JP3107799B2 - 大きな構造遺伝子の製造および発現 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、遺伝物質
の操作による所望のタンパク質、具体的には、ヒト免疫
インターフェロンポリペプチド類似体の生産に有用なプ
ロセスに関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】遺伝
物質とは、一般的には、細胞およびウィルスの構成成分
の製造をプログラムおよび誘導し、そして、細胞および
ウィルスの反応を制御する化学物質として定義できる。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として知られる長鎖重合
体物質は、リボ核酸（ＲＮＡ）によってプログラムされ
るある種のウィルスを除いて、あらゆる生細胞およびウ
ィルスの遺伝物質を構成する。 ＤＮＡポリマーの反復
単位は、４つの異なるヌクレオチドであり、それらは各
々燐酸塩基が付加したデオキシリボース糖類に結合した
プリン（アデニンあるいはグアニン）あるいはピリミジ
ン（チミンあるいはシトシン）を含む。 直線状ポリマ
ー内のヌクレオチドの接合は、１つのヌクレオチドの5'
−燐酸の、他のヌクレオチドの3'ヒドロキシル基への融
合によるものである。 機能性ＤＮＡはヌクレオチドの
一本鎖（デオキシオリゴヌクレオチドとして知られる）
の安定した二本鎖会合の形で生じ、この会合はプリン塩
基およびピリミジン塩基の間の水素結合によって生じる
〔すなわち、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との間、ま
たはグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間に存在する
『相補的』会合〕。 従来より、ヌクレオチドは、それ
らを形成するプリン塩基あるいはプリミジン塩基の名前
で呼ばれ、二本鎖ＤＮＡの相補的結合（すなわち、Ａ−
ＴおよびＧ−Ｃ）は『塩基対』と呼ばれている。 【０００３】リボ核酸は、ポリヌクレオチドであり、ア
デニン、グアニン、シトシン、およびチミンの代わりに
ウラシル（Ｕ）を含み、これらはリボースおよび燐酸基
に結合している。 【０００４】ＤＮＡのプログラム機能は、一般に、特定
のＤＮＡヌクレオチド配列（遺伝子）が、比較的に不安
定なメッセンジャーRNA(mRNA）ポリマーに『転写』され
るプロセスによって実現される。 一方、mRNAは、アミ
ノ酸から構造、調節および触媒タンパク質を生成するた
めの鋳型として役立つ。 この翻訳過程には、小さなＲ
ＮＡ鎖(tRNA)の作用が関連しており、tRNAは個々のアミ
ノ酸を送り込んでmRNAに沿って整列させて、適切なアミ
ノ酸配列のポリペプチドの生成を可能にする。 【０００５】ポリペプチド『発現』のために、ＤＮＡか
ら誘導され、tRNAの供給と20種類のアミノ酸のいずれか
の方向性を定めるmRNAの『メッセージ』は、三塩基『コ
ドン』の形態、すなわち、３つのヌクレオチド塩基の配
列的なグループ化の形態をとる。 ある意味では、タン
パク質の形成は、遺伝子のヌクレオチド配列によってプ
ログラムされた遺伝メッセージの『発現』の究極的な姿
である。 【０００６】ＤＮＡポリマー内にて、普通遺伝子に『先
行』するＤＮＡ配列は、mRNAへの転写の開始部位をもた
らす。 これら配列は、『プロモーター』配列と呼ばれ
る。ＤＮＡポリマー内で、通常遺伝子の『上流』にある
（すなわち、先行する）その他のＤＮＡ配列は、転写開
始の頻度（あるいは速度）を決定するタンパク質を結合
する。 このような配列は、『レギュレーター』配列と
呼ばれる。 このように、機能性ＤＮＡポリマーの中で
選択された一つの遺伝子（あるいは、複数の遺伝子の配
列）に先行し、かつ遺伝子の転写（および、その後の発
現）の有無を決定する配列は、『プロモーター／レギュ
レーター』あるいは『制御』ＤＮＡ配列と総称されてい
る。 ＤＮＡポリマー内で遺伝子に『続き』、かつmRNA
への転写の終了の信号をもたらすＤＮＡ配列は『ターミ
ネーター』配列と呼ばれる。 【０００７】過去10年近くの間、微生物学的プロセスの
焦点は、所望の生成物に関する遺伝情報を含まないＤＮ
Ａを保有する生物を用いて、工業的に、そして製薬的に
有用な物質を製造することに向けられてきた。 すなわ
ち、生成物の構造を定める遺伝子は、『供与』生物から
分離されるか、あるいは、化学的に合成され、そして、
安定的に他の生物、好ましくは、自己複製単細胞微生物
に導入される。 これが成功すれば、『形質転換され
た』宿主細胞内での、遺伝子発現の既存の機序が作用し
て所望の生成物を構築することになる。 【０００８】この技術分野では、選択された宿主生物の
形質転換に使用する遺伝物質の分離、合成、精製、およ
び増幅のための『組換えＤＮＡ』方法に関する数多くの
特許および文献が出されている。 例えば、Cohen等の
米国特許 No. 4,237,224は、選択された外来性ＤＮＡ配
列を含む『ハイブリッド』ウィルスＤＮＡあるいは環状
プラスミドＤＮＡを用いた原核単細胞宿主生物の形質転
換に関する。 Cohen等の特許の方法は、まず、酵素的
にウィルスＤＮＡまたは環状プラスミドＤＮＡを切断し
て、線状ＤＮＡを形成することによる形質転換用ベクタ
ーの製造に関する。 【０００９】選択された外来性ＤＮＡ鎖は、同様な酵素
を使用することによって線状に調製される。 線状ウィ
ルスＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡは、外来性ＤＮＡ
と共に、修復プロセスを進行せしめる能力がある結合酵
素の存在下で培養され、そしてウィルスＤＮＡまたは環
状ＤＮＡプラスミドに『切り出された』外来性ＤＮＡ断
片を含んだ、『ハイブリッド』ベクターが形成される。 【００１０】親和性のある単細胞宿主生物のハイブリッ
ド・ベクターによる形質転換は、宿主細胞内に外来性Ｄ
ＮＡの多数の複製を生じる。 場合によっては、目的
は、単に外来性ＤＮＡの増幅であり、収穫される『生成
物』はＤＮＡである。 大抵の場合、形質転換の目的
は、外来性ＤＮＡの宿主細胞での発現であり、外来性Ｄ
ＮＡによってコードされた商業的に有用なタンパク質あ
るいはポリペプチド断片を、分離可能なほどの量だけ大
規模に合成する。 例えば、Shineの米国特許 No.4,26
9,731、Manisの米国特許 No. 4,273,875、およびCohen
の米国特許 No. 4,293,652を参照のこと。 【００１１】Cohen等の特許のような方法の成功は、主
に、ハイブリッド化されないＤＮＡベクター、および重
要な外来性配列を含む真核生物のＤＮＡ鎖等の特定部位
の切断を促進する『制限エンドヌクレアーゼ』酵素が、
容易に入手できることによる。 【００１２】二本鎖線状ＤＮＡ鎖に、一本鎖相補性『末
端』を形成する切断方法は、『結合』酵素の処理を受け
た時の外来性ＤＮＡのベクターへの機能的組み込みの蓋
然性を顕著に高める。 このような多数の制限エンドヌ
クレアーゼ酵素が、現在商業的に入手可能である〔例え
ば、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社、ゲテスバ
ーグ、メリーランド州の『1981／1982カタログ』にある
『BRL制限エンドヌクレアーゼ参照表』を参照のこ
と〕。 ハイブリッド形成の確認は、クロマトグラフ法
によって容易なものとなり、この方法は、例えば、分子
量に基づいて非ハイブリッド・プラスミドとハイブリッ
ド・プラスミドとを区別することができる。 【００１３】その他の有用な方法は、放射性ＤＮＡハイ
ブリッド形成に関するものである。 【００１４】原核細胞の形質転換の成功に大いに寄与し
た他の操作『手段』は、選択可能な『標識付けした』遺
伝子配列の使用である。 つまり、所望の外来性ＤＮＡ
に加えて、形質転換された宿主細胞を、形質転換されて
いない宿主細胞から区別することのできる形質特性を発
現するコードを有する、一つ以上のＤＮＡ配列を含むハ
イブリッド・ベクターが使用される。 典型的な標識遺
伝子配列は、形質転換された原核細胞が形質転換されて
いない宿主細胞を殺すか、あるいは当該原核細胞の増殖
を甚だしく阻止する金属、抗生物質、およびこれらを含
む培地中にて、当該原核細胞が生存し、増殖することを
可能とするものである。 【００１５】形質転換された宿主微生物内において、外
来性遺伝子が首尾よく発現するか否かは、主に、前述の
遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAのメッセージのタンパ
ク質の翻訳を確実にする、その他の信号への転写を確実
にする適切なプロモーター／レギュレーター領域（例え
ば、リボゾーム結合部位）を持つ形質転換ベクターに前
述の遺伝子を組み込めるか否かによって決まる。 遺伝
子の『元の』プロモーター／レギュレーター領域が新し
い宿主において高レベルの発現を許すことは珍しい。
従って、挿入しようとする遺伝子には、挿入に先立って
新しい宿主に適合する転写および翻訳調節ＤＮＡ配列を
付加するか、あるいは、前述の遺伝子を、ベクターＤＮ
Ａ中にて現存の転写信号および翻訳信号に制御される部
位に挿入する必要がある。 【００１６】外来性遺伝子の、例えば、環状ＤＮＡプラ
スミド・ベクターへの挿入は、しばしば、現存する転写
および翻訳信号の直後の部位、あるいは宿主内で発現の
程度が高い、比較的大きなタンパク質のコードを有する
現存プラスミド遺伝子内で行われる。 後者の場合、こ
のようにして形成された『融合遺伝子』の宿主における
発現は、所望のタンパク質配列（例えば、大きなタンパ
ク質の化学的な切断によって分離できる中間断片とし
て）を含む『融合タンパク質』の高レベルでの生成とな
る。 前述した方法は単に、所望の調節と外来性遺伝子
生成物の高レベルの発現を確実にするのみならず、所望
のタンパク質生成物を宿主に内在するプロテアーゼの攻
撃からある程度防御する。 さらに、宿主生物によって
異なるが、前述した方法は、所望のタンパク質の宿主細
胞から細胞培地への一種の『ピギーバック』輸送を可能
とし、所望の生成物を分離するために宿主細胞を破壊す
る必要性を解消する。 【００１７】公表された組換えＤＮＡ方法に関して述べ
たことから、これらプロセスは、単純で、容易に実施で
き、かつ簡単に検証できるように見えるが、実際には、
必要なＤＮＡ配列の操作の実施は非常に煩雑かつ困難な
もので、所望の生成物の収率は、ほとんど例外なく、非
常に低い。 【００１８】一例を挙げると、宿主微生物の形質転換に
使用されるベクターに挿入するための遺伝子の、最初の
『調製』は非常に難しいプロセスである場合があり、発
現させようとする遺伝子がヒトのような高等生物に内在
するものである場合は、特にそうである。 この技術に
て行われる煩雑な工程の一つに、『供与』細胞の全ＤＮ
Ａゲノムの組換えプラスミドへの体系的なクローニング
があり、これは、ランダムなＤＮＡ配列断片を持つ形質
転換された細胞の膨大な『ライブラリー』が生成され、
このＤＮＡ配列断片を、個々に試験して所望の生成物の
発現を調べる必要がある。 他の方法によると、全mRNA
は高発現供与細胞（所望の生成物のためのコードを持つ
mRNAの多数の複製を含むもの）から分離され、最初に逆
転写酵素によって一本鎖cDNAに『複写』され、それから
ポリメラーゼによって二本鎖に転写され、そしてクロー
ニングされる。 この方法も、形質転換された細胞のラ
イブラリーを生成するが、このライブラリーは全ゲノム
・ライブラリーよりも幾分か小さく、所望の遺伝子の複
製を含み、かつ宿主微生物での発現に大きく干渉する形
質転換されない『イントロン』を持たない可能性があ
る。 上記した煩雑な遺伝子分離方法は、実際にいくつ
かのタンパク質を微生物に発現させるのために公表され
た組換えＤＮＡ方法で使用されたものであり、前記した
タンパク質は、ラット・プロインシュリン〔Ullrich
等、Science, 196, pp. 1313-1318(1977）〕、ヒト繊維
芽細胞インターフェロン〔Goedell等、Nucleic Acids R
esearch, ８, pp. 4087-4094(1980）〕、マウスβ−エン
ドルフィン〔Shine 等、Nature、285、pp. 456-461(198
0）〕、およびヒト白血球インターフェロン〔Goedell
等、Nature、287、pp. 411-416(1980）；および Goedel
l等、Nature, 290, pp. 20-26 (1981)〕を含む。 【００１９】可能であれば、ヌクレオチド塩基を用いた
所望の遺伝子の部分的あるいは全部の製造は、組換えＤ
ＮＡ方法で使用する遺伝子の調製のためのさらに望まし
い方法を構成する。 そのような製造のために必要なも
のは、当然のことながら、所望のポリペプチドの正確な
アミノ酸配列の知識である。 この情報があれば、タン
パク質を生成するＤＮＡ配列（すなわち、適切に配列さ
れた三塩基コドン）をデザインすることが可能となり、
対応する合成二本鎖ＤＮＡ配列を調製することができ
る。 製造方法とcDNA合成方法との組合せが、ヒト成長
ホルモン用の遺伝子の生成のために使用されたことが報
告されている。 特に、製造された72個のヌクレオチド
塩基対の線状二本鎖ＤＮＡ配列（所望の191個のアミノ
酸ポリペプチドの最初の21個のアミノ酸を決めるコドン
を持つもの）が、25〜191位のアミノ酸用のコードを持
つcDNA誘導二本鎖に結合されて、変性pBR322プラスミド
のラック・プロモーター／レギュレーター配列が制御す
る遺伝子座に挿入されている〔Goedell等、Nature, 28
1, pp. 544-548 (1981)〕。 【００２０】比較的に『短い』生物学的に機能するポリ
ペプチド、例えば、ヒト・ソマトスタチン（14個のアミ
ノ酸）およびヒト・インシュリン（21個のアミノ酸およ
び30個のアミノ酸の二つのポリペプチド鎖）用のコード
を持つ遺伝子の製造には、完全な合成手順が使用されて
いる。 【００２１】ソマトスタチン遺伝子調製手順〔Itakura
等、Science, 198, pp. 1056-1063(1977）〕では、52個
の塩基対遺伝子が調製され、この遺伝子において、42個
の塩基対が、必要な14個のアミノ酸を定めるコドンであ
り、そして、10個の塩基対が追加されて、構造遺伝子を
微生物形質転換ベクターに結合するために用いられる
『付着末端』一本鎖末端領域の形成を可能としている。
特に、この遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ酵素遺伝子
の末端近くに挿入され、その結果生じる融合遺伝子は融
合タンパク質として発現され、このタンパク質から臭化
シアン切断によってソマトスタチンが分離される。 ヒ
ト・インシュリン遺伝子の製造は、先に述べたように、
21個のアミノ酸鎖と30個のアミノ酸鎖のコードを持つ遺
伝子の調製を伴っている。 18個のデオキシオリゴヌク
レオチド断片を結合して、長い方の鎖のための遺伝子が
調製され、そして、11個の断片を結合して短い方の鎖の
遺伝子が調製された。 各遺伝子は、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子と共に融合遺伝子を形成するために使用さ
れ、個々に発現したポリペプチド鎖は、酵素的に分離さ
れ、結合されて完全なインシュリン分子を形成した〔Go
edell等, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 76, pp. 106
-110(1979）〕。 【００２２】上記した各方法において、デオキシオリゴ
ヌクレオチド断片が調製され、そして、下記の一般的な
方法に従って順次結合された。〔例えば, Agarwal等、N
ature, 227, pp. 1-7 (1970)および Khorana, Science,
203, pp. 614-675(1979)を参照のこと。〕 最初の
『頭』（すなわち、5'→3'極性）デオキシオリゴヌクレ
オチド断片は、酵素的に第２の『頭』断片に結合され
た。 これら２つの『頭』鎖の整列は、第１頭鎖の半分
と第２頭鎖の半分とに相補性を持つ塩基配列を持つ
『尾』（すなわち、3'→5'極性）鎖を使用することで可
能になった。 結合した後に、頭鎖の補体が結合してい
ない塩基は、形成された二重部分から『突き出す』。 【００２３】第２の底鎖が加えられるが、この鎖は、突
き出した頭鎖の５乃至６個の塩基補体を含み、さらに追
加の５乃至６個の塩基が加わるが、これは尾一本鎖部分
として突き出て、そして、２つの尾鎖は接合される。
このような逐次的な付加は、完全な遺伝子配列が形成さ
れるまで続けられ、いずれの方法も、非常に時間を要
し、かつ非常に不能率である。 【００２４】全遺伝子合成に関する前記方法が、時間を
要するという特徴は、先に言及した２つの『短い』イン
シュリン遺伝子の構築を行うのに、少なくとも４人の研
究者による、３カ月に及ぶ作業が必要であったという報
告に良く例示されている。 【００２５】さらに、ベクターの挿入に成功するために
は、比較的に少量の製造された遺伝子が必要なだけであ
るが、上記した合成方法は総収量が非常に低く（１結合
当たり20％のオーダー）、処方に細心の注意を払って作
業を行っても、選択された短い遺伝子のごく少量の分離
さえも保証されるものではない。 合成可能な最大長の
遺伝子において、個々の短い断片を接合する効率には明
らかに限度がある。そのような結合反応が、ｎほど必要
であり、前記した各反応の収率がｙであるとすると、正
しく合成された遺伝物質の量はｙnに比例して得られ
る。 この関係は、指数関数的であるので、１結合反応
当たりの収率の僅かな増加でも、合成できる最大遺伝子
の長さは大幅に増加することになる。 この方法の不能
率さは、主に、望ましくない中間生成物の形成によるも
のである。 一例を挙げると、尾の『鋳型』鎖を伴う、
アニールされた頭鎖を形成する最初の反応における望ま
しい反応は、下記表１のように進行するが； 【００２６】 【表１】 【００２７】実際に得られる生成物は、下記表２に示し
たようなものである。 【００２８】 【表２】 【００２９】さらに、個々のデオキシオリゴヌクレオチ
ドが長くなればなるほど、それらが熱力学的に安定した
自己会合、例えば、『ヘアピン』あるいは集団を形成す
る可能性が高まる。 【００３０】合成効率を高めるための提案は、これまで
ほとんど出されておらず、最近、『現在得られる方法で
は、約30ユニットを超える長さのアミノ酸よりも長いペ
プチドを合成することは経済的に不可能であり、多くの
臨床的に重要なタンパク質はもっと長いものである』と
報告されている〔Aharonowitz等、Scientific America
n, 245, No. 3, pp. 140-152, p.151 (1981)〕。 【００３１】大きな遺伝子の合成に関する『経済的実行
可能性』の例が、ヒト白血球インターフェロンの全合成
の努力の『成功』の最近の発表にみることができる〔Ed
ge等, Nature, 292, pp. 756-782 (1981)〕。 すなわ
ち、約15個の塩基を含む67個の異なるデオキシオリゴヌ
クレオチドが、『50％重複』方法によって合成、接合さ
れて11個の短い二本鎖を形成した。 次に、これらは、
４つのさらに長い二本鎖に構築され、前記した二本鎖は
最後に接合されて、 166個のアミノ酸タンパク質のコー
ドを持つ 514個の塩基対遺伝子をもたらした。 この方
法は、著者等が『迅速』と特徴付けたものであるが、５
人の研究者の約１カ年に及ぶ努力を要したものと確実に
推定され、構築計画の効率は明らかに非常に低い。 一
例として、出発点となった67個のデオキシオリゴヌクレ
オチドは、それぞれ 40pmoleが用意され、11個の中間サ
イズの二本鎖を形成するのために使用されたが、４つの
大きな二本鎖の構築が終わった頃には、全遺伝子を最終
的に構築するために使用可能な、長い二本鎖の収量は僅
かに約0.01pmoleだけであったことを指摘することがで
きよう。 【００３２】産業上および製薬用途に重要なタンパク質
の微生物による発現のための組換えＤＮＡ技術の実施の
ための他の態様は、『コドンの優先性』の現象である。
遺伝的に形質転換された宿主細胞内の遺伝子の発現の
ための、現存する機構が『作用して』所望の生成物を調
製することは既に述べたが、微生物内で行われる発現の
レベルは、大きな変動を示す可能性があり、部分的に
は、挿入された外来性遺伝子内に存在するアミノ酸を特
定する遺伝コードが特定のコードに変化する。 【００３３】４つの可能なヌクレオチド塩基の『三塩
基』コドンは、64個の異なる態様を採る。 これらの態
様が、わずか20個の異なるアミノ酸（さらに、転写の開
始および終了）のメッセージをもたらすということは、
アミノ酸によっては、２つ以上のコドンによってコード
を決めることができることを意味する。実際のところ、
アミノ酸によっては６つもの『冗長な』代替コドンを持
つものもあり、唯一のコドンしか持たないものもある。
いまだ完全には理解されていない理由によって、代替
コドンは異なる種類の細胞の内在性ＤＮＡ内に均一に存
在しておらず、ある種の細胞内のあるコドンには、異な
る自然の序列、すなわち、『優先性』が存在すると思わ
れる。 【００３４】一例として、アミノ酸ロイシンは、CTA、C
TC、CTG、CTT、TTAおよびTTG（それぞれ、mRNAコドン、
CUA、CUC、CUG、CUU、UUAおよびUUGに対応する）の６つ
のＤＮＡコドンの何れによっても特定される。 微生物
のゲノム・コドン頻度の徹底的な解析によって、大腸菌
の内在性ＤＮＡは、 CTGのロイシンを特定するコドンを
最も普通に含むことが判明し、酵母および変形菌類のＤ
ＮＡは、TTAのロイシンを特定するコドンを最も普通に
含むことが判明した。 この序列に鑑みて、大腸菌宿主
によって、ロイシンに富んだポリペプチドの高レベルで
の発現を得る可能性は、ある程度までコドンの使用の頻
度によって決まると一般に考えられている。 例えば、
TTAコドンの豊富な遺伝子は、まず間違いなく大腸菌に
おいては発現が少ないが、CTG の豊富な遺伝子は、ポリ
ペプチドをおそらく多く発現するであろう。 同様に、
酵母細胞が、ロイシンの豊富なポリペプチドの発現のた
めの形質転換宿主細胞である場合は、挿入されたＤＮＡ
で使用するのが望ましいコドンは、 TTAであろう。 例
えば、Grantham等、Nucleic Acids Research, ８,pp. r
49-r62 (1980)；Grantham等, Nucleic Acids Research,
８, pp. 1893-1912 (1980)；及び Grantham等, Nuclei
c Acids Research, ９, pp. r43-r74 (1981)を参照。 【００３５】組換えＤＮＡ方法におけるコドンの優先性
現象が意味するものは明白であり、そして、この現象は
首尾よく形質転換された宿主生物において、外来性遺伝
子での高い発現の実現に失敗した過去の多くの例を説明
するのに役立つ可能性がある。 すなわち、『優先性』
の低いコドンが、挿入された遺伝子に繰り返し存在し
て、発現のための宿主細胞の機構が効率的に機能しない
ではないかと考えられる。 この現象は、優先するコド
ンを宿主細胞に含むように設計され、その設計通りに製
造された遺伝子が、組換えＤＮＡ方法を実施するため
の、外来性遺伝物質の好ましい形態をもたらす。 この
ような関係において、コドンの選択を可能とする迅速、
かつ能率的な全遺伝子製造方法が存在しないことは、こ
の技術における進歩における深刻な障害を残していると
考えられる。 【００３６】本発明の背景に大きく関連するものは、生
物学的活性を呈する物質、インターフェロン(IFN）の調
製および使用に関する技術である。 インターフェロン
は、分泌されるタンパク質であり、詳細に研究された抗
ウィルス活性、抗腫瘍活性、および免疫調節機能を有す
る。 例えば、Gray等、Nature、 295, pp. 503-508(19
82)、ならびに前出のEdge等の文献、およびそこに記さ
れた文献を参照のこと。 【００３７】抗原性および生物学的ならびに化学的性質
に基づいて、ヒト・インターフェロンは、大きく３つ
に、すなわち、IFN-α（白血球）、IFN-β（繊維芽細
胞）、およびIFN-γ（免疫) に分類されている。 ウィ
ルス誘導した酸安定性インターフェロン（IFN-αおよび
IFN-β）の構造および性質に関する、情報の蓄積はかな
り進んでいる。 これら情報は、均質になるまで整理さ
れ、少なくとも部分的には、アミノ酸配列の確認が行わ
れている。 IFN-β1およびIFN-α多遺伝子科のクロー
ニングされたcDNAおよび遺伝子配列の解析によって、多
くのインターフェロンの完全なアミノ酸配列を推定する
ことが可能となった。 さらに、大腸菌におけるIFN-β
1およびいくつかのIFN-α、そして酵母におけるIFN-α1
の効率の高い合成が、これらタンパク質を大量に、生物
学的活性を伴う状態で精製することを可能にした。 【００３８】種々の分裂促進刺激を受けたリンパ球培養
において一般に生成されるインターフェロンである、IF
N-γの構造および性質に関する情報はさらに少ない。
IFN-γは酸に対して不安定で、IFN-αあるいはIFN-βに
対して調製された抗血清とは交差反応しない。 IFN-γ
は広範な生物学的作用を有するものと考えられ、これ
は、IFN-αおよびIFN-βの抗ウィルス作用も向上するも
のであり、IFN-γは、ウィルスおよび細胞の特異性、お
よび誘導される抗ウィルス性機序の点でIFN-αおよびIF
N-βとは異なっている。 粗調製の試料を用いたin vit
ro研究の結果は、IFN-γの主な機能が、免疫調節因子と
しての機能であることを示唆している。 【００３９】形質転換した細胞に対するIFN-γの抗増殖
効果は、IFN-αあるいはIFN-βの10倍から 100倍である
と報告されており、腫瘍の治療用途に使用できる可能性
を示唆している。 ネズミIFN-γ製剤は、マウス肉腫に
対して優れた抗腫瘍作用を持つことが示されている。 【００４０】ヒトIFN-γをコードするcDNA配列を含んだ
組換えプラスミドが分離され、その特性が確認された旨
が、最近報告されている（前出の、Gray等の文献）。
大腸菌および培養したサルの細胞内でのこの配列の発現
が、真正のヒトIFN-γの性質を有するポリペプチドを生
成したことが報告されている。 この発表によれば、cD
NA配列および『成熟』ポリペプチドの推定した 146個の
アミノ酸を含む、推定されるリーダー配列を除いたアミ
ノ酸配列は、下記表３に示した通りである。 【００４１】 【表３】【００４２】先に発表された配列では、グルタミンでは
なくアルギニンが、第140位にあった。 （従って、特
に言及しない限り、『ヒト免疫インターフェロン』ある
いは単に『IFN-γ』と称する場合、〔Arg140〕および
〔Gln140〕の両形態を包含するものとする。） 上述したインターフェロンの広範な生物学的作用に基づ
き、インターフェロンの合成ポリペプチド類似体を調製
することは、このクラスの化合物の治療用途での利用可
能性を具体化する上で、非常に大きな意義がある。 組
換えＤＮＡ法によって、今日まで大量のインターフェロ
ンの分離が行われたにもかかわらず、この分野の専門家
はインターフェロンの合成ポリペプチド類似体の調製に
おいて、具体的な成果を収めていない。 【００４３】換言すれば、前出のGray等の文献に開示さ
れた、IFN-γをコードする遺伝子の分離の研究、ならび
に前出のEdge等の文献に開示された、完全に製造された
IFN-α1遺伝子を取得するための多大な努力は、非常に
精密に決定された、単一のポリペプチド配列の発現のた
めの遺伝物質のみをもたらした。 『真正の』ポリペプ
チドと、１つ以上のアミノ酸の種類あるいは位置が異な
るヒトIFN-γ類似体の微生物による大量の発現を可能に
する方法（特定の部位の突然変異生成の手段は別とし
て）は全く存在しない。 同様に、前出のEdge等の文献
にて調製されたポリペプチドと、アミノ酸が１つ異なる
IFN-α1類似体の調製では、１つの３塩基コドンが異な
る全く新しい遺伝子を調製するのために、さらに１年の
時間が必要になると思われる。 対象遺伝子の断片を切
出して、変種のポリペプチド配列のコード情報を含む断
片で置換するための手段は存在しない。 さらに、報告
されたcDNAから誘導され、製造されたＤＮＡ配列を改変
してコドンを変更することは、選択可能な『オプショ
ン』ではない。 【００４４】実際、組換えＤＮＡ法による変種インター
フェロン・ポリペプチド類の調製の報告は、IFN-α1お
よびIFN-α1のためのヒト遺伝子の『ハイブリッド』調
製および発現に関連するもののみに散見される〔Weck
等, Nucleic Acids Research, ９, pp. 6153-6168 (198
1)および Streuli等, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,
78, pp.2848-2852 (1981）〕。 得られたハイブリッド
は、８つのヒト（cDNA誘導）遺伝子の２つが、偶然に配
列中に１度だけ含まれていることを知見して調製した遺
伝子断片の４つの可能な組合せから構成されており、塩
基配列は、細菌性エンドヌクレアーゼの制限エンドヌク
レアーゼ切断部位PvuIIおよびBglIIに対応する。 【００４５】従って、当該技術分野において、ヌクレオ
チド塩基からインターフェロン等の大きなポリペプチド
をコードする製造されたＤＮＡ配列の、完全な合成のた
めに、さらに効率の良い方法が待望されている。 さら
に、自然に生じる形態のものから選択された１つ以上の
アミノ酸の種類および／または位置が異なる合成ポリペ
プチドの微生物的発現を可能とするような、変異形態の
合成配列の迅速な作成のための合成方法が必要である。 【００４６】 【問題点を解決するための手段】本発明は、長さが約20
0ヌクレオチド塩基対を超える直線状二本鎖ＤＮＡ配列
の完全な合成のための、新規で、迅速で、かつ効率の良
い方法を提供するものであり、前記配列は所望のポリペ
プチドの広範な変異体の合成を司る構造遺伝子のみで構
成されている場合がある。 【００４７】本発明によると、事前に決定された長さが
約200塩基対を超えるアミノ酸の連続配列の発現を、こ
の配列を含む選択されたＤＮＡベクターによって形質転
換された選択された宿主微生物中で実施するためのコー
ドを含む直線状二本鎖ＤＮＡ配列は、下記工程、すなわ
ち； (a) 長さが約100塩基対以上の２つ以上の異なるサブユ
ニット直線状二本鎖ＤＮＡ配列を、選択されたアッセン
ブリー・ベクター内部で構築するための調製工程であっ
て、調製された各々の異なるサブユニットＤＮＡ配列
が、発現対象たる前記アミノ酸配列の異なる連続部分を
コードする一連のヌクレオチド塩基コドンを含み、前記
サブユニットの第１サブユニットの１つの末端領域は、
塩基配列の一部分を含み、この塩基配列は、第１制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断における認識部位をもたら
し、この認識部位は、前記アッセンブリー・ベクターに
サブユニットが挿入された後に、このベクター中に多く
とも１箇所存在するものであり、前記サブユニットの第
２サブユニットの１つの末端領域は、塩基配列の一部分
を含み、この塩基配列は、第２制限エンドヌクレアーゼ
による切断の認識部位をもたらし、この認識部位は、前
記アッセンブリー・ベクターにサブユニットが挿入され
た後に、このベクター中に多くとも１箇所存在するもの
であり、サブユニットの残りの末端領域の少なくとも半
分は、前記第１および第２エンドヌクレアーゼ以外の制
限エンドヌクレアーゼによる切断における認識部位部分
（好ましくは、パリンドロームの６塩基対認識部位）を
含み、この認識部位は、前記アッセンブリー・ベクター
にすべてのサブユニットが挿入された後に、このベクタ
ー中に１箇所のみ存在する、ことを特徴とするものであ
り、および(b) 工程(a) で調製された各サブユニットＤ
ＮＡ配列を、順次、選択されたアッセンブリー・ベクタ
ーに挿入し、次いで、アッセンブリー・ベクター配列の
生物学的増幅を行う工程であって、この工程が、事前に
定められた連続アミノ酸配列をコードする所望のＤＮＡ
配列を含むＤＮＡベクターを形成し、そして、構築され
る所望のＤＮＡ配列が、その中間位置に、制限エンドヌ
クレアーゼによる切断のための少なくとも１つの独特
の、好ましくは、パリンドロームの６塩基の認識部位を
含むようにするものである、工程を含む方法によって合
成される。 【００４８】上記した方法は、好ましくは、さらに所望
のＤＮＡ配列をアッセンブリー・ベクターから分離する
工程を含み、また、好ましくは、新たに１つの新規に製
造されたＤＮＡ配列のクラスをもたらすものであり、こ
の新規の配列はその中間位置に制限エンドヌクレアーゼ
による切断のための、少なくとも１つの独特のパリンド
ロームの６塩基認識部位を有する。 このようにして分
離された配列は、次に、他の『発現』ベクターに挿入さ
れ、アッセンブリー・ベクターが増幅されたものと同
じ、あるいは異なる微生物によって、所望のポリペプチ
ドが直接的に発現される。 この方法に関するその他の
望ましい実施例においては、少なくとも３つの異なるサ
ブユニットＤＮＡの発現が、工程(a)にて行われ、順
次、前記アッセンブリー・ベクターへ、工程(b)によっ
て挿入され、そして、得られた所望の製造されたＤＮＡ
配列は、その中間位置に制限エンドヌクレアーゼによる
切断のための少なくとも２つの独特のパリンドロームの
６塩基認識部位を含む。 この合成されたＤＮＡ配列
は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする前
記構造遺伝子を含み、そして、製造されたＤＮＡ配列で
のヌクレオチド塩基の配列は、前記した選択された宿主
微生物におけるコドンの優先的発現特性に基づいて、同
じアミノ酸を特定する代替コドンの中から選択された１
つ以上のコドンを含む。 【００４９】本発明による新規生成物は、長さが約200
塩基対を超える製造された直線状二本鎖ＤＮＡ配列であ
って、この配列を含む選択されたＤＮＡベクターによっ
て形質転換された選択された宿主微生物での、事前に定
められた連続アミノ酸配列の発現をコードするものであ
って、その中間位置に制限エンドヌクレアーゼによる切
断のための少なくとも１つの独特のパリンドロームの６
塩基認識部位を持つことを特徴とするものが含まれる。
前記した製造された配列の、生物での発現によるポリ
ペプチド生成物も、この新規生成物に含まれる。 【００５０】その例として、本発明により、ヒト免疫イ
ンターフェロン（IFN-γ）、およびヒト免疫インターフ
ェロンとは１つ以上のアミノ酸の種類および／または位
置が異なる新規の生物学的機能を備えた類似体ポリペプ
チドを合成するようコードする新規の遺伝子が製造され
る。 Ｆサブタイプ（『LeIFN-Ｆ』あるいは『IFN-α
Ｆ』）のヒト白血球インターフェロンおよびその類似
体、および協働ヒト白血球インターフェロンの合成をコ
ードする遺伝子も製造される。 【００５１】本発明の方法の実施にて使用するＤＮＡサ
ブユニット配列は、好ましくは、ヌクレオチド塩基か
ら、共同出願であり、本願出願と同時に出願された、Yi
tzhakStabinskyによる、『構造遺伝子の製造および発
現』なる発明の名称の、米国特許出願第 375,493号〔特
表昭59−501096号〕に開示された方法に従って合成され
る。 すなわち、その方法とは、以下の工程、すなわ
ち、(1) ２つ以上の異なる直線状の二本鎖ＤＮＡ鎖を調
製する工程であって、各二本鎖は、12個以上の選択され
た相補性塩基対の二本鎖領域を含み、さらに、この鎖の
一端に３〜７つの選択された塩基の頭一本鎖末端配列お
よび／またはこの鎖の他端に３〜７つの選択された塩基
の尾一本鎖末端配列を含み、各二本鎖ＤＮＡ鎖の各一本
鎖末端配列にて調製されたその他の二本鎖ＤＮＡ鎖の何
れかの、多くて１つの一本鎖末端配列の線塩基相補体を
含むものであり、および(2) 少なくとも27個の選択され
た塩基対の二本鎖領域であって、この塩基対は工程(1)
で調製された二本鎖ＤＮＡ鎖の一本鎖末端配列の相補性
会合によって形成された少なくとも３つの塩基対を含
み、さらに、前記二本鎖ＤＮＡ配列は３〜７つの塩基の
一本鎖頭、あるいは０〜２つの塩基の尾末端領域を有す
る、１つの連続した二本鎖ＤＮＡ配列を形成するため
に、工程(1)で調製された各二本鎖ＤＮＡ鎖を、工程(1)
で調製された相補性一本鎖末端配列を有する１つあるい
は２つの異なる二本鎖にアニーリングする工程、を含む
ことを特徴とするものである。 【００５２】サブユニットの製造のための、この好まし
いプロセスでは、少なくとも３つの異なる二本鎖ＤＮＡ
鎖が工程(1)で調製され、そして、調製された鎖は全て
１つのアニーリング反応混合物中で同時にアニールされ
て単一の連続二本鎖ＤＮＡ配列を形成し、また、この配
列は、少なくとも42個の選択された塩基対の二本鎖領域
を有するものであって、前記した選択された塩基対は、
工程(1)で調製された二本鎖の一本鎖末端配列の相補性
会合により形成された３つ以上の塩基対の少なくとも２
つの近接しない組み合わせを含む。 【００５３】好ましいサブユニット製造方法での、二本
鎖ＤＮＡ鎖の調製工程(1)は、好ましくは、下記の工
程、すなわち、(a) 選択された直線状配列内に、15個以
上の塩基を有する第１および第２の直線状デオキシオリ
ゴヌクレオチド断片を調製する工程であって、前記第２
断片の塩基の直線状配列は、前記第１断片の塩基の配列
の全相補体を含むものであるが、前記第２断片の少なく
とも一端は、前記第１断片を完全に相補する塩基に続い
て３〜７つの選択された塩基の直線状配列を含むか、あ
るいは前記第１断片の末端配列に相補的な３〜７つの塩
基の直線状の配列を欠くものであるが、前記第２断片
は、追加の塩基配列を持つこと、およびその両端に塩基
配列を欠いていないことを特徴とする；および(b) 前記
第１および第２断片を、断片間の相補的会合を促進する
ような条件下にて、組み合わせて１つの直線状二本鎖Ｄ
ＮＡ鎖を形成する、工程を含むものである。 【００５４】形成された二本鎖ＤＮＡサブユニット配列
内の塩基配列は、好ましくは、宿主微生物、例えば、酵
母細胞あるいは細菌、特に、大腸菌内でのコドンの優先
的発現特性に基づいて、同じアミノ酸を特定する代替コ
ドンから選択された１つ以上の三塩基コドンを含む。 【００５５】本発明によって、大腸菌宿主細胞内での選
択された外来性遺伝子の発現のレベルを上昇するための
方法および材料の改善がもたらされる。 具体的には、
発現ベクターは、ポリペプチド・コーディング領域の上
流に、選択されたＤＮＡ配列を含むように構成されるも
のであって、この選択された配列は、顕著に発現された
内在性ポリペプチドに伴うゲノムの大腸菌ＤＮＡに存在
するリボソーム結合部位の複製とする。 目下のとこ
ろ、好ましい選択された配列としては、アウターメンブ
レイン タンパクＦ（『OMP-Ｆ』）の、大腸菌での発現
に伴う、リボソーム結合部位配列の複製がある。 【００５６】本発明のその他の特徴および利点は、以下
の本発明の詳細な説明を考察すれば明らかになろう。 【００５７】本明細書にて使用される、ＤＮＡ配列ある
いは遺伝子に使われる『製造された』の用語は、ヌクレ
オチド塩基の構築により完全に化学的に合成される生成
物か、あるいはそのように化学的に合成された生成物の
生物学的反復複製から得られる生成物を意味する。 よ
って、この用語は生物学的起原の出発材料を用いるcDNA
方法、あるいはゲノムのクローニング法によって『合
成』された生成物を除外する。 以下の表４は、本明細
書にてアミノ酸を表示するために用いるIUPACの一文字
表記を含む略称を示すものである。 【００５８】 【表４】【００５９】一方、下記の表５に示した略称を、ヌクレ
オチド塩基に適用した。 【００６０】 【表５】 【００６１】本発明の理解の一助のために、下記の表６
および表７に、ＤＮＡの64個の三塩基ヌクレオチド塩基
コドンと、20個のアミノ酸との相関関係、ならびに、そ
れで特定される転写終了（『Stop』）を示す。 表中の
ＴをＵに置き換えることで、ＲＮＡの対応する相関が決
定される。 【００６２】 【表６】【００６３】 【表７】【００６４】二本鎖ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切
断における『パリンドローム』の認識部位は、頭と尾の
塩基相補体との間において、左から右ならびに右から左
への対称性を示すもの、すなわち、5'から3'末端までの
認識部位の相補性塩基配列の『読み』が同一であるもの
である。 制限エンドヌクレアーゼによる切断のための
パリンドロームの６塩基認識部位の例としては、頭およ
び尾鎖の5'から3'がAAGCTTであるHindIII による切断部
位がある。 非パリンドロームの６塩基制限部位の例と
しては、頭鎖がCAGCAGの反復配列を示す、EcoP15による
切断部位がある。 【００６５】尾鎖塩基相補体の5'から3'は、CTGCTGであ
る。 つまり、奇数（例えば、５、７）個の塩基からな
る制限部位は、非パリンドロームになる。 エンドヌク
レアーゼによっては、ある部位の変形部位を切断するも
のもあり、この場合の部位は、パリンドロームの場合
と、パリンドロームでない場合がある。 例を挙げれ
ば、XhoIIは、パリンドロームの配列AGATCTおよび非パ
リンドロームの配列GGATCTを含む、（プリン)-GATC-(ピ
リミジン）を認識する。 前述の『BRL制限エンドヌク
レアーゼの一覧表』を参照すれば、エンドヌクレアーゼ
を認識する６塩基配列のパリンドローム的部位は、以下
の表８に示した部位に限られる。 【００６６】 【表８】【００６７】非パリンドロームの６塩基配列のみを認識
するエンドヌクレアーゼは、Tth111II、EcoP15、AvaI、
およびAvrIに限られる。 パリンドロームと非パリンド
ロームの６塩基配列の両方を認識するエンドヌクレアー
ゼを、以下の表９に示した。 【００６８】 【表９】 【００６９】生成しようとする所望のポリペプチドの構
造が決まれば、本発明の実施においては、以下の操作を
必要とする。 長さが100塩基対以上の、２つ以上の適
切な構成の末端部分を有する、異なる特定の連続二本鎖
ＤＮＡサブユニット配列を調製する。 選択された宿主
生物にて、ハイブリッド・ベクターの中間増幅を行いな
がら、選択されたアッセンブリー・ベクターに、サブユ
ニットを順次挿入し、アッセンブリー・ベクター（ある
いは、サブユニットから製造されたＤＮＡ配列を含む他
の選択された『発現』ベクター）を用いて、適切な選択
された宿主を形質転換すること。 そして、宿主生物に
て発現されたポリペプチド発現物を分離する。 その最
も効率の良い態様では、本発明の実施によると、製造さ
れた配列の構築とポリペプチドの大量発現では、同じベ
クターを用いる。 同様に、発現のために利用する宿主
微生物は、通常、サブユニット構築方法で実施される増
幅において用いられるものと同じものを用いる。 【００７０】製造されたＤＮＡ配列は、発現の自律的な
制御のためのプロモーター／レギュレーター領域を備え
ること、あるいは、ベクター内に存在するプロモーター
／レギュレーター配列による発現の制御が可能となるよ
うな方法で、ベクターに取り込むことができる。 本発
明の製造されたＤＮＡ配列は、プラスミド内に存在する
遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）に適切に取り
込まれて製造されたＤＮＡ配列によってコードされ、所
望のアッセンブリー配列を含む、融合ポリペプチド生成
物をコードする融合遺伝子を形成できる。 【００７１】本発明の好ましい実施態様では、製造され
たポリペプチドの大きさは、約65あるいは75個のアミノ
酸から、約200以上のアミノ酸の範囲である。 選択さ
れた形質転換された宿主生物による、所望のポリペプチ
ドの高レベルの発現は、宿主によって優先的に発現され
る１つ以上の代替コドンを含む、ＤＮＡ配列の製造によ
って促進される。 【００７２】長さが100から200塩基対の二本鎖サブユニ
ットＤＮＡ配列の製造は、先に言及した先行技術のアッ
センブリー方法に従って進めることもできるが、好まし
くは、前出のStabinskyによる米国特許出願第 375,493
号に開示され、かつ以下の実施例にて使用された、迅速
で、能率的な方法によって行われる。 すなわち、これ
らの方法は、２つ以上の異なる直線状二本鎖ＤＮＡ鎖
を、デオキシオリゴヌクレオチドから構築するものであ
って、前記ＤＮＡ鎖は、それぞれ比較的に長い二本鎖領
域を、二本鎖の一端あるいは両端の比較的に短い一本鎖
領域と共に含むことを特徴とする。 この二本鎖領域
は、所望のポリペプチドのアミノ酸配列の開始部分、末
端部分、あるいは中間部分の構築を指定するのに必要な
コドンを含む。 【００７３】可能であれば、宿主（例えば、大腸菌）に
よって優先的に発現される、代替コドンが使用される。 【００７４】最終的に構築されるサブユニットＤＮＡ配
列において占める相対的位置によって異なるが、二本鎖
中の一本鎖領域は、他の二本鎖の塩基によって相補され
ると、所望のポリペプチド配列内のアミノ酸を指定する
コドンをもたらす塩基配列を含む。 【００７５】次に、この方法に従って形成された二本鎖
は、相補的な短い一本鎖領域を有する１つあるいは２つ
の異なる二本鎖に酵素的にアニールされて、所望のポリ
ペプチド断片をコードする所望の連続二本鎖サブユニッ
トＤＮＡ配列を形成する。 【００７６】全配列の構築に係る効率ならびに迅速さ
は、前記方法では、３つ以上の二本鎖のためのアニーリ
ング反応を実施することによって改善されるが、前記し
た二本鎖の短い一本鎖領域は、その他の二本鎖の多くと
も１つの他の一本鎖領域の塩基の相補体となる。 その
他の二本鎖の一本鎖領域の１つだけを特異的に相補する
短い一本鎖領域を形成したすべての二本鎖を用意するこ
とは、遺伝コードの冗長性の範囲内で、そして、好まし
くは、宿主生物のコドンの優先性を考慮して、代替コド
ンを選択することによって実現できる。 【００７７】仮想のポリペプチドをコードする仮想の長
いＤＮＡ配列の製造に関する以下の説明は、本発明の実
施において、特に、サブユニットＤＮＡ配列の適切な末
端配列の形成に関する説明において有用である。 【００７８】所望の生物学的活性を有するポリペプチド
を分離し、そのアミノ酸を順番に並べて、連続する100
のアミノ酸残基の配列の構成を明らかにする。 ポリペ
プチドの微生物学的発現のための遺伝子の形成は、選択
された宿主生物の形質転換のために使用される、選択さ
れたウィルスあるいは環状プラスミドＤＮＡベクターへ
挿入するための、少なくとも300塩基対の構築を必要と
する。 【００７９】製造された遺伝子を構成する前に、宿主が
予め決まっておれば、宿主種のコドンの優先性を考慮し
てコドンを選択できるので、微生物宿主の種類を考慮す
る必要がある。 本明細書では、大腸菌宿主を選択する
ものと仮定する。 【００８０】製造された遺伝子の構成において考慮すべ
き第２の点は、アッセンブリー・プロセスで用いられる
ＤＮＡベクターの種類である。 適切なベクターの選択
は、制限エンドヌクレアーゼ酵素によるベクターの切断
部位に関する、現在の知識に基づく。 具体的には、ア
ッセンブリー・ベクターは、サブユニットの容易な挿入
を許容するエンドヌクレアーゼ切断部位をもたらすＤＮ
Ａ配列の存在に基づいて選択される。 この点に関し
て、選択されたアッセンブリー・ベクターは、好ましく
は、少なくとも２つの制限部位を有しており、この制限
部位は、サブユニット挿入プロセスの実施以前には、ベ
クター内で１度しか（すなわち、『固有』である）起き
ない。 【００８１】この説明において、EcoRI 制限部位とは、
以下の部位、すなわち、 【００８２】 【化１】 【００８３】また、Pvu II制限部位とは、以下の部位、
すなわち、 【００８４】 【化２】 【００８５】を有する環状ＤＮＡプラスミドを仮定す
る。 【００８６】次に、アミノ酸の代替コドンの取得可能性
を考慮するために、所望のポリペプチドのアミノ酸配列
を解析する（好ましくは、大腸菌宿主のコドンの優先性
を考慮する）。 この情報を得てから、２つのサブユニ
ットＤＮＡ配列を設計するが、好ましくは、この配列は
約150 対単位の長さを持つものとし、各配列はそれぞれ
所望のポリペプチドの全アミノ酸配列の約半分をコード
する。 この説明において、製造された２つのサブユニ
ットを、『Ａ』および『Ｂ』と称する。 【００８７】本発明の方法を、前記した２つのサブユニ
ットに適用した場合、以下の操作を必要とする。 すな
わち、サブユニットの１つの、アッセンブリー・ベクタ
ーへの挿入；形成されたハイブリッド・ベクターの増
幅；および、第２のサブユニットを挿入して適切な配列
に構築されたサブユニットを含む第２のハイブリッドを
形成することである。 この方法は、２つのサブユニッ
トを接合し、接合された末端が事前に選択された連続し
た塩基配列をもたらし、事前に選択された連続的なアミ
ノ酸配列をコードすることを要するので、もう一方のサ
ブユニットに接合される製造されたサブユニットの末端
領域を構成する塩基の種類および配列に関する必要事項
を含むものである。 この方法は、サブユニットをアッ
センブリー・ベクターに接合することを要するので、ア
ッセンブリー・ベクターに接合される製造されたサブユ
ニットの末端領域を構成する塩基の種類および配列に関
するその他の必要事項を含むものである。 サブユニッ
トは、同時的ではなく、順次にアッセンブリー・ベクタ
ーに挿入される（かつ、サブユニットを、構築した形態
から選択的に切り出して、その中の製造された塩基配列
に変更を加えることができれば、本発明の方法は最も有
利に実施できる）ので、製造されたサブユニットの末端
領域の塩基の種類に関する必要事項がさらに含まれる。
理解を助けるために、以下の末端領域の性質に関する
考察では、サブユニットＡおよびＢの両端の末端領域
を、それぞれＡ−１とＡ−２、およびＢ−１とＢ−２と
称する。 【００８８】すなわち、以下の表10にあるように表現で
きる。 【００８９】 【表１０】 【００９０】まず、サブユニットＡをpBR3000に挿入
し、そして、末端領域Ａ−１をEcoRI制限部位でベクタ
ーに結合する構築計画を立てる。 最も簡単な場合、末
端領域は、単にEcoRI 『付着末端』、すなわち、４塩基
の一本鎖（-AATT-あるいは-TTAA-）を備え、これがpBR3
000のEcoRI 分解で形成される一本鎖配列を相補する。 【００９１】これによってリガーゼ酵素処理をすること
で、末端領域Ａ−１を、ベクターに結合することができ
る。 末端領域Ａ−１の末端の一本鎖に適切な塩基対、
例えば、下記の塩基対、すなわち、 【００９２】 【化３】 【００９３】が先行していないと、完全な認識部位は、
ベクターへの結合によって再構成されない。 この方法
は、結合によるEcoRI 認識部位の再構成の可能性（すな
わち、サブユニットＡをベクターに挿入した後に残った
EcoRI 認識部位の有無）、設計者の裁量に依存する側面
がある。 他の方法として、サブユニットＡの末端領域
Ａ−１を、仮に『XXX 』と称する他のエンドヌクレアー
ゼのための認識部位をもたらす塩基の完全な組み合わせ
を含むように構成し、そして上述したようにしてEcoRI
認識部位の部分を付加してEcoRI 『リンカー』を備えて
もよい。 構築した配列からサブユニットＡを切り出す
ために、実用に供するためには、『XXX』部位は、挿入
によって形成されたハイブリッド・プラスミド中にもあ
ってはならない。 従って、末端領域Ａ−１の構成にお
ける必要事項は、制限エンドヌクレアーゼによる切断の
ための認識部位をもたらす塩基配列部分（すなわち、全
部あるいは一部）を含むことであり、この認識部位をサ
ブユニットに挿入した後のアッセンブリー・ベクター中
の有無を見極める必要がある。 【００９４】サブユニットＢの末端領域Ｂ−２も、アッ
センブリー・ベクターに（例えば、pBR3000に存在する
PvuII切断のための単一の認識部位において）接合する
必要があると想定すれば、末端領域Ｂ−２の構成は、Ａ
−１の構成と同じであるが、但し、Ｂ−２を構成する際
に参照する第２のエンドヌクレアーゼ酵素は、Ａ−１を
構成する際に参照されるものとは異なっていなければな
らない。 認識部位がもし同じであれば、完全に構築さ
れた配列から、断片ＡおよびＢを別々に切り出すことは
できない。 【００９５】上記した想定から、末端領域Ａ−２は、最
終のpBR3000ハイブリッドにおいて末端領域Ｂ−１に結
合する必要がある。 末端領域Ａ−２あるいは末端領域
Ｂ−１のいずれかは、仮想の第３のエンドヌクレアーゼ
『YYY』による制限エンドヌクレアーゼ切断のための認
識部位の部分（好ましくは、パリンドロームの６塩基）
を含むように構成され、前記認識部位は、すべてのサブ
ユニットを発現ベクターに挿入した後に、発現ベクター
中に唯一、すなわち、サブユニット構築における中間位
置に存在することになる。 このような結果を得るため
の方法は幾つかある。 １つの選択可能な方法では、
『YYY』の全認識部位は末端領域Ａ−２に含まれ、この
領域は、増幅のためにサブユニットＡのアッセンブリー
・ベクターへ挿入され、そして、サブユニットＡのサブ
ユニットＢへの接合を可能にするのに必要なエンドヌク
レアーゼ切断のためのその他の認識部位の１つあるいは
２つを有する。 この場合、末端領域Ｂ−１の末端に
は、末端領域Ａ−２に繋ぐのに必要な塩基があるだけで
ある。 他の代替方法では、全『YYY』認識部位は、末
端領域Ｂ−１に含まれ、Ｂ−１はさらにその末端に、サ
ブユニットＡをサブユニットＢに接合するのに役立つエ
ンドヌクレアーゼ切断の認識部位の部分を有する。 【００９６】他の代替計画として、末端領域Ｂ−１は、
その末端に『YYY 』認識部位を含む。 【００９７】これにより、末端領域Ａ−２は全『YYY』
認識部位を含み、さらにその末端に、サブユニットの増
幅前に、アッセンブリー・ベクターにＡ−２を接合する
のに適切な『リンカー』を含むことになる（例えば、Pv
uII『付着末端』）。 サブユニットＡを含むハイブリ
ッドの増幅後に、ハイブリッドは『YYY』によって切断
され（Ａ−２の末端に『YYY』認識部位の付着末端部分
を露出し）、サブユニットＢを挿入することが可能とな
り、その末端領域Ｂ−１は、末端領域Ａ−２の末端と接
合して全『YYY』認識部位を再構成する。 すべての断
片（Ａ−１およびＢ−２を除く) の末端領域の構成に関
して必要なことは、１つ、あるいは一方または両方（す
なわち、『少なくとも半分』）が、第３のエンドヌクレ
アーゼ切断の認識部位の部分を含むことであり、この認
識部位はすべてのサブユニットが、前記アッセンブリー
・ベクターに挿入された後に、前記ベクターにただ１つ
だけ（すなわち、『固有に』）存在する。 本発明の新
規なＤＮＡ配列に分類される配列を生成するためには、
第３のエンドヌクレアーゼの認識部位は、６塩基のパリ
ンドローム的な認識部位でなければならない。 【００９８】前述したサブユニット『認識部位』は、サ
ブユニット末端からサブユニットに沿ってその中心にま
で延びるとも考えられるが、実際のところ、先に述べた
構成は、通常は最後の10あるいは20個の塩基によってな
される。 同様に、２つのサブユニット・アッセンブリ
ー内のユニークな『中間』認識部位は、製造された配列
の一方の末端へ、他方の末端よりも３倍ほど近似しても
よいが、この認識部位は、通常は配列の中央部近傍に置
かれる。 この説明において、接合する３つのサブユニ
ットの調製を含む合成方法が立てられた場合、製造され
た遺伝子は、中間位置に２つの独特の制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位を含むことになり、その内の少なくとも
１つは、本発明の新規のＤＮＡ配列に分類されるパリン
ドローム的な６塩基認識部位を有する。 【００９９】上記プロセスの優れた利点は明白である。
製造された遺伝子が、その長さの中間位置に１つ以上
の独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むので、
切断部位で接合される２つのサブユニットのコドン配列
の変更は、容易に、かつ製造された遺伝子全部を再合成
せずに行うことができる。 【０１００】 【実施例】ヒト免疫インターフェロン(IFN−γ) および
その類似体、Ｆサブタイプのヒト白血球インターフェロ
ン (INF-αＦ）およびその類似体、およびIFN-αＦとの
類縁関係からIFN-αＦ類似体と称することができる多種
の協働白血球インターフェロンの合成を司る能力のあ
る、製造された遺伝子の形成における本発明の実施例を
以下に示した。 【０１０１】以下の実施例から、本発明の遺伝子製造方
法は、非常に柔軟性のある枠組みの中で200塩基対を超
える長さの遺伝子の、真に迅速で、かつ効率的な合成お
よび発現のための総合的な合成方法をもたらすものであ
り、組換えＤＮＡ法を用いる研究者たちがこれまで実現
し得なかった生成物の、構造上の変異体の発現を可能と
することは明白である。 【０１０２】実施例１ ヒトIFN−γの発現のための合成遺伝子を構築する方法
において、最初に行った選択は、所望のポリペプチドの
発現の微生物宿主として大腸菌を選択したことであっ
た。 従って、コドンの選択方法は、前出のGranthamの
論文にて列挙された大腸菌のコドンに対する優先性を考
慮して行った。 第２の選択は、pBR322を発現ベクター
として、そして、重要なことに、サブユニット発現の増
幅に用いるアッセンブリー・ベクターとして選択したこ
とである。 プラスミドが、単一のBamHI、 HindIII、
およびSalI制限部位を含むことが分かっているので、後
者の要素に関してプラスミドを選択した。 これらの制
限部位とヒト免疫インターフェロン内の公知のアミノ酸
配列を考えながら、３つの『大』サブユニットＤＮＡ配
列（IF-3、IF-2、およびIF-1）、および１つの『小』サ
ブユニットＤＮＡ配列（IF-4）を形成する方法が立案さ
れた。 サブユニットの内容を、下記表11〜14に示し
た。 【０１０３】 【表１１】【０１０４】 【表１２】【０１０５】 【表１３】 【０１０６】 【表１４】【０１０７】『小』配列（IF-4）が、４番から１番の
(5'-TGT TAC TGC CAG)アミノ酸のためのコドンおよび開
始メチオニン〔Met-1〕を含んでいることが分かる。
この構成によると、『小』配列は追加の塩基を含んでお
り、後述するpBR322からの発現ベクター・アッセンブリ
ーに関連する制御因子部分をもたらす。 〔Arg140〕IF
N-γのための製造された遺伝子の合成のために使用する
サブユニットIFN-１の代替態様は、第140番目のアミノ
酸を特定するコドン部位に、 5'-CAG(〔Gln140〕のため
の）の代わりに、コドン5'-CGTを含んでいた。 【０１０８】合成されたポリペプチドの特定部分の全Ｄ
ＮＡの発現のための頭鎖用のコドンの配列は、下記表15
に示した通りであった。 【０１０９】 【表１５】 【０１１０】上記の配列において、制御塩基配列および
開始メチオニンコドンは示されておらず、末端配列ある
いは末端SalI制限部位をもたらす配列も示されていな
い。 【０１１１】縦線が、各サブユニット配列に関する頭鎖
部分を分けている。 【０１１２】次の実施例は、本発明のＤＮＡ配列の製造
において使用するデオキシオリゴヌクレオチドの調製の
ための、好ましい方法を示すものである。 【０１１３】実施例２ オリゴヌクレオチド断片を、４段階方法と、途中での数
回の洗浄によって合成した。 半融ガラス漏斗に入れら
れた重合結合したジメトキシトリチルに保護されたヌク
レオシドは、最初にジクロロメタン中で３％三塩化酢酸
を用いて、 1.5分間、5'−保護基を除去した。 そし
て、ポリマーを、メタノール、テトラヒドロフラン、お
よびアセトニトリルを用いて洗浄した。 洗浄したポリ
マーを、乾燥アセトニトリルで洗浄し、アルゴン中に置
いた。 次いで、以下のような凝縮処理を施した。 ア
セトニトリルに10mgのテトラゾールを溶かした溶液 0.5
mlを、ポリマーを入れた反応容器に加えた。 そして、
アセトニトリルに溶かした30mgの保護されたヌクレオシ
ド 0.5mlが加えられた。 【０１１４】この反応液を撹拌し、２分間、反応させ
た。 反応物質を吸引によって除去し、ポリマーをアセ
トニトリルで洗浄した。 酸化処理に続き、2-6-ルチジ
ン/H2O/THF、1:2:2 に0.1モルのＩ2を含む溶液１mlを、
２分間、ポリマーに結合したオリゴヌクレオチド鎖と反
応させた。 THFで洗浄した後に、ジメチルアミノピリ
ジン(100mlのTHF中に6.5ｇ）および無水酢酸の4:1の溶
液中で、２分間、キャッピングを行った。 その後、メ
タノールによる洗浄、およびTHFによる洗浄が続いた。
そして、CH2Cl2中の三塩化酢酸による処理で再び、一
連の操作（サイクル）を開始した。 このサイクルは、
所望のオリゴヌクレオチド配列が得られるまで繰り返さ
れた。 最終的なオリゴヌクレオチド鎖は、室温で、45
分間、チオフェノール、ジオキサン、トリエチルアミン
の1:2:2 によって処理された。 ジオキサン、メタノー
ル、およびジエチルエーテルで洗浄した後に、オリゴヌ
クレオチドを、ポリマーから水酸化アンモニウムを用い
て、室温にて、切り出した。 【０１１５】溶液をポリマーから除去した後に、濃縮水
酸化アンモニウム溶液中で、栓をした試験管中で、60℃
で、16時間、加熱した。 そして、1-ブタノールを用い
てオリゴヌクレオチド溶液を４度抽出した。 次いで、
溶液を、20％ポリアクリルアミド7M尿素電気泳動ゲルに
充填し、泳動を行った後に、適切なＤＮＡバンドを分離
した。 【０１１６】そして、サブユニットIF−１の構築のため
の方法に従って、デオキシオリゴヌクレオチドからサブ
ユニットを構築した。 【０１１７】所望の14個のＤＮＡ配列を分離した後に、
サブユニットIF−１を、以下の方法で構築した。 １．5'接着末端を含んだ、断片13および断片２を除く、
各ＤＮＡ断片１nmolを5'燐酸化した。 ２．ＤＮＡの相補性鎖、断片13と14、11と12、９と10、
７と８、５と６、３と４、および１と２を組み合わせ、
90℃まで加熱した後に、25℃まで徐冷した。 ３．得られたアニーリングしたＤＮＡ対を、順次組み合
わせ、37℃まで加熱した後に、25℃まで徐冷した。 ４．断片１から断片14までをすべて含む最終の、試験管
内のATPおよびDTTの濃度はそれぞれ、 150μＭおよび18
μＭに調整された。 この溶液に、20単位の T-4DNAリ
ガーゼを加え、反応物質を、４℃で、18時間、インキュ
ベートした。 ５．得られた粗生成物を、90℃までの温度で、２分間、
加熱し、10mMトリエチル重炭酸アンモニウムを溶離剤と
する、セファデックスG50/40上でゲル濾過した。 ６．所望の生成物を、5'燐酸化後に、８％ポリアクリル
アミド-TBEゲルを用いて精製した。 【０１１８】サブユニットIF-2、IF-3、およびIF-4を、
同様な方法で構築した。 【０１１９】次の実施例は、サブユニットIF-1、IF-2、
IF-3、およびIF-4からのヒト免疫インターフェロンの構
築、および、適切な栄養状態下での形質転換した大腸菌
細胞の培養、細胞からのヒト免疫インターフェロンの分
離、および分離されたインターフェロンの生物学的活性
の検定に関する。 【０１２０】実施例３ 完全なヒトIFN-γを特定する遺伝子を、サブユニットIF
-1、IF-2、およびIF-3から構築する方法の主要工程を、
第１図に示した。 【０１２１】136 塩基対サブユニットIF-1を、ゲルから
電気溶出し、エタノールで沈澱させた後に、再び水に0.
05pmole/μl の濃度で懸濁した。 プラスミドpBR322
(2.0 pmole）を、EcoRI およびSalIによって消化し、ホ
スファターゼで処理し、フェノールで抽出し、エタノー
ルで沈澱し、そして、再び水に 0.1pmole/μl で懸濁さ
れた。 結合は、0.1pmoleのプラスミドと 0.2pmole の
サブユニットIF-1とを用いて、T-4 DNA リガーゼによっ
て行われ、そして、ハイブリッド・プラスミドpINT1 が
形成された。 大腸菌が形質転換されてから、多数のpI
NT1 のコピーが分離された。 【０１２２】上記の方法は、153塩基対のサブユニットI
F-2を挿入してpINF2を形成するために繰り返されたが、
プラスミドは、EcoRIおよび BglIIで消化した。 153塩
基対のIF-3サブユニットは、pINT3 の製造の際に同様に
pINT2 に挿入されたが、プラスミドの消化にはEcoRI お
よびHindIII を使用した。 【０１２３】IF-4サブユニットは、最終の発現ベクター
の構成の際に下記のように使用した。 【０１２４】まず、プラスミドPVvIは、カリフォルニア
州、パロ・アルトのスタンフォード大学から購入し、Pv
uIIで消化した。 標準的な方法を用いて、EcoRI認識部
位をプラスミドのPvuII部位に挿入した。 このハイブ
リッドのコピーは、 EcoRIおよびHpaIによって消化さ
れ、trpプロモーター／オペレーター領域部分を含む245
塩基対の配列をもたらした。 標準的な方法を用いて、
免疫インターフェロンの最初の４つのアミノ酸（Cys-Ty
r-Cys-Gln)用のコドンをもたらす全trp翻訳開始シグナ
ルおよび残りの37塩基対を取り込むために、IF-4が、Hp
aI部位に付加された。 得られた構築体を、 EcoRIおよ
びBamHI によって消化し、pINT3に挿入することで、pIN
Tγ-TRPI7と称するプラスミドが生成した。 pINTγ-TR
PI7を含む大腸菌細胞は、吸光度（λ＝600nm)が１のト
リプトファンの存在状態で、Ｋ培地で培養された。 イ
ンドールアクリルIII が20μg/mlの濃度で加えられ、細
胞をさらに２時間、37℃で、培養した。 細胞を、遠心
分離によって収穫し、細胞ペレットを、HEPES緩衝ウシ
新生児血清（pH8.0)中に再懸濁した。 細胞は、10,000
psi でフレンチ・プレスに１度適用して溶解した。 細
胞溶解産物を、遠心分離によって残滓を除去し、上清液
を、CPE 検定〔『インターフェロン・システム』、Spri
nger-Verlag編、ニューヨーク、ニューヨーク州（198
1）〕によって、抗ウィルス性に関して調べた。 分離
された発現生成物を、γ-1と命名した。 【０１２５】本実施例は、プラスミドpINTγ-trpI7のＤ
ＮＡ配列の変更に関するものであり、この変更は、例え
ば、IFN-γおよびIFN-αＦの類似体をコードする構造遺
伝子の、trpプロモーター制御発現におけるベクターの
使用を容易にした。 【０１２６】実施例４ すでに述べたように、断片IF-4は、開始メチオニンコー
ドの塩基、IFN-γの最初の４つのアミノ酸、およびtrp
プロモーター／オペレーター発現のための3'末端で終了
し、シャイン・デルガルノ・リボゾーム結合配列を含む
37個の塩基対（HpaI平滑末端を有するその5'末端から始
まる）を含むように構成されている。 【０１２７】IFN-γ類似体およびIFN-γ以外のポリペプ
チドをコードする配列に関連する操作は、全trp プロモ
ーター／オペレーター領域に制限部位3'が設けられれば
容易になることは明らかであった。 例を挙げると、そ
の他の遺伝子用のIF-4に対応する配列は、trpプロモー
ター／オペレーターを再構成するのに必要な全37塩基対
を再び構築しなくとも、構築することができ、完全なプ
ロモーター／オペレーターを有する適切な読取枠中への
挿入を容易にするような塩基を、5'末端に必要とするだ
けである。 【０１２８】この目的にかなうように、配列IF-4を、tr
pプロモーター／オペレーターを完成する塩基対に、Xba
I制限部位3'を組み込んで再構築した。 この構成を、
以下の表16に示した。 【０１２９】 【表１６】 【０１３０】この断片IF-4の変異体は、pINTγ-trpI7
(HpaIおよびBamHIで消化したもの）に挿入され、プラス
ミドpINTγ-TXb4を生成し、このプラスミドのIFN-γを
コードする遺伝子は、XbaIおよびSalIで消化でき、そし
て、全trpプロモーター／オペレーターは大きな断片に
とどまる。 【０１３１】次の実施例は、IFN-γの構造類似体の構築
に関するものであり、そのポリペプチド構造は、１つ以
上のアミノ酸の種類あるいは位置が、IFN-γとは異な
る。 【０１３２】実施例５ IFN-γの類似体の第１分類が形成されたが、これは81位
にアスパラギンの代わりにリジン残基を含むものであっ
た。 この類似体を生成するために必要な単一の塩基配
列の変更は、表11〜14のサブユニットIF-2の断片35およ
び36であった。 【０１３３】アスパラギンを定めるコドンAACは、リジ
ンを定めるコドンAAGによって置き換えられた。 この
ように変更されたＤＮＡ配列〔Lys81〕IFN-γの発現生
成物は分離されて、γ-10と命名された。 IFNγ類似体
の他のクラスは、アミノ酸発現に関与する１つ以上の潜
在的な糖タンパク質化部位が削除されたポリペプチドを
含む。 具体的には、これらは〔Arg140〕IFN-γあるい
は〔Gln140〕IFN-γを含み、これらポリペプチド配列は
１つ以上の自然に生じる配列〔−(AsnあるいはGln)−
(アミノ酸)-(SerあるいはThr)−〕を含むことができ
ず、この配列は、ポリペプチドの糖タンパク質化部位を
もたらすことが分かっている。 この配列の１つは、IF
N-γにおいて、28〜30位 (Asn-Gly-Thr)を占め、他のも
のは101〜103位(Asn-Tyr-Ser) を占める。 28〜30位の
変更を伴う本発明による類似体の調製では、４つの全て
のIFN-γサブユニットを含むプラスミドを、BamHIおよ
びHindIIIによって切断してサブユニットIF-3を除去
し、続いてサブユニットIF-3の変異体を挿入するが、こ
の変異体において、アスパラギンのAACコドンは、グル
タミンのコドンCAGに置換される。 （先の置換は、デ
オキシオリゴヌクレオチド断片37を変更して、AACでは
なくCAGを含むようにし、さらに断片38を変更して、TTG
ではなくGTCを含むようにする。 表11〜14を参照のこ
と。） この変更されたＤＮＡ配列〔Gln28〕IFN-γの
発現生成物は分離されて、γ-12 と命名された。このタ
イプのポリペプチド類似体は、酵母細胞で発現されても
糖タンパク質化されないように思われる。 このように
して生成されたポリペプチド類似体は、自然に生じるIF
N-γとは、自然形態の抗体との反応性において、あるい
は抗増殖あるいは免疫調節薬理学的効果において、明ら
かな違いがあるとは考えられないが、ある形態におい
て、幾つかの態様で優れた薬効を示す可能性がある。 【０１３４】IFN-γのその他の分類では、〔Trp39〕残
基が〔Phe39〕に置換され、および／または、48、80、1
20および137位のアミノ酸位置にて、メチオニンが、例
えば、ロイシンによって置換され、および／または、１
および３位のアミノ酸位置にて、システインが、例え
ば、セリンによって置換されているか、あるいは、完全
に除去されたポリペプチドを含む。 最後に述べた類似
体は、分子間のジスルフィド結合形成能力が無いので、
微生物で発現すると、より容易に分離できる可能性があ
る。 【０１３５】39位のトリプトファンのフェニルアラニン
による置換は、サブユニットIF-3のTGGコドンを、TTC
(TTTも使用できた）で置換することを必要とし、これ
は、デオキシオリゴヌクレオチド断片33の変更（TGGか
らTTCへ）、およびIF-3を製造するために使用された重
複断片36の変更（TGAからTACへ）によって補われた。 【０１３６】〔Phe39、Lys81〕IFN-γは、前記した変更
されたＤＮＡ配列（上記した81位のアスパラギンをリジ
ンで置換することも含む）の発現生成物を分離したもの
であり、γ-5と命名した。 【０１３７】同様に、48、80、120および137位の１つ以
上のメチオニンの置換は、サブユニットIF-3（デオキシ
オリゴヌクレオチド断片31、32および33の再構成と共
に）、サブユニットIF-2（デオキシオリゴヌクレオチド
断片21および22の再構成と共に）、そして、サブユニッ
トIF-1（デオキシオリゴヌクレオチド断片７と10および
／あるいは３と４と共に）の変換に関係する。 48位で
トレオニンがメチオニンに代わったIFN-γの類似体は、
サブユニットIF-3内の断片31を変換してメチニン特定コ
ドンATG を消失し、ACT コドンで置換することによって
得られた。 【０１３８】この変化を起こすために、断片34の変換(T
ACからTGA)も必要であった。 【０１３９】〔Thr48、Lys81〕IFN-γは、前記した変換
されたＤＮＡ配列（81位にリジンを特定するコドンも含
む）の発現生成物を分離したものであり、γ-6と命名さ
れた。 【０１４０】１および３位のシステインの置換あるいは
削除は、サブユニットIF-4の変換のみに関係する。 第
１の例として、サブユニットIF-4の構成を変換して、１
および３位の両システインを特定するコドン（それぞれ
TGTおよびTGC)を、セリンを特定するコドンTCTで置換す
るには、２つの断片の再構成を必要とするだけであった
（表11〜14のｅとｆ）。 〔Ser1、Ser3、 Lys81〕IFN-
γは、前記したようにして変換された〔Lys81〕IFN-γD
NA 配列の発現生成物から分離されたものであり、γ-2
と命名した。 他の例として、〔Lys1、Lys2、Gln3、Ly
s81〕IFN-γは、γ-3と命名され、サブユニットIF-4の
構成変換による発現生成物として得られたが、そこで
は、コドンAAA、AAAおよびCAAが、それぞれ、TTG、TAC
およびTGCに代わっていた。 最後に、〔des-Cys1、des
-Tyr2、des-Cys3、Lys81〕IFN-γは、γ-4と命名した
が、アミノ酸特定領域のサブユニットIF-4断片を、以下
のように変換することによって得られた。 【０１４１】 【化４】 【０１４２】遺伝子の開始のアミノ酸コーディング領域
の上述した変換は、実施例４のpINTγ- TXb4の構成によ
って顕著に促進されたが、これは、アミノ末端タンパク
質コーディング配列を完成して、遺伝子を完全なtrpプ
ロモーターに結合するために、BbaIおよび BamHI付着末
端を有する短い配列の調製に止まったことによる。 【０１４３】本発明によって提供される、IFN-γ類似体
ポリペプチドのその他の分類には、以前からポリペプチ
ドの第２および第３の立体配置に関連すると考えられて
いたアミノ酸が、IFN-γのアミノ酸と異なるものが含ま
れている。 一例を挙げれば、IFN-γポリペプチド内の
中間位置にシステイン残基を導入すると、IFN-αに見ら
れるようなアミノ末端残基と中間のシステイン残基との
間に分子間ジスルフィド結合の形成を促進する構造を有
するポリペプチドを生成する。 さらに、本発明に従っ
て、ポリペプチドにプロリンを挿入するか、あるいは欠
失させると、曲折した立体配置に変化が生じて、生物学
的活性にも影響があると考えられる。 【０１４４】〔Lys81、Cys95〕IFN-γを、γ-9と命名し
たが、サブユニットIF-2の断片17および18の配列を、 【０１４５】 【化５】 【０１４６】に代えて 【０１４７】 【化６】 【０１４８】で変異したＤＮＡ配列の発現物から分離さ
れた。 〔Cys95〕IFN-γ（γ-11と命名した）を特定す
るＤＮＡの発現が、同じ方法によって、目下のところ調
製中である。 同様に、〔Cys95、Pro104〕IFN-γをコ
ードする遺伝子も、トレオニンを特定するコドンACA
（IF-2の断片15）を、プロリンを特定するコドンCCAに
変換することによって、調製しているところである。 【０１４９】〔Glu5〕IFN-γは、γ-13 と命名されてお
り、サブユニットIF-3の断片43を、アスパラギン酸を特
定するコドンGAT ではなく、グルタミン酸塩を特定する
コドンGAA を含むように変換することで得られる。 こ
の変更は、その遺伝子座にBamHI 認識部位を存在するこ
とを許容しないと考えられるので、サブユニットIF-3
は、複合サブユニットとして、サブユニットIF-4のアミ
ノ酸を特定する部分を含むものとして調製する必要があ
り、構築された遺伝子のXbaIとHindIIIの間には制限部
位は無くなる。 このIFN-γ類似体は、自然に生じる類
似体よりも、酸に対して安定している考えられる。 【０１５０】上述したトリプトファンおよび／またはメ
チオニンおよび／またはシステイン置換による上記の類
似体は、自然に生じるIFN-γと比較して、自然に生じる
類似体に対する抗体との反応度あるいは抗増殖薬効ある
いは免疫調節作用の点において異なるとは考えられない
が、薬理学的効果はより大きいものと期待されている。 【０１５１】さらに他の類似体の分類では、『ハイブリ
ッド』あるいは『融合した』タイプのポリペプチドがあ
り、これらは決定された配列の末端に、１つ以上の追加
のアミノ酸を含む。 これらは、IFN-γをコードする全
配列に、他の製造されたＤＮＡ配列、例えば、後述する
LeIFN-Conに特有のポリペプチドの配列をコードするサ
ブユニットの１つを追加することによって形成される遺
伝子によって発現されるであろう。 発現されるポリペ
プチドは、自然に生じるIFN-γの抗体反応を残し、そし
て、LeIFN の抗体反応を示すと考えられる。 その薬理
学的な作用は、薬効および持続期間の２点において、自
然に生じるIFN-γに優るものと考えられている。 【０１５２】以下の表17は、本発明に従って調製された
IFN-γと試験された幾つかの類似体に関する、抗ウィル
ス作用の研究結果をまとめたものである。 相対的な抗
ウィルス作用を、脳心筋炎ウイルス(EMCV)に感染したヒ
トHeLa細胞において検定し、IFN-γに対するモノクロー
ナル抗体による結合に関して免疫吸着分析によって決定
した。 【０１５３】 【表１７】 【０１５４】次の実施例は、所望の生成物の発現を促進
する、これまでの実施例でのＤＮＡ配列におけるポリペ
プチド・コーディング領域の変換に関するものである。 【０１５５】実施例６ IFN-γおよびIFN-γ類似体をコードする製造されたＤＮ
Ａ配列の、微生物での発現によるポリペプチド生成物に
関する分析結果から、２つの主要なタンパク質が、ほぼ
同じ量だけ製造されたことが明らかになった。 １つ
は、完全な146個のアミノ酸配列に対応する17Ｋ形態
で、他方は、アミノ末端の約50個のアミノ酸を失ったイ
ンターフェロン断片に対応する12Ｋ形態である。 製造
された遺伝子におけるコドンの使用を検討した結果、短
いコドンは、塩基配列の3'末端が、シャイン−デルガル
ロ・リボソーム結合配列に類似しているために生じた、
Met48残基での微生物の翻訳開始の末に形成された可能
性が高いことが明らかになった。 【０１５６】このように、転写されたmRNAの約半分は、
初めのメチオニンに先行する遺伝子座においてのみリボ
ソームと結合したが、残りの半分はMet48コドンに先行
する遺伝子座で結合されたように思われた。 ポリペプ
チド・コーディング領域内でのリボソーム結合の生成可
能性を減少するために、サブユニットの断片33および34
を再構成した。 具体的には、41位にグルタミン酸塩残
基を特定するのに用いられたGAGコドンは、他のGAAコド
ンに変えられ、45位にアルギニンを特定するために用い
たCGTコドンは、他のCGCコドンに変えられていた。 こ
れらの変更は、IFN-γのγ−６類似体を特定する遺伝子
を調製する際に実施され、適切な長さの単一の優勢な種
類のポリペプチドが生成した。 【０１５７】以下の実施例７および８は、ヒト白血球イ
ンターフェロンのＦサブタイプ（『LeuIFN-F』あるいは
『IFN-αＦ』）、およびそのポリペプチド類似体を特定
するように製造されたIFN-αを生成するための本発明の
方法に関する。 【０１５８】実施例７ Ｆサブタイプのヒト白血球インターフェロンのためのア
ミノ酸配列は、cDNAクローンの配列の解析結果から推定
される。 例えば、 Goedell等, Nature, 200,pp. 20-2
6 (1981)を参照のこと。 pBR322誘導発現ベクターを用
いてIFN-αＦを大腸菌内で微生物的に発現するために使
用する、製造されたＤＮＡ配列を設計および構築するた
めに、実施例１、２および３の方法を使用した。 ３つ
の『大』サブユニットＤＮＡ配列（LeuIFN-F、LeuIFN-F
II、およびLeuIFN-FIII）および１つの『小』サブユニ
ットＤＮＡ配列（LeuIFN-FIV）を構成するための方法が
立案され、サブユニットの内容を以下の表18〜21に示し
た。 【０１５９】 【表１８】 【０１６０】 【表１９】【０１６１】 【表２０】【０１６２】 【表２１】【０１６３】表23〜26に示す遺伝子製造方法の場合と同
様、表18〜21の方法では、デオキシリボヌクレオチド断
片の構成に支障のない限り、微生物にて優先されるコド
ンの使用と関連する。 サブユニットを用いる発現ベク
ターの作成は、IFN-γを特定する遺伝子に関連する方法
と似通っており、使用される制限酵素に僅かな違いがあ
るだけである。 サブユニットＩは、EcoRIおよびSalI
によって切断されたpBR322に結合される。 （サブユニ
ット末端部分は、一本鎖SalI『付着末端』を含むが、相
補が行われると、SalI認識部位は再構成されないことに
注意されたい。 【０１６４】しかしながら、全BamHI 認識部位は残存
し、その後のサブユニットの切出しを可能にする。）
この第１中間プラスミドは増幅され、サブユニットII
は、再びEcoRIおよび SalIによる切断後に、増幅された
プラスミドに挿入される。 このようにして形成された
第２中間プラスミドは増幅され、そしてサブユニットII
Iは、EcoRIおよびHindIIIで切断され、増幅されたプラ
スミドに挿入される。 【０１６５】このようにして形成された第３中間プラス
ミドを増幅する。 サブユニットIVは、実施例４のpINT
γ-TXb4 から分離されたEcoRI およびXbaI断片に結合さ
れ、この結合生成物（EcoRIおよびBstEII付着末端を持
つ）は、EcoRIおよびBstEIIによって切断され、増幅さ
れた中間プラスミドに挿入されて、最終の発現ベクター
を生成する。 【０１６６】最終発現ベクターに挿入された表18〜21に
記載の、製造されたＤＮＡ配列のtrpプロモーター／オ
ペレーターに制御された大腸菌による発現物から分離さ
れた生成物を、IFN-αＦ1と命名した。 【０１６７】実施例８ 後述の協働白血球インターフェロンに関する記述にて言
及するように、14位にトレオニン残基、および16位にメ
チオニン残基を含むヒト白血球インターフェロン・サブ
タイプが、Ala14およびIle16残基を有するサブタイプよ
りも、高い抗ウィルス作用を示すことは良く知られてい
る。 従って、ヒト白血球インターフェロン・サブタイ
プＦの類似体が、実施例７のＤＮＡ配列の微生物による
発現によって製造されたが、これらの配列は残基14およ
び16に、トレオニンおよびメチオニンをそれぞれ特定す
るように変更されている。 具体的には、〔Thr14、Met
16〕IFN-αＦは、IFN-αＦ2 と命名され、SalIおよびHi
ndIIIで切断した上で変更されたサブユニットII（表18
〜21のもの）を挿入した、表18〜21のベクターで形質転
換した大腸菌内で発現された。 サブユニットIIに係る
上記変換は、アラニンを特定するコドンGCTを、トレオ
ニンを特定するACTコドンで置換し、かつイソロイシン
を特定するコドンATTを、ATGのコドンで置換することに
よって変換された断片39の構築を必要とした。 相補性
塩基の対応する変更は、サブユニットLeuIFN-FIIの断片
40内で行われた。 【０１６８】以下の実施例９および10は、ヒト白血球イ
ンターフェロン・サブタイプＦの類似体と命名できる、
協働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチドの、微
生物による合成に関する本発明の実施例である。 【０１６９】実施例９ 本明細書において、『協働ヒト白血球インターフェロ
ン』（『IFN-Con』、『LeuIFN-Con』）とは、自然に生
じないポリペプチドを意味し、このポリペプチドは、自
然に生じるすべてのヒト白血球インターフェロン・サブ
タイプ配列に共通するアミノ酸残基を含み、かつ全ての
サブタイプに共通するアミノ酸が存在しない位置に優勢
に生じるアミノ酸を含み、常に少なくとも１つの自然に
生じるサブタイプに存在しないアミノ酸残基は含まない
ものを言う。 （この定義では、サブタイプＡは、他の
サブタイプと位置的に整理され、44位に『欠けている』
アミノ酸があることが明らかになる。） この定義によ
ると、協働ヒト白血球インターフェロンは、通常は、す
べてのサブタイプでの公知のすべての共通アミノ酸残基
を含むことになる。 自然に生じるサブタイプ配列に関
する知見が、常に進展しているのは周知の通りである。
特定の位置での特定の残基の『共通性』を否定する、
新しいサブタイプが後に発見されるかも知れない。 １
つ以上の位置の後に、改訂された共通性の決定に基づい
て構造が予測されるポリペプチドにもこの定義が適用で
きると思われる。 なぜなら、これらは共通のアミノ酸
を含み、さらに、もはや共通とは考えられなくなったア
ミノ酸が、当該位置での支配的なアミノ酸であると考え
られるからである。 何れかの位置において共通の、あ
るいは支配的なアミノ酸を含まないポリペプチドでも、
その位置での残基が、少なくとも１つのサブタイプで生
じれば先の定義に当てはまることになる。 協働ヒト白
血球インターフェロンの内部あるいは末端の１つ以上の
残基を欠くか、あるいは、いずれのサブタイプにも類縁
体の無い内部あるいは末端の残基を有するポリペプチド
は、ヒト協働白血球インターフェロンの類似体と見なさ
れる。 【０１７０】８つのcDNA誘導ヒト白血球インターフェロ
ン・サブタイプの、発表された推定アミノ酸配列は、16
6 残基の配列内のアミノ酸の種類に関して解析されたも
のである。 一般には、Goedell等、Nature、290、pp.
20-26 (1981)を参照のこと。 【０１７１】この論文は、LeIFN-ＡからLeIFN-Ｈまでを
比較し、79個のアミノ酸だけが、８つのすべてのインタ
ーフェロン態様の同一の位置にあり、Ｅサブタイプ（cD
NA偽遺伝子から得られたもの）を無視すれば、99個のア
ミノ酸が同じ位置にあると指摘するものであった。 残
りの位置について、それぞれのアミノ酸の相対的な存在
頻度が分析され、１つのアミノ酸が８つの態様の内の少
なくとも５つ態様と同じ位置にある場合は、そのアミノ
酸はその位置での支配的なアミノ酸であるとされた。
166 個のアミノ酸の『協働』ポリペプチド配列を図示
し、８つの個々の配列と比較した。 その結果、LeIFN-
Ｆのその『自然に生じる』態様を、僅かに変えるだけで
協働配列に従うことが判明した。 【０１７２】製造されたIFN-Con ＤＮＡ配列を調製する
方法を設計した。その配列を、以下の表22に示した。
この表において、LeIFN-Con1、すなわち、IFN-αＦの
〔Arg2 2、Ala76、Asp78、Glu79、Tyr90、Leu96、Th
r156、Asn157、Leu158〕類似体を生成するために、IFN-
αＦに加える必要のある変更を星印で示した。 図示れ
た頭鎖配列は、必要であれば、大腸菌内の優先的発現の
対象となるコドンを含む。この配列は、配列の中間の位
置にSal、HindIII、およびBstE2の認識部位を導入する
塩基、そして、配列の両末端にはXBaIおよびBamHI の認
識部位を導入する塩基も含む。 後者の部位は、IFN-α
Ｆおよびその類似体のために調製された配列の場合と同
様に、この配列を、pBR322ベクターに組み込むために選
択された。 【０１７３】 【表２２】【０１７４】以下の表23〜26は、IFN-Con1の製造のため
に使用する４つのサブユニットＤＮＡ配列の調製のため
の、二本鎖ＤＮＡ配列を示している。 サブユニットLe
uIFN-ConIVは、表22のLeuIFN-FIVの複製である。 IFN-
αＦ遺伝子を調製するために用いたものと異なるサブユ
ニットの断片は『プライム記号』で示した（例えば、3
7' および38' は、22位において、グリシンではなく、
アルギニンをもたらす必要のある37および38を変形した
ものである）。 【０１７５】 【表２３】【０１７６】 【表２４】 【０１７７】 【表２５】【０１７８】 【表２６】【０１７９】表23〜26の４つのサブユニットを、実施例
７の方法に従って順次発現ベクターに挿入し、trpプロ
モーター／オペレーターの制御を受ける表22のコーディ
ングリボソームを有するベクターを生成した。 このベ
クターの大腸菌での発現生成物を、IFN-Con1と命名し
た。 このポリペプチドは、前出のGoedell 等の文献に
示された全ての共通の残基を含んでおり、さらに、Ser
80、Glu83、Val114およびLys121を除いて、参照文献に
開示された配列の要約にある分析によって明らかとなっ
た支配的なアミノ酸も含んでいる。 上記した４つの残
基は、サブユニットの形成と発現ベクター内への組み込
みを容易にするために、天然のIFN-αＦ配列にて保持さ
れていた。 （例えば、セリンは、80位に保持されて、
HindIII部位の形成を可能とした。） Goedell 等のIFN-αサブタイプの要約の発表後に、いく
つかの追加のサブタイプが確認された。 図２は、現在
知られている13個のサブタイプ（公知の５つのcDNA偽遺
伝子によ明らかになったものは除く）の推定された配列
を、表の形で示しており、他の研究所が同じIFN-αサブ
タイプに付けた他の名称を括弧内に示した（例えば、IF
N-α６およびIFN-αＫ）。 例えば、前出の Goedell等
の文献、Stebbing等、組換えＤＮＡ生成物、インシュリ
ン、インターフェロンおよび成長ホルモン(A. Bollon
編）、CRC プレス(1983)、およびWeissman等、U.C.L.A.
Symp. Mol. Cell Biol., 25, pp.295- 326 (1982)を参
照のこと。 共通のアミノ酸の無い位置は、肉太活字で
示した。 IFN-αサブタイプは、アミノ酸残基に基づい
て大まかに分類されている。 ７つの位置（14、16、7
1、78、79、83および160)で、種々のサブタイプは僅か
２つの代替アミノ酸を示し、同じアミノ酸残基に占めら
れている７つの位置の相違に基づいてサブタイプを２つ
のサブグループ（ＩおよびII）に分類することを可能と
している。 ３つのIFN-αサブタイプ（Ｈ、Ｆおよび
Ｂ）は、アミノ酸位置に基づいてグループＩあるいはグ
ループIIに分類することができず、これらは、両グルー
プのサブタイプの自然ハイブリッドであると考えられ
る。 グループＩタイプのIFN-αサブタイプが、比較的
大きな抗ウィルス活性を呈し、一方で、グループＩタイ
プのIFN-αサブタイプが、比較的大きな抗腫瘍活性を呈
することが報告されている。 【０１８０】IFN-Con1の構造を、図面の最終行に記し
た。 Goedell等の配列に基づいて「共通である」と決
定されたIFN-Con1の特定の残基（例えば、第８位のセリ
ン）が、今や「支配的である」と思われることは特筆す
べきである。 さらに、先の文献に基づいて支配的であ
るとされた特定のIFN-Con1残基(Arg22、Asp78、Glu79お
よびTyr86)は、もはや支配的でなくなり、一方で、他の
支配的でないとされた残基(Ser80およびGlu83)は、今で
は支配的であると決定されている。 【０１８１】実施例10 14および16位のアミノ酸の同一性がIFN-Con1と異なるヒ
ト協働白血球インターフェロンを、IFN-Con1をコードす
るＤＮＡ配列の修飾により調製した。 具体的には、IF
N-Con1の発現ベクターを、BstEIIおよびHindIIIで処理
し、サブユニットLeuIFN ConIIIを除去した。 変更さ
れたサブユニットが挿入されたが、このサブユニットで
は、39および40位のアラニンを特定するコドンGCT が、
トレオニンを特定するコドンACTで置換され、イソロイ
シン・コドンCTGは、ATGに変えられた。 変更された遺
伝子の発現生成物である〔Thr14、Met16、Arg22、Al
a76、Asp78、Glu79、Tyr86、Tyr90、Leu96、Thr156、As
n157、Leu158〕IFN-αFを、IFN-Con2と命名した。 【０１８２】現在のところ、114および121位の残基の種
類に関して、IFN-Con1と異なる協働ヒト白血球インター
フェロン・ポリペプチドのための遺伝子が調製されてい
る。 【０１８３】具体的には、IFN-αＦサブタイプ残基を複
製するが、支配的なアミノ酸ではないVal114およびLys
121残基は、それぞれ優勢なGlu114およびArg121残基に
変えられる。 【０１８４】コドンを、Val114からArg114に（すなわ
ち、GTCからGAAに）変更すると、サブユニットLeuIFN C
on I（表23〜26）の末端部分にSalI部位が存在できなく
なるので、サブユニットＩおよびIIは、単一のサブユニ
ットとして調製される必要が生じると思われる。 断片
11および12のAAA、すなわち、リジン・コドンをCTGに変
えると、121位にアルギニンが存在することができる。
製造された遺伝子〔Arg 22、Ala76、Asp78、Glu79、Tyr
86、Tyr90、Leu96、Glu114、Arg121、Thr156、Asn157、
Leu158〕IFN-αＦの細菌による発現生成物を、IFN-Con3
と命名した。 【０１８５】次の実施例は、細菌宿主、特に、大腸菌に
おける外来性遺伝子の発現のレベルを高める方法に関す
る。 【０１８６】実施例11 前出の実施例での発現ベクターの形成において、trp プ
ロモーター／オペレーターＤＮＡ配列が用いられたが、
これら配列は、最初の転写開始(Met-1、ATG)の直前の位
置にリボソーム結合部位(RBS）配列を含んでいた。 発
現性の高い細胞タンパク質に関連するゲノム大腸菌ＤＮ
Ａ配列に存在する推定ＲＢＳ配列の、部分複製したＤＮ
Ａ配列を組み込むことによって、大腸菌内での種々の外
来性遺伝子の発現のレベルを増加するための試みがなさ
れた。 このタンパク質コーディング遺伝子の、Inokuc
hi等, Nuc. Acids. Res., 10, pp. 6957-6968 (1982)、
Gold等, Ann. Rev. Microbiol., 35, pp. 365-403 (198
1)、および Alton等, Nature, 282, pp. 864-869 (197
9)において報告されたリボソーム結合部位配列が検討さ
れ、大腸菌タンパク質OMP-F(外膜タンパク質）、CROお
よびCAM(クロラムフェニコール・トランスアセチラー
ゼ）に関連する遺伝子の部分的複製配列を用いることに
した。 【０１８７】例を挙げると、OMP-F RBS配列の一部を複
製するために、以下の配列がMet-1コドンの前に挿入さ
れる。 【０１８８】 【表２７】 【０１８９】この配列を、例えば、IFN-Con1あるいはIF
N-αF1をコードする製造されたIFN-αのタンパク質コー
ディング領域の前に組み込むために、発現ベクターのサ
ブユニットIVは削除され（ベクターをXbaIおよびBstEII
で切断することにより）、変更された断片41Ａおよび42
Ａ、および断片43および44を新断片RB１およびRB２で置
換した変更済みサブユニットIVに変更した。 変更され
た配列は、以下の表28に示す通りである。 【０１９０】 【表２８】【０１９１】以下の表29は、再構成された遺伝子のタン
パク質コーディング領域に先行する領域での前記ＤＮＡ
配列を示し、trpプロモーター／オペレーター内のHpaI
部位で始まる（表11〜14のサブユニットIF-4と比較のこ
と）。 【０１９２】 【表２９】 【０１９３】CROおよびCAM遺伝子のRBS配列の複製配列
を組み込むために同様の方法が採られ、Met-1コドンの
直前に下記表30に記した配列が生じた。 【０１９４】 【表３０】 【０１９５】すべてのRBS 配列の挿入体は、シャイン−
デルガルノ配列に良く相似しており、アデニンが豊富
で、通常、『停止』コドンをもたらす配列を含むことが
分かる。 【０１９６】IFN-Con1の大腸菌での発現レベルは、３つ
のRBS 挿入体（完全なtrpプロモーター／オペレーター
内に存在するRBS配列に加えて）に組み込まれたtrpで制
御された発現ベクターを用いて決定された。 OMP-F R
BS複製配列を用いた所望のポリペプチドの発現は、１ｌ
の培養当たり、150 〜300 mgであり、全タンパク質の10
〜20％に相当した。 CAM RBS複製配列を組み込んだベ
クターによる発現レベルは、OMP-Ｆ変異体による発現レ
ベルの約半分であった。 CRO RBS複製配列を含んだベ
クターは、OMP-Ｆ変異体の約1／10のレベルの所望のタ
ンパク質を生成した。 【０１９７】以下の実施例では、前述の実施例にて得ら
れたヒト白血球インターフェロンおよびポリペプチドの
抗ウィルス作用のスクリーニングに関する。 【０１９８】実施例12 以下の表31に、種々の細胞系における自然の（バフィコ
ート）インターフェロン、および分離され、微生物的に
発現された、IFN-αF1、IFN-αF2、IFN-Con1、およびIF
N-Con2と称するポリペプチドの抗ウィルス活性の試験結
果を示した。使用されたウイルスはVSV(水疱性口内ウイ
ルス）およびEMCV（脳心筋炎ウイルス）であった。 細
胞系は、種々の哺乳類に由来するものであり、ヒト(WIS
H, HeLa)、ウシ(MDBK)、マウス(MLV-6）、およびサル(V
ero)が含まれた。 抗ウィルス作用は、Weck等, J. Ge
n. Virol., 57, pp. 233-237 (1981)および Campbell
等, Can. J. Microbiol. 21, pp.1247- 1253（1975）に
報告された終点細胞変性効果検定によって測定した。
ここに示すデータは、WISH細胞における抗ウィルス活性
に対して正規化してある。 【０１９９】 【表３１】 【０２００】 【発明の効果】これら実施例より、本発明によって初め
て、完全に新規な種類の、合成された、生物学的活性を
有するタンパク様の生成物をもたらすものであり、この
生成物は、自然に生じる物質とは１つ以上のアミノ酸の
種類および／または位置の点で、さらに、１つ以上の生
物学的（例えば、抗体反応性）および薬理学的（例え
ば、薬効あるいは効果の持続期間）側面において異なる
ものであるが、その他の前述した性質を実質的に保持す
ることは明白である。 本発明の生成物は、適切に『標
識を付ける』ことが可能であり、例えば、酵素に接合し
た放射性標識（例えば、Ｉ125を用いて）、または螢光
色素で標識付けして、体液試料中の生成物および／また
は前述した抗体の存在量を定性的および／または定量的
に測定するための、検定および／または診断検査キット
に有用な試薬材料を提供することができる。 この抗体
は、１つ以上の動物種（例えば、マウス、ウサギ、ヤ
ギ、ヒト等）に接種を行うか、あるいはモノクローナル
抗体源から得ることができる。 【０２０１】この試薬材料は単独で、あるいは、適切な
基質、例えば、ガラスあるいはプラスチックのビーズに
塗布して使用することができる。 【０２０２】これまで開示してきた実施例を考慮すれ
ば、当業者であれば、多数の修正あるいは変更を想到で
きるものと考えられる。従って、本発明には、特許請求
の範囲の欄に記載された限定のみが付加されるべきであ
る。
の操作による所望のタンパク質、具体的には、ヒト免疫
インターフェロンポリペプチド類似体の生産に有用なプ
ロセスに関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】遺伝
物質とは、一般的には、細胞およびウィルスの構成成分
の製造をプログラムおよび誘導し、そして、細胞および
ウィルスの反応を制御する化学物質として定義できる。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として知られる長鎖重合
体物質は、リボ核酸（ＲＮＡ）によってプログラムされ
るある種のウィルスを除いて、あらゆる生細胞およびウ
ィルスの遺伝物質を構成する。 ＤＮＡポリマーの反復
単位は、４つの異なるヌクレオチドであり、それらは各
々燐酸塩基が付加したデオキシリボース糖類に結合した
プリン（アデニンあるいはグアニン）あるいはピリミジ
ン（チミンあるいはシトシン）を含む。 直線状ポリマ
ー内のヌクレオチドの接合は、１つのヌクレオチドの5'
−燐酸の、他のヌクレオチドの3'ヒドロキシル基への融
合によるものである。 機能性ＤＮＡはヌクレオチドの
一本鎖（デオキシオリゴヌクレオチドとして知られる）
の安定した二本鎖会合の形で生じ、この会合はプリン塩
基およびピリミジン塩基の間の水素結合によって生じる
〔すなわち、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との間、ま
たはグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間に存在する
『相補的』会合〕。 従来より、ヌクレオチドは、それ
らを形成するプリン塩基あるいはプリミジン塩基の名前
で呼ばれ、二本鎖ＤＮＡの相補的結合（すなわち、Ａ−
ＴおよびＧ−Ｃ）は『塩基対』と呼ばれている。 【０００３】リボ核酸は、ポリヌクレオチドであり、ア
デニン、グアニン、シトシン、およびチミンの代わりに
ウラシル（Ｕ）を含み、これらはリボースおよび燐酸基
に結合している。 【０００４】ＤＮＡのプログラム機能は、一般に、特定
のＤＮＡヌクレオチド配列（遺伝子）が、比較的に不安
定なメッセンジャーRNA(mRNA）ポリマーに『転写』され
るプロセスによって実現される。 一方、mRNAは、アミ
ノ酸から構造、調節および触媒タンパク質を生成するた
めの鋳型として役立つ。 この翻訳過程には、小さなＲ
ＮＡ鎖(tRNA)の作用が関連しており、tRNAは個々のアミ
ノ酸を送り込んでmRNAに沿って整列させて、適切なアミ
ノ酸配列のポリペプチドの生成を可能にする。 【０００５】ポリペプチド『発現』のために、ＤＮＡか
ら誘導され、tRNAの供給と20種類のアミノ酸のいずれか
の方向性を定めるmRNAの『メッセージ』は、三塩基『コ
ドン』の形態、すなわち、３つのヌクレオチド塩基の配
列的なグループ化の形態をとる。 ある意味では、タン
パク質の形成は、遺伝子のヌクレオチド配列によってプ
ログラムされた遺伝メッセージの『発現』の究極的な姿
である。 【０００６】ＤＮＡポリマー内にて、普通遺伝子に『先
行』するＤＮＡ配列は、mRNAへの転写の開始部位をもた
らす。 これら配列は、『プロモーター』配列と呼ばれ
る。ＤＮＡポリマー内で、通常遺伝子の『上流』にある
（すなわち、先行する）その他のＤＮＡ配列は、転写開
始の頻度（あるいは速度）を決定するタンパク質を結合
する。 このような配列は、『レギュレーター』配列と
呼ばれる。 このように、機能性ＤＮＡポリマーの中で
選択された一つの遺伝子（あるいは、複数の遺伝子の配
列）に先行し、かつ遺伝子の転写（および、その後の発
現）の有無を決定する配列は、『プロモーター／レギュ
レーター』あるいは『制御』ＤＮＡ配列と総称されてい
る。 ＤＮＡポリマー内で遺伝子に『続き』、かつmRNA
への転写の終了の信号をもたらすＤＮＡ配列は『ターミ
ネーター』配列と呼ばれる。 【０００７】過去10年近くの間、微生物学的プロセスの
焦点は、所望の生成物に関する遺伝情報を含まないＤＮ
Ａを保有する生物を用いて、工業的に、そして製薬的に
有用な物質を製造することに向けられてきた。 すなわ
ち、生成物の構造を定める遺伝子は、『供与』生物から
分離されるか、あるいは、化学的に合成され、そして、
安定的に他の生物、好ましくは、自己複製単細胞微生物
に導入される。 これが成功すれば、『形質転換され
た』宿主細胞内での、遺伝子発現の既存の機序が作用し
て所望の生成物を構築することになる。 【０００８】この技術分野では、選択された宿主生物の
形質転換に使用する遺伝物質の分離、合成、精製、およ
び増幅のための『組換えＤＮＡ』方法に関する数多くの
特許および文献が出されている。 例えば、Cohen等の
米国特許 No. 4,237,224は、選択された外来性ＤＮＡ配
列を含む『ハイブリッド』ウィルスＤＮＡあるいは環状
プラスミドＤＮＡを用いた原核単細胞宿主生物の形質転
換に関する。 Cohen等の特許の方法は、まず、酵素的
にウィルスＤＮＡまたは環状プラスミドＤＮＡを切断し
て、線状ＤＮＡを形成することによる形質転換用ベクタ
ーの製造に関する。 【０００９】選択された外来性ＤＮＡ鎖は、同様な酵素
を使用することによって線状に調製される。 線状ウィ
ルスＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡは、外来性ＤＮＡ
と共に、修復プロセスを進行せしめる能力がある結合酵
素の存在下で培養され、そしてウィルスＤＮＡまたは環
状ＤＮＡプラスミドに『切り出された』外来性ＤＮＡ断
片を含んだ、『ハイブリッド』ベクターが形成される。 【００１０】親和性のある単細胞宿主生物のハイブリッ
ド・ベクターによる形質転換は、宿主細胞内に外来性Ｄ
ＮＡの多数の複製を生じる。 場合によっては、目的
は、単に外来性ＤＮＡの増幅であり、収穫される『生成
物』はＤＮＡである。 大抵の場合、形質転換の目的
は、外来性ＤＮＡの宿主細胞での発現であり、外来性Ｄ
ＮＡによってコードされた商業的に有用なタンパク質あ
るいはポリペプチド断片を、分離可能なほどの量だけ大
規模に合成する。 例えば、Shineの米国特許 No.4,26
9,731、Manisの米国特許 No. 4,273,875、およびCohen
の米国特許 No. 4,293,652を参照のこと。 【００１１】Cohen等の特許のような方法の成功は、主
に、ハイブリッド化されないＤＮＡベクター、および重
要な外来性配列を含む真核生物のＤＮＡ鎖等の特定部位
の切断を促進する『制限エンドヌクレアーゼ』酵素が、
容易に入手できることによる。 【００１２】二本鎖線状ＤＮＡ鎖に、一本鎖相補性『末
端』を形成する切断方法は、『結合』酵素の処理を受け
た時の外来性ＤＮＡのベクターへの機能的組み込みの蓋
然性を顕著に高める。 このような多数の制限エンドヌ
クレアーゼ酵素が、現在商業的に入手可能である〔例え
ば、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社、ゲテスバ
ーグ、メリーランド州の『1981／1982カタログ』にある
『BRL制限エンドヌクレアーゼ参照表』を参照のこ
と〕。 ハイブリッド形成の確認は、クロマトグラフ法
によって容易なものとなり、この方法は、例えば、分子
量に基づいて非ハイブリッド・プラスミドとハイブリッ
ド・プラスミドとを区別することができる。 【００１３】その他の有用な方法は、放射性ＤＮＡハイ
ブリッド形成に関するものである。 【００１４】原核細胞の形質転換の成功に大いに寄与し
た他の操作『手段』は、選択可能な『標識付けした』遺
伝子配列の使用である。 つまり、所望の外来性ＤＮＡ
に加えて、形質転換された宿主細胞を、形質転換されて
いない宿主細胞から区別することのできる形質特性を発
現するコードを有する、一つ以上のＤＮＡ配列を含むハ
イブリッド・ベクターが使用される。 典型的な標識遺
伝子配列は、形質転換された原核細胞が形質転換されて
いない宿主細胞を殺すか、あるいは当該原核細胞の増殖
を甚だしく阻止する金属、抗生物質、およびこれらを含
む培地中にて、当該原核細胞が生存し、増殖することを
可能とするものである。 【００１５】形質転換された宿主微生物内において、外
来性遺伝子が首尾よく発現するか否かは、主に、前述の
遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAのメッセージのタンパ
ク質の翻訳を確実にする、その他の信号への転写を確実
にする適切なプロモーター／レギュレーター領域（例え
ば、リボゾーム結合部位）を持つ形質転換ベクターに前
述の遺伝子を組み込めるか否かによって決まる。 遺伝
子の『元の』プロモーター／レギュレーター領域が新し
い宿主において高レベルの発現を許すことは珍しい。
従って、挿入しようとする遺伝子には、挿入に先立って
新しい宿主に適合する転写および翻訳調節ＤＮＡ配列を
付加するか、あるいは、前述の遺伝子を、ベクターＤＮ
Ａ中にて現存の転写信号および翻訳信号に制御される部
位に挿入する必要がある。 【００１６】外来性遺伝子の、例えば、環状ＤＮＡプラ
スミド・ベクターへの挿入は、しばしば、現存する転写
および翻訳信号の直後の部位、あるいは宿主内で発現の
程度が高い、比較的大きなタンパク質のコードを有する
現存プラスミド遺伝子内で行われる。 後者の場合、こ
のようにして形成された『融合遺伝子』の宿主における
発現は、所望のタンパク質配列（例えば、大きなタンパ
ク質の化学的な切断によって分離できる中間断片とし
て）を含む『融合タンパク質』の高レベルでの生成とな
る。 前述した方法は単に、所望の調節と外来性遺伝子
生成物の高レベルの発現を確実にするのみならず、所望
のタンパク質生成物を宿主に内在するプロテアーゼの攻
撃からある程度防御する。 さらに、宿主生物によって
異なるが、前述した方法は、所望のタンパク質の宿主細
胞から細胞培地への一種の『ピギーバック』輸送を可能
とし、所望の生成物を分離するために宿主細胞を破壊す
る必要性を解消する。 【００１７】公表された組換えＤＮＡ方法に関して述べ
たことから、これらプロセスは、単純で、容易に実施で
き、かつ簡単に検証できるように見えるが、実際には、
必要なＤＮＡ配列の操作の実施は非常に煩雑かつ困難な
もので、所望の生成物の収率は、ほとんど例外なく、非
常に低い。 【００１８】一例を挙げると、宿主微生物の形質転換に
使用されるベクターに挿入するための遺伝子の、最初の
『調製』は非常に難しいプロセスである場合があり、発
現させようとする遺伝子がヒトのような高等生物に内在
するものである場合は、特にそうである。 この技術に
て行われる煩雑な工程の一つに、『供与』細胞の全ＤＮ
Ａゲノムの組換えプラスミドへの体系的なクローニング
があり、これは、ランダムなＤＮＡ配列断片を持つ形質
転換された細胞の膨大な『ライブラリー』が生成され、
このＤＮＡ配列断片を、個々に試験して所望の生成物の
発現を調べる必要がある。 他の方法によると、全mRNA
は高発現供与細胞（所望の生成物のためのコードを持つ
mRNAの多数の複製を含むもの）から分離され、最初に逆
転写酵素によって一本鎖cDNAに『複写』され、それから
ポリメラーゼによって二本鎖に転写され、そしてクロー
ニングされる。 この方法も、形質転換された細胞のラ
イブラリーを生成するが、このライブラリーは全ゲノム
・ライブラリーよりも幾分か小さく、所望の遺伝子の複
製を含み、かつ宿主微生物での発現に大きく干渉する形
質転換されない『イントロン』を持たない可能性があ
る。 上記した煩雑な遺伝子分離方法は、実際にいくつ
かのタンパク質を微生物に発現させるのために公表され
た組換えＤＮＡ方法で使用されたものであり、前記した
タンパク質は、ラット・プロインシュリン〔Ullrich
等、Science, 196, pp. 1313-1318(1977）〕、ヒト繊維
芽細胞インターフェロン〔Goedell等、Nucleic Acids R
esearch, ８, pp. 4087-4094(1980）〕、マウスβ−エン
ドルフィン〔Shine 等、Nature、285、pp. 456-461(198
0）〕、およびヒト白血球インターフェロン〔Goedell
等、Nature、287、pp. 411-416(1980）；および Goedel
l等、Nature, 290, pp. 20-26 (1981)〕を含む。 【００１９】可能であれば、ヌクレオチド塩基を用いた
所望の遺伝子の部分的あるいは全部の製造は、組換えＤ
ＮＡ方法で使用する遺伝子の調製のためのさらに望まし
い方法を構成する。 そのような製造のために必要なも
のは、当然のことながら、所望のポリペプチドの正確な
アミノ酸配列の知識である。 この情報があれば、タン
パク質を生成するＤＮＡ配列（すなわち、適切に配列さ
れた三塩基コドン）をデザインすることが可能となり、
対応する合成二本鎖ＤＮＡ配列を調製することができ
る。 製造方法とcDNA合成方法との組合せが、ヒト成長
ホルモン用の遺伝子の生成のために使用されたことが報
告されている。 特に、製造された72個のヌクレオチド
塩基対の線状二本鎖ＤＮＡ配列（所望の191個のアミノ
酸ポリペプチドの最初の21個のアミノ酸を決めるコドン
を持つもの）が、25〜191位のアミノ酸用のコードを持
つcDNA誘導二本鎖に結合されて、変性pBR322プラスミド
のラック・プロモーター／レギュレーター配列が制御す
る遺伝子座に挿入されている〔Goedell等、Nature, 28
1, pp. 544-548 (1981)〕。 【００２０】比較的に『短い』生物学的に機能するポリ
ペプチド、例えば、ヒト・ソマトスタチン（14個のアミ
ノ酸）およびヒト・インシュリン（21個のアミノ酸およ
び30個のアミノ酸の二つのポリペプチド鎖）用のコード
を持つ遺伝子の製造には、完全な合成手順が使用されて
いる。 【００２１】ソマトスタチン遺伝子調製手順〔Itakura
等、Science, 198, pp. 1056-1063(1977）〕では、52個
の塩基対遺伝子が調製され、この遺伝子において、42個
の塩基対が、必要な14個のアミノ酸を定めるコドンであ
り、そして、10個の塩基対が追加されて、構造遺伝子を
微生物形質転換ベクターに結合するために用いられる
『付着末端』一本鎖末端領域の形成を可能としている。
特に、この遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ酵素遺伝子
の末端近くに挿入され、その結果生じる融合遺伝子は融
合タンパク質として発現され、このタンパク質から臭化
シアン切断によってソマトスタチンが分離される。 ヒ
ト・インシュリン遺伝子の製造は、先に述べたように、
21個のアミノ酸鎖と30個のアミノ酸鎖のコードを持つ遺
伝子の調製を伴っている。 18個のデオキシオリゴヌク
レオチド断片を結合して、長い方の鎖のための遺伝子が
調製され、そして、11個の断片を結合して短い方の鎖の
遺伝子が調製された。 各遺伝子は、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子と共に融合遺伝子を形成するために使用さ
れ、個々に発現したポリペプチド鎖は、酵素的に分離さ
れ、結合されて完全なインシュリン分子を形成した〔Go
edell等, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 76, pp. 106
-110(1979）〕。 【００２２】上記した各方法において、デオキシオリゴ
ヌクレオチド断片が調製され、そして、下記の一般的な
方法に従って順次結合された。〔例えば, Agarwal等、N
ature, 227, pp. 1-7 (1970)および Khorana, Science,
203, pp. 614-675(1979)を参照のこと。〕 最初の
『頭』（すなわち、5'→3'極性）デオキシオリゴヌクレ
オチド断片は、酵素的に第２の『頭』断片に結合され
た。 これら２つの『頭』鎖の整列は、第１頭鎖の半分
と第２頭鎖の半分とに相補性を持つ塩基配列を持つ
『尾』（すなわち、3'→5'極性）鎖を使用することで可
能になった。 結合した後に、頭鎖の補体が結合してい
ない塩基は、形成された二重部分から『突き出す』。 【００２３】第２の底鎖が加えられるが、この鎖は、突
き出した頭鎖の５乃至６個の塩基補体を含み、さらに追
加の５乃至６個の塩基が加わるが、これは尾一本鎖部分
として突き出て、そして、２つの尾鎖は接合される。
このような逐次的な付加は、完全な遺伝子配列が形成さ
れるまで続けられ、いずれの方法も、非常に時間を要
し、かつ非常に不能率である。 【００２４】全遺伝子合成に関する前記方法が、時間を
要するという特徴は、先に言及した２つの『短い』イン
シュリン遺伝子の構築を行うのに、少なくとも４人の研
究者による、３カ月に及ぶ作業が必要であったという報
告に良く例示されている。 【００２５】さらに、ベクターの挿入に成功するために
は、比較的に少量の製造された遺伝子が必要なだけであ
るが、上記した合成方法は総収量が非常に低く（１結合
当たり20％のオーダー）、処方に細心の注意を払って作
業を行っても、選択された短い遺伝子のごく少量の分離
さえも保証されるものではない。 合成可能な最大長の
遺伝子において、個々の短い断片を接合する効率には明
らかに限度がある。そのような結合反応が、ｎほど必要
であり、前記した各反応の収率がｙであるとすると、正
しく合成された遺伝物質の量はｙnに比例して得られ
る。 この関係は、指数関数的であるので、１結合反応
当たりの収率の僅かな増加でも、合成できる最大遺伝子
の長さは大幅に増加することになる。 この方法の不能
率さは、主に、望ましくない中間生成物の形成によるも
のである。 一例を挙げると、尾の『鋳型』鎖を伴う、
アニールされた頭鎖を形成する最初の反応における望ま
しい反応は、下記表１のように進行するが； 【００２６】 【表１】 【００２７】実際に得られる生成物は、下記表２に示し
たようなものである。 【００２８】 【表２】 【００２９】さらに、個々のデオキシオリゴヌクレオチ
ドが長くなればなるほど、それらが熱力学的に安定した
自己会合、例えば、『ヘアピン』あるいは集団を形成す
る可能性が高まる。 【００３０】合成効率を高めるための提案は、これまで
ほとんど出されておらず、最近、『現在得られる方法で
は、約30ユニットを超える長さのアミノ酸よりも長いペ
プチドを合成することは経済的に不可能であり、多くの
臨床的に重要なタンパク質はもっと長いものである』と
報告されている〔Aharonowitz等、Scientific America
n, 245, No. 3, pp. 140-152, p.151 (1981)〕。 【００３１】大きな遺伝子の合成に関する『経済的実行
可能性』の例が、ヒト白血球インターフェロンの全合成
の努力の『成功』の最近の発表にみることができる〔Ed
ge等, Nature, 292, pp. 756-782 (1981)〕。 すなわ
ち、約15個の塩基を含む67個の異なるデオキシオリゴヌ
クレオチドが、『50％重複』方法によって合成、接合さ
れて11個の短い二本鎖を形成した。 次に、これらは、
４つのさらに長い二本鎖に構築され、前記した二本鎖は
最後に接合されて、 166個のアミノ酸タンパク質のコー
ドを持つ 514個の塩基対遺伝子をもたらした。 この方
法は、著者等が『迅速』と特徴付けたものであるが、５
人の研究者の約１カ年に及ぶ努力を要したものと確実に
推定され、構築計画の効率は明らかに非常に低い。 一
例として、出発点となった67個のデオキシオリゴヌクレ
オチドは、それぞれ 40pmoleが用意され、11個の中間サ
イズの二本鎖を形成するのために使用されたが、４つの
大きな二本鎖の構築が終わった頃には、全遺伝子を最終
的に構築するために使用可能な、長い二本鎖の収量は僅
かに約0.01pmoleだけであったことを指摘することがで
きよう。 【００３２】産業上および製薬用途に重要なタンパク質
の微生物による発現のための組換えＤＮＡ技術の実施の
ための他の態様は、『コドンの優先性』の現象である。
遺伝的に形質転換された宿主細胞内の遺伝子の発現の
ための、現存する機構が『作用して』所望の生成物を調
製することは既に述べたが、微生物内で行われる発現の
レベルは、大きな変動を示す可能性があり、部分的に
は、挿入された外来性遺伝子内に存在するアミノ酸を特
定する遺伝コードが特定のコードに変化する。 【００３３】４つの可能なヌクレオチド塩基の『三塩
基』コドンは、64個の異なる態様を採る。 これらの態
様が、わずか20個の異なるアミノ酸（さらに、転写の開
始および終了）のメッセージをもたらすということは、
アミノ酸によっては、２つ以上のコドンによってコード
を決めることができることを意味する。実際のところ、
アミノ酸によっては６つもの『冗長な』代替コドンを持
つものもあり、唯一のコドンしか持たないものもある。
いまだ完全には理解されていない理由によって、代替
コドンは異なる種類の細胞の内在性ＤＮＡ内に均一に存
在しておらず、ある種の細胞内のあるコドンには、異な
る自然の序列、すなわち、『優先性』が存在すると思わ
れる。 【００３４】一例として、アミノ酸ロイシンは、CTA、C
TC、CTG、CTT、TTAおよびTTG（それぞれ、mRNAコドン、
CUA、CUC、CUG、CUU、UUAおよびUUGに対応する）の６つ
のＤＮＡコドンの何れによっても特定される。 微生物
のゲノム・コドン頻度の徹底的な解析によって、大腸菌
の内在性ＤＮＡは、 CTGのロイシンを特定するコドンを
最も普通に含むことが判明し、酵母および変形菌類のＤ
ＮＡは、TTAのロイシンを特定するコドンを最も普通に
含むことが判明した。 この序列に鑑みて、大腸菌宿主
によって、ロイシンに富んだポリペプチドの高レベルで
の発現を得る可能性は、ある程度までコドンの使用の頻
度によって決まると一般に考えられている。 例えば、
TTAコドンの豊富な遺伝子は、まず間違いなく大腸菌に
おいては発現が少ないが、CTG の豊富な遺伝子は、ポリ
ペプチドをおそらく多く発現するであろう。 同様に、
酵母細胞が、ロイシンの豊富なポリペプチドの発現のた
めの形質転換宿主細胞である場合は、挿入されたＤＮＡ
で使用するのが望ましいコドンは、 TTAであろう。 例
えば、Grantham等、Nucleic Acids Research, ８,pp. r
49-r62 (1980)；Grantham等, Nucleic Acids Research,
８, pp. 1893-1912 (1980)；及び Grantham等, Nuclei
c Acids Research, ９, pp. r43-r74 (1981)を参照。 【００３５】組換えＤＮＡ方法におけるコドンの優先性
現象が意味するものは明白であり、そして、この現象は
首尾よく形質転換された宿主生物において、外来性遺伝
子での高い発現の実現に失敗した過去の多くの例を説明
するのに役立つ可能性がある。 すなわち、『優先性』
の低いコドンが、挿入された遺伝子に繰り返し存在し
て、発現のための宿主細胞の機構が効率的に機能しない
ではないかと考えられる。 この現象は、優先するコド
ンを宿主細胞に含むように設計され、その設計通りに製
造された遺伝子が、組換えＤＮＡ方法を実施するため
の、外来性遺伝物質の好ましい形態をもたらす。 この
ような関係において、コドンの選択を可能とする迅速、
かつ能率的な全遺伝子製造方法が存在しないことは、こ
の技術における進歩における深刻な障害を残していると
考えられる。 【００３６】本発明の背景に大きく関連するものは、生
物学的活性を呈する物質、インターフェロン(IFN）の調
製および使用に関する技術である。 インターフェロン
は、分泌されるタンパク質であり、詳細に研究された抗
ウィルス活性、抗腫瘍活性、および免疫調節機能を有す
る。 例えば、Gray等、Nature、 295, pp. 503-508(19
82)、ならびに前出のEdge等の文献、およびそこに記さ
れた文献を参照のこと。 【００３７】抗原性および生物学的ならびに化学的性質
に基づいて、ヒト・インターフェロンは、大きく３つ
に、すなわち、IFN-α（白血球）、IFN-β（繊維芽細
胞）、およびIFN-γ（免疫) に分類されている。 ウィ
ルス誘導した酸安定性インターフェロン（IFN-αおよび
IFN-β）の構造および性質に関する、情報の蓄積はかな
り進んでいる。 これら情報は、均質になるまで整理さ
れ、少なくとも部分的には、アミノ酸配列の確認が行わ
れている。 IFN-β1およびIFN-α多遺伝子科のクロー
ニングされたcDNAおよび遺伝子配列の解析によって、多
くのインターフェロンの完全なアミノ酸配列を推定する
ことが可能となった。 さらに、大腸菌におけるIFN-β
1およびいくつかのIFN-α、そして酵母におけるIFN-α1
の効率の高い合成が、これらタンパク質を大量に、生物
学的活性を伴う状態で精製することを可能にした。 【００３８】種々の分裂促進刺激を受けたリンパ球培養
において一般に生成されるインターフェロンである、IF
N-γの構造および性質に関する情報はさらに少ない。
IFN-γは酸に対して不安定で、IFN-αあるいはIFN-βに
対して調製された抗血清とは交差反応しない。 IFN-γ
は広範な生物学的作用を有するものと考えられ、これ
は、IFN-αおよびIFN-βの抗ウィルス作用も向上するも
のであり、IFN-γは、ウィルスおよび細胞の特異性、お
よび誘導される抗ウィルス性機序の点でIFN-αおよびIF
N-βとは異なっている。 粗調製の試料を用いたin vit
ro研究の結果は、IFN-γの主な機能が、免疫調節因子と
しての機能であることを示唆している。 【００３９】形質転換した細胞に対するIFN-γの抗増殖
効果は、IFN-αあるいはIFN-βの10倍から 100倍である
と報告されており、腫瘍の治療用途に使用できる可能性
を示唆している。 ネズミIFN-γ製剤は、マウス肉腫に
対して優れた抗腫瘍作用を持つことが示されている。 【００４０】ヒトIFN-γをコードするcDNA配列を含んだ
組換えプラスミドが分離され、その特性が確認された旨
が、最近報告されている（前出の、Gray等の文献）。
大腸菌および培養したサルの細胞内でのこの配列の発現
が、真正のヒトIFN-γの性質を有するポリペプチドを生
成したことが報告されている。 この発表によれば、cD
NA配列および『成熟』ポリペプチドの推定した 146個の
アミノ酸を含む、推定されるリーダー配列を除いたアミ
ノ酸配列は、下記表３に示した通りである。 【００４１】 【表３】【００４２】先に発表された配列では、グルタミンでは
なくアルギニンが、第140位にあった。 （従って、特
に言及しない限り、『ヒト免疫インターフェロン』ある
いは単に『IFN-γ』と称する場合、〔Arg140〕および
〔Gln140〕の両形態を包含するものとする。） 上述したインターフェロンの広範な生物学的作用に基づ
き、インターフェロンの合成ポリペプチド類似体を調製
することは、このクラスの化合物の治療用途での利用可
能性を具体化する上で、非常に大きな意義がある。 組
換えＤＮＡ法によって、今日まで大量のインターフェロ
ンの分離が行われたにもかかわらず、この分野の専門家
はインターフェロンの合成ポリペプチド類似体の調製に
おいて、具体的な成果を収めていない。 【００４３】換言すれば、前出のGray等の文献に開示さ
れた、IFN-γをコードする遺伝子の分離の研究、ならび
に前出のEdge等の文献に開示された、完全に製造された
IFN-α1遺伝子を取得するための多大な努力は、非常に
精密に決定された、単一のポリペプチド配列の発現のた
めの遺伝物質のみをもたらした。 『真正の』ポリペプ
チドと、１つ以上のアミノ酸の種類あるいは位置が異な
るヒトIFN-γ類似体の微生物による大量の発現を可能に
する方法（特定の部位の突然変異生成の手段は別とし
て）は全く存在しない。 同様に、前出のEdge等の文献
にて調製されたポリペプチドと、アミノ酸が１つ異なる
IFN-α1類似体の調製では、１つの３塩基コドンが異な
る全く新しい遺伝子を調製するのために、さらに１年の
時間が必要になると思われる。 対象遺伝子の断片を切
出して、変種のポリペプチド配列のコード情報を含む断
片で置換するための手段は存在しない。 さらに、報告
されたcDNAから誘導され、製造されたＤＮＡ配列を改変
してコドンを変更することは、選択可能な『オプショ
ン』ではない。 【００４４】実際、組換えＤＮＡ法による変種インター
フェロン・ポリペプチド類の調製の報告は、IFN-α1お
よびIFN-α1のためのヒト遺伝子の『ハイブリッド』調
製および発現に関連するもののみに散見される〔Weck
等, Nucleic Acids Research, ９, pp. 6153-6168 (198
1)および Streuli等, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,
78, pp.2848-2852 (1981）〕。 得られたハイブリッド
は、８つのヒト（cDNA誘導）遺伝子の２つが、偶然に配
列中に１度だけ含まれていることを知見して調製した遺
伝子断片の４つの可能な組合せから構成されており、塩
基配列は、細菌性エンドヌクレアーゼの制限エンドヌク
レアーゼ切断部位PvuIIおよびBglIIに対応する。 【００４５】従って、当該技術分野において、ヌクレオ
チド塩基からインターフェロン等の大きなポリペプチド
をコードする製造されたＤＮＡ配列の、完全な合成のた
めに、さらに効率の良い方法が待望されている。 さら
に、自然に生じる形態のものから選択された１つ以上の
アミノ酸の種類および／または位置が異なる合成ポリペ
プチドの微生物的発現を可能とするような、変異形態の
合成配列の迅速な作成のための合成方法が必要である。 【００４６】 【問題点を解決するための手段】本発明は、長さが約20
0ヌクレオチド塩基対を超える直線状二本鎖ＤＮＡ配列
の完全な合成のための、新規で、迅速で、かつ効率の良
い方法を提供するものであり、前記配列は所望のポリペ
プチドの広範な変異体の合成を司る構造遺伝子のみで構
成されている場合がある。 【００４７】本発明によると、事前に決定された長さが
約200塩基対を超えるアミノ酸の連続配列の発現を、こ
の配列を含む選択されたＤＮＡベクターによって形質転
換された選択された宿主微生物中で実施するためのコー
ドを含む直線状二本鎖ＤＮＡ配列は、下記工程、すなわ
ち； (a) 長さが約100塩基対以上の２つ以上の異なるサブユ
ニット直線状二本鎖ＤＮＡ配列を、選択されたアッセン
ブリー・ベクター内部で構築するための調製工程であっ
て、調製された各々の異なるサブユニットＤＮＡ配列
が、発現対象たる前記アミノ酸配列の異なる連続部分を
コードする一連のヌクレオチド塩基コドンを含み、前記
サブユニットの第１サブユニットの１つの末端領域は、
塩基配列の一部分を含み、この塩基配列は、第１制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断における認識部位をもたら
し、この認識部位は、前記アッセンブリー・ベクターに
サブユニットが挿入された後に、このベクター中に多く
とも１箇所存在するものであり、前記サブユニットの第
２サブユニットの１つの末端領域は、塩基配列の一部分
を含み、この塩基配列は、第２制限エンドヌクレアーゼ
による切断の認識部位をもたらし、この認識部位は、前
記アッセンブリー・ベクターにサブユニットが挿入され
た後に、このベクター中に多くとも１箇所存在するもの
であり、サブユニットの残りの末端領域の少なくとも半
分は、前記第１および第２エンドヌクレアーゼ以外の制
限エンドヌクレアーゼによる切断における認識部位部分
（好ましくは、パリンドロームの６塩基対認識部位）を
含み、この認識部位は、前記アッセンブリー・ベクター
にすべてのサブユニットが挿入された後に、このベクタ
ー中に１箇所のみ存在する、ことを特徴とするものであ
り、および(b) 工程(a) で調製された各サブユニットＤ
ＮＡ配列を、順次、選択されたアッセンブリー・ベクタ
ーに挿入し、次いで、アッセンブリー・ベクター配列の
生物学的増幅を行う工程であって、この工程が、事前に
定められた連続アミノ酸配列をコードする所望のＤＮＡ
配列を含むＤＮＡベクターを形成し、そして、構築され
る所望のＤＮＡ配列が、その中間位置に、制限エンドヌ
クレアーゼによる切断のための少なくとも１つの独特
の、好ましくは、パリンドロームの６塩基の認識部位を
含むようにするものである、工程を含む方法によって合
成される。 【００４８】上記した方法は、好ましくは、さらに所望
のＤＮＡ配列をアッセンブリー・ベクターから分離する
工程を含み、また、好ましくは、新たに１つの新規に製
造されたＤＮＡ配列のクラスをもたらすものであり、こ
の新規の配列はその中間位置に制限エンドヌクレアーゼ
による切断のための、少なくとも１つの独特のパリンド
ロームの６塩基認識部位を有する。 このようにして分
離された配列は、次に、他の『発現』ベクターに挿入さ
れ、アッセンブリー・ベクターが増幅されたものと同
じ、あるいは異なる微生物によって、所望のポリペプチ
ドが直接的に発現される。 この方法に関するその他の
望ましい実施例においては、少なくとも３つの異なるサ
ブユニットＤＮＡの発現が、工程(a)にて行われ、順
次、前記アッセンブリー・ベクターへ、工程(b)によっ
て挿入され、そして、得られた所望の製造されたＤＮＡ
配列は、その中間位置に制限エンドヌクレアーゼによる
切断のための少なくとも２つの独特のパリンドロームの
６塩基認識部位を含む。 この合成されたＤＮＡ配列
は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする前
記構造遺伝子を含み、そして、製造されたＤＮＡ配列で
のヌクレオチド塩基の配列は、前記した選択された宿主
微生物におけるコドンの優先的発現特性に基づいて、同
じアミノ酸を特定する代替コドンの中から選択された１
つ以上のコドンを含む。 【００４９】本発明による新規生成物は、長さが約200
塩基対を超える製造された直線状二本鎖ＤＮＡ配列であ
って、この配列を含む選択されたＤＮＡベクターによっ
て形質転換された選択された宿主微生物での、事前に定
められた連続アミノ酸配列の発現をコードするものであ
って、その中間位置に制限エンドヌクレアーゼによる切
断のための少なくとも１つの独特のパリンドロームの６
塩基認識部位を持つことを特徴とするものが含まれる。
前記した製造された配列の、生物での発現によるポリ
ペプチド生成物も、この新規生成物に含まれる。 【００５０】その例として、本発明により、ヒト免疫イ
ンターフェロン（IFN-γ）、およびヒト免疫インターフ
ェロンとは１つ以上のアミノ酸の種類および／または位
置が異なる新規の生物学的機能を備えた類似体ポリペプ
チドを合成するようコードする新規の遺伝子が製造され
る。 Ｆサブタイプ（『LeIFN-Ｆ』あるいは『IFN-α
Ｆ』）のヒト白血球インターフェロンおよびその類似
体、および協働ヒト白血球インターフェロンの合成をコ
ードする遺伝子も製造される。 【００５１】本発明の方法の実施にて使用するＤＮＡサ
ブユニット配列は、好ましくは、ヌクレオチド塩基か
ら、共同出願であり、本願出願と同時に出願された、Yi
tzhakStabinskyによる、『構造遺伝子の製造および発
現』なる発明の名称の、米国特許出願第 375,493号〔特
表昭59−501096号〕に開示された方法に従って合成され
る。 すなわち、その方法とは、以下の工程、すなわ
ち、(1) ２つ以上の異なる直線状の二本鎖ＤＮＡ鎖を調
製する工程であって、各二本鎖は、12個以上の選択され
た相補性塩基対の二本鎖領域を含み、さらに、この鎖の
一端に３〜７つの選択された塩基の頭一本鎖末端配列お
よび／またはこの鎖の他端に３〜７つの選択された塩基
の尾一本鎖末端配列を含み、各二本鎖ＤＮＡ鎖の各一本
鎖末端配列にて調製されたその他の二本鎖ＤＮＡ鎖の何
れかの、多くて１つの一本鎖末端配列の線塩基相補体を
含むものであり、および(2) 少なくとも27個の選択され
た塩基対の二本鎖領域であって、この塩基対は工程(1)
で調製された二本鎖ＤＮＡ鎖の一本鎖末端配列の相補性
会合によって形成された少なくとも３つの塩基対を含
み、さらに、前記二本鎖ＤＮＡ配列は３〜７つの塩基の
一本鎖頭、あるいは０〜２つの塩基の尾末端領域を有す
る、１つの連続した二本鎖ＤＮＡ配列を形成するため
に、工程(1)で調製された各二本鎖ＤＮＡ鎖を、工程(1)
で調製された相補性一本鎖末端配列を有する１つあるい
は２つの異なる二本鎖にアニーリングする工程、を含む
ことを特徴とするものである。 【００５２】サブユニットの製造のための、この好まし
いプロセスでは、少なくとも３つの異なる二本鎖ＤＮＡ
鎖が工程(1)で調製され、そして、調製された鎖は全て
１つのアニーリング反応混合物中で同時にアニールされ
て単一の連続二本鎖ＤＮＡ配列を形成し、また、この配
列は、少なくとも42個の選択された塩基対の二本鎖領域
を有するものであって、前記した選択された塩基対は、
工程(1)で調製された二本鎖の一本鎖末端配列の相補性
会合により形成された３つ以上の塩基対の少なくとも２
つの近接しない組み合わせを含む。 【００５３】好ましいサブユニット製造方法での、二本
鎖ＤＮＡ鎖の調製工程(1)は、好ましくは、下記の工
程、すなわち、(a) 選択された直線状配列内に、15個以
上の塩基を有する第１および第２の直線状デオキシオリ
ゴヌクレオチド断片を調製する工程であって、前記第２
断片の塩基の直線状配列は、前記第１断片の塩基の配列
の全相補体を含むものであるが、前記第２断片の少なく
とも一端は、前記第１断片を完全に相補する塩基に続い
て３〜７つの選択された塩基の直線状配列を含むか、あ
るいは前記第１断片の末端配列に相補的な３〜７つの塩
基の直線状の配列を欠くものであるが、前記第２断片
は、追加の塩基配列を持つこと、およびその両端に塩基
配列を欠いていないことを特徴とする；および(b) 前記
第１および第２断片を、断片間の相補的会合を促進する
ような条件下にて、組み合わせて１つの直線状二本鎖Ｄ
ＮＡ鎖を形成する、工程を含むものである。 【００５４】形成された二本鎖ＤＮＡサブユニット配列
内の塩基配列は、好ましくは、宿主微生物、例えば、酵
母細胞あるいは細菌、特に、大腸菌内でのコドンの優先
的発現特性に基づいて、同じアミノ酸を特定する代替コ
ドンから選択された１つ以上の三塩基コドンを含む。 【００５５】本発明によって、大腸菌宿主細胞内での選
択された外来性遺伝子の発現のレベルを上昇するための
方法および材料の改善がもたらされる。 具体的には、
発現ベクターは、ポリペプチド・コーディング領域の上
流に、選択されたＤＮＡ配列を含むように構成されるも
のであって、この選択された配列は、顕著に発現された
内在性ポリペプチドに伴うゲノムの大腸菌ＤＮＡに存在
するリボソーム結合部位の複製とする。 目下のとこ
ろ、好ましい選択された配列としては、アウターメンブ
レイン タンパクＦ（『OMP-Ｆ』）の、大腸菌での発現
に伴う、リボソーム結合部位配列の複製がある。 【００５６】本発明のその他の特徴および利点は、以下
の本発明の詳細な説明を考察すれば明らかになろう。 【００５７】本明細書にて使用される、ＤＮＡ配列ある
いは遺伝子に使われる『製造された』の用語は、ヌクレ
オチド塩基の構築により完全に化学的に合成される生成
物か、あるいはそのように化学的に合成された生成物の
生物学的反復複製から得られる生成物を意味する。 よ
って、この用語は生物学的起原の出発材料を用いるcDNA
方法、あるいはゲノムのクローニング法によって『合
成』された生成物を除外する。 以下の表４は、本明細
書にてアミノ酸を表示するために用いるIUPACの一文字
表記を含む略称を示すものである。 【００５８】 【表４】【００５９】一方、下記の表５に示した略称を、ヌクレ
オチド塩基に適用した。 【００６０】 【表５】 【００６１】本発明の理解の一助のために、下記の表６
および表７に、ＤＮＡの64個の三塩基ヌクレオチド塩基
コドンと、20個のアミノ酸との相関関係、ならびに、そ
れで特定される転写終了（『Stop』）を示す。 表中の
ＴをＵに置き換えることで、ＲＮＡの対応する相関が決
定される。 【００６２】 【表６】【００６３】 【表７】【００６４】二本鎖ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切
断における『パリンドローム』の認識部位は、頭と尾の
塩基相補体との間において、左から右ならびに右から左
への対称性を示すもの、すなわち、5'から3'末端までの
認識部位の相補性塩基配列の『読み』が同一であるもの
である。 制限エンドヌクレアーゼによる切断のための
パリンドロームの６塩基認識部位の例としては、頭およ
び尾鎖の5'から3'がAAGCTTであるHindIII による切断部
位がある。 非パリンドロームの６塩基制限部位の例と
しては、頭鎖がCAGCAGの反復配列を示す、EcoP15による
切断部位がある。 【００６５】尾鎖塩基相補体の5'から3'は、CTGCTGであ
る。 つまり、奇数（例えば、５、７）個の塩基からな
る制限部位は、非パリンドロームになる。 エンドヌク
レアーゼによっては、ある部位の変形部位を切断するも
のもあり、この場合の部位は、パリンドロームの場合
と、パリンドロームでない場合がある。 例を挙げれ
ば、XhoIIは、パリンドロームの配列AGATCTおよび非パ
リンドロームの配列GGATCTを含む、（プリン)-GATC-(ピ
リミジン）を認識する。 前述の『BRL制限エンドヌク
レアーゼの一覧表』を参照すれば、エンドヌクレアーゼ
を認識する６塩基配列のパリンドローム的部位は、以下
の表８に示した部位に限られる。 【００６６】 【表８】【００６７】非パリンドロームの６塩基配列のみを認識
するエンドヌクレアーゼは、Tth111II、EcoP15、AvaI、
およびAvrIに限られる。 パリンドロームと非パリンド
ロームの６塩基配列の両方を認識するエンドヌクレアー
ゼを、以下の表９に示した。 【００６８】 【表９】 【００６９】生成しようとする所望のポリペプチドの構
造が決まれば、本発明の実施においては、以下の操作を
必要とする。 長さが100塩基対以上の、２つ以上の適
切な構成の末端部分を有する、異なる特定の連続二本鎖
ＤＮＡサブユニット配列を調製する。 選択された宿主
生物にて、ハイブリッド・ベクターの中間増幅を行いな
がら、選択されたアッセンブリー・ベクターに、サブユ
ニットを順次挿入し、アッセンブリー・ベクター（ある
いは、サブユニットから製造されたＤＮＡ配列を含む他
の選択された『発現』ベクター）を用いて、適切な選択
された宿主を形質転換すること。 そして、宿主生物に
て発現されたポリペプチド発現物を分離する。 その最
も効率の良い態様では、本発明の実施によると、製造さ
れた配列の構築とポリペプチドの大量発現では、同じベ
クターを用いる。 同様に、発現のために利用する宿主
微生物は、通常、サブユニット構築方法で実施される増
幅において用いられるものと同じものを用いる。 【００７０】製造されたＤＮＡ配列は、発現の自律的な
制御のためのプロモーター／レギュレーター領域を備え
ること、あるいは、ベクター内に存在するプロモーター
／レギュレーター配列による発現の制御が可能となるよ
うな方法で、ベクターに取り込むことができる。 本発
明の製造されたＤＮＡ配列は、プラスミド内に存在する
遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）に適切に取り
込まれて製造されたＤＮＡ配列によってコードされ、所
望のアッセンブリー配列を含む、融合ポリペプチド生成
物をコードする融合遺伝子を形成できる。 【００７１】本発明の好ましい実施態様では、製造され
たポリペプチドの大きさは、約65あるいは75個のアミノ
酸から、約200以上のアミノ酸の範囲である。 選択さ
れた形質転換された宿主生物による、所望のポリペプチ
ドの高レベルの発現は、宿主によって優先的に発現され
る１つ以上の代替コドンを含む、ＤＮＡ配列の製造によ
って促進される。 【００７２】長さが100から200塩基対の二本鎖サブユニ
ットＤＮＡ配列の製造は、先に言及した先行技術のアッ
センブリー方法に従って進めることもできるが、好まし
くは、前出のStabinskyによる米国特許出願第 375,493
号に開示され、かつ以下の実施例にて使用された、迅速
で、能率的な方法によって行われる。 すなわち、これ
らの方法は、２つ以上の異なる直線状二本鎖ＤＮＡ鎖
を、デオキシオリゴヌクレオチドから構築するものであ
って、前記ＤＮＡ鎖は、それぞれ比較的に長い二本鎖領
域を、二本鎖の一端あるいは両端の比較的に短い一本鎖
領域と共に含むことを特徴とする。 この二本鎖領域
は、所望のポリペプチドのアミノ酸配列の開始部分、末
端部分、あるいは中間部分の構築を指定するのに必要な
コドンを含む。 【００７３】可能であれば、宿主（例えば、大腸菌）に
よって優先的に発現される、代替コドンが使用される。 【００７４】最終的に構築されるサブユニットＤＮＡ配
列において占める相対的位置によって異なるが、二本鎖
中の一本鎖領域は、他の二本鎖の塩基によって相補され
ると、所望のポリペプチド配列内のアミノ酸を指定する
コドンをもたらす塩基配列を含む。 【００７５】次に、この方法に従って形成された二本鎖
は、相補的な短い一本鎖領域を有する１つあるいは２つ
の異なる二本鎖に酵素的にアニールされて、所望のポリ
ペプチド断片をコードする所望の連続二本鎖サブユニッ
トＤＮＡ配列を形成する。 【００７６】全配列の構築に係る効率ならびに迅速さ
は、前記方法では、３つ以上の二本鎖のためのアニーリ
ング反応を実施することによって改善されるが、前記し
た二本鎖の短い一本鎖領域は、その他の二本鎖の多くと
も１つの他の一本鎖領域の塩基の相補体となる。 その
他の二本鎖の一本鎖領域の１つだけを特異的に相補する
短い一本鎖領域を形成したすべての二本鎖を用意するこ
とは、遺伝コードの冗長性の範囲内で、そして、好まし
くは、宿主生物のコドンの優先性を考慮して、代替コド
ンを選択することによって実現できる。 【００７７】仮想のポリペプチドをコードする仮想の長
いＤＮＡ配列の製造に関する以下の説明は、本発明の実
施において、特に、サブユニットＤＮＡ配列の適切な末
端配列の形成に関する説明において有用である。 【００７８】所望の生物学的活性を有するポリペプチド
を分離し、そのアミノ酸を順番に並べて、連続する100
のアミノ酸残基の配列の構成を明らかにする。 ポリペ
プチドの微生物学的発現のための遺伝子の形成は、選択
された宿主生物の形質転換のために使用される、選択さ
れたウィルスあるいは環状プラスミドＤＮＡベクターへ
挿入するための、少なくとも300塩基対の構築を必要と
する。 【００７９】製造された遺伝子を構成する前に、宿主が
予め決まっておれば、宿主種のコドンの優先性を考慮し
てコドンを選択できるので、微生物宿主の種類を考慮す
る必要がある。 本明細書では、大腸菌宿主を選択する
ものと仮定する。 【００８０】製造された遺伝子の構成において考慮すべ
き第２の点は、アッセンブリー・プロセスで用いられる
ＤＮＡベクターの種類である。 適切なベクターの選択
は、制限エンドヌクレアーゼ酵素によるベクターの切断
部位に関する、現在の知識に基づく。 具体的には、ア
ッセンブリー・ベクターは、サブユニットの容易な挿入
を許容するエンドヌクレアーゼ切断部位をもたらすＤＮ
Ａ配列の存在に基づいて選択される。 この点に関し
て、選択されたアッセンブリー・ベクターは、好ましく
は、少なくとも２つの制限部位を有しており、この制限
部位は、サブユニット挿入プロセスの実施以前には、ベ
クター内で１度しか（すなわち、『固有』である）起き
ない。 【００８１】この説明において、EcoRI 制限部位とは、
以下の部位、すなわち、 【００８２】 【化１】 【００８３】また、Pvu II制限部位とは、以下の部位、
すなわち、 【００８４】 【化２】 【００８５】を有する環状ＤＮＡプラスミドを仮定す
る。 【００８６】次に、アミノ酸の代替コドンの取得可能性
を考慮するために、所望のポリペプチドのアミノ酸配列
を解析する（好ましくは、大腸菌宿主のコドンの優先性
を考慮する）。 この情報を得てから、２つのサブユニ
ットＤＮＡ配列を設計するが、好ましくは、この配列は
約150 対単位の長さを持つものとし、各配列はそれぞれ
所望のポリペプチドの全アミノ酸配列の約半分をコード
する。 この説明において、製造された２つのサブユニ
ットを、『Ａ』および『Ｂ』と称する。 【００８７】本発明の方法を、前記した２つのサブユニ
ットに適用した場合、以下の操作を必要とする。 すな
わち、サブユニットの１つの、アッセンブリー・ベクタ
ーへの挿入；形成されたハイブリッド・ベクターの増
幅；および、第２のサブユニットを挿入して適切な配列
に構築されたサブユニットを含む第２のハイブリッドを
形成することである。 この方法は、２つのサブユニッ
トを接合し、接合された末端が事前に選択された連続し
た塩基配列をもたらし、事前に選択された連続的なアミ
ノ酸配列をコードすることを要するので、もう一方のサ
ブユニットに接合される製造されたサブユニットの末端
領域を構成する塩基の種類および配列に関する必要事項
を含むものである。 この方法は、サブユニットをアッ
センブリー・ベクターに接合することを要するので、ア
ッセンブリー・ベクターに接合される製造されたサブユ
ニットの末端領域を構成する塩基の種類および配列に関
するその他の必要事項を含むものである。 サブユニッ
トは、同時的ではなく、順次にアッセンブリー・ベクタ
ーに挿入される（かつ、サブユニットを、構築した形態
から選択的に切り出して、その中の製造された塩基配列
に変更を加えることができれば、本発明の方法は最も有
利に実施できる）ので、製造されたサブユニットの末端
領域の塩基の種類に関する必要事項がさらに含まれる。
理解を助けるために、以下の末端領域の性質に関する
考察では、サブユニットＡおよびＢの両端の末端領域
を、それぞれＡ−１とＡ−２、およびＢ−１とＢ−２と
称する。 【００８８】すなわち、以下の表10にあるように表現で
きる。 【００８９】 【表１０】 【００９０】まず、サブユニットＡをpBR3000に挿入
し、そして、末端領域Ａ−１をEcoRI制限部位でベクタ
ーに結合する構築計画を立てる。 最も簡単な場合、末
端領域は、単にEcoRI 『付着末端』、すなわち、４塩基
の一本鎖（-AATT-あるいは-TTAA-）を備え、これがpBR3
000のEcoRI 分解で形成される一本鎖配列を相補する。 【００９１】これによってリガーゼ酵素処理をすること
で、末端領域Ａ−１を、ベクターに結合することができ
る。 末端領域Ａ−１の末端の一本鎖に適切な塩基対、
例えば、下記の塩基対、すなわち、 【００９２】 【化３】 【００９３】が先行していないと、完全な認識部位は、
ベクターへの結合によって再構成されない。 この方法
は、結合によるEcoRI 認識部位の再構成の可能性（すな
わち、サブユニットＡをベクターに挿入した後に残った
EcoRI 認識部位の有無）、設計者の裁量に依存する側面
がある。 他の方法として、サブユニットＡの末端領域
Ａ−１を、仮に『XXX 』と称する他のエンドヌクレアー
ゼのための認識部位をもたらす塩基の完全な組み合わせ
を含むように構成し、そして上述したようにしてEcoRI
認識部位の部分を付加してEcoRI 『リンカー』を備えて
もよい。 構築した配列からサブユニットＡを切り出す
ために、実用に供するためには、『XXX』部位は、挿入
によって形成されたハイブリッド・プラスミド中にもあ
ってはならない。 従って、末端領域Ａ−１の構成にお
ける必要事項は、制限エンドヌクレアーゼによる切断の
ための認識部位をもたらす塩基配列部分（すなわち、全
部あるいは一部）を含むことであり、この認識部位をサ
ブユニットに挿入した後のアッセンブリー・ベクター中
の有無を見極める必要がある。 【００９４】サブユニットＢの末端領域Ｂ−２も、アッ
センブリー・ベクターに（例えば、pBR3000に存在する
PvuII切断のための単一の認識部位において）接合する
必要があると想定すれば、末端領域Ｂ−２の構成は、Ａ
−１の構成と同じであるが、但し、Ｂ−２を構成する際
に参照する第２のエンドヌクレアーゼ酵素は、Ａ−１を
構成する際に参照されるものとは異なっていなければな
らない。 認識部位がもし同じであれば、完全に構築さ
れた配列から、断片ＡおよびＢを別々に切り出すことは
できない。 【００９５】上記した想定から、末端領域Ａ−２は、最
終のpBR3000ハイブリッドにおいて末端領域Ｂ−１に結
合する必要がある。 末端領域Ａ−２あるいは末端領域
Ｂ−１のいずれかは、仮想の第３のエンドヌクレアーゼ
『YYY』による制限エンドヌクレアーゼ切断のための認
識部位の部分（好ましくは、パリンドロームの６塩基）
を含むように構成され、前記認識部位は、すべてのサブ
ユニットを発現ベクターに挿入した後に、発現ベクター
中に唯一、すなわち、サブユニット構築における中間位
置に存在することになる。 このような結果を得るため
の方法は幾つかある。 １つの選択可能な方法では、
『YYY』の全認識部位は末端領域Ａ−２に含まれ、この
領域は、増幅のためにサブユニットＡのアッセンブリー
・ベクターへ挿入され、そして、サブユニットＡのサブ
ユニットＢへの接合を可能にするのに必要なエンドヌク
レアーゼ切断のためのその他の認識部位の１つあるいは
２つを有する。 この場合、末端領域Ｂ−１の末端に
は、末端領域Ａ−２に繋ぐのに必要な塩基があるだけで
ある。 他の代替方法では、全『YYY』認識部位は、末
端領域Ｂ−１に含まれ、Ｂ−１はさらにその末端に、サ
ブユニットＡをサブユニットＢに接合するのに役立つエ
ンドヌクレアーゼ切断の認識部位の部分を有する。 【００９６】他の代替計画として、末端領域Ｂ−１は、
その末端に『YYY 』認識部位を含む。 【００９７】これにより、末端領域Ａ−２は全『YYY』
認識部位を含み、さらにその末端に、サブユニットの増
幅前に、アッセンブリー・ベクターにＡ−２を接合する
のに適切な『リンカー』を含むことになる（例えば、Pv
uII『付着末端』）。 サブユニットＡを含むハイブリ
ッドの増幅後に、ハイブリッドは『YYY』によって切断
され（Ａ−２の末端に『YYY』認識部位の付着末端部分
を露出し）、サブユニットＢを挿入することが可能とな
り、その末端領域Ｂ−１は、末端領域Ａ−２の末端と接
合して全『YYY』認識部位を再構成する。 すべての断
片（Ａ−１およびＢ−２を除く) の末端領域の構成に関
して必要なことは、１つ、あるいは一方または両方（す
なわち、『少なくとも半分』）が、第３のエンドヌクレ
アーゼ切断の認識部位の部分を含むことであり、この認
識部位はすべてのサブユニットが、前記アッセンブリー
・ベクターに挿入された後に、前記ベクターにただ１つ
だけ（すなわち、『固有に』）存在する。 本発明の新
規なＤＮＡ配列に分類される配列を生成するためには、
第３のエンドヌクレアーゼの認識部位は、６塩基のパリ
ンドローム的な認識部位でなければならない。 【００９８】前述したサブユニット『認識部位』は、サ
ブユニット末端からサブユニットに沿ってその中心にま
で延びるとも考えられるが、実際のところ、先に述べた
構成は、通常は最後の10あるいは20個の塩基によってな
される。 同様に、２つのサブユニット・アッセンブリ
ー内のユニークな『中間』認識部位は、製造された配列
の一方の末端へ、他方の末端よりも３倍ほど近似しても
よいが、この認識部位は、通常は配列の中央部近傍に置
かれる。 この説明において、接合する３つのサブユニ
ットの調製を含む合成方法が立てられた場合、製造され
た遺伝子は、中間位置に２つの独特の制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位を含むことになり、その内の少なくとも
１つは、本発明の新規のＤＮＡ配列に分類されるパリン
ドローム的な６塩基認識部位を有する。 【００９９】上記プロセスの優れた利点は明白である。
製造された遺伝子が、その長さの中間位置に１つ以上
の独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むので、
切断部位で接合される２つのサブユニットのコドン配列
の変更は、容易に、かつ製造された遺伝子全部を再合成
せずに行うことができる。 【０１００】 【実施例】ヒト免疫インターフェロン(IFN−γ) および
その類似体、Ｆサブタイプのヒト白血球インターフェロ
ン (INF-αＦ）およびその類似体、およびIFN-αＦとの
類縁関係からIFN-αＦ類似体と称することができる多種
の協働白血球インターフェロンの合成を司る能力のあ
る、製造された遺伝子の形成における本発明の実施例を
以下に示した。 【０１０１】以下の実施例から、本発明の遺伝子製造方
法は、非常に柔軟性のある枠組みの中で200塩基対を超
える長さの遺伝子の、真に迅速で、かつ効率的な合成お
よび発現のための総合的な合成方法をもたらすものであ
り、組換えＤＮＡ法を用いる研究者たちがこれまで実現
し得なかった生成物の、構造上の変異体の発現を可能と
することは明白である。 【０１０２】実施例１ ヒトIFN−γの発現のための合成遺伝子を構築する方法
において、最初に行った選択は、所望のポリペプチドの
発現の微生物宿主として大腸菌を選択したことであっ
た。 従って、コドンの選択方法は、前出のGranthamの
論文にて列挙された大腸菌のコドンに対する優先性を考
慮して行った。 第２の選択は、pBR322を発現ベクター
として、そして、重要なことに、サブユニット発現の増
幅に用いるアッセンブリー・ベクターとして選択したこ
とである。 プラスミドが、単一のBamHI、 HindIII、
およびSalI制限部位を含むことが分かっているので、後
者の要素に関してプラスミドを選択した。 これらの制
限部位とヒト免疫インターフェロン内の公知のアミノ酸
配列を考えながら、３つの『大』サブユニットＤＮＡ配
列（IF-3、IF-2、およびIF-1）、および１つの『小』サ
ブユニットＤＮＡ配列（IF-4）を形成する方法が立案さ
れた。 サブユニットの内容を、下記表11〜14に示し
た。 【０１０３】 【表１１】【０１０４】 【表１２】【０１０５】 【表１３】 【０１０６】 【表１４】【０１０７】『小』配列（IF-4）が、４番から１番の
(5'-TGT TAC TGC CAG)アミノ酸のためのコドンおよび開
始メチオニン〔Met-1〕を含んでいることが分かる。
この構成によると、『小』配列は追加の塩基を含んでお
り、後述するpBR322からの発現ベクター・アッセンブリ
ーに関連する制御因子部分をもたらす。 〔Arg140〕IF
N-γのための製造された遺伝子の合成のために使用する
サブユニットIFN-１の代替態様は、第140番目のアミノ
酸を特定するコドン部位に、 5'-CAG(〔Gln140〕のため
の）の代わりに、コドン5'-CGTを含んでいた。 【０１０８】合成されたポリペプチドの特定部分の全Ｄ
ＮＡの発現のための頭鎖用のコドンの配列は、下記表15
に示した通りであった。 【０１０９】 【表１５】 【０１１０】上記の配列において、制御塩基配列および
開始メチオニンコドンは示されておらず、末端配列ある
いは末端SalI制限部位をもたらす配列も示されていな
い。 【０１１１】縦線が、各サブユニット配列に関する頭鎖
部分を分けている。 【０１１２】次の実施例は、本発明のＤＮＡ配列の製造
において使用するデオキシオリゴヌクレオチドの調製の
ための、好ましい方法を示すものである。 【０１１３】実施例２ オリゴヌクレオチド断片を、４段階方法と、途中での数
回の洗浄によって合成した。 半融ガラス漏斗に入れら
れた重合結合したジメトキシトリチルに保護されたヌク
レオシドは、最初にジクロロメタン中で３％三塩化酢酸
を用いて、 1.5分間、5'−保護基を除去した。 そし
て、ポリマーを、メタノール、テトラヒドロフラン、お
よびアセトニトリルを用いて洗浄した。 洗浄したポリ
マーを、乾燥アセトニトリルで洗浄し、アルゴン中に置
いた。 次いで、以下のような凝縮処理を施した。 ア
セトニトリルに10mgのテトラゾールを溶かした溶液 0.5
mlを、ポリマーを入れた反応容器に加えた。 そして、
アセトニトリルに溶かした30mgの保護されたヌクレオシ
ド 0.5mlが加えられた。 【０１１４】この反応液を撹拌し、２分間、反応させ
た。 反応物質を吸引によって除去し、ポリマーをアセ
トニトリルで洗浄した。 酸化処理に続き、2-6-ルチジ
ン/H2O/THF、1:2:2 に0.1モルのＩ2を含む溶液１mlを、
２分間、ポリマーに結合したオリゴヌクレオチド鎖と反
応させた。 THFで洗浄した後に、ジメチルアミノピリ
ジン(100mlのTHF中に6.5ｇ）および無水酢酸の4:1の溶
液中で、２分間、キャッピングを行った。 その後、メ
タノールによる洗浄、およびTHFによる洗浄が続いた。
そして、CH2Cl2中の三塩化酢酸による処理で再び、一
連の操作（サイクル）を開始した。 このサイクルは、
所望のオリゴヌクレオチド配列が得られるまで繰り返さ
れた。 最終的なオリゴヌクレオチド鎖は、室温で、45
分間、チオフェノール、ジオキサン、トリエチルアミン
の1:2:2 によって処理された。 ジオキサン、メタノー
ル、およびジエチルエーテルで洗浄した後に、オリゴヌ
クレオチドを、ポリマーから水酸化アンモニウムを用い
て、室温にて、切り出した。 【０１１５】溶液をポリマーから除去した後に、濃縮水
酸化アンモニウム溶液中で、栓をした試験管中で、60℃
で、16時間、加熱した。 そして、1-ブタノールを用い
てオリゴヌクレオチド溶液を４度抽出した。 次いで、
溶液を、20％ポリアクリルアミド7M尿素電気泳動ゲルに
充填し、泳動を行った後に、適切なＤＮＡバンドを分離
した。 【０１１６】そして、サブユニットIF−１の構築のため
の方法に従って、デオキシオリゴヌクレオチドからサブ
ユニットを構築した。 【０１１７】所望の14個のＤＮＡ配列を分離した後に、
サブユニットIF−１を、以下の方法で構築した。 １．5'接着末端を含んだ、断片13および断片２を除く、
各ＤＮＡ断片１nmolを5'燐酸化した。 ２．ＤＮＡの相補性鎖、断片13と14、11と12、９と10、
７と８、５と６、３と４、および１と２を組み合わせ、
90℃まで加熱した後に、25℃まで徐冷した。 ３．得られたアニーリングしたＤＮＡ対を、順次組み合
わせ、37℃まで加熱した後に、25℃まで徐冷した。 ４．断片１から断片14までをすべて含む最終の、試験管
内のATPおよびDTTの濃度はそれぞれ、 150μＭおよび18
μＭに調整された。 この溶液に、20単位の T-4DNAリ
ガーゼを加え、反応物質を、４℃で、18時間、インキュ
ベートした。 ５．得られた粗生成物を、90℃までの温度で、２分間、
加熱し、10mMトリエチル重炭酸アンモニウムを溶離剤と
する、セファデックスG50/40上でゲル濾過した。 ６．所望の生成物を、5'燐酸化後に、８％ポリアクリル
アミド-TBEゲルを用いて精製した。 【０１１８】サブユニットIF-2、IF-3、およびIF-4を、
同様な方法で構築した。 【０１１９】次の実施例は、サブユニットIF-1、IF-2、
IF-3、およびIF-4からのヒト免疫インターフェロンの構
築、および、適切な栄養状態下での形質転換した大腸菌
細胞の培養、細胞からのヒト免疫インターフェロンの分
離、および分離されたインターフェロンの生物学的活性
の検定に関する。 【０１２０】実施例３ 完全なヒトIFN-γを特定する遺伝子を、サブユニットIF
-1、IF-2、およびIF-3から構築する方法の主要工程を、
第１図に示した。 【０１２１】136 塩基対サブユニットIF-1を、ゲルから
電気溶出し、エタノールで沈澱させた後に、再び水に0.
05pmole/μl の濃度で懸濁した。 プラスミドpBR322
(2.0 pmole）を、EcoRI およびSalIによって消化し、ホ
スファターゼで処理し、フェノールで抽出し、エタノー
ルで沈澱し、そして、再び水に 0.1pmole/μl で懸濁さ
れた。 結合は、0.1pmoleのプラスミドと 0.2pmole の
サブユニットIF-1とを用いて、T-4 DNA リガーゼによっ
て行われ、そして、ハイブリッド・プラスミドpINT1 が
形成された。 大腸菌が形質転換されてから、多数のpI
NT1 のコピーが分離された。 【０１２２】上記の方法は、153塩基対のサブユニットI
F-2を挿入してpINF2を形成するために繰り返されたが、
プラスミドは、EcoRIおよび BglIIで消化した。 153塩
基対のIF-3サブユニットは、pINT3 の製造の際に同様に
pINT2 に挿入されたが、プラスミドの消化にはEcoRI お
よびHindIII を使用した。 【０１２３】IF-4サブユニットは、最終の発現ベクター
の構成の際に下記のように使用した。 【０１２４】まず、プラスミドPVvIは、カリフォルニア
州、パロ・アルトのスタンフォード大学から購入し、Pv
uIIで消化した。 標準的な方法を用いて、EcoRI認識部
位をプラスミドのPvuII部位に挿入した。 このハイブ
リッドのコピーは、 EcoRIおよびHpaIによって消化さ
れ、trpプロモーター／オペレーター領域部分を含む245
塩基対の配列をもたらした。 標準的な方法を用いて、
免疫インターフェロンの最初の４つのアミノ酸（Cys-Ty
r-Cys-Gln)用のコドンをもたらす全trp翻訳開始シグナ
ルおよび残りの37塩基対を取り込むために、IF-4が、Hp
aI部位に付加された。 得られた構築体を、 EcoRIおよ
びBamHI によって消化し、pINT3に挿入することで、pIN
Tγ-TRPI7と称するプラスミドが生成した。 pINTγ-TR
PI7を含む大腸菌細胞は、吸光度（λ＝600nm)が１のト
リプトファンの存在状態で、Ｋ培地で培養された。 イ
ンドールアクリルIII が20μg/mlの濃度で加えられ、細
胞をさらに２時間、37℃で、培養した。 細胞を、遠心
分離によって収穫し、細胞ペレットを、HEPES緩衝ウシ
新生児血清（pH8.0)中に再懸濁した。 細胞は、10,000
psi でフレンチ・プレスに１度適用して溶解した。 細
胞溶解産物を、遠心分離によって残滓を除去し、上清液
を、CPE 検定〔『インターフェロン・システム』、Spri
nger-Verlag編、ニューヨーク、ニューヨーク州（198
1）〕によって、抗ウィルス性に関して調べた。 分離
された発現生成物を、γ-1と命名した。 【０１２５】本実施例は、プラスミドpINTγ-trpI7のＤ
ＮＡ配列の変更に関するものであり、この変更は、例え
ば、IFN-γおよびIFN-αＦの類似体をコードする構造遺
伝子の、trpプロモーター制御発現におけるベクターの
使用を容易にした。 【０１２６】実施例４ すでに述べたように、断片IF-4は、開始メチオニンコー
ドの塩基、IFN-γの最初の４つのアミノ酸、およびtrp
プロモーター／オペレーター発現のための3'末端で終了
し、シャイン・デルガルノ・リボゾーム結合配列を含む
37個の塩基対（HpaI平滑末端を有するその5'末端から始
まる）を含むように構成されている。 【０１２７】IFN-γ類似体およびIFN-γ以外のポリペプ
チドをコードする配列に関連する操作は、全trp プロモ
ーター／オペレーター領域に制限部位3'が設けられれば
容易になることは明らかであった。 例を挙げると、そ
の他の遺伝子用のIF-4に対応する配列は、trpプロモー
ター／オペレーターを再構成するのに必要な全37塩基対
を再び構築しなくとも、構築することができ、完全なプ
ロモーター／オペレーターを有する適切な読取枠中への
挿入を容易にするような塩基を、5'末端に必要とするだ
けである。 【０１２８】この目的にかなうように、配列IF-4を、tr
pプロモーター／オペレーターを完成する塩基対に、Xba
I制限部位3'を組み込んで再構築した。 この構成を、
以下の表16に示した。 【０１２９】 【表１６】 【０１３０】この断片IF-4の変異体は、pINTγ-trpI7
(HpaIおよびBamHIで消化したもの）に挿入され、プラス
ミドpINTγ-TXb4を生成し、このプラスミドのIFN-γを
コードする遺伝子は、XbaIおよびSalIで消化でき、そし
て、全trpプロモーター／オペレーターは大きな断片に
とどまる。 【０１３１】次の実施例は、IFN-γの構造類似体の構築
に関するものであり、そのポリペプチド構造は、１つ以
上のアミノ酸の種類あるいは位置が、IFN-γとは異な
る。 【０１３２】実施例５ IFN-γの類似体の第１分類が形成されたが、これは81位
にアスパラギンの代わりにリジン残基を含むものであっ
た。 この類似体を生成するために必要な単一の塩基配
列の変更は、表11〜14のサブユニットIF-2の断片35およ
び36であった。 【０１３３】アスパラギンを定めるコドンAACは、リジ
ンを定めるコドンAAGによって置き換えられた。 この
ように変更されたＤＮＡ配列〔Lys81〕IFN-γの発現生
成物は分離されて、γ-10と命名された。 IFNγ類似体
の他のクラスは、アミノ酸発現に関与する１つ以上の潜
在的な糖タンパク質化部位が削除されたポリペプチドを
含む。 具体的には、これらは〔Arg140〕IFN-γあるい
は〔Gln140〕IFN-γを含み、これらポリペプチド配列は
１つ以上の自然に生じる配列〔−(AsnあるいはGln)−
(アミノ酸)-(SerあるいはThr)−〕を含むことができ
ず、この配列は、ポリペプチドの糖タンパク質化部位を
もたらすことが分かっている。 この配列の１つは、IF
N-γにおいて、28〜30位 (Asn-Gly-Thr)を占め、他のも
のは101〜103位(Asn-Tyr-Ser) を占める。 28〜30位の
変更を伴う本発明による類似体の調製では、４つの全て
のIFN-γサブユニットを含むプラスミドを、BamHIおよ
びHindIIIによって切断してサブユニットIF-3を除去
し、続いてサブユニットIF-3の変異体を挿入するが、こ
の変異体において、アスパラギンのAACコドンは、グル
タミンのコドンCAGに置換される。 （先の置換は、デ
オキシオリゴヌクレオチド断片37を変更して、AACでは
なくCAGを含むようにし、さらに断片38を変更して、TTG
ではなくGTCを含むようにする。 表11〜14を参照のこ
と。） この変更されたＤＮＡ配列〔Gln28〕IFN-γの
発現生成物は分離されて、γ-12 と命名された。このタ
イプのポリペプチド類似体は、酵母細胞で発現されても
糖タンパク質化されないように思われる。 このように
して生成されたポリペプチド類似体は、自然に生じるIF
N-γとは、自然形態の抗体との反応性において、あるい
は抗増殖あるいは免疫調節薬理学的効果において、明ら
かな違いがあるとは考えられないが、ある形態におい
て、幾つかの態様で優れた薬効を示す可能性がある。 【０１３４】IFN-γのその他の分類では、〔Trp39〕残
基が〔Phe39〕に置換され、および／または、48、80、1
20および137位のアミノ酸位置にて、メチオニンが、例
えば、ロイシンによって置換され、および／または、１
および３位のアミノ酸位置にて、システインが、例え
ば、セリンによって置換されているか、あるいは、完全
に除去されたポリペプチドを含む。 最後に述べた類似
体は、分子間のジスルフィド結合形成能力が無いので、
微生物で発現すると、より容易に分離できる可能性があ
る。 【０１３５】39位のトリプトファンのフェニルアラニン
による置換は、サブユニットIF-3のTGGコドンを、TTC
(TTTも使用できた）で置換することを必要とし、これ
は、デオキシオリゴヌクレオチド断片33の変更（TGGか
らTTCへ）、およびIF-3を製造するために使用された重
複断片36の変更（TGAからTACへ）によって補われた。 【０１３６】〔Phe39、Lys81〕IFN-γは、前記した変更
されたＤＮＡ配列（上記した81位のアスパラギンをリジ
ンで置換することも含む）の発現生成物を分離したもの
であり、γ-5と命名した。 【０１３７】同様に、48、80、120および137位の１つ以
上のメチオニンの置換は、サブユニットIF-3（デオキシ
オリゴヌクレオチド断片31、32および33の再構成と共
に）、サブユニットIF-2（デオキシオリゴヌクレオチド
断片21および22の再構成と共に）、そして、サブユニッ
トIF-1（デオキシオリゴヌクレオチド断片７と10および
／あるいは３と４と共に）の変換に関係する。 48位で
トレオニンがメチオニンに代わったIFN-γの類似体は、
サブユニットIF-3内の断片31を変換してメチニン特定コ
ドンATG を消失し、ACT コドンで置換することによって
得られた。 【０１３８】この変化を起こすために、断片34の変換(T
ACからTGA)も必要であった。 【０１３９】〔Thr48、Lys81〕IFN-γは、前記した変換
されたＤＮＡ配列（81位にリジンを特定するコドンも含
む）の発現生成物を分離したものであり、γ-6と命名さ
れた。 【０１４０】１および３位のシステインの置換あるいは
削除は、サブユニットIF-4の変換のみに関係する。 第
１の例として、サブユニットIF-4の構成を変換して、１
および３位の両システインを特定するコドン（それぞれ
TGTおよびTGC)を、セリンを特定するコドンTCTで置換す
るには、２つの断片の再構成を必要とするだけであった
（表11〜14のｅとｆ）。 〔Ser1、Ser3、 Lys81〕IFN-
γは、前記したようにして変換された〔Lys81〕IFN-γD
NA 配列の発現生成物から分離されたものであり、γ-2
と命名した。 他の例として、〔Lys1、Lys2、Gln3、Ly
s81〕IFN-γは、γ-3と命名され、サブユニットIF-4の
構成変換による発現生成物として得られたが、そこで
は、コドンAAA、AAAおよびCAAが、それぞれ、TTG、TAC
およびTGCに代わっていた。 最後に、〔des-Cys1、des
-Tyr2、des-Cys3、Lys81〕IFN-γは、γ-4と命名した
が、アミノ酸特定領域のサブユニットIF-4断片を、以下
のように変換することによって得られた。 【０１４１】 【化４】 【０１４２】遺伝子の開始のアミノ酸コーディング領域
の上述した変換は、実施例４のpINTγ- TXb4の構成によ
って顕著に促進されたが、これは、アミノ末端タンパク
質コーディング配列を完成して、遺伝子を完全なtrpプ
ロモーターに結合するために、BbaIおよび BamHI付着末
端を有する短い配列の調製に止まったことによる。 【０１４３】本発明によって提供される、IFN-γ類似体
ポリペプチドのその他の分類には、以前からポリペプチ
ドの第２および第３の立体配置に関連すると考えられて
いたアミノ酸が、IFN-γのアミノ酸と異なるものが含ま
れている。 一例を挙げれば、IFN-γポリペプチド内の
中間位置にシステイン残基を導入すると、IFN-αに見ら
れるようなアミノ末端残基と中間のシステイン残基との
間に分子間ジスルフィド結合の形成を促進する構造を有
するポリペプチドを生成する。 さらに、本発明に従っ
て、ポリペプチドにプロリンを挿入するか、あるいは欠
失させると、曲折した立体配置に変化が生じて、生物学
的活性にも影響があると考えられる。 【０１４４】〔Lys81、Cys95〕IFN-γを、γ-9と命名し
たが、サブユニットIF-2の断片17および18の配列を、 【０１４５】 【化５】 【０１４６】に代えて 【０１４７】 【化６】 【０１４８】で変異したＤＮＡ配列の発現物から分離さ
れた。 〔Cys95〕IFN-γ（γ-11と命名した）を特定す
るＤＮＡの発現が、同じ方法によって、目下のところ調
製中である。 同様に、〔Cys95、Pro104〕IFN-γをコ
ードする遺伝子も、トレオニンを特定するコドンACA
（IF-2の断片15）を、プロリンを特定するコドンCCAに
変換することによって、調製しているところである。 【０１４９】〔Glu5〕IFN-γは、γ-13 と命名されてお
り、サブユニットIF-3の断片43を、アスパラギン酸を特
定するコドンGAT ではなく、グルタミン酸塩を特定する
コドンGAA を含むように変換することで得られる。 こ
の変更は、その遺伝子座にBamHI 認識部位を存在するこ
とを許容しないと考えられるので、サブユニットIF-3
は、複合サブユニットとして、サブユニットIF-4のアミ
ノ酸を特定する部分を含むものとして調製する必要があ
り、構築された遺伝子のXbaIとHindIIIの間には制限部
位は無くなる。 このIFN-γ類似体は、自然に生じる類
似体よりも、酸に対して安定している考えられる。 【０１５０】上述したトリプトファンおよび／またはメ
チオニンおよび／またはシステイン置換による上記の類
似体は、自然に生じるIFN-γと比較して、自然に生じる
類似体に対する抗体との反応度あるいは抗増殖薬効ある
いは免疫調節作用の点において異なるとは考えられない
が、薬理学的効果はより大きいものと期待されている。 【０１５１】さらに他の類似体の分類では、『ハイブリ
ッド』あるいは『融合した』タイプのポリペプチドがあ
り、これらは決定された配列の末端に、１つ以上の追加
のアミノ酸を含む。 これらは、IFN-γをコードする全
配列に、他の製造されたＤＮＡ配列、例えば、後述する
LeIFN-Conに特有のポリペプチドの配列をコードするサ
ブユニットの１つを追加することによって形成される遺
伝子によって発現されるであろう。 発現されるポリペ
プチドは、自然に生じるIFN-γの抗体反応を残し、そし
て、LeIFN の抗体反応を示すと考えられる。 その薬理
学的な作用は、薬効および持続期間の２点において、自
然に生じるIFN-γに優るものと考えられている。 【０１５２】以下の表17は、本発明に従って調製された
IFN-γと試験された幾つかの類似体に関する、抗ウィル
ス作用の研究結果をまとめたものである。 相対的な抗
ウィルス作用を、脳心筋炎ウイルス(EMCV)に感染したヒ
トHeLa細胞において検定し、IFN-γに対するモノクロー
ナル抗体による結合に関して免疫吸着分析によって決定
した。 【０１５３】 【表１７】 【０１５４】次の実施例は、所望の生成物の発現を促進
する、これまでの実施例でのＤＮＡ配列におけるポリペ
プチド・コーディング領域の変換に関するものである。 【０１５５】実施例６ IFN-γおよびIFN-γ類似体をコードする製造されたＤＮ
Ａ配列の、微生物での発現によるポリペプチド生成物に
関する分析結果から、２つの主要なタンパク質が、ほぼ
同じ量だけ製造されたことが明らかになった。 １つ
は、完全な146個のアミノ酸配列に対応する17Ｋ形態
で、他方は、アミノ末端の約50個のアミノ酸を失ったイ
ンターフェロン断片に対応する12Ｋ形態である。 製造
された遺伝子におけるコドンの使用を検討した結果、短
いコドンは、塩基配列の3'末端が、シャイン−デルガル
ロ・リボソーム結合配列に類似しているために生じた、
Met48残基での微生物の翻訳開始の末に形成された可能
性が高いことが明らかになった。 【０１５６】このように、転写されたmRNAの約半分は、
初めのメチオニンに先行する遺伝子座においてのみリボ
ソームと結合したが、残りの半分はMet48コドンに先行
する遺伝子座で結合されたように思われた。 ポリペプ
チド・コーディング領域内でのリボソーム結合の生成可
能性を減少するために、サブユニットの断片33および34
を再構成した。 具体的には、41位にグルタミン酸塩残
基を特定するのに用いられたGAGコドンは、他のGAAコド
ンに変えられ、45位にアルギニンを特定するために用い
たCGTコドンは、他のCGCコドンに変えられていた。 こ
れらの変更は、IFN-γのγ−６類似体を特定する遺伝子
を調製する際に実施され、適切な長さの単一の優勢な種
類のポリペプチドが生成した。 【０１５７】以下の実施例７および８は、ヒト白血球イ
ンターフェロンのＦサブタイプ（『LeuIFN-F』あるいは
『IFN-αＦ』）、およびそのポリペプチド類似体を特定
するように製造されたIFN-αを生成するための本発明の
方法に関する。 【０１５８】実施例７ Ｆサブタイプのヒト白血球インターフェロンのためのア
ミノ酸配列は、cDNAクローンの配列の解析結果から推定
される。 例えば、 Goedell等, Nature, 200,pp. 20-2
6 (1981)を参照のこと。 pBR322誘導発現ベクターを用
いてIFN-αＦを大腸菌内で微生物的に発現するために使
用する、製造されたＤＮＡ配列を設計および構築するた
めに、実施例１、２および３の方法を使用した。 ３つ
の『大』サブユニットＤＮＡ配列（LeuIFN-F、LeuIFN-F
II、およびLeuIFN-FIII）および１つの『小』サブユニ
ットＤＮＡ配列（LeuIFN-FIV）を構成するための方法が
立案され、サブユニットの内容を以下の表18〜21に示し
た。 【０１５９】 【表１８】 【０１６０】 【表１９】【０１６１】 【表２０】【０１６２】 【表２１】【０１６３】表23〜26に示す遺伝子製造方法の場合と同
様、表18〜21の方法では、デオキシリボヌクレオチド断
片の構成に支障のない限り、微生物にて優先されるコド
ンの使用と関連する。 サブユニットを用いる発現ベク
ターの作成は、IFN-γを特定する遺伝子に関連する方法
と似通っており、使用される制限酵素に僅かな違いがあ
るだけである。 サブユニットＩは、EcoRIおよびSalI
によって切断されたpBR322に結合される。 （サブユニ
ット末端部分は、一本鎖SalI『付着末端』を含むが、相
補が行われると、SalI認識部位は再構成されないことに
注意されたい。 【０１６４】しかしながら、全BamHI 認識部位は残存
し、その後のサブユニットの切出しを可能にする。）
この第１中間プラスミドは増幅され、サブユニットII
は、再びEcoRIおよび SalIによる切断後に、増幅された
プラスミドに挿入される。 このようにして形成された
第２中間プラスミドは増幅され、そしてサブユニットII
Iは、EcoRIおよびHindIIIで切断され、増幅されたプラ
スミドに挿入される。 【０１６５】このようにして形成された第３中間プラス
ミドを増幅する。 サブユニットIVは、実施例４のpINT
γ-TXb4 から分離されたEcoRI およびXbaI断片に結合さ
れ、この結合生成物（EcoRIおよびBstEII付着末端を持
つ）は、EcoRIおよびBstEIIによって切断され、増幅さ
れた中間プラスミドに挿入されて、最終の発現ベクター
を生成する。 【０１６６】最終発現ベクターに挿入された表18〜21に
記載の、製造されたＤＮＡ配列のtrpプロモーター／オ
ペレーターに制御された大腸菌による発現物から分離さ
れた生成物を、IFN-αＦ1と命名した。 【０１６７】実施例８ 後述の協働白血球インターフェロンに関する記述にて言
及するように、14位にトレオニン残基、および16位にメ
チオニン残基を含むヒト白血球インターフェロン・サブ
タイプが、Ala14およびIle16残基を有するサブタイプよ
りも、高い抗ウィルス作用を示すことは良く知られてい
る。 従って、ヒト白血球インターフェロン・サブタイ
プＦの類似体が、実施例７のＤＮＡ配列の微生物による
発現によって製造されたが、これらの配列は残基14およ
び16に、トレオニンおよびメチオニンをそれぞれ特定す
るように変更されている。 具体的には、〔Thr14、Met
16〕IFN-αＦは、IFN-αＦ2 と命名され、SalIおよびHi
ndIIIで切断した上で変更されたサブユニットII（表18
〜21のもの）を挿入した、表18〜21のベクターで形質転
換した大腸菌内で発現された。 サブユニットIIに係る
上記変換は、アラニンを特定するコドンGCTを、トレオ
ニンを特定するACTコドンで置換し、かつイソロイシン
を特定するコドンATTを、ATGのコドンで置換することに
よって変換された断片39の構築を必要とした。 相補性
塩基の対応する変更は、サブユニットLeuIFN-FIIの断片
40内で行われた。 【０１６８】以下の実施例９および10は、ヒト白血球イ
ンターフェロン・サブタイプＦの類似体と命名できる、
協働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチドの、微
生物による合成に関する本発明の実施例である。 【０１６９】実施例９ 本明細書において、『協働ヒト白血球インターフェロ
ン』（『IFN-Con』、『LeuIFN-Con』）とは、自然に生
じないポリペプチドを意味し、このポリペプチドは、自
然に生じるすべてのヒト白血球インターフェロン・サブ
タイプ配列に共通するアミノ酸残基を含み、かつ全ての
サブタイプに共通するアミノ酸が存在しない位置に優勢
に生じるアミノ酸を含み、常に少なくとも１つの自然に
生じるサブタイプに存在しないアミノ酸残基は含まない
ものを言う。 （この定義では、サブタイプＡは、他の
サブタイプと位置的に整理され、44位に『欠けている』
アミノ酸があることが明らかになる。） この定義によ
ると、協働ヒト白血球インターフェロンは、通常は、す
べてのサブタイプでの公知のすべての共通アミノ酸残基
を含むことになる。 自然に生じるサブタイプ配列に関
する知見が、常に進展しているのは周知の通りである。
特定の位置での特定の残基の『共通性』を否定する、
新しいサブタイプが後に発見されるかも知れない。 １
つ以上の位置の後に、改訂された共通性の決定に基づい
て構造が予測されるポリペプチドにもこの定義が適用で
きると思われる。 なぜなら、これらは共通のアミノ酸
を含み、さらに、もはや共通とは考えられなくなったア
ミノ酸が、当該位置での支配的なアミノ酸であると考え
られるからである。 何れかの位置において共通の、あ
るいは支配的なアミノ酸を含まないポリペプチドでも、
その位置での残基が、少なくとも１つのサブタイプで生
じれば先の定義に当てはまることになる。 協働ヒト白
血球インターフェロンの内部あるいは末端の１つ以上の
残基を欠くか、あるいは、いずれのサブタイプにも類縁
体の無い内部あるいは末端の残基を有するポリペプチド
は、ヒト協働白血球インターフェロンの類似体と見なさ
れる。 【０１７０】８つのcDNA誘導ヒト白血球インターフェロ
ン・サブタイプの、発表された推定アミノ酸配列は、16
6 残基の配列内のアミノ酸の種類に関して解析されたも
のである。 一般には、Goedell等、Nature、290、pp.
20-26 (1981)を参照のこと。 【０１７１】この論文は、LeIFN-ＡからLeIFN-Ｈまでを
比較し、79個のアミノ酸だけが、８つのすべてのインタ
ーフェロン態様の同一の位置にあり、Ｅサブタイプ（cD
NA偽遺伝子から得られたもの）を無視すれば、99個のア
ミノ酸が同じ位置にあると指摘するものであった。 残
りの位置について、それぞれのアミノ酸の相対的な存在
頻度が分析され、１つのアミノ酸が８つの態様の内の少
なくとも５つ態様と同じ位置にある場合は、そのアミノ
酸はその位置での支配的なアミノ酸であるとされた。
166 個のアミノ酸の『協働』ポリペプチド配列を図示
し、８つの個々の配列と比較した。 その結果、LeIFN-
Ｆのその『自然に生じる』態様を、僅かに変えるだけで
協働配列に従うことが判明した。 【０１７２】製造されたIFN-Con ＤＮＡ配列を調製する
方法を設計した。その配列を、以下の表22に示した。
この表において、LeIFN-Con1、すなわち、IFN-αＦの
〔Arg2 2、Ala76、Asp78、Glu79、Tyr90、Leu96、Th
r156、Asn157、Leu158〕類似体を生成するために、IFN-
αＦに加える必要のある変更を星印で示した。 図示れ
た頭鎖配列は、必要であれば、大腸菌内の優先的発現の
対象となるコドンを含む。この配列は、配列の中間の位
置にSal、HindIII、およびBstE2の認識部位を導入する
塩基、そして、配列の両末端にはXBaIおよびBamHI の認
識部位を導入する塩基も含む。 後者の部位は、IFN-α
Ｆおよびその類似体のために調製された配列の場合と同
様に、この配列を、pBR322ベクターに組み込むために選
択された。 【０１７３】 【表２２】【０１７４】以下の表23〜26は、IFN-Con1の製造のため
に使用する４つのサブユニットＤＮＡ配列の調製のため
の、二本鎖ＤＮＡ配列を示している。 サブユニットLe
uIFN-ConIVは、表22のLeuIFN-FIVの複製である。 IFN-
αＦ遺伝子を調製するために用いたものと異なるサブユ
ニットの断片は『プライム記号』で示した（例えば、3
7' および38' は、22位において、グリシンではなく、
アルギニンをもたらす必要のある37および38を変形した
ものである）。 【０１７５】 【表２３】【０１７６】 【表２４】 【０１７７】 【表２５】【０１７８】 【表２６】【０１７９】表23〜26の４つのサブユニットを、実施例
７の方法に従って順次発現ベクターに挿入し、trpプロ
モーター／オペレーターの制御を受ける表22のコーディ
ングリボソームを有するベクターを生成した。 このベ
クターの大腸菌での発現生成物を、IFN-Con1と命名し
た。 このポリペプチドは、前出のGoedell 等の文献に
示された全ての共通の残基を含んでおり、さらに、Ser
80、Glu83、Val114およびLys121を除いて、参照文献に
開示された配列の要約にある分析によって明らかとなっ
た支配的なアミノ酸も含んでいる。 上記した４つの残
基は、サブユニットの形成と発現ベクター内への組み込
みを容易にするために、天然のIFN-αＦ配列にて保持さ
れていた。 （例えば、セリンは、80位に保持されて、
HindIII部位の形成を可能とした。） Goedell 等のIFN-αサブタイプの要約の発表後に、いく
つかの追加のサブタイプが確認された。 図２は、現在
知られている13個のサブタイプ（公知の５つのcDNA偽遺
伝子によ明らかになったものは除く）の推定された配列
を、表の形で示しており、他の研究所が同じIFN-αサブ
タイプに付けた他の名称を括弧内に示した（例えば、IF
N-α６およびIFN-αＫ）。 例えば、前出の Goedell等
の文献、Stebbing等、組換えＤＮＡ生成物、インシュリ
ン、インターフェロンおよび成長ホルモン(A. Bollon
編）、CRC プレス(1983)、およびWeissman等、U.C.L.A.
Symp. Mol. Cell Biol., 25, pp.295- 326 (1982)を参
照のこと。 共通のアミノ酸の無い位置は、肉太活字で
示した。 IFN-αサブタイプは、アミノ酸残基に基づい
て大まかに分類されている。 ７つの位置（14、16、7
1、78、79、83および160)で、種々のサブタイプは僅か
２つの代替アミノ酸を示し、同じアミノ酸残基に占めら
れている７つの位置の相違に基づいてサブタイプを２つ
のサブグループ（ＩおよびII）に分類することを可能と
している。 ３つのIFN-αサブタイプ（Ｈ、Ｆおよび
Ｂ）は、アミノ酸位置に基づいてグループＩあるいはグ
ループIIに分類することができず、これらは、両グルー
プのサブタイプの自然ハイブリッドであると考えられ
る。 グループＩタイプのIFN-αサブタイプが、比較的
大きな抗ウィルス活性を呈し、一方で、グループＩタイ
プのIFN-αサブタイプが、比較的大きな抗腫瘍活性を呈
することが報告されている。 【０１８０】IFN-Con1の構造を、図面の最終行に記し
た。 Goedell等の配列に基づいて「共通である」と決
定されたIFN-Con1の特定の残基（例えば、第８位のセリ
ン）が、今や「支配的である」と思われることは特筆す
べきである。 さらに、先の文献に基づいて支配的であ
るとされた特定のIFN-Con1残基(Arg22、Asp78、Glu79お
よびTyr86)は、もはや支配的でなくなり、一方で、他の
支配的でないとされた残基(Ser80およびGlu83)は、今で
は支配的であると決定されている。 【０１８１】実施例10 14および16位のアミノ酸の同一性がIFN-Con1と異なるヒ
ト協働白血球インターフェロンを、IFN-Con1をコードす
るＤＮＡ配列の修飾により調製した。 具体的には、IF
N-Con1の発現ベクターを、BstEIIおよびHindIIIで処理
し、サブユニットLeuIFN ConIIIを除去した。 変更さ
れたサブユニットが挿入されたが、このサブユニットで
は、39および40位のアラニンを特定するコドンGCT が、
トレオニンを特定するコドンACTで置換され、イソロイ
シン・コドンCTGは、ATGに変えられた。 変更された遺
伝子の発現生成物である〔Thr14、Met16、Arg22、Al
a76、Asp78、Glu79、Tyr86、Tyr90、Leu96、Thr156、As
n157、Leu158〕IFN-αFを、IFN-Con2と命名した。 【０１８２】現在のところ、114および121位の残基の種
類に関して、IFN-Con1と異なる協働ヒト白血球インター
フェロン・ポリペプチドのための遺伝子が調製されてい
る。 【０１８３】具体的には、IFN-αＦサブタイプ残基を複
製するが、支配的なアミノ酸ではないVal114およびLys
121残基は、それぞれ優勢なGlu114およびArg121残基に
変えられる。 【０１８４】コドンを、Val114からArg114に（すなわ
ち、GTCからGAAに）変更すると、サブユニットLeuIFN C
on I（表23〜26）の末端部分にSalI部位が存在できなく
なるので、サブユニットＩおよびIIは、単一のサブユニ
ットとして調製される必要が生じると思われる。 断片
11および12のAAA、すなわち、リジン・コドンをCTGに変
えると、121位にアルギニンが存在することができる。
製造された遺伝子〔Arg 22、Ala76、Asp78、Glu79、Tyr
86、Tyr90、Leu96、Glu114、Arg121、Thr156、Asn157、
Leu158〕IFN-αＦの細菌による発現生成物を、IFN-Con3
と命名した。 【０１８５】次の実施例は、細菌宿主、特に、大腸菌に
おける外来性遺伝子の発現のレベルを高める方法に関す
る。 【０１８６】実施例11 前出の実施例での発現ベクターの形成において、trp プ
ロモーター／オペレーターＤＮＡ配列が用いられたが、
これら配列は、最初の転写開始(Met-1、ATG)の直前の位
置にリボソーム結合部位(RBS）配列を含んでいた。 発
現性の高い細胞タンパク質に関連するゲノム大腸菌ＤＮ
Ａ配列に存在する推定ＲＢＳ配列の、部分複製したＤＮ
Ａ配列を組み込むことによって、大腸菌内での種々の外
来性遺伝子の発現のレベルを増加するための試みがなさ
れた。 このタンパク質コーディング遺伝子の、Inokuc
hi等, Nuc. Acids. Res., 10, pp. 6957-6968 (1982)、
Gold等, Ann. Rev. Microbiol., 35, pp. 365-403 (198
1)、および Alton等, Nature, 282, pp. 864-869 (197
9)において報告されたリボソーム結合部位配列が検討さ
れ、大腸菌タンパク質OMP-F(外膜タンパク質）、CROお
よびCAM(クロラムフェニコール・トランスアセチラー
ゼ）に関連する遺伝子の部分的複製配列を用いることに
した。 【０１８７】例を挙げると、OMP-F RBS配列の一部を複
製するために、以下の配列がMet-1コドンの前に挿入さ
れる。 【０１８８】 【表２７】 【０１８９】この配列を、例えば、IFN-Con1あるいはIF
N-αF1をコードする製造されたIFN-αのタンパク質コー
ディング領域の前に組み込むために、発現ベクターのサ
ブユニットIVは削除され（ベクターをXbaIおよびBstEII
で切断することにより）、変更された断片41Ａおよび42
Ａ、および断片43および44を新断片RB１およびRB２で置
換した変更済みサブユニットIVに変更した。 変更され
た配列は、以下の表28に示す通りである。 【０１９０】 【表２８】【０１９１】以下の表29は、再構成された遺伝子のタン
パク質コーディング領域に先行する領域での前記ＤＮＡ
配列を示し、trpプロモーター／オペレーター内のHpaI
部位で始まる（表11〜14のサブユニットIF-4と比較のこ
と）。 【０１９２】 【表２９】 【０１９３】CROおよびCAM遺伝子のRBS配列の複製配列
を組み込むために同様の方法が採られ、Met-1コドンの
直前に下記表30に記した配列が生じた。 【０１９４】 【表３０】 【０１９５】すべてのRBS 配列の挿入体は、シャイン−
デルガルノ配列に良く相似しており、アデニンが豊富
で、通常、『停止』コドンをもたらす配列を含むことが
分かる。 【０１９６】IFN-Con1の大腸菌での発現レベルは、３つ
のRBS 挿入体（完全なtrpプロモーター／オペレーター
内に存在するRBS配列に加えて）に組み込まれたtrpで制
御された発現ベクターを用いて決定された。 OMP-F R
BS複製配列を用いた所望のポリペプチドの発現は、１ｌ
の培養当たり、150 〜300 mgであり、全タンパク質の10
〜20％に相当した。 CAM RBS複製配列を組み込んだベ
クターによる発現レベルは、OMP-Ｆ変異体による発現レ
ベルの約半分であった。 CRO RBS複製配列を含んだベ
クターは、OMP-Ｆ変異体の約1／10のレベルの所望のタ
ンパク質を生成した。 【０１９７】以下の実施例では、前述の実施例にて得ら
れたヒト白血球インターフェロンおよびポリペプチドの
抗ウィルス作用のスクリーニングに関する。 【０１９８】実施例12 以下の表31に、種々の細胞系における自然の（バフィコ
ート）インターフェロン、および分離され、微生物的に
発現された、IFN-αF1、IFN-αF2、IFN-Con1、およびIF
N-Con2と称するポリペプチドの抗ウィルス活性の試験結
果を示した。使用されたウイルスはVSV(水疱性口内ウイ
ルス）およびEMCV（脳心筋炎ウイルス）であった。 細
胞系は、種々の哺乳類に由来するものであり、ヒト(WIS
H, HeLa)、ウシ(MDBK)、マウス(MLV-6）、およびサル(V
ero)が含まれた。 抗ウィルス作用は、Weck等, J. Ge
n. Virol., 57, pp. 233-237 (1981)および Campbell
等, Can. J. Microbiol. 21, pp.1247- 1253（1975）に
報告された終点細胞変性効果検定によって測定した。
ここに示すデータは、WISH細胞における抗ウィルス活性
に対して正規化してある。 【０１９９】 【表３１】 【０２００】 【発明の効果】これら実施例より、本発明によって初め
て、完全に新規な種類の、合成された、生物学的活性を
有するタンパク様の生成物をもたらすものであり、この
生成物は、自然に生じる物質とは１つ以上のアミノ酸の
種類および／または位置の点で、さらに、１つ以上の生
物学的（例えば、抗体反応性）および薬理学的（例え
ば、薬効あるいは効果の持続期間）側面において異なる
ものであるが、その他の前述した性質を実質的に保持す
ることは明白である。 本発明の生成物は、適切に『標
識を付ける』ことが可能であり、例えば、酵素に接合し
た放射性標識（例えば、Ｉ125を用いて）、または螢光
色素で標識付けして、体液試料中の生成物および／また
は前述した抗体の存在量を定性的および／または定量的
に測定するための、検定および／または診断検査キット
に有用な試薬材料を提供することができる。 この抗体
は、１つ以上の動物種（例えば、マウス、ウサギ、ヤ
ギ、ヒト等）に接種を行うか、あるいはモノクローナル
抗体源から得ることができる。 【０２０１】この試薬材料は単独で、あるいは、適切な
基質、例えば、ガラスあるいはプラスチックのビーズに
塗布して使用することができる。 【０２０２】これまで開示してきた実施例を考慮すれ
ば、当業者であれば、多数の修正あるいは変更を想到で
きるものと考えられる。従って、本発明には、特許請求
の範囲の欄に記載された限定のみが付加されるべきであ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 サブユニットIF-1、IF-2、およびIF-3から、
ヒトIFN-γを特定する遺伝子を構築する方法の工程図で
ある。 【図２】 166個のアミノ酸を含む８つの『協働』ポリ
ペプチド配列の比較対照図である。
ヒトIFN-γを特定する遺伝子を構築する方法の工程図で
ある。 【図２】 166個のアミノ酸を含む８つの『協働』ポリ
ペプチド配列の比較対照図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 スタビンスキィ， イツアーク
アメリカ合衆国 80303 コロラド ボ
ールダー ハイデルバーグ ドライブ
3415
(72)発明者 スニトマン， ディヴィッド エル.
アメリカ合衆国 80303 コロラド ボ
ールダー イシニカ ドライブ 1475
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト免疫インターフェロン活性を有するヒト免疫イ
ンターフェロンポリペプチド類似体の製造プロセスであ
って、下記工程、すなわち； 製造された遺伝子を含む生物学的機能ＤＮＡで形質転換
した微生物を適切な栄養条件下で増殖し、および該微生
物での該遺伝子の発現により、ヒト免疫インターフェロ
ン活性を有するヒト免疫インターフェロンポリペプチド
類似体を生成せしめる工程を含み、 該製造された遺伝子が、選択されたＤＮＡベクターで形
質転換した選択された宿主微生物にて、１つ以上のアミ
ノ酸の種類および／または位置が、下記アミノ酸配列、
すなわち、 Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu- Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn- Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu- Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Met-Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr- Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln- Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-Lys-Phe- Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu- Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Lys-Ala- Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala- Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Gln- Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Glnのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む ポリペプチ
ドの発現をコードする製造された直線状二本鎖ＤＮＡ配
列であって、および 該ＤＮＡ配列が、その中間位置に制
限エンドヌクレアーゼによる切断のための少なくとも１
つの独特のパリンドロームの６塩基対認識部位を含むこ
とを特徴とする、製造された直線状二本鎖ＤＮＡ配列で
ある、 ことを特徴とする、ヒト免疫インターフェロン活性を有
するヒト免疫インターフェロンポリペプチド類似体の製
造プロセス。 ２．前記微生物が、大腸菌である請求項１に記載のプロ
セス。
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