNA > 2 miliony kopií/ml	11 %	27%	1 %	4%
Jiné HCV genotypy1 / baseíinové hladiny HCV-RNA > 2 miliony kopií/ml	61 %	64%	25%	36%
Jiné HCV genotypy1 / baseíinové hladiny HCV-RNA > 2 miliony kopií/ml	62%	61 %	11 %	10%

¹ Záznam 3 % pacientů s trvalou odezvou HCV genotypů 4/5/6 pro I + R: 24 % (24 týdny) a % (48 týdny); pro I + P: 0 % (24 týdny) a 11 % (48 týdnů). Hodnota trvalé odezvy u HCVgenotypů 2 + 3 je stejná jako výše.

Tabulka 18

Trvalá virologická odezva podle baselinových hladin HCV-RNA pro všechny pacienty (Studie 1 & 2)

Pacienti	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
Pacienti s baselinovými hladinami HCV-RNA < 2 miliony kopií/ml	44%	46%	9%	36%
Pacienti s baselinovými hladinami HCV-RNA > 2 miliony kopií/ml	27%	38%	4%	10%

-26CZ 300540 B6

Tabulka 19

Procenta pacientů s trvalou virologickou odezvou podle doby prvně nedetekovatelných hladin HCV-RNA ze Studií 1 & 2

Doba prvně nedetekovatelné HCV-RNA (týdny)	INTRON A + ribavirin	INTRON A + placebo
24 týdny	48 týdnů	24 týdny	48 týdnů
4	83% (92/111)	82% (94/115)	48% (10/21)	71% (47/66)
12	44% (66/149)	66% (91/137)	9% (3/32)	35% (29/84)
24	19% (8/42)	44% (20/45)	0% (0/22)	15% (6/39)

Tabulka 20 io

Odezva ALT: Normalizace ALT v séru u všech pacientů ze Studií 1 & 2

	INTRON A a ribavirin	INTRON A a placebo
Ukončení léčby	A 24 týdny	B 48 týdnů	C 24 týdny	D 48 týdnů	Hodnota pa	Hodnota p·
	N = 505	N = 505	N = 231	N = 503	B vsD	A vs D
Studie
1 &2b	66% (329)	66% (334)	24% (56)	37% (185)	<0,001	0,739
1	58% (133)	61% (138)	24% (56)	28% (62)	<0,001	<0,001
2	71% (196)	71% (196)	-	44% (123)	<0,001	<0,001
Ukončení následného pozorování
Studie
1 &2b	36% (181)	44% (221)	11% (25)	24% (102)	<0,001	<0,001
1	32% (72)	36% (83)	11% (25)	16% (35)	<0,001	<0,001
2	39% (109)	50% (138)	-	24% (67)	<0,001	<0,001

^a Pro kombinované výsledky Cochran-Mantet Haenszelův obecný vztah; pro individuální stu15 die Fisherův přesný test ^b Kombinované výsledky

Odborníkům znalým v oboru bude zřejmé, že je proveditelných mnoho modifikací a variací předkládaného vynálezu, aniž by se opustil duch a rozsah vynálezu. Zde popsaná specifická provedení jsou nabízena pouze jako příklady a předkládaný vynález se limituje pouze

-27 CZ 300540 B6 v termínech přiložených nároků, společně s plným rozsahem ekvivalentů, ke kterým jsou nároky oprávněny.

Průmyslová využitelnost

Ribavirin a interferon alfa se používají pro přípravu farmaceutických přípravků pro léčbu pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě. Tato kombinovaná léčba ribavirinem a interferonem alfa vede u pacientů s chronickou infekcí hepatitidou C, kteří dosud nebyli podrobeni žádné antivirové léčbě, k vymizení detekovatelné

HCV-RNA v séru.

Claims (12)

15 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití ribavirínu pro přípravu farmaceutického přípravku k likvidaci detekované RNA při antivirové léčbě pacienta, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, majícího chronic20 kou infekci hepatitidy C genotypu 1 a virovou zátěž větší než 2 miliony kopií/ml séra měřeno HCV-RNA kvantitativním PCR, kde farmaceutický prostředek je určen pro kombinované podání s účinným množstvím interferonu alfa po dobu 40 až 50 týdnů.

2. Použití interferonu alfa pro přípravu farmaceutického přípravku k likvidaci detekované RNA

25 při antivirové léčbě pacienta, který dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, majícího chronickou infekci hepatitidy C genotypu 1 a virovou zátěž větší než 2 miliony kopií/ml séra měřeno HCV-RNA kvantitativním PCR, kde farmaceutický prostředek je určen pro kombinované podání s účinným množstvím ribavirínu po dobu 40 až 50 týdnů.

30

3. Použití jak ribavirinu tak interferonu alfa pro přípravu farmaceutického přípravku k likvidaci detekované RNA při antivirové léčbě pacienta, kteiý dosud nebyl podroben žádné antivirové léčbě, majícího chronickou infekci hepatitidy C genotypu 1 a virovou zátěž větší než 2 miliony kopií/ml séra měřeno HCV-RNA kvantitativním PCR, kde farmaceutický prostředek je určen pro kombinované podání po dobu 40 až 50 týdnů.

4. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, kde interferon alfa je vybrán z interferonu alfa-2a, interferonu alfa-2b, konvenčního interferonu, čištěného vyrobeného interferonu alfa, pegylovaného interferonu alfa-2a nebo pegylovaného interferonu alfa-2b.

40

5. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, kde interferon alfa je pegylovaný interferonu alfa.

6. Použití podle nároku 5, kde interferon alfa je pegylovaný interferon alfa-2b.

45

7. Použití podle nároku 5, kde interferon alfa je pegylovaný interferon alfa-2a.

8. Použití podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, kde interferon alfa je pegylovaný interferon alfa2b.

50

9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde interferon alfa je interferon alfa-2a.

10. Použití podle nároku 1, kde farmaceutický prostředek je určen pro podání 800 až 1200 mg ribavirinu za den po dobu 48 týdnů.

-28CZ 300540 B6

11. Použití podle nároku 2, kde farmaceutický prostředek je určen pro podání 2 až 10 milionů HJ interferonu alfa za týden na týdenní, třikrát týdně, každý druhý den nebo denní bázi po dobu 48 týdnů.

12. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9, kde interferonem alfa je interferon alfa-2a a podávané množství interferonu alfa je 2 až 10 milionů HJ za týden na týdenní, třikrát týdně, každý druhý den nebo denní bázi po dobu 48 týdnů.